Sử dụng kỹ thuật PCR nhằm rút ngắn thời gian tìm kiếm các chủng Bacillus subtilis có khả năng ức chế hình thành aflatoxin.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO
Đ
TẠO
O
TRƯỜN
NG ĐẠI HỌC
H
NÔNG
G LÂM TH
HÀNH PHỐ
Ố HỒ CHÍÍ MINH
BỘ
Ộ MÔN CÔ
ÔNG NGHỆ
Ệ SINH HỌ
ỌC

KHÓA
K A LUẬ
ẬN TỐ
ỐT NG
GHIỆP
P
SỬ DỤ
ỤNG PCR PHÁT
T HIỆN NHANH
N
CÁC CH
HỦNG
B
Bacillus

subtilis C
CÓ KHẢ
Ả NĂNG ỨC CHẾ
Ế
ÀNH AFLATOXIN
HÌÌNH THÀ

Ngành học:
h

G NGHỆ SIINH HỌC
CÔNG

Sinh viên thực hiện
n: LÊ HO
OÀNG THÁ
ÁI
óa:
Niên khó

2010 – 2014

Th
háng 12/201
13


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO
Đ
TẠO

O
TRƯỜN
NG ĐẠI HỌC
H
NÔNG
G LÂM TH
HÀNH PHỐ
Ố HỒ CHÍÍ MINH
BỘ
Ộ MÔN CÔ
ÔNG NGHỆ
Ệ SINH HỌ
ỌC

KHÓA
K A LUẬ
ẬN TỐ
ỐT NG
GHIỆP
P
SỬ DỤ
ỤNG PCR PHÁT
T HIỆN NHANH
N
CÁC CH
HỦNG
CÓ KHẢ
Ả NĂNG ỨC CHẾ
Ế
Bacillus subtilis C

ÀNH AFLATOXIN
HÌÌNH THÀ

Hướng
g dẫn khoa học

S
Sinh
viên th
hực hiện

PGS.TS. NGUYỄ
ỄN NGỌC HẢI

L HOÀNG
LÊ
G THÁI

T
Tháng 12/22013


LỜI CẢM ƠN
Con mãi khắc ghi công ơn sinh thành, dưỡng dục của ba, mẹ và nội những
người luôn cho con hạnh phúc, niềm vui, là chỗ dựa tinh thần vững chắc và luôn tạo
mọi điều kiện cho con học tập .
Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ
Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian
học tập tại trường.
Em xin chân thành biết ơn sâu sắc đến Thầy PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải đã tận

tình hướng dẫn và tạo những điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp.
Em xin cảm ơn:
Thầy Võ Khánh Hưng, cô Tôn Bảo Linh, thầy Huỳnh Văn Biết đã tận tình chỉ
dẫn em trong suốt thời gian học tập.
Hai chị, cảm ơn những người bạn thân yêu ở phòng trọ 2/55 và anh cảm ơn
em đã luôn quan tâm, động viên anh những lúc khó khăn.
Chị Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, chị Nguyễn Ngọc Ánh, anh Võ Tấn Hùng đã
nhiệt tình giúp đỡ và chỉ dẫn em. Đặc biệt em xin cảm ơn chị Vương Thị Thúy Vi đã
động viên và cho em nhiều ý kiến hay trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Các bạn lớp DH10SH nhất là các bạn kí túc xá phòng 16C, bạn Lê Thị Ân, Đỗ
Khắc Sáng, Nguyễn Thị Thu Hà và Trương Hồng Tâm đã luôn an ủi, chia sẻ cùng em
những lúc khó khăn.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2013
Lê Hoàng Thái

i


TÓM TẮT
Aflatoxin là độc tố quan trọng nhất trong nhóm độc tố mycotoxin do nấm tạo
ra. Tác hại của aflatoxin đã được ghi nhận khắp nơi trên thế giới, đặc biệt là ở những
nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam. Trước đây, việc tìm kiếm, sàng lọc các
chủng Bacillus subtilis có khả năng ức chế hình thành aflatoxin thường mất nhiều
thời gian và độ tin cậy không cao. Do đó, rất cần một biện pháp với độ tin cậy cao có
khả năng sàng lọc nhanh các chủng B. subtilis có khả năng ức chế hình thành
aflatoxin. Từ thực tiễn đó đề tài “ Sử dụng PCR phát hiện nhanh các chủng Bacillus
subtilis có khả năng ức chế hình thành aflatoxin” được thực hiện.
Vi khuẩn B. subtilis trong đất được phân lập trên môi trường NA. Sau đó, thí
nghiệm định tính khả năng ức chế aflatoxin trên môi trường thạch nước cốt dừa được

thực hiện. Các chủng thể hiện khả năng ức chế aflatoxin ở thí nghiệm định tính sẽ
được chọn để thực hiện PCR định danh B. subtilis. Các chủng là B. subtilis và các
chủng không phải B. subtilis nhưng thể hiện tốt khả năng ức chế aflatoxin ở thí
nghiệm định tính được sử dụng để thực hiện PCR khuếch đại hai gen ituD và lpa-14.
Các gen được giải trình tự, so sánh và phân tích. Thí nghiệm định lượng khả năng ức
chế hình thành aflatoxin của các chủng vi khuẩn mang gen mục tiêu trên môi trường
bắp được thực hiện.
Kết quả đạt được từ nghiên cứu: phân lập được vi khuẩn Bacillus subtilis
trong đất; phát hiện gen sản sinh iturin A (lpa-14, ituD) liên quan đến khả năng ức
chế hình thành aflatoxin ở một số chủng Bacillus subtilis bằng PCR; trình tự
nucleotide của các gen lpa-14, ituD và các chuỗi amino acid được mã hóa tương ứng
ở các chủng vi khuẩn phân lập được có độ tương đồng cao so với các trình tự tham
khảo; không phát hiện thấy sự biến đổi nghiêm trọng trong chuỗi amino acid được
mã hóa từ các gen lpa-14 và ituD ở các chủng vi khuẩn phân lập được; bước đầu xác
nhận các chủng vi khuẩn được phát hiện mang gen sản sinh iturin A thể hiện khả
năng ức chế sự hình thành độc tố aflatoxin qua thí nghiệm phân tích hàm lượng
aflatoxin trong bắp. Kết quả của đề tải cho thấy có thể sử dụng PCR để phát hiện
nhanh Bacillus subtilis có khả năng ức chế hình thành aflatoxin.
Từ khóa: Bacillus subtilis, iturin A, aflatoxin, Polymerase chain reaction.
ii


SUMMARY
Aflatoxins are recognized as the most important mycotoxins produced by
fungi. The harmful effects of aflatoxin have been recorded around the world,
especially in developing countries, including Viet Nam. Previous researches to find
and screen Bacillus subtilis strains capable of inhibiting aflatoxin formation often
time consuming and lack of reliable. We need a measure with high reliability capable
of rapid screening of B. subtilis strains capable of inhibiting afaltoxin formation. So,
the study “ Using PCR to rapid detection Bacillus subtilis strains capable of

inhibiting afaltoxin formation” was carried out.
In this study, B. subtilis from soil samples were isolated on NA medium.
Then, qualitative test aflatoxin inhibition were conducted on coconut agar. The
isolated strains showed inhibition of aflatoxin in qualitative experiments will be
selected to carry out PCR to identify B. subtilis. Strains of

B. subtilis or

non - B. subtilis but showed good ability to inhibit aflatoxin in qualitative
experiments were chosen to carry out PCR amplification of two genes ituD and
lpa-14. Genes were sequenced and then compare and analyze. Quantitative
experiment about inhibition of aflatoxin formation of isolated strains containing
target genes was performed on maize.
The results obtained from study showed that: Bacillus subtilis was sucessfully
isolated in soil; Bacillus subtilis strains which potential of producing iturin A could
be detected by PCR using specific primers for ituD and lpa-14 amplification; the
lpa-14 and ituD gene of the isolated strains showed high homology with the
corresponding genes of iturin operon of Bacillus subtilis RB14; sequences of amino
acid encoded by lpa-14 and ituD of the isolated strains showed high homology with
those encoded by lpa-14 and ituD of Bacillus subtilis RB14; there is not serious
changes in amino acid sequences encoded by lpa-14 and ituD; the isolated strains
having the gen of iturin A are capable of inhibiting of the aflatoxin formation through
experiment analysis of aflatoxin level in maize. So, PCR can be used for rapid
detection of Bacillus subtilis capable of inhibiting of aflatoxin formation.
Keywords: Bacillus subtilis, iturin A, aflatoxin, Polymerase chain reaction.
iii


MỤC LỤC
Trang

Lời cảm ơn ........................................................................................................................ i
Tóm tắt .............................................................................................................................ii
Summary ........................................................................................................................ iii
Mục lục ........................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt .............................................................................................vii
Danh sách các bảng ..................................................................................................... viii
Danh sách các hình ......................................................................................................... ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2. Yêu cầu đề tài............................................................................................................ 2
1.3. Nội dung thực hiện ................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1. Tổng quan về aflatoxin ............................................................................................. 3
2.1.1. Khái quát về aflatoxin ........................................................................................... 3
2.1.2. Lịch sử phát hiện aflatoxin ................................................................................... 3
2.1.3. Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa của aflatoxin ............................................. 3
2.1.4.Các loài nấm mốc sinh độc tố aflatoxin ................................................................ 4
2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của Aspergillus và sản sinh độc tố
aflatoxin. ................................................................................................................... 5
2.1.6.Tác hại của aflatoxin ............................................................................................. 7
2.1.7. Hiện trạng nhiễm aflatoxin trên thế giới và trong nước ..................................... 11
2.1.8. Các phương pháp phát hiện aflatoxin trong thực phẩm ..................................... 12
2.1.9. Các phương pháp phân hủy aflatoxin . ................................................................ 13
2.2. Tổng quan về Bacillus subtilis ............................................................................... 14
2.2.1. Lịch sử phát hiện và phân loại ............................................................................. 14
2.2.2. Đặc điểm của Bacillus subtilis ............................................................................ 15
2.2.2.1. Đặc điểm sinh thái và phân bố trong tự nhiên .................................................. 15
2.2.2.2. Đặc điểm hình thái và sinh hóa ....................................................................... 15
2.2.2.3. Đặc điểm nuôi cấy ............................................................................................ 16
iv

2.2.2.4. Đặc điểm bào tử................................................................................................ 16
2.2.3. Bộ gen của Bacillus subtilis và phương pháp PCR định danh B. subtilis ........... 17
2.2.4. Khả năng sản sinh kháng sinh của Bacillus subtilis ............................................ 18
2.2.5. Iturin A và tiềm năng ứng dụng trong ức chế hình thành độc tố aflatoxin. ........ 18
2.2.5.1. Công thức cấu tạo của iturin A ........................................................................ 18
2.2.5.2. Tính chất hóa lý và cơ chế diệt nấm của iturin A. ........................................... 19
2.2.5.3. Tiềm năng ứng dụng iturin A trong ức chế hình thành độc tố aflatoxin. ........ 20
2.2.5.4. Đặc tính vùng gen mã hóa iturin A .................................................................. 21
2.3. Tính kị nước của các amino acid theo thang Rose (Rose scale) ............................ 23
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 24
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 24
3.2. Vật liệu và hóa chất ................................................................................................ 24
3.2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 24
3.2.2. Hóa chất và thiết bị .............................................................................................. 24
3.2.2.1. Hóa chất và thiết bị dùng trong nuôi cấy vi sinh vật ........................................ 24
3.2.2.2. Hóa chất và thiết bị dùng trong PCR ............................................................... 25
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 26
3.3.1. Phân lập Bacillus subtilis trong đất. .................................................................... 26
3.3.1.1. Cách lấy mẫu đất .............................................................................................. 26
3.3.1.2. Phân lập Bacillus subtilis.................................................................................. 27
3.3.2. Thí nghiệm định tính khả năng ức chế aflatoxin của các chủng vi khuẩn
nghi ngờ là Bacillus subtilis ............................................................................... 27
3.3.2.1. Hoạt hóa chủng Aspergillus flavus trên môi trường khoai tây tự nhiên ........... 27
3.3.2.2. Đánh giá sơ bộ khả năng ức chế hình thành aflatoxin của các chủng
vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis ............................................................... 27
3.3.3. PCR định danh vi khuẩn Bacillus subtilis và khuếch đại hai gen mục tiêu
ituD và lpa-14 ..................................................................................................... 28
3.3.3.1. Ly trích DNA vi khuẩn ..................................................................................... 28

3.3.3.2. Thực hiện các phản ứng PCR ........................................................................... 29
3.3.3.3. Điện di sản phẩm PCR ..................................................................................... 30
3.3.4. Giải và phân tích trình tự ..................................................................................... 31

v


3.3.5. Thí nghiệm định lượng khả năng ức chế hình thành aflatoxin của các chủng
vi khuẩn mang gen mục tiêu (kể cả B. subtilis và không phải B. subtilis) ........... 31
3.3.5.1. Phương pháp xác định số lượng bào tử Aspergillus flavus .............................. 31
3.3.5.2. Phương pháp xác định số lượng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis .................. 32
3.3.5.3. Bố trí thí nghiệm ............................................................................................... 32
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 33
4.1. Tìm kiếm phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong đất ......................................... 33
4.2. Thí nghiệm định tính khả năng ức chế hình thành aflatoxin của các chủng
vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis................................................................... 33
4.2.1. Hoạt hóa Aspergillus flavus và kiểm tra khả năng sinh aflatoxin ....................... 33
4.2.2. Đánh giá sơ bộ khả năng ức chế hình thành aflatoxin của các chủng
vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis .................................................................. 34
4.3. PCR định danh Bacillus subtilis và khuếch đại hai gen ituD và lpa-14................ 35
4.4. Giải và phân tích trình tự ....................................................................................... 38
4.4.1. Phân tích trình tự gen ytcP .................................................................................. 38
4.4.2. So sánh, phân tích trình tự gen lpa-14 và trình tự amino acid được mã hóa ...... 39
4.4.3. So sánh, phân tích trình tự gen ituD và trình tự amino acid được mã hóa .......... 45
4.5. Thí nghiệm định lượng khả năng ức chế hình thành AF của các chủng vi khuẩn
mang gen mục tiêu (kể cả B. subtilis và không phải B. subtilis) trên bắp .............. 51
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 59
5.1. Kết luận................................................................................................................... 59
5.2. Kiến nghị ................................................................................................................ 59
Tài liệu tham khảo ......................................................................................................... 60

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AF:

Aflatoxin

BGYF:

Bright Greenish-yellow Fluorescence

CMI:

Cell-mediated Immunity

ctv:

cộng tác viên

DNA:

Deoxyribonucleic acid

ELISA:

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

FDA:

Food and Drug Administration

HBV:

Hepatitis B virus

HCV:

Hepatitis C virus

HPLC:

High-performance Liquid Chromatography

ORF:

Open Reading Frame

PCR:

Polymerase Chain Reaction

ppb:

part per billion

TSA:

Trypticase Soya Agar

UV:

Ultraviolet

WHO:

World Health Organization

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Một số loài nấm mốc có khả năng sản sinh aflatoxin .............................. 5
Bảng 2.2 Giới hạn các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển, sản sinh độc tố
aflatoxin của A. flavus và A. parasiticus .................................................................. 6
Bảng 2.3 Qui định của Bộ y tế về giới hạn hàm lượng AF trong thực phẩm ........ 10
Bảng 2.4 Qui định giới hạn AFB1 và AF tổng số trong hỗn hợp thức ăn cho
gia súc gia cầm ....................................................................................................... 11
Bảng 2.5 Quy định của FDA về giới hạn aflatoxin ............................................... 11
Bảng 2.6 Khả năng ức chế aflatoxin của iturin A trên ngô và thức ăn gia súc ..... 21
Bảng 3.1 Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR ............................... 30
Bảng 4.1 Kết quả xác định gen lpa-14 và ituD của các chủng B. subtilis và
không phải B. subtilis ............................................................................................. 37
Bảng 4.2 Kết quả PCR định danh B. subtilis và khuếch đại hai gen mục tiêu ..... 38
Bảng 4.3 Tỉ lệ tương đồng giữa các chủng vi khuẩn dựa trên gen lpa-14............. 43
Bảng 4.4 Tỉ lệ tương đồng giữa các chủng dựa trên trình tự amino acid được
mã hóa từ gen lpa-14 .............................................................................................. 44
Bảng 4.5 Tỉ lệ tương đồng giữa các chủng vi khuẩn dựa trên gen ituD ................ 49

Bảng 4.6 Tỉ lệ tương đồng giữa các chủng dựa trên trình tự amino acid được
mã hóa từ gen ituD............... ................................................................................ ..50
Bảng 4.7 So sánh mức độ màu sắc của bắp sau 5 ngày thí nghiệm....................... 52
Bảng 4.8 Hàm lượng aflatoxin sau khi phân tích HPLC ....................................... 53
Bảng 4.9 Hàm lượng AF B2 và AF B1 trung bình ................................................ 56

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Công thức hoá học của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 ........................... 4
Hình 2.2 Cơ chế ảnh hưởng của aflatoxin đến sức khỏe con người ....................... 8
Hình 2.3 Cấu tạo Iturin A ...................................................................................... 19
Hình 2.4 Operon tổng hợp iturin A ở Bacillus subtilis RB14 ............................... 22
Hình 3.1 Sơ đồ phương pháp nghiên cứu .............................................................. 26
Hình 4.1 Khuẩn lạc nghi nhờ là Bacillus subtilis trên môi trường NA ................. 33
Hình 4.2 Khuẩn lạc A. flavus dưới tia UV bước sóng 365 nm sau 4 ngày
nuôi cấy trên môi trường thạch nước cốt dừa ........................................................ 34
Hình 4.3 Sự phát triển của vi khuẩn làm khuẩn lạc nấm mốc bị khuyết vào ........ 34
Hình 4.4 Vòng sáng độc tố aflatoxin bị mờ ở vị trí khuẩn lạc nấm mốc tiếp
xúc với khuẩn lạc vi khuẩn .................................................................................... 35
Hinh 4.5 Điện di sản phẩm PCR định danh vi khuẩn Bacillus subtilis ................. 36
Hình 4.6 Điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen ituD .......................................... 36
Hình 4.7 Điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen lpa-14 ....................................... 37
Hình 4.8 Kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng bằng công cụ BLAST đối với
chủng T7/str.7 ......................................................................................................... 39
Hình 4.9 Kết quả môi trường bắp sau 5 ngày thí nghiệm...................................... 52

ix

Chương 1 MỞ ĐẦU
1.3.

Đặt vấn đề
Aflatoxin là độc tố quan trọng nhất trong nhóm độc tố mycotoxin do nấm

tạo ra. Nó gây ra những hậu quả vô cùng nặng nề đối với sức khỏe con người và
tổn thất to lớn về kinh tế. Tác hại của aflatoxin đã được ghi nhận khắp nơi trên
thế giới, đặc biệt là ở những nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam.
Nước ta nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa với đặc thù khí hậu là nóng và
độ ẩm cao đó là điều kiện thích hợp cho nhiều loại nấm hại phát triển, trong đó
có Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus, hai chủng nấm mốc có khả năng
sinh aflatoxin cao. Những nghiên cứu gần đây cho thấy lượng aflatoxin có trên
mẫu ngô, lạc vượt quá giới hạn cho phép sử dụng của tiêu chuẩn quốc tế. Ngoài ra,
Việt Nam còn được ghi nhận là nước có tỷ lệ nhiễm virus viêm gan siêu vi B
(Hepatitis B Virus - HBV) cao hàng đầu thế giới, điều này sẽ càng làm cho tác hại
của aflatoxin thêm nặng nề hơn.
Việc xử lý các vấn đề liên quan đến aflatoxin trước đây chỉ dừng lại ở việc
dùng hóa chất diệt nấm mốc hay xử lý nhiệt, tuy nhiên những biện pháp này có thể làm
giảm giá trị dinh dưỡng, không an toàn cho sức khỏe người tiêu dùng và gây ô nhiễm
môi trường. Do đó, tìm kiếm, sử dụng vi sinh vật có thể ức chế sự phát triển
và hình thành aflatoxin từ nấm mốc được ưu tiên nghiên cứu. Có nhiều chủng
vi sinh vật đã được nghiên cứu và ứng dụng, trong đó Bacillus subtilis nổi lên
như một ứng viên hàng đầu vì nó vừa có khả năng ức chế hình thành aflatoxin
vừa là một tác nhân sinh học an toàn. Tuy nhiên, không phải bất kỳ chủng
Bacillus subtilis nào cũng có khả năng ức chế hình thành aflatoxin, do đó phải
tiến hành phân lập và nghiên cứu khả năng kháng sự phát triển của nấm mốc có
khả năng sinh aflatoxin. Quá trình này thường mất nhiều thời gian và độ tin cậy

không cao. Do đó, rất cần một biện pháp với độ tin cậy cao có khả năng sàng lọc
nhanh các chủng Bacillus subtilis ức chế hình thành aflatoxin. Vì tính cấp thiết ấy, đề
tài “Sử dụng PCR phát hiện nhanh Bacillus subtilis có khả năng ức chế hình thành
aflatoxin” đã được thực hiện.

1


1.4.

Yêu cầu đề tài
Sử dụng kỹ thuật PCR nhằm rút ngắn thời gian tìm kiếm các chủng

Bacillus subtilis có khả năng ức chế hình thành aflatoxin.
1.5.

Nội dung thực hiện
Phân lập Bacillus subtilis từ đất.
Hoạt hóa giống Aspergillus flavus có khả năng sinh aflatoxin do phòng

thí nghiệm thực hành vi sinh, khoa Chăn nuôi - Thú y trường Đại học Nông Lâm Tp.
Hồ Chí Minh cung cấp.
Thử nghiệm định tính khả năng ức chế độc tố aflatoxin của các chủng vi khuẩn
phân lập được.
PCR định danh vi khuẩn Bacillus subtilis và khuếch đại 2 gen ituD và lpa-14 .
Giải và xử lý các trình các trình tự gen bằng phần mềm tin sinh học, so sánh
và phân tích.
Thực hiện thí nghiệm định lượng khả năng làm giảm độc tố aflatoxin
của các chủng Bacillus subtilis có một trong hai gen và có cả 2 gen và các chủng
không phải là Bacillus subtilis nhưng có cả 2 gen mục tiêu.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.

Tổng quan về aflatoxin

2.1.1. Khái quát về aflatoxin
Mycotoxin hay độc tố nấm mốc là một trong những nhóm độc chất tự nhiên
do các loài nấm mốc sản sinh ra trong quá trình phát triển trên các cơ chất, đặc biệt là
lương thực, thực phẩm dành cho người và gia súc. Trong đó, độc tố aflatoxin (AF),
do nấm Aspergillus (chủ yếu là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus sinh ra)
là độc tố quan trọng nhất và được nghiên cứu nhiều nhất. AF có thể hình thành
ngay trong quá trình canh tác hoặc sau thu hoạch và chế biến nếu sản phẩm
không được phơi khô hay có độ ẩm cao. Tiêu thụ thực phẩm nhiễm AF thường xuyên
có thể gây ra những hậu nặng nề về sức khỏe thậm chí có thể tử vong.
2.1.2. Lịch sử phát hiện aflatoxin
Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm ở nước Anh bị tổn thất rất nặng nề, lúc đầu
hơn 10.000 gà tây chết vì một bệnh mới gọi là bệnh “X” ở gà tây (Turkey “X”
disease). Sau đó, các loại gia cầm khác như vịt, gà cũng bị nhiễm bệnh và tử vong rất
nhiều. Qua điều tra, người ta xác định được bệnh có liên quan đến một loại độc tố do
nấm có trong thức ăn sinh ra. Năm 1961 người ta đã tìm ra bản chất hoá học của độc
chất này là aflatoxin do vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus tạo ra.
Từ đó trở đi có rất nhiều công trình nghiên cứu về độc tố AF và tác hại của nó cũng
như các nghiên cứu về cách ức chế và giảm khả năng hình thành AF trong thực phẩm.
2.1.3. Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa của aflatoxin
Aflatoxin gồm 4 loại là B1, B2, G1, G2 lần lượt ký hiệu là AFB1, AFB2,
AFG1, AFG2, có công thức phân tử là:

• AFB1: C17H12O6
• AFB2: C17H14O6
• AFG1: C17H12O7
• AFG2: C17H14O7
Trong đó AFB2 và AFG2 là dẫn xuất dihydroxy của B1và G1(Victoria, 2001;
Nabil Saad, 2004, trích dẫn bởi Trương Quốc Phú, 2005).

3


Ngoài 4 loại trên, aflatoxin còn có thêm hai sản phẩm trao đổi chất là aflatoxin
M1 và aflatoxin M2. M1 là 4-hydroxy aflatoxin B1 và aflatoxin M2 là 4-dihydroxy
aflatoxin B2.

Hình 2.1 Công thức cấu tạo hoá học của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2
(Nguồn: Williams và ctv, 2004).
Tính chất lý học của các loại aflatoxin :
AFB1: có điểm nóng chảy 268 - 2690C, có màu xanh lam trên đèn huỳnh quang.
AFB2: có điểm nóng chảy 286 - 2890C, có màu xanh lam trên đèn huỳnh quang.
AFG1: có điểm nóng chảy 244 - 2460C, có màu xanh lục trên đèn huỳnh quang.
AFG2: có điểm nóng chảy 229 - 2310C, có màu xanh lục trên đèn huỳnh quang.
2.1.4. Các loài nấm mốc sinh độc tố aflatoxin
Nấm mốc là vi sinh vật (vi nấm) có cấu tạo gần giống với thực vật, sống ký sinh
hay hoại sinh trên nhiều loại cơ chất khác nhau, đặc biệt là các chất hữu cơ đơn giản,
nhất là hydratcacbon. Nấm mốc không chứa diệp lục tố, cấu tạo dạng sợi có vách ngăn
hoặc không có vách ngăn. Những sợi nấm này phân nhánh, hình thành từng đám
chằng chịt gọi là hệ sợi nấm. Có 2 loại sợi: sợi nấm dinh dưỡng nằm trong lớp môi
trường, làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng cho toàn bộ hệ nấm; sợi nấm khí sinh
thường nhô lên trên môi trường, giữ vai trò sinh sản (tạo bào tử).
4

Aflatoxin là một nhóm độc tố chủ yếu do nấm mốc Aspergillus flavus
và Aspergillus parasiticus sản sinh ra, được tìm thấy đầu tiên từ bánh dầu phộng
nhập từ Brazil. Ngoài ra còn có một số nấm mốc khác có khả năng sinh aflatoxin
(bảng 2.1).
Bảng 2.1 Một số loài nấm mốc có khả năng sản sinh aflatoxin
Loài nấm mốc

Aflatoxin
G1

Tác giả

B1

B2

G2

Aspergillus flavus

+

+

Aspergillus parasiticus

+

+

+

+

Coduer và ctv,1963

Aspergillus nomius

+

+

+

+

Kurzman và ctv, 1987

Aspergillus oryzae

+

Basappa và ctv, 1967

Aspergillus niger

+

Kulik và Holaday, 1967

Aspergillus wentii

+

Kulik và Holaday, 1967

Aspergillus ruber

+

Kulik và Holaday, 1967

Aspergillus ostianus

+

Aspergillus ochraceus

+

Penicillium puberulum

+

Sargeant và ctv, 1961

+

Scot và ctv, 1968
Van Walbeck và ctv,1968

+

+

+

Kulik và Holaday, 1967

(Phạm Hoàng Thái, 2007)

Gần đây người ta phát hiện thêm vài loài nữa có khả năng sinh AF như:
A. tamarii (Goto và ctv, 1997), A. pseudotamarii (Ito và ctv 2001). Trong các loại
độc tố AF thì độc tố AFB1 chủ yếu do loài Aspergillus flavus sinh ra, là độc tố AF
phổ biến nhất trong thực phẩm và là độc tố nguy hiểm nhất đối với sức khỏe
người tiêu dùng.
2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của Aspergillus và sản sinh độc tố
aflatoxin
Sự phát triển và sản sinh độc tố aflatoxin của Aspergillus phụ thuộc vào
các yếu tố trong môi trường mà nó phát triển (nhiệt độ, pH, hoạt độ nước, thành phần
có trong thực phẩm…) cũng như các yếu tố bên ngoài như độ ẩm môi trường
xung quanh, nhiệt độ trong kho bảo quản, các vi sinh vật cạnh tranh,… (Zinedine
và Mañes, 2009).
Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus có điều kiện sinh trưởng
và sản sinh aflatoxin khá tương đồng, được thể hiện qua bảng 2.2.
5

Bảng 2.2 Giới hạn các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển, sản sinh độc tố
của A. flavus và A. parasiticus
Sự

A. flavus A. parasiticus A. flavus A. parasiticus

phát triển

Tối thiểu

Nhiệt độ( 0C)

10 - 12

Hoạt độ nước

0,8

pH
Sản sinh AF

Tối ưu

12
0,8 – 0,83

2

2

Cao nhất

33

32

43

42

0,98

0,99

> 0,99

> 0,99

5-8

5-8

>11

>11

A. flavus A. parasiticus A. flavus A. parasiticus
Tối thiểu

Nhiệt độ( 0C)

13

Hoạt độ nước

0,82

pH

– 2

A. flavus A. parasiticus

Tối ưu
12

0,86 – 0,87
–

A. flavus A.parasiticus
Cao nhất

16 - 31

25

31- 37

40

0,95 – 0,99

0,95

> 0,99

> 0,99

6

–

>8

(ICMSF, 1996)

Mặc dù các điều kiện được mô tả có đôi chút biến đổi tùy thuộc vào nguồn
tài liệu, nhưng nhìn chung nhiều báo cáo cho thấy A. flavus và A. parasiticus phát triển
ở nhiệt độ trung bình 10-12 (mức thấp nhất) đến 42-430C, nhiệt độ tối ưu là 32- 330C.
Chúng có thể phát triển trong giới hạn pH rộng (2,1 - 11,2), tối ưu là từ 3,5 - 8.
Hoạt độ nước (aw), thấp nhất là từ 0,8 – 0,83 và tối ưu là 0,99 (Sweeney và Dobson,
1998).
Ở nhiệt độ 12-400C, A. flavus và A. parasiticus có khả năng sinh độc tố,
nhiệt độ tối ưu để lượng độc tố tạo ra cao nhất là từ 25 - 300C. Đối với A. parasiticus,
ở nhiệt độ cao thì lượng độc tố aflatoxin B tạo ra cao hơn aflatoxin G (ICMSF, 1996).
Quá trình sản sinh AF của A. parasiticus diễn ra ở pH giao động từ 3,5 - 8, và tối ưu
ở pH là 6. Hoạt độ nước thấp nhất mà A. flavus có thể tạo aflatoxin là 0,82 (Sweeney
và Dobson, 1998), tối ưu là 0,99 (Cousin và ctv, 2005).
Vùng khí hậu nhiệt đới với các đặc tính nhiệt độ và độ ẩm cao là điều kiện
lý tưởng cho cho sự phát triển và sản sinh độc tố aflatoxin (tối ưu là từ 25 - 300C)

(Sweeney và Dobson, 1998). Một số nước ở vùng khí hậu này, như trường hợp
ở Ma-Rốc, có tỷ lệ người mắc bệnh ung thư gan cao cũng như các bệnh lý không rõ
nguyên nhân mà người ta tin rằng có thể có liên quan đến aflatoxin (Zinedine
và Mañes, 2009).

6


Trong môi trường giàu carbohydrate thì quá trình sản sinh aflatoxin sẽ mạnh mẽ
hơn, ngoài ra một số cơ chất giàu chất béo và protein (điển hình là đậu phộng) cũng là
cơ chất lý tưởng cho sự sản sinh aflatoxin. Trong một số trường hợp sự hiện diện của
một số loài nấm khác sẽ làm giảm khả năng tổng hợp aflatoxin, ngoài ra, một số thành
phần có trong thực phẩm cũng có thể làm giảm sự sản sinh aflatoxin. Ví dụ, oleuropein
(một phenolic iridoid) trong dầu ô liu có khả năng làm giảm khả năng sinh aflatoxin
của Aspergillus flavus và A. parasiticus. Caffeine ức chế sự phát triển và khả năng sinh
độc tố aflatoxin của nấm Aspergillus (CAST, 1998). Còn có một số báo cáo cho thấy
một số vitamin, ví dụ như vitamin K5 ngoài hoạt tính kháng khuẩn, nó còn làm chậm
quá trình tăng trưởng cũng như sản sinh aflatoxin của các chủng Aspergillus (Miranda
và ctv, 2011). Ngoài ra sự hiện diện và khả năng tổng hợp các hợp chất thứ cấp của vi
khuẩn cũng có thể ức chế sự phát triển cũng như sản sinh aflatoxin, điều này sẽ được
đề cập ở các phần sau.
2.1.6. Tác hại của aflatoxin
Tác hại đầu tiên của aflatoxin phải kể đến đó là ung thư gan. Trong
các trường hợp chết do ung thư thì ung thư gan là bệnh có số người chết cao thứ ba
trên thế giới, với khoảng 550.000 - 600.000 trường hợp mỗi năm (WHO, 2008). 83%
các trường hợp chết vì ung thư gan xảy ra ở các nước Đông Nam Á và các nước
ở cận Sahara - Châu Phi (Kirk và ctv, 2006). Theo Wu và Khlangwiset (2010) thì các
enzyme P450 đặc biệt (CYP1A2, 3A4, 3A5, 3A7) trong gan sẽ chuyển hóa độc tố
aflatoxin thành aflatoxin -8,9-epoxide, sản phẩm này gắn kết vào các protein gan gây
ngộ độc cấp tính (aflatoxicosis), hoặc chúng sẽ đính vào DNA và gây ra ung thư gan.

Cơ chế ảnh hưởng của aflatoxin đến sức khỏe con người được mô tả ở hình 2.2.

7


Cây trồng bị

Các điều kiện kiện bảo quản

stress

không đảm bảo

Aflatoxin tích lũy trong nông sản

Tiêu thụ aflatoxin

Gan chuyển hóa
thành aflatoxin 8,9-epoxide

AF-8,9-epoxide

Ngộ độc

gắn vào các

cấp tính

protein gan

Thay đổi tính toàn

Điều biến sự

AF-8,9-epoxide

Ung

vẹn của đường ruột

biểu hiện cytokine

gắn vào DNA

thư gan

Chậm phát triển ở trẻ
em

Ức chế miễn

Hiệp đồng tác

dịch

dụng với HBV

Hình 2.2 Cơ chế ảnh hưởng của aflatoxin đến sức khỏe con người (Wu, 2010).
Các mũi tên màu đỏ biểu thị các mối liên hệ đã biết rõ cơ chế, trong khi đó các
mũi tên màu xanh biểu thị các mối liên hệ chưa được hiểu rõ. Cây trồng bị stress

(do hạn hán, mưa lũ, côn trùng tấn công,…) sẽ dễ bị nhiễm nấm có khả năng sinh độc
tố ngay trên đồng ruộng, hoặc sau khi thu hoạch, các điều kiện bảo quản
không đảm bảo (độ ẩm cao, nông sản không được phơi khô,..) aflatoxin sẽ tích lũy
trong nông sản. Khi tiêu thụ thực phẩm nhiễm aflatoxin, gan sẽ chuyển aflatoxin thành
aflatoxin -8,9-epoxide, sản phẩm này sẽ đính vào các protein gan gây ngộ độc cấp tính
(aflatoxicosis), hoặc chúng sẽ đính vào DNA và gây ra ung thư gan. Aflatoxin sau khi
chuyển hóa thành aflatoxin -8,9-epoxide sẽ hiệp đồng tác dụng với virus HBV gây
ung thư gan (cơ chế chưa được hiểu rõ). Tiêu thụ thực phẩm nhiễm aflatoxin làm thay
đổi tính toàn vẹn của đường ruột, dẫn đến tình trạng chậm phát triển ở trẻ
và ức chế miễn dịch (cơ chế chưa được hiểu rõ). Ngoài ra sử dụng thực phẩm
nhiễm aflatoxin sẽ dẫn đến điều biến sự biểu hiện cytokine, từ đó cũng có thể gây
ức chế miễn dịch và gây ra tình trạng chậm phát triển ở trẻ em.
8


Nhiều bằng chứng dịch tể học cho thấy thường xuyên tiêu thụ thực phẩm
nhiễm aflatoxin và cơ thể bị nhiễm virus HBV hoặc HCV mãn tính sẽ tăng nguy cơ
dẫn đến ung thư gan. Theo Qian và ctv (1994) thì những người bị ung thư gan do
sử dụng thực phẩm nhiễm aflatoxin thời gian dài phần lớn là những người bị
nhiễm HBV mạn tính. Nguy cơ ung thư gan tăng gấp 30 lần đối với trường hợp bị
nhiễm HBV mạn tính và sử dụng thực phẩm nhiễm aflatoxin so với các trường hợp chỉ
dương tính với HBV hoặc sử dụng thực phẩm nhiễm aflatoxin (Groopman và ctv,
2008). Không may là cả hai yếu tố aflatoxin và HBV (hay HCV) lại rất phổ biến
ở các nước đang phát triển, đặc biệt là các nước châu Phi và châu Á, trong đó
có Việt Nam.
Ngoài ung thư gan, aflatoxin được ghi nhận có khả năng liên quan đến rối loạn
hệ thống miễn dịch, tuy nhiên cơ chế chưa được hiểu rõ. Turner và ctv (2003)
tiến hành nghiên cứu để xác định tác hại của việc phơi nhiễm aflatoxin trong chế độ ăn
thông qua các thông số miễn dịch của trẻ em từ 6 - 9 tuổi ở Gambia. Các thông số
miễn dịch khảo sát bao gồm secretory IgA (sIgA) ở nước bọt, CMI,…Kết quả cho thấy

rằng trẻ em vùng nông thôn Gambia phơi nhiễm aflatoxin hàm lượng cao và sIgA
trong nước bọt giảm, đồng thời đáp ứng của kháng thể cũng yếu đi. Nhiều nghiên cứu
được tiến hành trên gia cầm, lợn và chuột cho thấy rằng sử dụng thực phẩm
nhiễm aflatoxin có thể ức chế đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào (Williams và
ctv, 2004). Aflatoxin còn được ghi nhận liên quan đến tình trạng chậm phát triển ở trẻ
em, ví dụ, aflatoxin được ghi nhận liên quan tới còi xương ở trẻ em Nigeria
(Khlangwiset, 2011).
Trong nước, theo Dương Thanh Liêm (2002) thì aflatoxin gây ra nhiều
tác hại như thận bị sưng to làm cho việc bài thải chất độc ra khỏi cơ thể trở nên khó
khăn, từ đó làm cho triệu chứng ngộ độc trở nên trầm trọng; bào mòn ống tiêu hóa nên
làm giảm khả năng tiêu hóa các chất dinh dưỡng trong thức ăn; đôi khi cũng thấy
tổn thương ở miệng, làm cho thú khó lấy thức ăn; làm giảm khả năng đề kháng
của động vật, ức chế hệ thống sinh kháng thể. Do đó khi nhiễm aflatoxin cơ thể
rất mẫn cảm với các bệnh thông thường, có thể gây tử vong cho thú. Ngoài ra aflatoxin
còn làm thay đổi hoạt động sinh lý bình thường, gây rối loạn sinh sản, giảm tính

9


ngon miệng đối với thức ăn do sự phát triển của nấm mốc làm mất mùi thức ăn, làm
hư hại các chất dinh dưỡng trong thức ăn (glucid, protein, vitamin,..).
Trên vật nuôi, sự mẫn cảm của aflatoxin đối với từng loài rất khác nhau và
được chia làm ba nhóm. Mẫn cảm nhất bao gồm vịt và gà tây, chỉ với hàm lượng
aflatoxin nhỏ hơn 1ppm trong thức ăn hàng ngày đã gây ngộ độc. Mẫn cảm vừa gồm
bò, lợn và gia cầm khác, hàm lượng aflatoxin xấp xỉ 10 ppm trong thức ăn hàng ngày
sẽ gây ngộ độc. Mẫn cảm ít có cừu, hàm lượng aflatoxin lớn hơn 10 ppm trong thức ăn
hàng ngày mới gây ngộ độc.
Gia súc non rất dễ bị ngộ độc do bú sữa, ví dụ, bê chỉ cần hàm lượng 2 ppm đã
gây ngộ độc.
Ngộ độc aflatoxin được chia làm hai thể: thể cấp tính với các biểu hiện như gan

biến đổi, màu nhạt, hoại tử, xuất huyết, viêm cầu thận nặng; thể mạn tính với các biểu
hiện: con vật bỏ ăn, chậm lớn, gầy yếu, lông xơ xác, mổ khám thấy gan biến đổi nặng
nhất như xơ gan, có các khối u hoặc gan nhiễm mỡ, thoái hóa, xuất huyết, hoại tử.
Không có phương pháp điều trị đặc hiệu cho gia súc, gia cầm bị ngộ độc aflatoxin do
đó điều quan trọng nhất là cần loại bỏ thức ăn bị mốc có chứa aflatoxin .
Vì những mối nguy hại ấy mà việc kiểm soát aflatoxin trong thực phẩm hết sức
gắt gao. Tại Việt Nam một số qui định về quản lí aflatoxin được thể hiện trong bảng
2.3 và 2.4. Ở Mỹ, FDA thiết lập quy định giới hạn hàm lượng aflatoxin trong thức ăn
dành cho người và động vật được trình bày ở bảng 2.5.
Bảng 2.3 Qui định của Bộ y tế về hàm lượng aflatoxin tối đa trong thực phẩm
Loại thực phẩm

Tên độc tố vi nấm

Giới hạn tối đa
(µg/kg)

Thực phẩm ( chung cho các loại thực phẩm)

Aflatoxin B1

5

Thực phẩm (chung cho các loại thực phẩm)

Aflatoxin tổng số

15

Sữa và các sản phẩm sữa

Aflatoxin M1

0,5

Quyết định 46/2007/QĐ-BYT, ngày 19/12/2007 của Bộ trưởng Bộ Y tế về quy định giới hạn
tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm.

10


Bảng 2.4 Qui định giới hạn AFB1 và AF tổng số trong hỗn hợp thức ăn cho gia súc
gia cầm
Loại vật nuôi
Gà con từ 1-28 ngày tuổi
Nhóm gà còn lại
Vịt con từ 1-28 ngày tuổi
Nhóm vịt còn lại
Lợn con theo mẹ từ 1-28 ngày tuổi
Nhóm lợn còn lại
Bò nuôi lấy sữa

AF B1 (ppb)
20
30
Không có
10
10
100
20

AF (ppb)
30
50
10
20
30
200
50

Quyết định số 104/2001/QĐ/BNN, ký ngày 31/10/2001, của Bộ nông nghiệp và phát triển
nông thôn về giới hạn độc tố aflatoxin B1và aflatoxin tổng số.

Bảng 2.5 Quy định của FDA về giới hạn aflatoxin
Thức ăn dành cho người hoặc động vật
Lượng aflatoxin tối đa cho phép, ppb
Thức ăn dành cho người
20
Sữa
0.5 (AF M1)
Thức ăn giành cho vỗ béo bò thịt
300
Thức ăn trong chăn nuôi gia súc, lợn, gia
100
cầm trưởng thành
Thức ăn cho động vật chưa trưởng thành
Thức ăn trong chăn nuôi động vật lấy sữa
(bò sữa,...)

20

20

(igrow.org)

2.1.7. Hiện trạng nhiễm aflatoxin trên thế giới và trong nước
Aflatoxin thường xuất hiện trong các sản phẩm nông nghiệp trên cánh đồng
trước khi thu hoạch hoặc sau khi thu hoạch nếu sản phẩm không được phơi khô ngay
hay ẩm độ trong sản phẩm cao tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển. Đôi khi sữa,
trứng, thịt cũng bị phát hiện có aflatoxin do động vật đã ăn những loại thức ăn
bị nhiễm aflatoxin, vấn đề này gây ra những hậu quả khôn lường và thiệt hại nặng nề
cho người chăn nuôi. Theo Wu và Khlangwiset (2010) nhu cầu tiêu thụ ngô
và đậu phộng trên thế giới rất cao, tuy nhiên đây là hai loại sản phẩm rất mẫn cảm
với aflatoxin, do đó đây là hai nguồn chủ yếu gây nhiễm aflatoxin cho con người.
Ở Indonesia, các mẫu đậu phộng thu thập từ động ruộng, nhà kho bảo quản
của nông dân, chợ có tỉ lệ nhiễm nấm A. flavus là từ 60 - 80%, trong đó lượng
aflatoxin dao động từ 40 - 4100 ppb, các sản phẩm đậu phộng như đậu phộng chiên,
11


bột đậu phộng lượng aflatoxin nhiễm trên 1000 ppb (Sudjadi và ctv, 1999). Ở Ai Cập,
32% số ngũ cốc và 6% số loại bột cá đem kiểm nghiệm bị nhiễm aflatoxin
từ 1- 50 ppb; 8% số ngũ cốc và 16% số loại bột cá bị nhiễm từ 201 - 2000 ppb
(Hagazy, 1988, trích dẫn bởi Diab và ctv, 2000). Theo Bhatti và ctv (2001)
trong 3320 mẫu nguyên liệu có nguồn gốc động, thực vật ở Pakistan
được kiểm nghiệm đều có chứa AFB1với hàm lượng thấp nhất là 13 ppb và cao nhất là
78 ppb. Hầu hết các mẫu cám gạo, cám lúa mì, bột bắp, bột cá, bột hướng dương,
bột đậu nành và bột hạt bông đều có hàm lượng AFB1cao hơn mức khuyến cáo
(20 ppb) của tổ chức FDA. Aflatoxin cũng có thể hiện diện trong các loại thực phẩm
chế biến, đặc biệt là các sản phẩm từ bắp.
Ở Việt Nam, đã có một số tác giả nghiên cứu về mức độ nhiễm aflatoxin

trên ngô, đậu phộng. Đậu Ngọc Hào (1992) xác định tỷ lệ nhiễm AFB1 trong 168 mẫu
nguyên liệu sản xuất thức ăn chăn nuôi, tỷ lệ nhiễm trên ngô hạt là 33%,
ngô bột là 74,2%, đậu phộng là 84,7%. Theo Nguyễn Thùy Châu (1997)
đã nghiên cứu và thấy rằng mức độ nhiễm nấm mốc trên ngô Việt Nam, kết quả
cho thấy các loại nấm mốc nhiễm bên trong hat ngô miền miền Bắc thường là
loài A. flavus, với tỷ lệ dao động 20 - 90%. Sau đó là loài A. parasiticus, ngô
ở ngoại thành Hà Nội, ngô của Hà Bắc nhiễm cả A. flavus và A. parasiticus. Ngô
ở Sơn La, Hòa Bình, Nghệ An có mức nhiễm A. flavus cao hơn hẳn lần lượt là là 50%,
90% và 34%. Đối với ngô miền Nam, A. flavus cũng là loài có tần suất cao nhất
trong các loài của Aspergillus nhiễm trên các mẫu, dao động từ 50 - 60%.
2.1.8. Các phương pháp phát hiện aflatoxin trong thực phẩm
Có thể dùng các kỹ thuật đơn giản và không đắt tiền như phương pháp "black
light" hay còn gọi là phương pháp BGYF. Phương pháp này dựa trên
màu huỳnh quang màu vàng xanh sáng quan sát được dưới tia UV bước sóng 366nm.
Huỳnh quang màu vàng xanh sáng được tạo ra từ phản ứng của acid kojic (acid này
được tạo ra do cùng một loại nấm sản sinh aflatoxin). Phương pháp này
là phương pháp nhanh nhất để phát hiện aflatoxin tuy nhiên độ tin cậy không cao
và không dùng để phát hiện aflatoxin trong hạt đã qua xử lý nhiệt.
Phương pháp huyết thanh học: phát hiện aflatoxin thông qua những
phương tiện phát hiện nhanh, dễ thực hiện theo nguyên tắc: sử dụng kháng thể để "bắt"
(có lựa chọn) độc tố đặc biệt đã được tách chiết từ hạt hay các thành phần của thức ăn.
12


Sau khi tách chiết, sẽ sử dụng bộ kiểm tra và thêm chất chỉ định màu. Cường độ
màu sắc sẽ chỉ định có độc tố hay không và có thể định lượng được lượng độc tố.
Ví dụ phương pháp ELISA .
Sắc ký (sắc ký bản mỏng, sắc ký khí hay sắc ký lỏng cao áp): phương pháp
đáng tin cậy để phát hiện các độc tố, được sử dụng nhiều trong các phòng nghiên cứu
của các công ty thương mại. Ở Việt Nam, Đoàn Thị Khang và ctv (2007) đã xây dựng

được quy trình tối ưu cho phương pháp xác định độc chất aflatoxin B1, B2, G1, G2
trong các loại nguyên liệu và thức ăn chăn nuôi bằng HPLC.
2.1.9. Các phương pháp phân hủy aflatoxin
Phương pháp hóa học
Phương pháp sử dụng các chất oxi hóa - khử như natrihypochlorit (NaOCl), oxy
già (H2O2) được sử dụng để làm mất độc tính của aflatoxin. Tuy nhiên
sử dụng NaOCl để xử lý hạt nhiễm aflatoxin có thể làm mất màu sắc của hạt
và biến chất các acid amin. Khí ozon (O3) cũng được thử nghiệm về khả năng phân
hủy aflatoxin trong mẫu và đạt được hiệu quả tốt, song có bằng chứng
là chất lượng các thành phần của thức ăn bị giảm đặc biệt là protein, vitamin.
Phương pháp sử dụng các chất kiềm: hydroxit amon (NH4OH) và hyroxit natri
(NaOH) là 2 chất kiềm thường được sử dụng làm vô hoạt aflatoxin. Các chất này đều
có hoạt tính mạnh, có thể phá vỡ vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin .
Phương pháp sử dụng khí NH3: nhiều thí nghiệm đã chứng minh hiệu quả
của việc dùng khí NH3 làm vô hoạt aflatoxin. Người ta nhận thấy,
nếu hàm lượng NH3 là 0,5 - 1,5% và nhiệt độ bên ngoài là 250C, thì sau 14 ngày lượng
độc tố từ 200 bbp xuống còn 10 ppb (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).
Làm giảm aflatoxin bằng các chất hấp phụ hoặc kết dính độc tố: các chất hấp
phụ thường là các chất vô cơ hoặc hữu cơ (tự nhiên hoặc nhân tạo) có hoạt tính bề mặt
cao. Các chất có khả năng hấp phụ aflatoxin gồm: than hoạt tính, một số polymer hữu,
vô cơ có bản chất aluminosilicat như bentonite, mốt số chất sét đặc biệt (kaolin,
sepiolite, clinoptilolite, zeolite), một số polymer hữu cơ tự nhiên (alfalfa) hoặc nhân
tạo (nhựa trao đổi ion, polyvinyl polypyrrolidone) (Charmley, 1994; trích dẫn bởi Đậu
Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).

13


Phương pháp vật lý học
Phân hủy aflatoxin bằng hấp ướt ở áp suất cao: phương pháp hấp ướt ở nhiệt độ

cao dưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn. Quá trình này phá hủy
nhanh chóng vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin. Rehana (1979)
(trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003) nhận thấy nếu gạo
nhiễm aflatoxin từ 40 - 4000 ppb được hấp ướt trong 5 phút ở 1200C (thêm nước vào
gạo tỷ lệ là 1:4) có thể làm giảm hàm lượng aflatoxin đến 68%. Ở đậu phộng có độ
ẩm10%, chứa 7000 ppb aflatoxin B1 được hấp ướt ở 1200C trong 4 giờ
giảm còn 370 ppb. Ở hàm lượng aflatoxin thấp (760 ppb) được hấp ở 1,5 atm
trong vòng một giờ đã phân hủy hoàn toàn aflatoxin .
Phương pháp sinh vật học
Hai phương pháp vật lý và hóa học có thể giảm lượng aflatoxin, tuy nhiên
hạn chế lớn nhất của 2 phương án này đó là làm giảm giá trị dinh dưỡng, giá trị
cảm quan, gây ô nhiễm môi trường cũng như chi phí đầu tư lớn. Do đó, hiện nay
người ta rất chú trọng sử dụng các tác nhân vi sinh để xử lý độc tố aflatoxin .
Trên thế giới cũng như trong nước có rất nhiều nghiên cứu sử dụng vi sinh vật để ức
chế sự phát triển của A. flavus và A. parasiticus cũng như giảm độc tố aflatoxin do
chúng sinh ra. Lactobacillus casei được nghiên cứu sử dụng kháng aflatoxin (Gourama
và ctv, 1997). Các chủng Enterococcus faecium, Rhodococcus erythropolis được
nghiên cứu sử dụng để giải độc tố AFB1(Ali và ctv, 2010; Alberts và ctv, 2006).
Rhizopus stolonifer phân hủy được aflatoxin G1. Rhizopus arrhizus có thể làm giảm
tính gây độc của aflatoxin B1. Một số chủng Aspergillus parasiticus cũng có thể
tác động lên aflatoxin qua hệ thống men của hệ sợi nấm. Một số chủng Saccharomyces
cerevisiae có tác dụng hạn chế ảnh hưởng xấu của aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi,
ngoài ra còn giúp tăng trọng và giảm bệnh đường tiêu hóa ở vật nuôi (theo Đậu Ngọc
Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). Bacillus subtilis đã được nghiên cứu rất nhiều
và có tiềm năng to lớn để ức chế tổng hợp aflatoxin từ nấm mốc Aspergillus flavus
và Aspergillus parasiticus.
2.2. Tổng quan về Bacillus subtilis
2.2.1. Lịch sử phát hiện và phân loại
Ban đầu vi khuẩn được đặt tên là Vibrio subtilis, sau đó Cohn mới đổi thành
Bacillus subtilis. Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941

14