XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY CỎ NGỌT (Stevia rebaudiana Bertoni)in vitroVÀ KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG CỦA CÂY CỎ NGỌT ex vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY CỎ NGỌT
(Stevia rebaudiana Bertoni)in vitroVÀ KHẢO SÁT
SỰ SINH TRƯỞNG CỦA CÂY CỎ NGỌT ex vitro

Ngành học:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện:

LÊ THỊ NHƯ QUỲNH

Niên khóa:

2010 – 2014

Tháng 12/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY CỎ NGỌT
(Stevia rebaudiana Bertoni)in vitroVÀ KHẢO SÁT

SỰSINH TRƯỞNG CỦA CÂY CỎ NGỌT ex vitro

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. TRẦN THỊ LỆ MINH

LÊ THỊ NHƯ QUỲNH

KS. TÔ THỊ NHÃ TRẦM

Tháng 12/2013


LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn đến:
Ban Giám hiệu trường đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiêm Bộ
môn Công nghệ Sinh học, cùng quý thầy cô tại trường đã tận tình giảng dạy, hướng
dẫn giúp đỡ tôi.
Cô Trần Thị Lệ Minh cùng cô Tô Thị Nhã Trầm hết lòng giúp đỡ và tận tình
hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp.
Cô chủ nhiệm Tôn Bảo Linh đã quan tâm giúp đỡ và tư vấn học tập cho tôi
trong suốt thời gian học đại học.
Toàn thể lớp DH10SH, các thành viên làm trong phòng nuôi cấy mô và các bạn
làm đề tài trong bộ môn đã chia sẻ, hỗ trợ giúp đỡ và động viên tôi trong thời gian học
tập và làm đề tài.
Con xin thành kính ghi ơn cha mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn
tạo mọi điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập.
Tp Hồ Chí Minh, ngày 7 tháng 12 năm 2014

Sinh viên

Lê Thị Như Quỳnh

i


TÓM TẮT
Cỏ ngọt (Stevia rebaudiana) là một loài cây thân thảo có nguồn gốc từ Châu
Mỹ, hiện trồng ở nhiều nơi trên thế giới được dùng để làm chất tạo ngọt và làm thuốc.
Hoạt chất chính trong cỏ ngọt là một glycoside có tên là steviol, chất này có độ ngọt
gấp 300 lần so với đường mía đặc biệt không sinh năng lượng nên được sử dụng rộng
rãi để điều trị các bệnh như đái tháo đường, cao huyết áp.Vì khả năng nảy mầm của hạt
thấp nên phương pháp nuôi cấy mô được cho là thích hợp cho nhân giống cây cỏ ngọt.
Trong nghiên cứu này, chồi cỏ ngọt in vitrosống và không bị nhiễm sau 3 tuần
nuôi cấy trên môi trường tạo chồi là môi trường MS có bổ sung 0,2 mg/l BA được cắt
thành từng đốt dài khoảng 1 cm có mang 2 chồi ngủ cấy chuyền vào môi trường nhân
chồi MS có sự kết hợp BA (0,0 - 3,0 mg/l) và Kn (0,1 mg/l). Sau 6 tuần nuôi cấy các
chồi được tách ra từ cụm chồi và cấy chuyền tạo rễ trên môi trường MS½ có bổ sung
NAA (0,0 - 1,0 mg/l).Khi cây đã phát triển hoàn chỉnh sau 3 tuần tạo rễ, cây cỏ ngọt
được đưa ra vườn ươm trồng khảo sát giá thể với hỗn hợp giá thể theo các tỉ lệ khác
nhau (đất sạch : phân trùn : mụn dừa : tro trấu).
Kết quả cho thấy ở thí nghiệm nhân chồi, cụm chồi cho số lượng chồi nhiều
nhất trên môi trường MS + 2,0 mg/l BA + 0,1 mg/l Kn với số lượng chồi trung
bìnhcao nhất là 5,84 chồi/mẫu, chiều cao trung bình chồi đạt 3,81 cm với số lá trung
bình là 6,31 lá. Qúa trình tạo rễ, rễ được cảm ứng hình thànhtốt nhất trên môi trường
MS½ có bổ sung 0,5 mg/l NAA với hệ rễ to khỏe thích hợp đưa ra vườn ươm số lượng
rễ trung bình là 8,27 rễ và chiều dài trung bình rễ là 1,58 cm. Cây cỏ ngọt in vitro hoàn
chỉnh có lá mở to, rễ phát triển và chiều cao cây trung bình đưa ra vườn ươm phát triển
tốt trên hỗn hợp giá thể bao gồm đất sạch : phân trùn : mụn dừa : tro trấu theo tỉ lệ 4 :

1 : 0 : 1 đạt tỉ lệ sống trung bình 73,33%.

ii


SUMMARY
Micropropagation of stevia(Stevia rebaudianaBertoni) and examinethe growth
ofsteviaexvitro.
Stevia (Stevia rebaudiana) is a herbaceous species originating from the
America, which is grown in many places in the world and used as sweetener and
medicine. The active ingredient in the sweet grass is a steviol glycoside called, this
substance is 300 times more sweetness than cane sugar is not particularly energy
should be widely used to treat diseases such as diabetes, high blood pressure.
Sincegerminationofseedsislow andtissue culturemethodssuitable forthefreshgrass.
In this study, fresh grass shoots after 3 weeks in vitro culture was cut into gas
bearing dormant buds subculture of shoots on MS medium is a combination
of BA (0.0 – 3.0 mg/l) and Kn (0.1 mg/l). After 6 weeks of culture, it were separated
from the shoots and buds subculture rooted in medium MS½ supplemented with
NAA (0.0 to 1.0 mg/l). When fully developed trees given nursery can cost survey with
different rates (soil : earthworm distribution : rice husk ash : coco peat).
The results showed that the number of buds for most shoots in MS medium +
2.0 mg/l BA + 0.1 mg/l Kn number is 5.84 with buds/sample, shoot height was
3.81 cm with an average number of leaves is 6.31. Roots to create the best medium
MS½ + 0.5 mg/l NAA with the most number of roots 8.27 and root length was
1.58 cm. In vitro stevia nursery complete version of mixtures developed on substrates
land: distribution worms : rice husk ash : coco peat in proportion 4: 1 : 1 : 0 reached
73.33% survival rate.

iii

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN.................................................................................................................. i 
TÓM TẮT....................................................................................................................... ii 
SUMMARY................................................................................................................... iii 
MỤC LỤC ..................................................................................................................... iv 
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................... vi 
DANH SÁCH CÁC BẢNG ......................................................................................... vii 
DANH SÁCH CÁC HÌNH .......................................................................................... viii 
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................1 
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................1 
1.2 Yêu cầu của đề tài......................................................................................................2 
1.3 Nội dung nghiên cứu .................................................................................................2 
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................3 
2.1 Giới thiệu về cây cỏ ngọt ...........................................................................................3 
2.1.1 Vị trí phân loại .......................................................................................................................... 3 
2.1.2 Nguồn gốc và phân bố ............................................................................................................. 3 
2.1.3 Đặc điểm hình thái ................................................................................................................... 3 
2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng .............................................................................................................. 4 
2.1.5 Các hợp chất có trong cây cỏ ngọt.......................................................................................... 6 
2.1.6 Giá trị của cây cỏ ngọt ............................................................................................................. 6 
2.2 Nhân giống vô tính ....................................................................................................7 
2.2.1 Khái niệm nhân giống in vitro ................................................................................................ 7 
2.2.2 Các giai đoạn nuôi cấy mô ...................................................................................................... 7 
2.2.3 Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng trong phát sinh hình thái .......................................... 8 
2.2.4 Hiện tượng thủy tinh thể ........................................................................................................ 10 
2.3 Vai trò của các loại giá thể ......................................................................................11 
2.3.1 Giá thể mụn dừa ..................................................................................................................... 11 
2.3.2 Giá thể tro trấu ........................................................................................................................ 11 

2.3.3 Phân trùn quế .......................................................................................................................... 12 
2.3.4 Giá thể đất sạch....................................................................................................................... 12 
iv


2.4 Những nghiên cứu trong nước và thế giới về cây cỏ ngọt .....................................12 
2.4.1 Nghiên cứu trong nước .......................................................................................................... 12 
2.4.2 Nghiên cứu ngoài nước ......................................................................................................... 13 
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................14 
3.1 Thời gian và địa điểm ..............................................................................................14 
3.2 Vật liệu nghiên cứu..................................................................................................14 
3.3 Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu ...............................................................................14 
3.4 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................15 
3.4.1Khảo sát tác động của môi trường đến sự nhân nhanh chồi cây cỏ ngọt in vitro ....... 15 
3.4.2Khảo sát sự tạo rễ của cây cỏ ngọt in vitro ........................................................................... 16 
3.4.3Khảo sát ảnh hưởng giá thể đến sự sinh trưởng của cây cỏ ngọt ex vitro ......................... 16 
3.5 Phương pháp xử lí số liệu ........................................................................................17 
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................18 
4.1 Khảo sát tác động của môi trường đến sự nhân nhanh chồi cây cỏ ngọt ................18 
4.2 Khảo sát khả năng tạo rễ của cây cỏ ngọt in vitro ..............................................22 
4.3 Khảo sát ảnh hưởng giá thể đến sự sinh trưởng của cây cỏ ngọt ex vitro ...............26 
5.1Kết luận.....................................................................................................................33 
5.2 Đề nghị ....................................................................................................................34 
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................35 

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2,4 - D

2,4 - dichlorophenoxyacetic acid

BA

Benzyladenin

NAA

Naphthalene acetic acid

IAA

3-indol-acetic acid

IBA

Indol-3-butyric acid

BAP

6-benzylaminopurine

MS

Môi trường Murashige và Skoog (1962)

Kn

N-(2-furanylmethyl)-1H-purine-6-amine

MS¼

Môi trường MS có thành phần đa lượng giảm 3/4

MS½

Môi trường MS có thành phần đa lượng giảm ½

2 – Pi

6-(3-methyl-2-butenylamino)purine

FAO

Tổ chức nông – lương Liên Hiệp Quốc

FDA

Cục quản lí thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ

CV

Coefficient of Variation - Độ biến thiên

Ctv

Cộng tác viên

vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của môi trường lên sự nhân nhanh chồi của cây cỏ ngọt in vitro ... 15
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của NAA lên sự tạo rễ của chồi cây cỏ ngọt in vitro .................16
Bảng 3.3 Thành phần và tỉ lệ hỗn hợp giá thể cho từng nghiệm thức ..........................17
Bảng 4.1 Số chồi mới hình thành trên môi trường có bổ sung BA và Kn 6 tuần nuôi cấy18
Bảng 4.2 Số rễ tạo ra trên môi trường có bổ sung NAA sau 3 tuần nuôi cấy...............22
Bảng 4.3 Tỉ lệ sống của cây cỏ ngọt in vitro sau 3 tuần………………………………….28
Bảng 4.4 Chiều cao và số lá của cây cỏ ngọt in vitro sau 3 tuần ..................................30

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cây cỏ ngọt ngoài vườn ươm BM công nghệ sinh học ĐH Nông Lâm ..........3
Hình 2.2 Các bộ phận của cây cỏ ngọt ...........................................................................4
Hình 4.1Chồi cỏ ngọt sau 3 tuần nuôi cấy trên các môi trường cảm ứng nhân nhanh chồi...19
Hình 4.2 Chồi cỏ ngọt nhân nhanh sau 6 tuần trên các môi trường .............................20
Hình 4.3 Sự khác biệt về hình thái của chồi cỏ ngọt sau 6 tuần ...................................21
Hình 4.4 Rễ cây cỏ ngọt in vitro sau 3 tuần nuôi cấy ...................................................24
Hình 4.5 Sự khác biệt hình thái cây cỏ ngọt sau 3 tuần tạo rễ......................................25
Hình 4.6 Cây cỏ ngọt ex vitro ngoài vườn ươm sau 3 tuần ..........................................27
Hình 4.7 Cây cỏ ngọt ex vitro sau 2 tuần ngoài vườn ươm. .........................................28
Hình 4.8Cỏ ngọt ex vitro trồng trên 2 giá thể khác nhau sau 2 tuần ngoài vườn ươm. ..29
Hình 4.9 Rễ cây cỏ ngọt ex vitro sau 2 tuần ngoài vườn ươm......................................30
Hình 4.10 Sự phát triển về chiều cao và số lá của cây cỏ ngọt ex vitro .......................31
Hình 4.11 Cỏ ngọt ex vitro 3 tuần trồng ngoài vườn ươm............................................32

viii


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cây cỏ ngọt có tên khoa học là Stevia rebaudiana Bertoni, thuộc họ cúc được
phát hiện và sử dụng cách đây hơn 1.500 năm ở Nam Mỹ, nhưng mãi đến thời gian
gần đây mới được cả thế giới quan tâm vì sự kì diệu của nó. Cây cỏ ngọt chứa hàm
lượng stevioside cao, chất này có độ ngọt gấp 300 lần đường sucrose, không lên men,
kháng khuẩn, có khả năng duy trì hàm lượng đường trong máu, cải thiện tiêu hóa, điều
tiết hoạt động của hệ mạch (Rafiq và ctv, 2007) và đặc biệt không sinh năng lượng, vô
hại với cơ thể nên có thể dùng trong chế độ ăn kiêng. Ngoài ra, cỏ ngọt còn sử dụng
cho người bị bệnh đái tháo đường, chống béo phì ở phụ nữ, chống ung thư. Trong
công nghiệp thực phẩm, chất stevioside là chất phụ gia để sản xuất bánh kẹo, nước giải
khát... Do đó, cỏ ngọt được xem là nguồn nguyên liệu quý giá trong tương lai.
Cây cỏ ngọt được trồng phổ biến nhiều nơi trên thế giới và được nhập vào Việt
Nam năm 1988. Ở nước ta hiện nay cỏ ngọt đang được khảo nghiệm ở nhiều vùng
khác nhau như: Hà Giang, Cao Bằng, Lâm Đồng, Đăk Lăk. Kết quả ban đầu thu được
rất khả quan, lợi nhuận thu được từ cây cỏ ngọt đạt 380 - 400 triệu/ha/năm. Trên thế
giới, Nhật Bản là nước trồng và tiêu thụcỏ ngọtchiếm40%thị trường chất ngọt còn
Trung Quốclà nước xuất khẩu cỏ ngọt lớn nhất thế giới. Ngoài ra, ở Mỹ cỏ ngọt được
sử dụng chủ yếu để thay thếđường.
Hiện nay, cỏ ngọt chủ yếu được nhân giống bằng hạt, giâm cành và chiết cành.
Tuy nhiên, việc nhân giống bằng hạt cũng như giâm cành và chiết cành còn nhiều
nhược điểm với tỉ lệ nảy mầm thấp, bị phân ly tính trạng, khó giữ được các đặc tính
quý giá, ưu việt của cây bố mẹ (Miyazaki và Wantenabe, 1974), hệ số nhân thấp và
cây dễ bị nhiễm bệnh từ cây mẹ. Vì thế, việc chọn ra nguồn giống tốt, có năng suất
cao, ổn định và sạch bệnh còn nhiều hạn chế.
Trong những năm trở lại đây phương pháp nhân giống in vitro được sử dụng

rộng rãi với nhiều ưu điểm như hệ số nhân giống cao, tiết kiệm thời gian, diện tích, tạo
cây trồng sạch, sản xuất được cây số lượng lớn với độ đồng đều cao. Vì vậy, nhân
giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật là công cụ rất tốt cho việc nhân
giống nhanh và nghiên cứu tạo giống mới, có thể khắc phục được các nhược điểm của
1


phương pháp nhân giống truyền thống không phù hợp trong sản xuất và mang lại lợi
nhuận. Do đó, đề tài “Xây dựng quy trình nhân giống cây cỏ ngọt(Stevia rebaudiana
Bertoni) in vitro và khảo sát sự sinh trưởng của cây cỏ ngọt ex vitro” được thực hiện.
1.2 Yêu cầu của đề tài
Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho khả năng nhân
chồi và tạo rễ của cây cỏ ngọt.
Tạo cây cỏ ngọt in vitro hoàn chỉnh nhằm cung cấp nguồn cây con khảo sát
giá thể ngoài vườn ươm.
Xác định thành phần tỉ lệ giá thể thích hợp cho sự sinh trưởng của cây cỏ
ngọt ngoài vườn ươm.
Xây dựng hoàn chỉnh quy trình nhân giống cây cỏ ngọt in vitro.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và Kn đến sự nhân nhanh chồi cây cỏ ngọt
in vitro nhằm mục đích tạo ra số lượng lớn chồi làm vật liệu cho quá trình tạo rễ.
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự hình thành rễ của cây cỏ ngọt
in vitro để tạo cây con hoàn chỉnh làm nguồn vật liệu khảo sát giá thể ngoài vườn ươm.
Khảo sát ảnh hưởng giá thể lên sự sinh trưởng của cây cỏ ngọt ex vitro nhằm
xác định loại giá thể phù hợp cho sự thuần hóa cây cỏ ngọt in vitro ngoài vườn ươm.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây cỏ ngọt
Tên thường gọi: cỏ ngọt, cỏ đường, cỏ mật
Tên khoa học: Stevia rebaudiana
2.1.1 Vị trí phân loại
Giới: plantae
Bộ: Asterales
Họ: Asteraceae
Tông: Eupatorieae
Chi: Stevia
Loài: Rebaudiana
Hình 2.1 Cây cỏ ngọt ngoài vườn ươmBộ
môn công nghệ sinh học ĐH Nông Lâm
Hiện nay đã phát hiện trên 100 loài thuộc chi stevia, nhưng chất ngọt
(glucoside) chỉ tìm thấy ở loài Stevia rebaudiana, không tìm thấy glucoside ở các loài
stevia khác.
2.1.2 Nguồn gốc và phân bố
Cỏ ngọt có nguồn gốc từ thung lũng Rio Monday nằm ở Đông Bắc Panama
Trung Mỹ. Vào thế kỷ 16, các thủy thủ người Tây Ban Nha đã từng đề cập tới loại
thảo mộc này nhưng đến năm 1888 các nhà thực vật học người Paraguay là Mises
Santiago Bertoni mới phân loại và chính thức đặt tên gọi là Stevia rebaudiana Bertoni.
Cỏ ngọt được trồng chủ yếu ở Paraguay, Brazil, Nhật Bản và Trung
Quốc.Chúng được nhập vào Việt Nam trồng khảo nghiệm từ năm 1988. Hiện nay, cỏ
ngọt đã thích ứng với những vùng khí hậu khác nhau của nước ta, cây sinh trưởng tốt
tại Lâm Đồng, Đắk Lắk, Hà Nội, Hà Tây, Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Yên Bái.
2.1.3 Đặc điểm hình thái
Cỏ ngọt thuộc cây thân thảo, là một loại cỏ sống lâu năm, 6 tháng sau khi trồng
gốc bắt đầu hoá gỗ, mỗi gốc có nhiều cành (nếu để mọc tự nhiên cây có thể cao đến
100 cm).Thân có tiết diện tròn, có rãnh dọc với nhiều lông mịn, phần gốc màu nâu,
phía trên màu xanh. Cành non và lá đều phủ lông trắng mịn, lá mọc đối, hình mũi mác,
3

dài 30 - 60 mm, rộng 15 - 30 mm, có 3 gân chính xuất phát từ cuống lá. Mép lá có
răng cưa ở nửa phần trên. Cụm hoa hình đầu, mỗi tổng bao có chứa 5 hoa nhỏ, tràng
hình ống, màu trắng ngà, có 5 cánh nhỏ. Hoa dài 10 - 12 mm, có hai vòi nhụy dài thò
ra ngoài, hoa có mùi thơm nhẹ (hình dáng giống hoa cỏ Lào nhưng nhỏ hơn nhiều),
mùa hoa từ tháng 10 năm trước đến tháng 2 năm sau (theo dương lịch). Toàn thân có
vị ngọt, nhiều nhất ở lá, lá già chết khô ở dưới nhưng cuống rất dai nên không rụng
(vẫn còn vị ngọt). Cỏ ngọt sinh sản hữu tính (gieo hạt) và vô tính (giâm cành) là loại
cây ưa ẩm, ưa sáng nhưng cây không chịu được ngập úng.

Hình 2.2Các bộ phận của cây cỏ ngọt
()

2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng
Mùa vụ: cỏ ngọt sinh trưởng quanh năm, nhưng cho năng suất cao nhất từ tháng
4 đến tháng 11 dương lịch. Trong điều kiện đất đai cho phép cây có thể được trồng từ
tháng 2, tháng 3 nhưng thời gian đầu cây sinh trưởng kém và thu hoạch thấp.
4


Làm đất: cỏ ngọt không kén đất để trồng nhưng cây cho năng suất cao nhất trên
loại đất thịt pha cát, tơi xốp và thoát nước. Cỏ ngọt cũng ưa loại đất chua, có pH từ
4 - 5, tuy nhiên cây cũng có thể trồng đất có pH từ 6 - 7 có khi pH lên tới 7,5. Tránh
trồng cỏ ngọt trên những loại đất sét và đất mặn.
Phân bón: cỏ ngọt là cây cho thu hoạch nhiều lứa trong năm vì vậy yêu cầu
lượng dinh dưỡng lớn. Sản phẩm thu hoạch là lá xanh nên bón phân nhiều sẽ cho năng
suất cao. Tuy nhiên cần bón cân đối giữa đạm, lân và kali, nếu bón nhiều đạm sẽ tăng
dư lượng nitrat trong lá, làm giảm chất lượng sản phẩm. Một loại phân hữu cơ rất tốt
để cung cấp dinh dưỡng trước khi trồng cỏ ngọt là dạng compost, compost thường

được sản xuất bằng cách ủ rác thải sinh hoạt.
Mật độ khoảng cách trồng cỏ ngọt tùy theo điều kiện từng nơi để bố trí khoảng
cách cây khác nhau cho phù hợp và thuận tiện cho việc chăm sóc. Sau khi trồng cần
tưới đủ ẩm, tránh để khô đất nhưng không tưới quá ẩm.Nếu có điều kiện sau khi trồng
nên phủ rơm rạ hoặc nilon để giữ ẩm cho cây và hạn chế cỏ dại.
Chăm sóc: cỏ ngọt yêu cầu đất tươi xốp, có độ thoáng cao do đó cần xới đất
thường xuyên đặc biệt ở giai đoạn đầu sau khi trồng cây còn yếu, sinh trưởng chậm.
Tưới tiêu: tùy theo độ ẩm mà có chế độ tưới tiêu thích hợp. Tốt nhất ở giai đoạn
cây con nên tưới phun sương, nhưng khi cây lớn thì nên tưới rãnh cây. Khi mưa nhiều
phải lập thức tháo nước cho cây tránh hiện tượng để cây bị chết éo.Cỏ ngọt ưa ẩm
nhưng lại không chịu được úng, để có năng suất cao nhất nên giữ độ ẩm 70 - 80%.
Ánh sáng: không được trồng cỏ ngọt trong bóng râm vì cây cỏ ngọt là cây ưa
sáng mạnh, cần phải được trồng ở những nơi có đủ ánh sáng mặt trời.
Nhiệt độ: cỏ ngọt là cây trồng nhiệt đới, sinh trưởng trong điều kiện mát mẻ. Có
thể sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ từ 15 - 300C, nhiệt độ thích
hợp nhất là 22 ± 20C.Nhiệt độ tối thích hợp cho sự nảy mầm của hạt là 200C.Từ 15 300C cây sinh trưởng khoẻ cho năng suất thu hoạch cao. Nhiệt độ> 350C cây sinh
trưởng kém.
Ẩm độ: Môi trường sống tự nhiên của cây cỏ ngọt thích hợp nhất là khí hậu cận
nhiệt đới, ưa ẩm ướt, với lượng mưa trung bình hàng năm từ 1400- 1600mm. Độ ẩm
thích hợp nhất cho sinh trưởng, phát triển là 70 - 85%. Cỏ ngọt thường mọc tự nhiên
trên các đầm lầy.

5


2.1.5 Các hợp chất có trong cây cỏ ngọt
Từ lá cỏ ngọt, người ta đã chiết xuất được trên 11 chất có hàm lượng và độ ngọt
khác nhau trong đó steviosidelà chất làm ngọt tự nhiên chính được chiết xuất từ lá
Stevia rebaudiana Bertoni (Brahmachari và ctv, 2011). Các hợp chất có trong cây cỏ
ngọt chiếm thành phần như sau: stevioside(48,9%), rebaudiosideA(24,4%),

rebaudioside C(9,8%), dulcoside A (5,6%)và các thành phần không xác định(11,3%)
(Yasukawa và ctv, 2002).
Theo các nhà nghiên cứu, chất stevioside (là một glucoside) có vị ngọt gấp
250 - 300 lần đường sucrose, nhưng chất stevioside không sinh năng lượng
(Chatsudthipong và Muanprasat, 2009).Trong cỏ ngọt khô (bao gồm cả cành và lá)
chứa khoảng 1,5% chất ngọt stevioside. Như vậy, 100g cỏ ngọt khô có lượng chất ngọt
tương đương 400 - 450g đường kính.
2.1.6 Giá trị của cây cỏ ngọt
Trong y học, cỏ ngọt được sử dụng như một loại trà an toàn cho bệnh nhân tiểu
đường vì nó không ảnh hưởng đến lượng đường trong máu (Alan, 2002; Mogra và
Dashore, 2009). Ngoài các đặc tính làm ngọt không chứa calo,cỏ ngọt còn có nhiều
đặc tính quan trọng kháctrong việc điều trị các bệnh nhân ung thư (Yasukawa và ctv,
2002), lợi tiểu (Lailerdetal, 2004), béo phì, cao huyết áp (Dyrskog và ctv, 2004).
Ngày nay, cỏ ngọt thường được dùng kết hợp với các loại thảo mộc khác trong các
thang thuốc y học dân tộc.
Trong công nghiệp thực phẩm, cỏ ngọt an toàn khi sử dụng như một chất làm
ngọt (Geuns, 2003)nó được dùng để pha chế làm tăng độ ngọt của các loại thực phẩm
khác nhau. Ngoài ra, người ta còn dùng để chế rượu màu, nước hoa quả, các loại bánh
kẹo, món tráng miệng đông lạnh, ướp các loại hải sản sấy khô, chế biến dấm.
Cỏ ngọt còn được dùng trong công nghệ chế biến mỹ phẩm như các loại sữa
làm mượt tóc, kem làm mềm da, vừa có tác dụng nuôi dưỡng tất cả các mô và giúp cơ
thể tái tạo làn da mới trên toàn bộ bề mặt da, vừa chống nhiễm khuẩn lại trừ được nấm.
Ngày 4 tháng 7 năm 2008 Tổ chức lương thực và nông nghiệp Liên Hợp Quốc
(FAO) phê chuẩn Cục quản lí dược và thực phẩm Mỹ FDA cho phép vào ngày 17
tháng 12 năm 2008 về việc sử dụng cây cỏ ngọt để chế xuất chất làm ngọt. Đường
chiết xuất từ cây cỏ ngọt đang trở thành mặt hàng thiết yếu và an toàn, cụ thể là các

6

hãng thực phẩm lớn trên thế giới như Cocacola, Pepsi, Cargill đang sử dụng đường cỏ
ngọt thay đường mía (Trích dẫn bởi Nguyễn Thị Nhật Lệ, 2013).
2.2 Nhân giống vô tính
2.2.1 Khái niệm nhân giống in vitro
Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức
nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều
kiện vô trùng.Môi trường có các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin,
các hormone tăng trưởng và đường (Dương Công Kiên, 2002).
Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như: lá,
hoa, thân và rễ. Phương pháp này có nhiều ưu điểm: tiết kiệm thời gian và diện tích, có
thể nhân giống các loài mà phương pháp nhân giống tự nhiên không cho phép hay
không thuận lợi, tạo cây sạch bệnh, dễ dàng chọn lọc cá thể, giảm chi phí sản xuất, sản
xuất quanh năm, tạo ra các dòng đột biến, tạo ngân hàng gen (Pierik, 1975;
Anonymous, 1980; Assche, 1983; Gebhard và ctv, 1983; Kunneman, 1984).
2.2.2 Các giai đoạn nuôi cấy mô
Nhân giống in vitro là quá trình phức tạp, phải qua nhiều giai đoạn (Trần Thị
Dung, 2003), để đạt được thành công trong nhân giống in vitro phải trải qua 5 giai
đoạn.
Giai đoạn 1: khử trùng mô mẫu cấy
Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống in
vitro.Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu ban đầu vô trùng để
đưa vào môi trường nuôi cấy.Vô trùng mẫu cấy là một thao tác khó, ít khi thành công
ngay từ lần đầu tiên.Tuy nhiên, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng
thích hợp thì sau vài lần thử sẽ đạt được kết quả tốt.
Giai đoạn 2: tái sinh mẫu nuôi cấy
Mục đích của giai đoạn này là sự tái sinh một cách có định hướng của các mô
cấy.Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỉ lệ các hợp chất auxin, cytokinin
ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy. Thường mô non, chưa phân hóa có khả năng
tái sinh cao hơn các mô trưởng thành đã chuyên hóa sâu.
Giai đoạn 3: nhân nhanh

Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình. Để tăng hệ số nhân,
ta thường thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng
7


(auxin, cytokinin, gibberellin) các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm
men kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Tùy thuộc vào từng đối tượng
nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành qua các cụm chồi
(nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các chồi nách (vi giâm cành) hoặc tạo
cây thông qua phôi vô tính.
Giai đoạn 4: tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giai
đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường 2 - 3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất
hiện rễ và trở thành cây con hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này người ta thường bổ sung vào
môi trường nuôi cấy các chất auxin là nhóm chất hormone thực vật quan trọng có chức
năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy.
Giai đoạn 5: đưa cây con ra đất
Giai đoạn đưa cây con hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của
quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này
trong thực tiễn sản xuất. Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị
dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh
(nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, giá thể) phù hợp để cây con đạt tỉ lệ sống cao trong vườn
ươm cũng như ruộng sản xuất.
2.2.3 Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng trong phát sinh hình thái
Có bốn nhóm chất điều hòa sinh trưởng quan trọng trong nuôi cấy mô thực vật:
auxin, gibberellin, cytokinin và acid abcisic. Cả auxin và cytokinin đều được bổ sung
vào môi trường nuôi cấy để kích thích sự phát sinh hình thái và tỉ lệ hormone sử dụng
để kích thích tạo chồi hay tạo rễ không giống nhau. Tùy theo giống, loài thực vật mà
nhu cầu về dạng, nồng độ của auxin và cytokinin khác nhau trong phát sinh hình thái
(Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).

 Vai trò của auxin
Auxin là chất kích thích sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong
nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của
môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và
điều hòa sự phát sinh hình thái đặc biệt là khi nó được sử dụng với cytokinin. Sự áp
dụng loại và nồng độ auxin trong các loại môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: kiểu
tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu, hàm lượng auxin nội sinh của mẫu nuôi
8


cấy, sự tác động qua lại giữa auxin nội sinh và auxin ngoại sinh (Nguyễn Đức Lượng
và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào. Các hormone của
nhóm này có hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng, tính hướng sáng, tính ưu
thế ngọn, kích thích ra rễ và phân hóa mạch dẫn. Tác động của auxin thường liên quan
tới độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ. Đối với nuôi cấy mô và tế bào thực vật thường
sử dụng nhóm auxin: IBA (Indoly Butyric Acid), IAA (Indoly Acetic Acid),
NAA (α – Naptalen Acetic Acid), 2,4 – D (Dichlorphenoxy Acetic Acid).
Các loại auxin IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường tạo rễ và phối hợp
với cytokinin cho môi trường ra chồi. NAA và 2,4 – D không bị biến tính trong môi
trường nuôi cấy.
Trong sự phát sinh hình thái (trên sự tạo chồi và tạo rễ): Khi nồng độ cytokinin
cao hơn auxin thì sẽ có sự tạo chồi từ mẫu cấy. Ngược lại, khi nồng độ auxin cao hơn
cytokinin hoặc khi xử lí với auxin thì rễ được hình thành.Trong sự tạo rễ thì lượng
cytokinin ngoại sinh sẽ là chất cản. Auxin cảm ứng sự tạo rễ là do nó có cảm ứng sự
tổng hợp polyamine (Friedman và ctv, 1985)
Trong sự tạo rễ thì nồng độ auxin cao cần để cảm ứng sự ra rễ nhưng để kéo dài
phác thể rễ (sơ khởi rễ) thì nồng độ auxin thấp là cần thiết.Vì vậy, trong điều kiện in
vitro khởi đầu cho sự tạo rễ bất định thường với nồng độ auxin cao sau đó nồng độ
giảm để phát triển phác thể rễ xảy ra.

 Vai trò của cytokinin
Cytokinin là dẫn xuất của adenine, hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia
tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Các cytokinin thường được sử dụng nhất là BAP (6-Benzyl Amino Purine), Kn, zeatin,
BA (6-Benzyl Adenine). Hàm lượng sử dụng các loại cytokinin dao động từ
0,1 - 0,2 mg/l. Ở nồng độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình
thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy.
BAP và Kn là các loại cytokinin tổng hợp kích thích mạnh mẽ sự phân chia tế
bào, tăng kích thước của tế bào và sinh tổng hợp protein. Cytokinin ngăn cản sự lão
hóa mô, thúc đẩy sự hình thành chồi non nhưng ức chế sự tạo rễ.Hầu hết các loại
cytokinin được sử dụng trong nuôi cấy chồi ở các loài thực vật khác nhau. BAP kích
thích sự tăng sinh chồi bên của Castanea (Vieitez, 1980) còn Kn thì kích thích sự tạo
9


chồi bên trong quá trình nuôi cấy chồi Prunus và để tăng sinh chồi cần phải sử dụng
đến BAP (Martinelli, 1985). Sự kết hợp BAP và Kn sẽ kích thích sự tạo chồi dạng hoa
hồng ở Brassica campestris trong nuôi cấy chồi. Ngoài ra trong nuôi cấy chồi Gynura
sarmentosa, BAP, Kn và 2 - Pi đều kích thích sự tạo chồi khi sử dụng riêng lẻ nhưng
mỗi chất đều gây ra sự bất thường ở vài chồi. Chồi được tạo ra khỏe mạnh và tăng
trưởng nhanh hơn khi phối hợp cả 3 chất cùng lúc (Caiiloux, 1978). Ở một số loài thực
vật, khi phối hợp một vài loại cytokinin với nhau thì sẽ làm tăng hiệu quả tăng sinh
chồi như Corylus avellana (Anderson, 1984; Cucumismelo Kathal và ctv, 1988).
Để kích thích sự tăng trưởng của chồi bên và làm giảm hiện tượng ưu thế ngọn
trong nuôi cấy chồi người ta bổ sung một hoặc một vài loại cytokinin vào trong môi
trường nuôi cấy ở giai đoạn 2. Cách này có thể cảm ứng sự tăng trưởng của một vài
chồi nhỏ từ mỗi mẫu cấy sau khoảng 4 - 6 tuần. Nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích
thích sự hình thành của nhiều chồi nhỏ nhưng những chồi này không thể kéo dài và
làm cho lá bị biến dạng hay làm cho chồi chứa nhiều nước.
Cản sự tạo rễ: nồng độ cytokinin cao (0,5 - 10 mg/l) thường cản hoặc làm chậm

sự tạo rễ (Schraudolf và Reinert, 1959; Harris và Hart, 1964; Ben-Jaacov và ctv, 1999)
đồng thời cũng cản sự tăng trưởng của rễ và cản hiệu quả kích thích tạo rễ của auxin
(Humphries, 1960). Vì vậy mà người ta không sử dụng cytokinin trong môi trường
kích thích sự ra rễ của chồi để tạo cây con (giai đoạn 3). Đôi khi người ta cũng cấy
chuyền một hoặc vài lần qua môi trường không có cytokinin để làm giảm lượng
cytokinin trong mô cấy.
2.2.4 Hiện tượng thủy tinh thể
Thân, lá phồng to chứa nhiều nước, cây có dạng trong. Đây là một dạng bệnh lí
thường thấy khi cây được nuôi trong môi trường mà việc trao đổi khí giữa cây và môi
trường bên ngoài bị dừng lại, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây đưa đến sự
chết của mô trong nuôi cấy (Trần Văn Minh, 1999).
Một số phương pháp hạn chế quá trình thủy tinh thể là giảm sự hút nước của
cây in vitro bằng cách tăng độ đường trong môi trường nuôi cấy hoặc dùng các chất có
áp suất thẩm thấu cao.Tránh gây tổn thương trên mẫu cấy hoặc tiếp xúc với mẫu cấy ít
nhất; Giảm nồng độ đạm trong môi trường nuôi cấy; Giảm C2H2 trong bình nuôi cấy
bằng cách thông gió tốt; Tăng cường ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy.

10


2.3 Vai trò của các loại giá thể
2.3.1 Giá thể mụn dừa
Mụn xơ dừa là một sản phẩm phụ từ việc chế biến chỉ xơ dừa, nó chính là phần
còn lại sau khi tước lấy chỉ xơ dừa, mụn xơ dừa có khả năng giữ một trữ lượng nước
rất lớn. Trong vỏ dừa, tính theo trọng lượng khô có 19% là lớp vỏ ngoài, 34% mụn
dừa và 47% là xơ dừa.
Mụn xơ dừa có đặc tính xốp, thoáng khí khả năng giữ ẩm cao, lưu giữ được
chất dinh dưỡng cho đất, có khả năng giữ được nước gấp 8 lần khối lượng. Khác với
than bùn và một số vật liệu khác thường có khuynh hướng dẹp xuống khi bị ướt trong
khi mụn dừa lại có tính đàn hồi cao, không dẹp xuống khi bị ướt cũng như co rút lại

khi bị khô, nhờ đó mà giữ ẩm tốt, lượng nước thoát ra không nhiều, đồng thời lưu giữ
được chất dinh dưỡng và phân bón.
Thành phần hóa lí của mụn xơ dừa: pH5,5 - 6,5,tỷ lệ C : N80 : 1,độ xốp10 – 12%,chất
hữu cơ94 – 98%, cellulose20 – 30%,lignin60 – 70%,tanin8,0 - 8,5% (Nguồn: Nguyễn
Ngọc Phương, 2006).

2.3.2 Giá thể tro trấu
Trấu là lớp vỏ ngoài cùng của hạt lúa và được tách ra trong quá trình xay
xát.Trong vỏ trấu chứa khoảng 75% chất hữu cơ dễ bay hơi sẽ cháy trong quá
trình đốt và khoảng 25% còn lại chuyển thành tro (Energy Efficiency Guide for
Industry in Asia). Sau khi đốt, tro trấu có chứa trên 80% là SiO2, đây là thành
phần được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực.
Vỏ trấu đốt thành tro tồn tại trong đất, nhờ đó đất tơi xốp, vừa tạo đổ ẩm vừa
thoát nước cho cây, tạo môi trường phát triển thuận lợi cho các hệ sinh vật hoạt động
giúp cải tạo đất bạc màu và có nhiều dưỡng chất cho cây trồng phát triển tốt hơn.
Chi phí sản xuất tro trấu thấp, giá thành mua tro trấu rẻ góp phần giảm chi phí
đầu vào. Do đó, tro trấu mang lại lợi nhuận thực tế cao hơn so với sử dụng các loại giá
thể khác. Tro trấu được dùng làm giá thể để sản xuất rau sạch, rau an toàn không cần
đất, để sản xuất cây giống rau, hoa hoặc để trồng cây cảnh.
Thành phần hóa học của tro trấu: SiO2 (90,75%)K2O (1,34%) Na2O(0,67%) CaO
(1,04%)MgO

(0,56%)MKN(3,10%)

K2 O

)

11

(1,34%)Fe2O3

(0,48%)(Nguồn:


2.3.3 Phân trùn quế
Phân trùn là một loại phân hữu cơ 100% được tạo thành từ các chất thải hữu cơ
sau khi qua ống tiêu hóa của con trùn quế. Nguồn nguyên liệu làm thức ăn cho trùn
quế rất đa dạng (phân gia súc, xác bã thực vật, rác thải gia đình). Chất lượng của phân
trùn tùy thuộc vào nguồn nguyên liệu thức ăn cho trùn. Phân trùn chứa một lượng vi
sinh vật có hoạt tính cao như vi khuẩn, nấm mốc đặc biệt là hệ vi khuẩn cố định đạm
tự do (Azotobacter), vi khuẩn phân giải lân, phân giải cellulose và chất xúc tác sinh
học.
Phân trùn có thể được sử dụng như thành phần của đất để ươm cây trồng. Có
tác dụng kích thích sự nảy nầm và giúp cây con khỏe mạnh. Phân trùn cũng có thể
xem như phân bón hữu cơ cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng và cải tạo đất.Phân trùn
giàu những chất dinh dưỡng hòa tan trong nước và chứa hơn 50% chất mùn được tìm
thấy trong lớp đất mặt có thể được cây trồng sử dụng ngay. Ngoài ra, phân trùn còn
cung cấp các chất khoáng cần thiết cho sự phát triển của cây trồng như N, P, K và
khoáng vi lượng.
2.3.4 Giá thể đất sạch
Đất sạch là một loại đất trồng được sản xuất từ mụn dừa, qua quá trình xử lí
công nghiệp kết hợp vi sinh tạo thành một loại chất trồng hữu cơ. Thành phần phối
trộn tạo nên đất sạch là khác nhau như tro trấu, xơ dừa, phân bò hoai mục, phân trùn
quế, đất màu tự nhiên, than bùn tùy theo tỉ lệ của nhà sản xuất.Đất sạch có các đặc tính
ưu việt: tơi xốp, thoáng khí, dễ thấm nước, giữ ẩm cao, không mang mầm bệnh, chứa
nhiều vi sinh vật có lợi cho đất, sau 6 tháng sử dụng đất trở nên mùn, đặc biệt đất sạch
có tính giữ ẩm cao hơn 9 lần so với đất thông thường.
2.4 Những nghiên cứu trong nước và thế giới về cây cỏ ngọt
2.4.1 Nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, từ những thập niên 90 đã có những nghiên cứu về cây cỏ ngọt.
Trong cùng một giống thu hoạch ở các thời vụ khác nhau sẽ cho hàm lượng chất
stevioside khác nhau. Năm 1995, giống cỏ ngọt St-88 được Bộ Nông nghiệp và Phát
triển nông thôn công nhận là giống quốc gia (Trần Đình Phong, 1996; Mai Thị Phương
Anh,1992; Liakhovkin, 1993).
Nghiên cứu về khả năng nhân giống cây cỏ ngọt cho thấy hạt cỏ ngọt có khả
năng nảy mầm tốt nếu để giống ở vùng cao và lạnh. Nhân giống cỏ ngọt bằng phương
12


pháp vô tính cho thấy trong môi trường MS thạch lỏng cây con sinh trưởng nhanh, tỉ lệ
sống cao, tạo nhiều chồi và rễ (Nguyễn Thị Hằng và Mai Thị Phương Anh, 1992).
Năm 2011, Lê Thục Anh phối hợp với Công ty cổ phần Stevia Venturues cùng
nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất cây giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế
bào tại Trung tâm nghiên cứu cây trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội.
2.4.2 Nghiên cứu ngoài nước
Theo thống kê trên thế giới có khoảng 300 sáng chế nghiên cứu về cây cỏ ngọt
và chất tạo ngọt trong cây này. Ovodio Rebaudi (1900) đã cô lập thành công hai loại
hợp chất từ cây cỏ ngọt: chất có vị ngọt và chất có vị đắng (hậu ngọt). Tiếp đó,
Reseback (1908) và Dieterich (1909) đã chiết xuất được glucoside từ lá cỏ ngọt nhưng
tới năm 1931 thì Bridel và Lavieille mới xác định và tinh chế được stevioside (Trích
dẫn bởi Nguyễn Thị Thanh Tâm, 2013).
Năm 1986, Miyagawa và cộng tác viên đã thực hiện nghiên cứu và rút ra được
kết luận: chồi non cỏ ngọt được tái sinh trên môi trường GamborgB5có chứaBAPvà
NAA. Sau đó, rễ được tạo thànhphát triển thànhcây controng vòng 2hoặc3 tuần trên
môi trườngGamborgB5có chứa0,02 mg/lBAPvà2% sucrose. Tiếp theo đó, theo nghiên
cứu Ferreira và Handro (1988) đã ghi nhận mô sẹo từ lá cỏ ngọt được tạo thành tốt trên
môi trường có chứa 2,0 mg/lBA trong điều kiện ánh sáng và 2,0 mg/l BA + 2,0 mg/l
NAAtrong điều kiện tối. Chồi được tái sinh từ mô sẹo trên môi trường có bổ sung 0,1
mg/lBA cho kết quả tốt.Trong khi đó, kết quả nghiên cứu môi trường MS có bổ sung

kết hợp BAP (2,0-3,0 mg/l) và NAA (2,0 mg/l) cho thấy môi trường có chứa 2,0 mg/l
BAP + 2,0 mg/l NAA là tốt nhất cho cảm ứng mô sẹo. Rễ cỏ ngọt tạo ra tốt hơn trên
môi trường MS¼bổ sung 0,1mg/l IBA (Patel và Shah, 2009).Năm 2010, Pratibha
Gupta và cộng tác viên đã nghiên cứu thành công quá trình tạo ra mô sẹo của cây cỏ
ngọt. Nghiên cứu đã cho thấy việc tạo thành mô sẹo từ đốt thân hiệu quả nhất trong
môi trường MS có chứa 5 mg/l Kn. Sau đó, năm 2011 Mohamed và cộng tác viên đã vi
nhân giống cây cỏ ngọt thành công từ các đốt thân của cây. Sự tạo thành chồi non
được chứng minh là hiệu quả nhất ở môi trường MS có chứa 2,0 mg/l BA và 0,5 mg/l
Kn. Sự kéo dài chồi hiệu quả sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có sự kết hợp
giữa 0,5 mg/l BA và 1,0 mg/l Kn.

13


Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm
Đề tài được thực hiện từ tháng 7/2013 đến tháng 12/2013 tại phòng thí nghiệm
nuôi cấy mô Bộ môn Công nghệ Sinh học - trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
Mẫu thí nghiệm được tiến hành trên giống cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana) in
vtro sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường tạo chồi.

Hình 3.1 Chồi cỏ ngọt in vitro trên môi
trường tạo chồi 3 tuần cấy
3.3 Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
Thiết bị và dụng cụ: máy đo pH, cân điện tử, tủ cấy, nồi hấp, dàn sáng, dao,
kéo, pence, đèn cồn, chai thủy tinh, đĩa petri, tủ lạnh.
Hóa chất: chất điều hòa sinh trưởng (BA, Kn, NAA), các chất pha môi trường
MS (các chất trong môi trường MS được nêu ở phần phụ lục 1).

14


3.4 Phương pháp nghiên cứu
Môi trường MS cơ bản bổ sung 8 g/l agar, 30 g/l đường, pH 5,7 - 5,8 trước khi
hấp khử trùng được dùng làm môi trường nuôi cấy cơ bản cho các thí nghiệm nuôi cấy
cây cỏ ngọt in vitro. Môi trường được đặt trong chai thủy tinh 500 ml, mỗi chai chứa
50 ml. Hấp khử trùng trong autoclaver ở 121oC trong 20 phút.
Các thí nghiệm nuôi cấy in vitrocây cỏ ngọt được tiến hành trong điều kiện:
nhiệt độ25± 2oC, thời gian chiếu sáng 16 - 18 giờ, cường độ chiếu sáng
40 - 45 µmol/m2/s, độ ẩm tương đối 70- 75%. Các điều kiện về nhiệt độ, độ ẩm, cường
độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng sẽ được giữ ổn định trong suốt thời gian thí nghiệm.
3.4.1 Khảo sát tác động của môi trường đến sự nhân nhanh chồi cây cỏ ngọt in vitro
Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ BA và Kn thích hợp cho sự nhân
nhanh chồi cây cỏ ngọt, tạo nguồn vật liệu cho thí nghiệm tạo rễ nhằm tạo ra cây cỏ
ngọt in vitro hoàn chỉnh.
Phương pháp tiến hành: mẫu thân của cây cỏ ngọt in vitro sống và không bị
nhiễm sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường tạo chồi (MS + 0,2 mg/l BA) được cắt
thành từng đốt nhỏ dài khoảng 1 cm, mỗi đoạn thân mang hai chồi ngủ được cấy
chuyền vào môi trường MS có bổ sung BA với nồng độ 0,0- 3,0 mg/l và Kn có nồng
độ 0,1 mg/l.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bao gồm 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được
thực hiện lặp lại 3 lần (3 chai/nghiệm thức/lần lặp lại), mẫu được cấy với số lượng
3 mẫu/chai. Tổng số mẫu sử dụng cho thí nghiệm 189 mẫu (27 mẫu/nghiệm thức).
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của môi trường lên sự nhân nhanh chồi của cây cỏ ngọt in vitro
Nghiệm thức
Đối chứng

Môi trường
MS

BA (mg/l)
0,0

Kn (mg/l)
0,0

A1

MS

0,5

0,1

A2

MS

1,0

0,1

A3

MS

1,5

0,1

A4

MS

2,0

0,1

A5

MS

2,5

0,1

A6

MS

3,0

0,1

15