XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC – MSMS (Liquid Chromatography – Mass SpectrometryMass Spectrometry)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

 
 
 
 

 
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH TRONG THỨC ĂN
CHĂN NUÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC – MS/MS (Liquid
Chromatography – Mass Spectrometry/Mass Spectrometry)
 
 
  
Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN THỊ KIM NGÂN

Niên khóa

: 2008 - 2012

 
 

 
 
 

 
 
Tháng 07 năm 2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

 
 
 
 

 
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
 
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH TRONG THỨC ĂN
CHĂN NUÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC – MS/MS (Liquid
Chromatography – Mass Spectrometry/Mass Spectrometry)
 
 
Hướng dẫn khoa học  

Sinh viên thực hiện

ThS. PHÙNG VÕ CẨM HỒNG

NGUYỄN THỊ KIM NGÂN

ThS. NGUYỄN VĂN SANG

 
 
 
 
 

Tháng 07 năm 2013
ii

 


LỜI CÁM ƠN
Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cô Phùng Võ Cẩm Hồng.
Cảm ơn Cô đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên và truyền đạt những kiến thức
quí báu để em có thể hoàn thành bài khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn tất cả các Thầy Cô bộ môn Công nghệ sinh học
trường Đại Học Nông Lâm -TPHCM đã tận tụy giảng dạy cho em trong những năm
học tập ở trường.
Với tất cả lòng thành, tôi trân trọng nhớ ơn ThS. Phùng Võ Cẩm Hồng và ThS.
Nguyễn Văn Sang đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong
suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi chân thành cám ơn các anh chị trong Trung Tâm Kĩ Thuật Tiêu Chuẩn Đo
Lường Chất Lượng 3 đã tận tình hướng dẫn tôi trong thời gian thực hiện đề tài tại

Trung tâm.
Tôi cám ơn tập thể lớp DH08SH đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt
thời gian làm đề tài.
Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo
điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập.
Tôi xin chân thành cảm ơn bạn Mỹ Hạnh, Thùy Dung, Thị Hoa, Kim Thoa đã
động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Tp.Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2013
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Kim Ngân

iii

 


TÓM TẮT
Ngày nay, chất kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong ngành nông nghiệp như
chăn nuôi, trồng trọt, nuôi trồng thủy hải sản,.... có tác dụng rất lớn là giúp cho vật
nuôi cây trồng chống lại bệnh tật từ vi sinh vật. Tuy vậy, chất kháng sinh như một
con dao hai lưỡi. Một mặt giúp sinh vật chống lại bệnh tật, mặt khác, có thể làm cho
sinh vật xuất hiện phản ứng phụ, và đặc biệt là lượng chất kháng sinh tồn dư trong
sinh vật có thể ảnh hưởng đến chất lượng thực phẩm, nhất là sức khỏe người tiêu
dùng. Vì vậy, việc phân tích kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi đã trở nên cấp thiết
cho người sử dụng.
Phương pháp phân tích kháng sinh sử dụng hệ thống sắc ký lỏng khối phổ hai
lần (Liquid Chromatography – Mass Spectrometry/Mass Spectrometry) (hãng
Waters) được thực hiện để xác định hàm lượng 18 loại kháng sinh (Arsanilic,
Roxarsone, Virginiamycin, Clopidol, Lasalocid, Monensin, Nitarsone, Salinomycin,
Narasin, Amprolium, Tylosin, Decoquinate, Licomycin, Bacitracin, Oxytetracyline,

Chlotetracyline, Sulfadimethoxin, Tetracycline) trong các mẫu thức ăn chăn nuôi.
Đề tài: “Xác định hàm lượng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi bằng phương
pháp LC – MS/MS” được tiến hành tại phòng Sắc ký – Quang phổ thuộc Trung tâm
Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 3 từ tháng 02/ 2012 đến tháng 06/2012,
với mục đích: Khảo sát định tính và định lượng 18 loại kháng sinh có trong mẫu thức
ăn chăn nuôi, từ đó tối ưu hóa quy trình phân tích các loại kháng sinh trên những nền
mẫu thức ăn khác nhau.
Đề tài đã đạt được những kết quả sau: hiệu suất thu hồi của phương pháp là khá
cao nằm trong khoảng 87 % đến 115%, kết quả cho độ lặp lại tốt, giới hạn phát hiện
(LOD) của phương pháp trên các loại kháng sinh là khá thấp, khoảng từ 0,2 – 2,2
µg/kg, hàm lượng các loại kháng sinh nằm trong khoảng 0,5 – 17,6 µg/g.
Từ những kết quả đạt được ở trên, chúng tôi thấy rằng việc xác định hàm lượng
kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp LC – MS/MS kết hợp với quy
trình xử lý mẫu hợp lý cho kết quả khá chính xác. Phương pháp này có thể đưa ra để
phân tích các mẫu thật.

iv

 


SUMMARY
Thesis: "Determination of antibiotics in animal feed by LC - MS / MS method"
was conducted at Chromatography - Spectroscopy room of Quatest 3 from Feb 2012
to Jun 2012.
Today, antibiotics are widely used in agriculture such as animal husbandry,
horticulture, aquaculture seafood .... to help for pets fight the disease from growing
microorganisms. However, antibiotics are such as a double-edged sword. On the one
hand help to fight disease organisms, on the other hand, can make the creature appear
side - effects, and particularly residues of antibiotics in animals can affect food

quality, especially health consumers. Therefore, the analysis of antibiotics in animal
feed has become imperative for the user.
The analysis of antibiotics using Liquid Chromatography - Mass Spectrometry/
Mass Spectrometry) system was performed to determine eighteen antibiotics
(Arsanilic, Roxarsone, Virginiamycin, Clopidol, Lasalocid, Monensin, Nitarsone,
Salinomycin, Narasin, Amprolium, Tylosin, Decoquinate, Salinomycin, Bacitracin,
Oxytetracyline, Chlotetracyline, Sulfadimethoxin, Tetracycline) in animal feed.
The results were achieved: the recovery of the method is quite high in the range
of 87% to 115%, the results for good repeatability, limit of detection (LOD) of the
method is quite low, from 0.2 – 2.2 µg/kg, concentration of antibiotics in the range of
0.5 – 17.6 µg/g.
From the above results has been shown that antibiotics content is determined by
LC–MS/MS method with the processing of samples according appropriate procedure
for quite accurate result. This method can provide for the analysis of real samples.
Key words: Antibiotics, LC-MS/MS

v

 


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ....................................................................................................................... i
Tóm tắt ........................................................................................................................... iv
Summary ........................................................................................................................ iv
Mục lục ......................................................................................................................... ivi
Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................ vii
Danh sách các hình ...................................................................................................... viii
Danh sách các bảng ....................................................................................................... ix

Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................ i
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2. Yêu cầu ..................................................................................................................... ii
1.3. Nội dung thực hiện ................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1. Giới thiệu chung về kháng sinh .............................................................................. iii
2.1.1. Khái niệm kháng sinh ............................................................................................ 3
2.1.2. Phân loại kháng sinh ..............................................................................................3
2.1.3. Sử dụng kháng sinh ...............................................................................................5
2.1.3.1. Tình hình sử dụng kháng sinh ở Việt Nam và một số nước trên thế giới .......... 5
2.1.3.2. Các trường hợp sử dụng kháng sinh ................................................................... 5
2.1.3.3. Tiêu chí lựa chọn kháng sinh ............................................................................. 5
2.1.3.4. Các vấn đề tồn tại khi sử dụng kháng sinh không đúng ..................................... 5
2.1.4. Lợi ích của sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi và cơ chế tác động .......6
2.1.4.1. Lợi ích của việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi ...........................6
2.1.4.2. Cơ chế tác động của kháng sinh như chất kích thích tăng trưởng......................6

vi

 


2.1.4.3. Mặt trái của kháng sinh ......................................................................................7
2.2. Phương pháp sắc ký ..................................................................................................9
2.2.1. Lịch sử phương pháp sắc ký ..................................................................................9
2.2.2. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký ...........................................................10
2.2.3. Phân loại sắc ký ................................................................................................... 10
2.3. Giới thiệu về hệ thống LC-MS/MS API 4000 được dùng trong nghiên cứu ......... 11
2.3.1. LC Agilent 1200 .................................................................................................. 11
2.3.2. Khối phổ API 4000 .............................................................................................. 12

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................17
3.1. Thời gian, địa điểm thực hiện đề tài .......................................................................17
3.2. Vật liệu nghiên cứu................................................................................................. 17
3.3. Chuẩn bị dung dịch chất chuẩn làm việc ................................................................ 18
3.4. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 20
3.4.1. Phương pháp phân tích kháng sinh...................................................................... 21
3.4.2. Tối ưu hóa các thông số kỹ thuật của hệ thống LC – MS/MS ............................ 23
3.4.2.1. Điều kiện phân tích các kháng sinh thuộc nhóm 1 .......................................... 23
3.4.2.2. Điều kiện phân tích các loại kháng sinh thuộc nhóm 2 ....................................24
3.5. Xử lý kết quả ..........................................................................................................25
3.5.1. Xử lý định tính.....................................................................................................25
3.5.2. Xử lý định lượng .................................................................................................25
3.5.3. Khảo sát hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích ............................................. 26
3.5.4. Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) ....................27
3.5.4.1. Định nghĩa LOD, LOQ .....................................................................................27
3.5.4.2.Cách xác định giới hạn LOD, LOQ...................................................................27
3.5.5. Khảo sát trên mẫu thật .........................................................................................27
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................28
4.1. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của các loại kháng sinh ......................................... 28
vii

 


4.2. Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích ....................................29
4.3. Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp .....34
4.4. Kết quả khảo sát trên mẫu thật ............................................................................... 35
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 36
5.1. Kết luận................................................................................................................... 36
5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................37

 
 
 

 

 
 
 
 
 

viii

 


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ACN:

Acetonnitril

BMCNSH: Bộ môn Công nghệ Sinh học
CE:

Collision Energy

CN:

Chăn nuôi

CNSH–MT: Viện Công nghệ Sinh học – Môi trường
CXP:

Collision Cell Exit Potential

DP:

Declustering Potential

ĐTL:

Độ tái lặp

EDTA:

Etilendiamin tetraacetic acid

GC:

Gas Chromatography

GTTB:

Giá trị trung bình

HPLC:

High Performance Liquid Chromatography

ISO:

International Standard Organization

KS:

Kháng sinh

LC:

Liquid Chromatography

LC–MS/MS: Liquid Chromatography – Mass Spectrometry/Mass Spectrometry
LOD:

Limit of Detection

LOQ:

Limit of Quatitative

SD:

Standard

SK – QP:

Sắc ký – Quang phổ

S/N:

Signal to noise

TA:

Thức ăn

TCVN:

Tiêu chuẩn Việt Nam

 
 
 

ix

 


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Hệ thống LC-MS/MS API 4000 ............................................................... 11
Hình 2.2 Nguồn ion Turbo V ................................................................................... 12
Hình 2.3 Sơ đồ bộ phân tích khối của khối phổ API 4000 ...................................... 13
Hình 2.4 Hình 1 tứ cực ............................................................................................ 14
Hình 2.5 Hình bộ ghi tín hiệu của khối phổ API 4000 ............................................ 15
Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt các bước thực nghiệm ........................................................ 20
Hình 3.2 Quy trình xử lý mẫu thức ăn chăn nuôi .................................................... 22

 
 
 

x

 


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Hàm lượng kháng sinh cho phép trong thức ăn hỗn hợp cho lợn ............ .8
Bảng 2.2 Hàm lượng kháng sinh cho phép trong thức ăn hỗn hợp cho gà .............. .9
Bảng 3.1 Các chất chuẩn dùng trong việc xác định hàm lượng kháng sinh ............ 18
Bảng 3.2 Cách pha dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian ........................................ 19
Bảng 3.3 Cách pha dung dịch chuẩn làm việc ......................................................... 20
Bảng 3.4 Chương trình đẳng dòng thành phần pha động ........................................ 23
Bảng 3.5 Điều kiện khối phổ của 9 loại kháng sinh nhóm 1 ................................... 24
Bảng 3.6 Chương trình đẳng dòng thành phần pha động ........................................ 24
Bảng 3.7 Điều kiện khối phổ của 9 loại kháng sinh nhóm 2 ................................... 25
Bảng 4.1 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của các loại kháng sinh ........................... 28
Bảng 4.2 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của quy trình (thêm chuẩn 50 ppb) ... 30
Bảng 4.3 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của quy trình (thêm chuẩn 100 ppb) . 31
Bảng 4.4 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của quy trình (thêm chuẩn 200 ppb) . 32
Bảng 4.5 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích ...................... 33
Bảng 4.6 Kết quả khảo sát LOD, LOQ của phương pháp ....................................... 34
Bảng 4.7 Kết quả khảo sát hàm lượng các loại kháng sinh trong mẫu thật ............. 35

xi

 


Chương 1 MỞ ĐẦU
 

1.1. Đặt vấn đề
Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học hiện đại, vi sinh vật học công
nghiệp - một nhánh có vai trò hết sức trọng yếu trong ngành công nghệ sinh học đã
thu được rất nhiều thành tựu to lớn trong sản xuất sinh khối, dược phẩm, các chất
điều vị thực phẩm...sử dụng trong công nghiệp, y, dược học, nông nghiệp ...nhờ vi
sinh vật –bộ máy sản xuất sinh khối kì diệu.
Hiện đã biết trên 8000 chất kháng sinh và mỗi năm có khoảng vài trăm chất
kháng sinh mới được phát hiện. Trong tương lai chắc chắn còn có nhiều chất kháng
sinh khác nữa cũng sẽ được tìm ra vì đa số các vi sinh vật có khả năng tạo thành chất
kháng sinh đã được nghiên cứu cho tới nay đều chỉ thuộc về các chi Streptomyces và
Bacillus. Nhiều nhà nghiên cứu về các chất kháng sinh tin rằng sẽ có nhiều chất
kháng sinh mới được phát hiện nếu tìm thêm ở các nhóm vi sinh vật khác. Mặt khác
các kỹ thuật của công nghệ di truyền sẽ cho phép thiết kế một cách nhân tạo các chất
kháng sinh mới khi mà các chi tiết về bản đồ gen của các vi sinh vật sản sinh chất
kháng sinh đã được biết rõ.
Ngày nay, chất kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong ngành nông nghiệp như
chăn nuôi, trồng trọt, nuôi trồng thủy hải sản,.... có tác dụng rất lớn là giúp cho vật
nuôi, cây trồng chống lại bệnh tật từ vi sinh vật. Tuy vậy, chất kháng sinh như một
con dao hai lưỡi. Một mặt giúp sinh vật chống lại bệnh tật, mặt khác, có thể làm cho
sinh vật xuất hiện phản ứng phụ, và đặc biệt là lượng chất kháng sinh tồn dư trong
sinh vật có thể ảnh hưởng đến chất lượng thực phẩm, nhất là sức khỏe người tiêu
dùng.
Với một lượng thực phẩm khổng lồ từ động vật đang được tiêu thụ trên thị
trường, song ít ai nghĩ đến việc mỗi ngày trong cơ thể chúng ta đang phải tích lũy dần

dần dư lượng chất kích thích tăng trọng và thuốc kháng sinh trong từng miếng thịt
động vật của các loại sản phẩm này. Bởi trong chăn nuôi gia súc, gia cầm hiện nay,
người dân sử dụng rất tùy tiện các loại thức ăn tăng trọng và thuốc kháng sinh nhằm
ngăn ngừa, trị bệnh và giúp vật nuôi mau ăn chóng lớn. Hậu quả là dư lượng chất
kích thích và thuốc kháng sinh trong thịt gia súc, gia cầm vượt ngưỡng cho phép gấp


nhiều lần, tuy không gây ngộ độc cấp tính tức thời, nhưng sẽ gây nguy hại về lâu dài
cho sức khỏe của người tiêu dùng.
Vì những vấn đề cấp thiết trên, đề tài: “Xác định hàm lượng kháng sinh trong
thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp LC-MS/MS” được thực hiện.
1.2. Yêu cầu
Thao tác thực hiện thí nghiệm chính xác
Xử lý mẫu đưa vào phân tích có độ tinh sạch cao
Sử dụng hệ thống LC-MS/MS để tiến hành xử lý và phân tích các mẫu thức ăn
chăn nuôi tại phòng Sắc ký-Quang phổ thuộc Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường
chất lượng 3
1.3. Nội dung thực hiện
Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn 5 điểm của 18 loại kháng
sinh ở các nồng độ khác nhau cho độ tuyến tính cao để quá trình phân tích định lượng
kháng sinh trong các mẫu thức ăn chăn nuôi được phân tích bằng thiết bị LC-MS/MS
đạt kết quả chính xác và sai số trong mức cho phép.
Định lượng kháng sinh có trong mẫu thử để xác định hiệu suất thu hồi nhằm
đánh giá độ đúng, độ lặp lại và độ tái lặp của quy trình phân tích.
Nhằm đánh giá độ nhạy của phương pháp, đề tài khảo sát giới hạn phát hiện và
giới hạn định lượng.
Khảo sát trên một số mẫu nền thực tế khi các điều kiện phân tích đã tối ưu.

ii

 


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về kháng sinh
2.1.1. Khái niệm kháng sinh
Kháng sinh (antibiotics) là những chất chuyển hóa vi sinh vật hay chất tương
đồng tổng hợp, hoặc chất tổng hợp không liên quan đến những chất thiên nhiên, ở
liều nhỏ các chất này ức chế sự phát triển và sống sót của vi sinh vật mà không có
độc tính trầm trọng trên ký chủ.
Năm 1909 nhà vật lý học người Đức (Paul Ehrlich) đã tạo ra một chất và đặt tên
là Salvarsan dùng điều trị bệnh giang mai rất có hiệu quả. Năm 1928 Alexander
Fleming - một nhà vi trùng học người Anh phát hiện ra penicillin. Bốn năm sau
(1932) Gerhard Domagk (nhà vật lý học người Đức) phát hiện ra sulfanilamide. Năm
1944 Wakeman tìm ra streptomycine.
Việc phát hiện ra kháng sinh và các đặc tính của chúng đã tạo ra một cuộc cách
mạng trong y học và cứu loài người thoát khỏi nhiều thảm dịch do vi trùng gây ra.
Việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn (TA) chăn nuôi được đánh dấu bằng một thí
nghiệm của Stokstad và Juke (1949) khi cho gia cầm ăn TA có bổ sung aureomycin,
nhận thấy tốc độ sinh trưởng và hiệu quả sử dụng TA của gia cầm tăng rõ rệt. Từ đó
rất nhiều công trình nghiên cứu về kháng sinh như chất bổ sung trong TA chăn nuôi
được thực hiện và bắt đầu từ những năm 1950 và 1960 của thế kỷ 20, một kỷ nguyên
mới của ngành chăn nuôi đã được mở ra khi kháng sinh được coi như một yếu tố
không thể thiếu và đã tạo nên một bước đột phá về năng suất và hiệu quả chăn nuôi ở
nhiều nước trên thế giới.
2.1.2. Phân loại kháng sinh
 Nhóm penicillin: là nhóm kháng sinh đầu tiên được phát hiện ra. Ban đầu
penicillin được chiết xuất từ nấm penicillium notatum. Bây giờ penicillin được
tổng hợp nhiều từ một số loại hóa chất khác. Các dòng penicillin gồm có :
-

Penicillin G và penicillin V : là 2 loại được tổng hợp lần đầu tiên.

-

Aminopenicillin : là penicillin bán tổng hợp gồm có ampicillin, amoxillin...

-

Các

penicillin

kháng

enzyme

penicillinase:

chloxacillin...
iii

 

oxacillin,

methicillin,


-

Penicilin chuyên dùng để điều trị vi khuẩn nhóm pseudomonas : như
piperacillin, cacbercillin, ticarcillin.

-

Các penicillin kết hợp chất ức chế enzyme βlactamase: Augmentine,
amoxiklav...

 Nhóm cephalosporin: Gồm 4 thế hệ I, II, III, IV. Thế hệ I, II chủ yếu để điều
trị các vi khuẩn Gram(+); thế hệ III, IV chủ yếu để điều trị vi khuẩn Gram(-).
 Nhóm tetracycline: gồm tetracyclin, oxytetracycline, chlorotetracycline,…có
hoạt phổ rộng (các vi khuẩn Gram (+) và Gram(-), Rickettsia, Xoắn khuẩn,..).
Chỉ định điều trị bằng cách kết hợp với các kháng sinh khác để điều trị các
bệnh: Brucella, tả, sốt định kỳ, lậu cầu, giang mai, viêm đường tiêu hoá, sốt
rét,...
 Nhóm macrolide: erythromycin, spiramycin, azthromycin, rovamycin,
tylosin... Là kháng sinh có hoạt phổ kháng khuẩn rộng, tác dụng mạnh hơn
trên gram âm, nhóm này hầu hết được thải trừ qua thận. Độc tính trên thận
(gây hoại tử ống thận cấp) và thính giác (gây ù tai, điếc) nếu dùng kéo dài.
Các thuốc của nhóm như: gentamycin, novomycin... các thuốc này hầu hết
không hấp thu qua đường tiêu hóa, nếu dùng điều trị nhiễm khuẩn toàn thân
thì phải dùng dạng tiêm
 Nhóm lincoxinamid: như Lincocine...
 Nhóm quinolon: ciprofloxacin, ciprofloxacin-d8, oxolinic acid, danofloxacin,
enrofloxacin, difloxacin, sarafloxacin, ofloxacin, norfloxacin...
 Nhóm Aminosid: có từ nguồn gốc vi sinh, có phổ tác dụng rộng, chủ yếu trên
vi khuẩn Gram(-), theo nguồn gốc vi sinh có thể chia ra:
-

Thuốc chiết xuất từ nấm Streptomyces: Streptomicin, Dihydrostreptomycin,
Kanamycin, Neomycin, Paromomycin,...

-

Thuốc chiết xuất từ Microspora: Gentamicin, Sisimicin,...

-

Sau này, khi thay đổi cấu trúc của các hợp chất tự nhiên nói trên, người ta thu
được các thuốc bán tổng hợp như: Amikacin, Netilmicin, Dibekacin,...

 Nhóm Chloramphenicol (hay Phenicol): gồm 2 kháng sinh
-

Chloramphenicol: thường được gọi là Chlorocid, được phân lập từ nấm
Streptomyces, nay sản xuất bằng phương pháp tổng hợp toàn phần. Có tác

iv

 


dụng điều trị bệnh thương hàn và sốt phát ban do Rickettsia (là tác nhân
truyền bệnh rận, chấy)
-

Thiamphenicol: là dẫn chất của Chloramphenicol, khi thay thế gốc Nitro bằng
gốc Metylsulfon, dung nạp tốt hơn Chloramphenicol

2.1.3. Sử dụng kháng sinh
2.1.3.1. Tình hình sử dụng kháng sinh ở Việt Nam và một số nước trên thế giới
Ở Việt Nam, có 143 loại biệt dược chứa kháng sinh đang được sử dụng trong
chăn nuôi, trong đó có 36 loại kháng sinh đang được sử dụng phổ biến như: Colistin,
Enrofloxacin, Sulfamide, Trimethoprim, Gentamycin, nhóm Tetracycline, ….
Ở Úc, từ giai đoạn 1992 – 1997 có khoảng 55,8% lượng kháng sinh nhập khẩu
được sử dụng; 36,4% sử dụng cho người và 7,8% cho thú y.
Tại Mỹ, có khoảng 6 triệu pound kháng sinh được sản xuất ra mỗi năm, trong
đó 60% sử dụng cho người, 40% dùng cho chăn nuôi (32% dùng cho phòng bệnh,
8% dùng điều trị bệnh gia súc gia cầm) (Barton, 2000).
Tại Châu Âu (1996 – 1997): 52% kháng sinh được sử dụng cho người, 33% cho
thú y và 15% cho mục đích tăng trưởng bằng cách bổ sung trong chăn nuôi thú y.
Năm 1999, số lượng kháng sinh sử dụng tại Châu Âu và Thụy Sĩ ước tính là 13.288
tấn, trong đó có 65% dùng cho người, 29% dùng trong thú y và 6% dùng trong kích
thích tăng trưởng (Nicole, 2008).
2.1.3.2. Các trường hợp sử dụng kháng sinh
-

Sử dụng kháng sinh trong điều trị

-

Sử dụng kháng sinh trong phòng bệnh

-

Sử dụng kháng sinh với mục đích tăng trọng

2.1.3.3. Tiêu chí lựa chọn kháng sinh
-

Sự hiểu biết về mức độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh

-

Sự hiểu biết về tác động dược lý để đánh giá khả năng mà kháng sinh đi tới ổ
bệnh với nồng độ đủ ức chế hay tiêu diệt vi khuẩn

-

Sự hiểu biết về độc tính của kháng sinh và các yếu tố làm tăng độc tính của nó

-

Sự hiểu biết về chi phí của việc điều trị, đi kèm với hiệu quả điều trị

2.1.3.4. Các vấn đề tồn tại khi sử dụng kháng sinh không đúng

v

 


Vi khuẩn gây bệnh tiếp xúc thường xuyên với kháng sinh liều thấp sẽ tạo thích
ứng với một số chủng thay đổi cấu trúc ADN để chống lại kháng sinh, dần dần chúng
biến kháng sinh thành yếu tố cần thiết để tránh sự tấn công của vi khuẩn khác.
Đối với vật nuôi và con người: Gây rối loạn tiêu hóa, cơ thể mất đi sức đề
kháng bản thân, sức chống chọi với bệnh tật ngày càng yếu. Sử dụng kháng sinh thời
gian dài làm tăng hiện tượng kháng kháng sinh, làm cho việc điều trị không hiệu quả.
Đối với chất lượng sản phẩm chăn nuôi: Vật nuôi ăn thức ăn bị nhiễm kháng

sinh trong thời gian dài sẽ để lại lượng tồn dư kháng sinh trong sữa, gây ức chế vi
khuẩn sử dụng trong chế biến các sản phẩm từ sữa như phomat, sữa chua,….
Đối với môi trường: Kháng sinh do vật nuôi đào thải ra ngoài môi trường trong
thời gian dài, gây ảnh hưởng có hại đến môi trường sống, phá vỡ hệ sinh thái vi sinh
vật đất, sự tồn tại và luân chuyển của nguồn gen kháng kháng sinh trong môi trường.
2.1.4. Lợi ích của sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi và cơ chế tác
động của kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi
2.1.4.1 Lợi ích của việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi
Trong chăn nuôi, kháng sinh (KS) được sử dụng với 3 mục đích: (1) điều trị
bệnh; (2) phòng bệnh và (3) dùng như chất kích thích sinh trưởng. Tuỳ theo mục đích
sử dụng mà liều lượng và phương thức sử dụng KS có khác nhau. Có nhiều ý kiến
khác nhau về lợi ích của việc sử dụng KS bổ sung trong thức ăn như chất kích thích
sinh trưởng, nhưng tựu chung lại những lợi ích chính như sau:
-

Tăng năng suất sinh trưởng và sinh sản ở gia súc, gia cầm

-

Tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, làm cho vật nuôi thích ứng nhanh chóng với
sự thay đổi bất thường về cơ cấu và chủng loại nguyên liệu trong khẩu phần ăn

-

Nâng cao chất lượng sản phẩm (giảm tỷ lệ thịt mỡ, tăng tỷ lệ thịt nạc, làm cho
thịt trở nên mềm hơn và không nhiễm mầm bệnh).

-

Phòng các bệnh mạn tính và ngăn chặn xảy ra những dịch bệnh do vi trùng.

-

Tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi.

2.1.4.2. Cơ chế tác động của kháng sinh như chất kích thích sinh trưởng
Có rất nhiều thuyết khác nhau và mỗi thuyết đều có những cơ sở khoa học rất
thuyết phục. Dưới đây là một số giải thích về cơ chế tác động của KS như những chất
kích thích sinh trưởng:
-

Kiểm soát bệnh tật
vi

 


-

Tiết kiệm chất dinh dưỡng

-

Ảnh hưởng đến trao đổi chất

-

Ảnh hưởng đến khả năng thu nhận thức ăn và nước uống

2.1.4.3. Mặt trái của kháng sinh

Kháng sinh cũng có những phản ứng phụ, tạo ra phản ứng của cơ thể đối với
chất kháng sinh chẳng hạn như chứng ban đỏ và các triệu chứng khác. Phản ứng trầm
trọng nhất là dẫn tới tử vong. Đôi khi, chất kháng sinh không có hữu hiệu đối với một
số vi khuẩn mầm bệnh.
Theo một tài liệu của bộ môn Công nghệ thực phẩm, Đại học Bách Khoa Tp
HCM, lượng kháng sinh tồn dư trong gia súc, gia cầm cao sẽ chuyển hóa protein
thành các histamins gây chứng nhức đầu cho người sử dụng. Người thường xuyên sử
dụng gia súc, gia cầm nhiễm kháng sinh sẽ rất dễ bị “nhờn” thuốc, khi bị bệnh khó
chữa trị do lượng kháng sinh này sẽ tích tụ trong cơ thể gây nên hiện tượng vi khuẩn
thích ứng với kháng sinh.
Các loại kháng sinh này thường không bị phân hủy và tồn lưu trong môi trường
nuôi trồng thủy sản trong thời gian dài, khiến các loại vi khuẩn thích nghi với môi
trường có kháng sinh. Kết quả là các loại vi khuẩn gây bệnh trong thủy sản lại có khả
năng kháng thuốc kháng sinh. Nếu kháng sinh được trộn lẫn vào thức ăn nuôi thủy
sản, có thể tìm thấy dư lượng kháng sinh trong thịt thủy sản và các sản phẩm chế
biến. Những người ăn thủy sản chứa dư lượng kháng sinh sẽ vô tình hấp thụ kháng
sinh vào cơ thể, dẫn đến những thay đổi trong môi trường vi khuẩn bình thường,
khiến họ trở nên dễ bị nhiễm khuẩn hơn.
Đặc biệt việc lạm dụng chất kháng sinh sẽ gây lờn thuốc, dẫn đến sự phát triển
của các loại vi khuẩn có khả năng kháng thuốc trong cơ thể động vật cũng như trong
thủy sản.
Khoa chăn nuôi Thú y, trường Đại học Nông Lâm TP HCM mới đây đã tiến
hành khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi và dư lượng kháng sinh
trong thịt ở các quầy kinh doanh gia súc, gia cầm. Đa số người chăn nuôi sử dụng
kháng sinh không hợp lý như liều lượng cao, sử dụng liên tục để phòng ngừa bệnh
cho gia súc đến khi nào bán được. Xét nghiệm các mẫu thịt được lấy trực tiếp tại các
chợ cho thấy có 26 loại kháng sinh được phát hiện. Trong đó loại được sử dụng nhiều
nhất là chloramphenicol (chiếm 15,35%), tylosin (15%), colistin (13,24%),
vii

 


norfloxacin (10%), gentamycin (8,35%), nhóm tetracycline (7,95%). Trong đó,
chloramphenicol là kháng sinh hiện đã bị cấm sử dụng trên nhiều quốc gia.
Trong 149 mẫu thịt gà được kiểm tra, phân tích có đến 44,96% số mẫu có dư
kháng sinh vượt quá mức quy định cho phép từ 2,5 đến 1100 lần so với tiêu chuẩn
ngành. Trong đó loại kháng sinh chloramphenicol chiếm tỷ lệ cao nhất 87,5%,
flumequin chiếm 83,33%, chlortetracycline chiếm 62,5%, amoxillin chiếm 60%....
Do đó cần phải biết được phương pháp xác định dư lượng kháng sinh trong thực
phẩm để hạn chế được những nguy hại từ những thực phẩm chứa dư lượng thuốc
kháng sinh quá tiêu chuẩn cho phép.
 Hàm lượng kháng sinh tối đa cho phép trong thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho
lợn theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1 Hàm lượng kháng sinh, hóa dược tối đa cho phép trong thức ăn hỗn hợp
hoàn chỉnh cho lợn
Số
thứ
tự

Tên kháng sinh,
hóa dược

Hàm lượng tối đa
cho phép (µg/g)

Thời gian ngừng sử dụng thức ăn
có kháng sinh, hóa dược trước
khi giết mổ (ngày)

1

Arsanilic

90

5

2

BMD (Bacitracin
MethyleneDisalicylate)

30

5

80 (cho lợn < 3
tháng tuổi)
Bacitracin

3

50 (cho lợn <4
tháng tuổi)

0

20 (cho lợn <6
tháng tuổi)

4

Chlotetracyline

50

0

5

Lincomycin

20

0

6

Oxytetracyline

50 (liều phòng chỉ
dùng cho lợn con)

0

7

Roxarsone

34

5

8

Tylosin

40

0

viii

 


Virginiamycin

9

10 (cho lợn <60kg)

0

Thông tư của Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông Thôn số 81/2009/TT-BNNPTNT

 Hàm lượng kháng sinh tối đa cho phép trong thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho
gà thịt theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia được trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2 Hàm lượng kháng sinh, hóa dược tối đa cho phép trong thức ăn hỗn hợp
hoàn chỉnh cho gà

Số thứ
tự

Tên kháng
sinh,hóa dược

Hàm lượng tối
đa cho phép
(µg/g)
Gà
Gà thịt
trứng

Thời gian ngừng sử dụng thức ăn có
kháng sinh,hóa dược trước khi giết
mổ(ngày)

1
2
3
4
5
6

Amprolium
Arsanilic
Bacitracin
Chlotetracyline
Clopidol

Decoquinate

250
90
50
50
250
30

25
-

0
0
0
0
5
0

7

Lasalocid

113

-

3

8

9
10
11
12
13
14
15

Lincomycin
Monensin
Narasin
Nitrasone
Oxytetracyline
Roxarsone
Salinomycin
Sulfadimethoxin

4
110
72
187
50
50
60
113

-

0
0

5
0
0
0
0
0

16

Tylosin

50

17
18

Virginiamycin
Zoalene

5
113,5

0
-

0
0

Thông tư của Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông Thôn số 81/2009/TTBNNPTNT

2.2. Phương pháp sắc ký
2.2.1. Lịch sử phương pháp sắc ký
Nhà thực vật học người Nga Mikhail Tswett (Mikhail Semyonovich Tsvet) phát
minh ra kĩ thuật sắc ký vào năm 1903 khi ông đang nghiên cứu về chlorophyll.
ix

 


Năm 1952, Archer John Porter Martin và Richard Laurence Millington Synge
đã đoạt giải Nobel hóa học về sắc ký phân tách.
Kĩ thuật sắc ký phát triển nhanh chóng trong suốt thế kỉ 20. Các nhà nghiên cứu
nhận thấy nguyên tắc nền tảng của sắc ký Tsvet có thể được áp dụng cho nhiều cách
khác nhau, từ đó xuất hiện nhiều loại sắc ký khác nhau. Đồng thời kĩ thuật sắc ký
ngày càng được phát triển cao hơn cho đến ngày nay.
2.2.2. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký
Sắc ký (Chromatography) là phương pháp phân tách, phân ly, phân tích các hợp
chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và pha tĩnh.
Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và
pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp thu, tính tan, …). Trong các
hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ thống sắc
ký. Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá
trình chuyển động dọc theo hệ thống sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh
khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có ái lực
lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất có ái
lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất
tương tác yếu hơn pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta cố thể tách các chất qua
quá trình sắc ký.
Hầu hết các phương pháp sắc ký đều được dựa theo nguyên lý trên, và hiệu quả
của từng phương pháp phụ thuộc vào sự lựa chọn giữa pha động và pha tĩnh.

2.2.3. Phân loại sắc ký
Trong phương pháp sắc ký, pha động phải là các lưu thể (các chất ở dạng khí
hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hay rắn.
Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta có thể chia sắc ký thành hai
nhóm lớn: sắc ký khí (Gas Chromatography – GC) và sắc ký lỏng (Liquid
Chromatography – LC). Dựa vào cơ chế trao đổi của các chất giữa hai pha động và
pha tĩnh người ta lại chia các phương pháp sắc ký thành những nhóm nhỏ hơn.
Tùy theo tính chất phân cực của cột ghi sắc ký và dung môi, người ta phân ra
hai loại HPLC :
-

HPLC pha thường (normal phase HPLC): cột hấp phụ chứa các hạt silic dioxit
(silica – một hợp chất phân cực) rất nhỏ, dung môi là chất không phân cực, ví
x

 


dụ hexan. Thông thường cột hấp phụ có đường kính trong 4,6 mm, chiều dài
150 – 250 mm. Các hợp chất không phân cực sẽ di chuyển qua ống nhanh hơn
các hợp chất phân cực. Tuy nhiên phương pháp này ít khi được sử dụng.
-

HPLC đảo pha (reversed phase HPLC): kích thước cột như phương pháp pha
thường nhưng các hạt silica được biến trở thành không phân cực bằng cách
gắn các chuỗi hydrocacbon lên các hạt này. Thông thường, mỗi hạt gắn
khoảng 8-18 nguyên tử Cacbon. Dung dịch là chất phân cực, ví dụ hỗn hợp
nước + rượu. Các hợp chất không phân cực trong hỗn hợp có xu hướng gắn
kết với các nhóm hydrocacbon nhờ lực Van de Waals. Các hợp chất không
phân cực cũng khó hòa tan hơn trong dung môi phân cực. Do đó, các hợp chất

không phân cực sẽ di chuyển qua ống chậm hơn các hợp chất phân cực.
Phương pháp này thường được sử dụng phổ biến hơn phương pháp pha
thường.

2.3. Giới thiệu về hệ thống LC-MS/MS API 4000 được dùng trong nghiên cứu

Hình 2.1 Hệ thống LC-MS/MS API 4000 của hãng Water (thuộc phòng Sắc
ký-Quang phổ, Trung tâm 3)
Hệ thống này gồm 2 phần: LC của Agilent 1200 và khối phổ MS/MS API 4000
của hãng API.
2.3.1. LC Agilent 1200
LC Agilent 1200 gồm các bộ phận và đặc tính kỹ thuật sau:
Khay chứa dung dịch pha động: dùng để các bình chứa dung môi pha động. Có
4 bình chứa phân biệt là A1, B1 và A2, B2.

xi

 


Bộ khử khí: Bộ phận này có tác dụng loại khí hòa tan còn lẫn trong pha động
nhằm giúp cho quá trình tách sắc ký trở nên tốt hơn, thời gian lưu ổn định hơn và
“peak” thu được trở nên đối xứng hơn.
Bơm (pump): Là hệ Binary Pump, có tác dụng đưa thành phần pha động và chất
phân tích vào cột sắc ký để tiến hành tách các chất cần thiết và đưa vào khối phổ. Tốc
độ cho phép từ 50-5000 µL/ phút và áp suất tối đa là 6000 psi.
Binary Pump: còn được gọi là bơm đôi, là hệ thống gồm 2 bơm giống nhau và
có đường dây dẫn dung môi vừa ra khỏi bơm được nối vào cùng một nơi để trộn
dung môi từ 2 bơm này với nhau. Binary pump cho phép một chương trình gradient
được trộn ở áp suất cao nên tốc độ dòng đòi hỏi thấp, thường dùng với cột có đường

kính nhỏ từ 1 đến 2 mm. Pump này được thiết kế có một van dung môi cho phép
người dùng chọn hỗn hợp 2 dung môi từ khay chứa 4 chai dung môi.
Bộ phận tiêm mẫu tự động (autosampler): Có tác dụng tiêm chất phân tích từ
các vial chứa vào cột sắc ký. Autosampler của LC Agilent 1200 có khay chứa 100
vial.
Buồng ổn nhiệt cột: Có tác dụng giữ nhiệt độ nhất định để cho thời gian lưu của
chất cần phân tích ổn định. Nhiệt độ buồng cột từ 20-60 0C.
Pilot: Bộ phận điều khiển tay có tác dụng điều khiển LC mà không cần thông
qua phần mềm, có thể coi sắc ký đồ trực tiếp trên đó
2.3.2. Khối phổ API 4000
 Nguồn tạo ion (ion source) dùng nguồn Turbo V để tạo ion

Hình 2.2 Nguồn ion Turbo V
xii

 


Tích hợp sẵn 2 kỹ thuật tạo ion là ESI và APCI nên người dùng có thể dễ dàng
chuyển từ ESI sang APCI và ngược lại.
Dùng 2 bộ phận gia nhiệt từ 0-750 0C, để làm bay hơi hoàn toàn dung môi, hạn
chế dung môi và tạp chất không cần thiết vào MS
Dạng phun 900 nên các tạp chất bị phun trực tiếp ra ngoài. Chất phân tích bị hút
vào khối phổ theo một hướng vuông góc
Với thiết kế nguồn như vậy giúp người sử dụng dễ dàng làm vệ sinh khi cần
thiết, hạn chế tạp chất tăng độ nhạy của khối phổ
 Bộ phận tách khối (mass analyzer)

Hình 2.3 Sơ đồ bộ phân tích khối của khối phổ API 4000
Gồm 2 vùng chính là vùng chuyển tiếp và vùng phân tích

Vùng chuyển tiếp gồm 4 phần chính:
Curtain plate: Là 1 đĩa hình nón bằng thép không rỉ, có 1 lỗ tròn đường kính 2
mm ở trung tâm được áp một điện tích nhất định. Khi dòng ion đi vào “curtain plate”
thì gặp một dòng “curtain gas” (khí N2) thổi ngược lại để loại bỏ hoàn toàn dung môi,
không cho hơi dung môi chưa được bốc hơi hết vào “orifice plate”.
Orifice plate: Ion sau khi qua “curtain plate” tiếp tục vào “orifice plate”, có
đường kính rất nhỏ 0.317 mm để hạn chế ion không cần thiết vào MS và được áp một
thế nhất định tùy thuộc vào cấu trúc của chất phân tích nên khi chỉ có những chất cần
phân tích mới qua được “orifice plate”. “Orifice plate” là vách ngăn giữa vùng áp
xiii

 


suất khí quyển và vùng chân không thấp khoảng 1 torr. Vùng chân không này được
tạo ra do một “roughing pump”. “Orifice plate” được làm bằng gốm (ceramic) nên rất
dễ vỡ do đó khi vệ sinh nguồn phải hết sức cẩn thận.
Skimmer cone được thiết kế hình nón để hướng ion vào Q0
Q0: được thiết kế là một tứ cực, có chân không khoảng 8.10-3 torr do một turbo
pump được thiết kế bên cạnh Q0. Q0 có tác dụng như một bộ lọc ion đầu tiên có tác
dụng loại bỏ các tạp chất, hạn chế bẩn MS.
 Vùng tách khối
Gồm 3 thành phần chính là Q1, Q2, Q3 là 3 tứ cực được thiết kế bằng 4 thanh
kim loại làm bẳng thép không rỉ, được đặt song song từng cặp với nhau. Khi hoạt
động, một tứ cực được áp dòng điện 1 chiều (DC) và dòng điện xoay chiều (AC) lên
hai cặp đối nhau của 4 thanh kim loại. Bằng cách lựa chọn tỉ lệ AC/DC thích hợp trên
mỗi cặp thanh kim loại, các ion có khối lượng được chọn trước đi qua 4 thanh kim
loại này và tiếp tục đi xa hơn (đến detector), trong khi đó các ion khác do có quỹ đạo
không phù hợp, bị loại bỏ khỏi tứ cực và bị hút ra ngoài.

Hình 2.4 Hình 1 tứ cực
Ở giữa Q0, Q1, Q2, Q3 là các hệ thống hội tụ ion (ion lens) được ký hiệu là
ST1, ST2, ST3. Chúng được áp một điện thế nhất định để hướng các ion thích hợp đi
từ tứ cực này qua tứ cực khác, còn các ion không cần thiết thì bị loại bỏ.

xiv