ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ SỬ DỤNG SINH KHỐI Acetobacter xylinum LÀM GIÁ THỂ TRONG NHÂN GIỐNG THỰC VẬT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ SỬ DỤNG SINH KHỐI
Acetobacter xylinum LÀM GIÁ THỂ TRONG
NHÂN GIỐNG THỰC VẬT

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN THỊ LIỄU

Niên khóa

: 2009 – 2013

Tháng 6/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ SỬ DỤNG SINH KHỐI
Acetobacter xylinum LÀM GIÁ THỂ TRONG
NHÂN GIỐNG THỰC VẬT

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. BÙI MINH TRÍ

NGUYỄN THỊ LIỄU

ThS. TRẦN THỊ THU HÀ

Tháng 6/2013


LỜI CẢM ƠN
Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự hỗ trợ,
giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác. Trong suốt thời gian
từ khi bắt đầu học tập ở giảng đường Đại học đến nay, em đã nhận được rất nhiều sự
quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy,Cô, gia đình và bạn bè.
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy, Cô Trường Đại học
Nông lâm Tp.HCM đã dùng những tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn
kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập tại trường.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Bùi Minh Trí đã tận tình hướng dẫn em từ những
bước đầu tiên của khóa luận. Nếu không có những lời hướng dẫn, dạy bảo và sự giúp
đỡ tận tình của Thầy, em nghĩ rất khó để có thể hoàn thành được đề tài. Một lần nữa
em xin chân thành cảm ơn Thầy.
Em xin chân thành cảm ơn ThS. Trần Thị Thu Hà đã tận tình giúp đỡ em trong

suốt quá trình làm và hoàn thành đề tài. Cô đã cho em những lời khuyên cũng như
những lời động viên mà em nghĩ rằng nó đã giúp em vượt qua những nỗi lo sợ của
chính bản thân em trong quá trình làm đề tài. Em xin chân thành cảm ơn Cô.
Con xin cảm ơn Ba Má đã sinh con ra và cho con một cuộc sống với những điều
kiện tốt nhất trong khi Ba Má phải thức khuya dậy sớm làm lụng vất vả. Ba Má đã cho
con niềm tin niềm hy vọng vào tương lai, gia đình đã cho con một tổ ấm hạnh phúc và
là chỗ dựa vững chắc cho con mỗi khi con gặp khó khăn.
Em xin cảm ơn Cô Tô Thị Nhã Trầm cùng tập thể lớp DH09SH đã luôn bên
cạnh, ủng hộ và giúp đỡ em trong suốt 4 năm đại học.
Xin chúc tất cả các Thầy, Cô và tất cả các bạn sức khỏe dồi dào và luôn thành
công trên mọi lĩnh vực!
Tp.HCM, tháng 6 năm 2013
Sinh viên

Nguyễn Thị Liễu

i


TÓM TẮT
Đề tài: Đánh giá hiệu quả sử dụng sinh khối Acetobacter xylinum làm giá thể
trong nhân giống thực vật.
Đề tài này được thực hiện nhằm tìm ra công thức tối ưu nhất cho việc sản xuất
bacterial cellulose (thạch dừa) và đánh giá hiệu quả sử dụng sinh khối bacterial
cellulose làm giá thể trong nuôi cấy thực vật.
Đề tài được thực hiện gồm 4 thí nghiệm. Thí nghiệm 1 khảo sát tìm ra lượng rỉ
đường và mật ong bổ sung vào môi trườngsao cho khối lượng bacterial cellulose thu
được cao nhất. Thí nghiệm 2 và 3 đánh giá hiệu quả sử dụng bacterial cellulosecùng tỉ
lệ bacterial cellulose trong môi trường nuôi cấy cây lúa hoang và tìm ra loại bacterial
cellulose cho hiệu quả cao nhất. Thí nghiệm 4 đánh giá hiệu quả sử dụng bacterial

cellulose làm giá thể nuôi cấy cây cà chua đối chứng với môi trường sử dụng giá thể
agar và môi trường sử dụng giá thể bông gòn.
Kết quả nghiên cứucho thấybổ sung 80ml/1lít lượng rỉ đường vào môi trường
hoặcbổ sung 80ml/1lít lượng mật ong vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn A.xylinum cho
khối lượng bacterial cellulose thu được cao nhất. Các loại BCtrên môi trường bổ sung
rỉ đường và môi trường bổ sung mật ong đều có thể sử dụng làm giá thể nuôi cấy. Loại
BC5% ẩm độcho hiệu quả sử dụng làm giá thể cho cây lúa hoang là tốt nhất. BC3 lớp
cho hiệu quả sử dụng làm giá thể nuôi cấy cây lúa hoang tốt hơn BC 1 và 2 lớp khi cần
nuôi cấy cây trong thời gian dài. Đối với cây cà chua, trên môi trường sử dụng giá thể
BC tươi có thể rút ngắn thời gian nảy mầm so với trên môi trường sử dụng giá thể agar
và môi trường sử dụng giá thể bông gòn. Sử dụng BC làm giá thể nuôi cấy cho thấy có
hiệu quả kinh tế hơn giá thể agar và giá thể bông gòn. BC thành phẩm rẻ hơn agar và
có thể tái sử dụng cho lần nuôi cấy tiếp theo. Ngoài ra, có thể sử dụng giá thể BC để
điều khiển độ ẩm môi trường tùy theo mục đích nuôi cấy.

ii


SUMMARY
Evaluating the effectiveness of using biomass Acetobacter xylinum as the
substrate in tissue culture.
The thesis was researched in order to find outthe most optimal formula for
producing bacterial cellulose and to evaluate the effectiveness of using bacterial
cellulose as the substrate for tissue cultured.The thesis included4 experiments.
Experiment 1 surveyed of molasses and honey added to the media. Experiments 2 and
3 evaluated the effectiveness of using bacterial cellulose as the substrate for wild rice
cultivar and find out what kind of bacterial cellulose and water ratio for the highest
efficiency. Experiments 4 evaluate the effectiveness of using bacterial cellulose as the
substrate cultured tomato plants in media using agar substrate and using cotton.The
result indicated that 80 ml/1 liter of molasses added into the media or 80 ml/1 liter of

honey gave highest result on the growth of BC biomass. The BC on the media of
molasses supplementation and honey could be used as a culture base. BC was
squeezed to 5% water use obtained highest efficiency for wild rice. 3 layers BC was
more cost effectively for growing wild rice than BC 1 and 2 class when cultured plants
for long time. For the tomato plants, the media used BC shorten germination time as
compared with using agar and cotton.BC used as the substrate got higher economic
efficiency than agar and cotton. BC was cheaper and reusable for subsequent culture.
In addition, could control humidity environment based on target culture.
Keyword: bacterial cellulose, biomass Acetobacter xylinum, wild rice, agar,
cotton.

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ........................................................................................................................i
Tóm tắt............................................................................................................................ ii
Summary........................................................................................................................ iii
Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................ vii
Danh sách các bảng ..................................................................................................... viii
Danh sách các hình .........................................................................................................ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................1
1.1Đặt vấn đề ...................................................................................................................1
1.2Yêu cầu của đề tài.......................................................................................................1
1.3 Nội dung thực hiện ....................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................... 3
2.1. Nuôi cấy mô tế bào thực vật .....................................................................................3
2.1.1 Định nghĩa ..............................................................................................................3
2.1.2 Ý nghĩa và tầm quan trọng của nuôi cấy mô ..........................................................3

2.1.3 Các thành phần cơ bản trong nuôi cấy mô .............................................................4
2.1.4. Giá thể trong nuôi cấy mô tế bào thực vật.............................................................4
2.1.4.1 Khái niệm và công dụng của giá thể ...................................................................4
2.1.4.2 Các tác nhân làm đặc môi trường ........................................................................4
2.1.4.3 Giá thể trên môi trường lỏng ...............................................................................9
2.1.4.4 Những vật liệu xốp làm giá thể .........................................................................10
2.1.4.5 Giá thể từ BC .....................................................................................................11
2.2. Đặc điểm cấu tạo của giống vi khuẩn Acetobacter ................................................11
2.2.1 Đặc điểm cấu tạo chung .......................................................................................11
2.2.2Tình hình nghiên cứu về màng BC ở Việt Nam và trên thế giới ..........................12
2.2.3. Đặc điểm của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum ...........................................13
2.2.3.1 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Acetobacter xylinum .....................................13
2.2.3.2 Đặc điểm sinh lý và sinh hoá của vi khuẩn Acetobacter xylinum. ....................13
2.2.3.3 Một vài đặc điểm của BC ..................................................................................13
2.2.3.4 Bản chất sinh hóa của quá trình hình thành BC ................................................15
iv


2.3.1 Nước dừa già ........................................................................................................15
2.3.2 Rỉ đường ...............................................................................................................17
2.3.3 Mật ong .................................................................................................................18
2.3.4 Các nguyên liệu khác từ công nghiệp thực phẩm.................................................19
2.4 Các ứng dụng của BC ..............................................................................................19
2.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình hình thành BC ................................................20
2.5.1 Ảnh hưởng của (NH4)2SO4 và (NH4)2PO4............................................................20
2.5.2 Ảnh hưởng của nồng độ chất khô .........................................................................21
2.5.3 Ảnh hưởng của các loại đường .............................................................................21
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 24
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện .............................................................................24
3.2. Vật liệu - hóa chất - trang thiết bị ...........................................................................24

3.2.1. Vật liệu ................................................................................................................24
3.2.1.1. Nguồn giống vi khuẩn ......................................................................................24
3.2.2 Hóa chất ................................................................................................................24
3.2.3 Dụng cụ - Trang thiết bị .......................................................................................24
3.3. Phương pháp tiến hành ...........................................................................................24
3.3.1. Nội dung 1: Tìm ra công thức tối ưu cho việc sản xuất sinh khối BC ................24
3.3.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của các nguồn đường đến sản xuất sinh khối BC ...25
3.3.2. Nội dung 2: Thử nghiệm dùng BC làm giá thể nuôi cấy thực vật ......................27
3.3.2.1 Thí nghiệm 2.1: Xác định loại giá thể BC phù hợp cho quá trình nuôi cấy......27
3.3.2.2 Thí nghiệm 2.2: Xác định tỷ lệ BC phù hợp sử dụng làm giá thể nuôi cấy ......28
3.3.2.3 Thí nghiệm 2.3: Xác định giá thể phù hợp cho quá trình nuôi cấy cà chua ......30
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................................... 32
4.1. Nội dung 1: Tìm ra công thức tối ưu cho việc sản xuất sinh khối BC ...................32
4.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của các nguồn đường đến sản xuất sinh khối BC ......32
4.2 Nội dung 2: Thử nghiệm dùng BC làm giá thể nuôi cấy thực vật ..........................35
4.2.1 Thí nghiệm 2.1: Xác định loại giá thể BC phù hợp cho quá trình nuôi cấy.........35
4.2.2 Thí nghiệm 2.2: Xác định tỷ lệ BC phù hợp để sử dụng làm giá thể nuôi cấy ....37
4.2.3 Thí nghiệm 2.3: Xác định giá thể phù hợp cho quá trình nuôi cấy cây cà chua ..39
4.2.4 Đánh giá hiệu quả kinh tế việc sử dụng rỉ đường, mật ong trong sản xuất BC....42
4.2.5 Đánh giá hiệu quả kinh tế việc sử dụng BC làm giá thể nuôi cấy thực vật..........43
v


Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 45
5.1 Kết luận....................................................................................................................45
5.2 Đề nghị ....................................................................................................................45
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 46
PHỤ LỤC

vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Acetobacter xylinum:

A. xylinum

ADP:

Adenosine diphosphate

ATP:

Adenosine triphosphate

BC:

Bacterial cellulose

Ctv:

Cộng tác viên

DAP:

Diammonium hydrogen phosphate

EDTA:

Ethylenediaminetetraacetic acid

FAD :

Flavin Adenine Dinucleotide

HM pectin:

Hight methoxyl pectin

LM pectin:

Low methoxyl pectin

MS:

Murashige và Skoog, 1962

NADP:

Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

NT:

Nghiệm thức

PC:

Plant cellulose

SA:

Sulfate ammonium

VSV:

Vi sinh vật

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Ảnh hưởng các loại đường đến sự hình thành BC ở nước dừa tại pH = 5,0 .22
Bảng 2.2 Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến trạng thái cấu trúc của BC................. 22
Bảng 2.3 Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành BC .....................................................22
Bảng 2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành BC tại pH = 5,0 ....................... 22
Bảng 3.1 Các nghiệm thức ở thí nghiệm 1................................................................... 25
Bảng 4.1 Sinh khối BC thu được sau 10 ngày nuôi cấy trên các loại môi trường ....... 32
Bảng 4.2 Số liệu thu được trên các môi trường sử dụng các loại giá thể khác nhau ... 35
Bảng 4.3 Số liệu thu được trên các môi trường sử dụng các loại giá thể khác nhau ... 37
Bảng 4.4 Số liệu thu được trên môi trường sử dụng các loại giá thể khác nhau ......... 39
Bảng 4.5 Chi phí nguyên liệu bổ sung cho 100 lít môi trường lên men thu nhận BC . 42
Bảng 4.6 Các chi phí trang thiết bị vật tư được tính dựa trên chi phí nguyên liệu ...... 42
Bảng 4.7 Chi phí sản xuất BC của các loại môi trường sử dụng giá thể khác nhau .... 42
Bảng 4.8 Chi phí các loại giá thể cho 1 lít môi trường nuôi cấy thực vật ................... 43

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang
Hình 2.1 Vi khuẩn Acetobacter xylinum.......................................................................11
Hình 2.2 Các sợi nano cellulose vi khuẩn và thực vật dưới kính hiển vi điện tử .........14
Hình 2.3 Quả dừa 12 tháng tuổi ................................................................................... 15
Hình 2.4 Thạch dừa và các sản phẩm từ thạch dừa ..................................................... 16
Hình 2.5 Quy trình sản xuất BC ...................................................................................17
Hình 2.6 Rỉ đường ........................................................................................................17
Hình 2.7 Mật ong ..........................................................................................................19
Hình 4.1 BC trên các loại môi trường nước dừa già, rỉ đường, mật ong. .....................34
Hình 4.2 BC thu được trên môi trường rỉ đường và sau khi rửa với nước .................. 34
Hình 4.3 Cây lúa trên môi trường sử dụng giá thể agar, BC 5% ẩm độ, bông gòn ..... 36
Hình 4.4 Hạt lúa nảy mầm trêncác loại môi trường agar, bông gòn, BC 1, 2, 3 lớp ....38
Hình 4.5 Chiều cao và hình dạng rễ cây lúa trên môi trường agar, BC và bông gòn .. 38
Hình 4.6Cây cà chua trên các loại môi trường BC tươi, agar, bông gòn .....................41
Hình 4.7 Chiều cao cây và rễ cây cà chua trên các môi trường agar, BC, bông gòn ...41
Hình 4.8 Lan Dendrobium trên môi trường BC tươi và BC 5% ẩm độ ...................... 41

ix


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm một số thành phần cơ bản, trong đó
giá thể là một thành phần vô cùng quan trọng trong suốt quá trình nuôi cấy. Kỹ thuật
nuôi cấy mô cần sử dụng nhiều loại giá thể khác nhau để đáp ứng các nhu cầu đa dạng
trong quá trình nuôi cấy. Các giá thể đều có một số đặc điểm chung như: là vật nâng
đỡ, chỗ bám của rễ vào trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển. Vật liệu làm giá
thể phải chắc chắn và ổn định trong các điều kiện khác nhau, ví dụ chịu được hấp vô
trùng mà không bị biến tính và trơ với các chất trong môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên
các giá thể được sử dụng rộng rãi hiện nay vẫn chưa đáp ứng đầy đủ các điều kiện trên

đồng thời thể hiện một số nhược điểm như là giá thành cao, có chứa các chất ảnh
hưởng xấu đến môi trường, dễ chảy lỏng và không đồng đều về chất lượng.
Vi khuẩn Acetobacter xylinum là một chủng vi khuẩn trước đây được khai thác
để sản xuất thực phẩm là thạch dừa (Nata - de-Coco). Thạch dừa còn được gọi là BC là
cellulose được thu nhận từ sinh khối của vi khuẩn A. xylinum. Thạch dừa chứa một số
yếu tố có khả năng phù hợp để tạo ra một giá thể mới cho quá trình nuôi cấy mô. Một
vài nghiên cứu BClàm giá thể nuôi cấy mô thực vật đã được tiến hành. Tuy nhiên, các
nghiên cứu này mới chỉ ở mức cơ bản và chưa cụ thể hóa các điều kiện ứng dụng
hay/hoặc chưa tạo ra một sản phẩm phục vụ cho quá trình nuôi cấy mô.
Nhằm đa dạng hóa các ứng dụng của BC, dựa vào đặc tính hút và giữ nước với tỉ
lệ cao vànhằm thử nghiệm dùng BC làm giá thể nuôi cấy mô thực vật, đề tài “Đánh giá
hiệu quả sử dụng sinh khối Acetobacter xylinum làm giá thể trong nhân giống thực
vật” được thực hiện.
1.2 Yêu cầu của đề tài
Xác định công thức tối ưu nhất để sản xuất BC trên các môi trường thay thế (môi
trường bổ sung rỉ đường và môi trường bổ sung mật ong) và đánh giá hiệu quả việc sử
dụng BC làm giá thể trong môi trường nuôi cấy thực vật.

1


1.3 Nội dung thực hiện
Khi thực hiện đề tài việc đầu tiên là cần phải tăng sinh giống vi khuẩn
Acetobacter xylinumnhằm sản xuất sinh khối BC thô. Sinh khối BC thô này sẽ được sử
dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.
Sau đó khảo sát, đánh giá và xác định công thức tối ưu nhất để sản xuất sinh khối
BC thô trên các môi trường bổ sung rỉ đường hoặcmật ong, kết quả thu được đối
chứng với môi trường nước dừa già.
Khi đã có đủ lượng BC cần thiết cho các thí nghiệm, tiếp tục nuôi cấy và đánh
giá hiệu quả việc sử dụng sinh khối BC làm giá thể trong nuôi cấy thực vật. Thực vật

dùng để khảo sát trong đề tài là cây lúa và cây cà chua.

2


Chương2TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.1.1 Định nghĩa
Nuôi cấy mô là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy vô trùng in vitro các bộ
phận tách rời khác nhau của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích
là nhân giống và cải thiện di truyền (ví dụ: nhân giống cây trồng), sản xuất sinh khối
các sản phẩm hóa sinh, nghiên cứu bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn
gen quý. Các hoạt động này được bao hàm trong thuật ngữ công nghệ sinh
học(biotechnology).
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào là phương pháp tách rời mô tế bào (thân, lá, rễ, chồi,
phôi, noãn, bao phấn) đem nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng thích hợp. Từ đó
chúng thực hiện quá trình sinh trưởng và phát triển (tiếp tục biệt hóa) để hình thành
mô, cơ quan hay hình thành cây mới.
Nguyên lý của kỹ thuật này dựa vào hai nguyên tắc cơ bản là tính toàn năng và
khả năng biệt hóa và tái biệt hóa của tế bào.
2.1.2 Ý nghĩa và tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật
Trong những năm gần đây, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã không ngừng phát
triển và đem lại hiệu quả thiết thực trong công tác chọn tạo và nhân giống cây trồng.
Những thành tựu trên đã góp phần rất lớn vào việc thúc đẩy sự phát triển nền nông
nghiệp công nghệ cao mang tính cạnh tranh trên thị trường quốc tế.
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật có nhiều ứng dụng vào lí luận và thực tiễn
quan trọng như nhân nhanh giống cây trồng quý, tạo giống sạch bệnh, lai tạo giống
mới, thu các chất có hoạt tính sinh học sớm từ mô sẹo, tạo các đối tượng nghiên cứu,
tạo tế bào gốc, phôi, mô, cơ quan sử dụng trong y học.
Hiện nay, con người ta bắt đầu ứng dụng khả năng nuôi cấy mô tế bào thực vật

tách rời ở quy mô công nghiệp để thu nhận các sản phẩm, các hoạt chất sinh học có giá
trị kinh tế cao. Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học trẻ có nhiều triển
vọng, được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực kinh tế.

3


2.1.3 Các thành phần cơ bản trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm một
số thành phần cơ bản sau: các giá thể là chất làm thay đổi trạng thái môi trường; các
muối khoáng đa lượng và vi lượng; các vitamin; các amino acid và các nguồn cung
cấp nitrogen khác; nguồn carbon là một số các loại đường; các chất điều hoà sinh
trưởng; các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai
tây.Tất cả các hợp chất này đều tham gia vào một hoặc nhiều chức năng trong sự sinh
trưởng và phân hoá của thực vật nuôi cấy in vitro.
Các nhà khoa học sử dụng các môi trường nuôi cấy rất khác nhau. Việc lựa chọn
môi trường nuôi cấy với thành phần hoá học đặc trưng phụ thuộc vào một số yếu tố:
- Đối tượng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác nhau về thành
phần dinh dưỡng trong môi trường.
- Mục đích nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy mô sẹo phôi
hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc huyền phù tế bào, vi nhân giống).
- Trạng thái môi trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng) (Vưu Ngọc Dung, 2010).
2.1.4. Giá thể trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.1.4.1 Khái niệm và công dụng của giá thể
Giá thể là một loại hay một hỗn hợp vật liệu được sử dụng làm vật nâng đỡ, là
chỗ cho rễ bám vào trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển. Vật liệu làm giá thể
phải chắc chắn và ổn định trong các điều kiện khác nhau, chịu được hấp vô trùng mà
không bị biến tính, trơ với các chất trong môi trường nuôi cấy. Ngoài ra, vật làm giá
thể phải sạch và không được chứa các chất lạ, vì thành phần của môi trường dinh
dưỡng đã được xác định và cần kiểm soát được trong từng trường hợp nuôi cấy. Chất

tạo đông thông dụng nhất là agar, nhưng theo thời gian, nhiều loại giá thể khác đã
được thương mại hóa với những tính năng ưu việt hơn như Rockwool, Gelrite.
Các mô hay các cơ quan thực vật hầu như thích hợp khi nuôi cấy trên bề mặt môi
trường mềm và dẻo. Tính chất này do các gel tạo nên. Nhiều chất có thể sử dụng để
làm đặc môi trường nuôi cấy mô thực vật nhưng kết quả đạt được khác nhau. Tùy theo
tốc độ tăng trưởng của mỗi loại thực vật và giá thành của sản phẩm thu được mà ta
thiết lập nên các quy trình nhân giống khác nhau ở mỗi loại thực vật (George, 1993).
2.1.4.2 Các tác nhân làm đặc môi trường

4


a) Giá thể agar
Agar là một sulfat polysacaride được tách ra bằng nước sôi từ các loài tảo đỏ
Rhodophycean, như Gelidium, Gracillarita vàPterocladia (đặc biệt là Gelidium
amansii), thu hoạch từ biển các quốc gia khác nhau. Nó thay đổi trong tự nhiên theo
nước xuất xứ, năm sản xuất, cách thức chiết xuất và xử lý. Agar là phức hợp của các
polysaccharid được tạo từ đường và galactose. Agar gồm hai phân đoạn: agarose và
agaropectin. Agarose là một polymer trung tính, tạo nên tính đông của agar.
Agaropectin là một polymer tích điện âm, làm cho agar có tính nhầy. Phân đoạn
agarose trong agar chiếm 50 – 90%. Điều này có nghĩa là có một sự khác biệt lớn về
tính chất giữa các sản phẩm agar từ các nhà cung cấp khác nhau (Geogre, 1993).
Từ báo cáo của White (1939), sở dĩ agar được sử dụng phổ biến vì có tính trong
suốt cao, tính ổn định, không độc hại, không tác động mạnh đến thành phần của môi
trường nuôi cấy và không kháng lại quá trình biến dưỡng của mô thực vật trong suốt
quá trình nuôi cấy (Geogre, 1993; Henderson và Kinnersley, 1988; McLachlan, 1985).
Tuy nhiên, có một số ý trái ngược lại với các ý kiến trên (Singha, 1980; Debergh,
1983; Kohlenbach và Wernicke, 1983; Arnold và Erickson, 1989; Babbara và Jain,
1998; George, 1993). Một số báo cáo đã cho thấy một số khuyết điểm của agar như là
tính không đồng nhất ở mỗi mẻ agar, sự ức chế tăng trưởng, sự hiện diện của các tạp

chất, và sự hư hỏng do hút ẩm (Romberger và Tabor, 1971; Debergh và ctv, 1983).
Theo White (1954), một vài loại agar có vai trò dinh dưỡng, vì một vài loại mô
thực vật có thể sử dụng các carbohydrate, acid amin và vitamin ở dạng vết có trong
agar. Bởi vì lý do này mà White đề nghị không nên sử dụng agar cho các thí nghiệm
về biến dưỡng thực vật. Agar chứa một lượng nhỏ các khoáng đa lượng và vi lượng,
đặc biệt là calcium, natri, kali, và phosphate. Các chất này có thể tham gia vào thành
phần môi trường nuôi cấy thực vật (Debergh, 1983; Scherer và ctv, 1988). Mặt khác,
agaropectin có các nhóm sulphate ester trên vài đơn vị lường, cho nên agar luôn chứa
một lượng lớn sulphate (George, 1993; Pierik, 1987).
Mặt khác, quá trình ly trích và tinh sạch agar là một quá trình phức tạp. Điều này
giải thích tại sao giá thành agar rất đắt. Nó được xem là thành phần đắt nhất trong các
thành phần của nuôi cấy mô thực vật (Babbara và Jain, 1998; George, 1993).
Một vài loại agar có thể chứa các hợp chất có thể gây cản trở sự tăng trưởng và
sinh tạo hình thái mô thực vật (Kohlenbach và Wernicke, 1983). Sự hình thành phôi
5


sinh dưỡng từ hạt phấn thuốc lá cho kết quả tốt hơn khi trải bao phấn trên môi trường
được làm đặc bởi Difco Noble agar hơn là Difco Bacto agar (George, 1993).
Skirvin (1981) chỉ ra rằng, hơi nước được thoát ra từ môi trường nuôi cấy tăng
khi nồng độ agar giảm. Vì vậy, cần phải thận trọng khi giữ mẫu trong môi trường được
làm đặc bởi agar.
Debergh (1983) chỉ ra rằng sự cứng của môi trường tỉ lệ tuyến tính với nồng độ
agar. Môi trường càng cứng, khả năng hấp thụ các chất điều hòa tăng trưởng, các ion
khoáng, các hợp chất hữu cơ của mô thực vật càng giảm. Agar sẽ bị thủy giải một
phần trong môi trường acid khi được hấp khử trùng bởi autoclave. Tính đông của agar
có thể bị giảm khi có sự hiện diện từ 0,8 – 1% than hoạt tính trong môi
trường.Debergh (1983) cũng khám phá ra rằng có một lượng đồng nhất đáng kể trong
Difco Bacto agar làm cho mô thực vật hóa đen nhanh chóng.
Theo Scherer và ctv (1988) thì agar chứa các hợp chất phenol chất này có thể ảnh

hưởng xấu đến mô thực vật.
Theo quy trình sản xuất agar từ rong Chỉ Vàng (Gracilaria verucosa) ở Việt
Nam (quy trình công nghệ do Bộ Thủy sản ban hành) thì 1 kg rong bổ sung từ 35 –
40g borat natri. Bổ sung borat natri để làm tăng độ chắc của thạch và giúp quá trình
phân pha nhanh trong quá trình nấu chiết agar (Trần Thị Luyến và Đỗ Minh Phụng,
1996).
Có nhiều ý kiến trái ngược nhau về sự tác động của agar lên mẫu cấy. Theo Tran
Thanh Van và ctv, khả năng tạo chồi hoa từ lớp mỏng biểu bì thuốc lá giảm 15% khi
nồng độ agar giảm từ 1% xuống 0,5%. Ngược lại, theo Mohn và ctv (1990), các chất
kích thích tố thực vật cũng như các chất kích thích quá trình sinh tạo hình thái khác bị
gãy trong mạng lưới agar nên không được mô thực vật sử dụng. Vì vậy, Mohn sử dụng
môi trường lỏng, không giá thể để nuôi cấy các lớp mỏng tế bào.
Quá trình hình thành gel và độ ổn định của gel bị ảnh hưởng bởi hàm lượng agar
và khối lượng phân tử của nó. Khả năng tạo gel phụ thuộc hàm lượng đường agarose.
Sự có mặt của ion sunfate làm cho gel bị mờ đục. Do đó nên tránh dùng nước cứng để
sản xuất agar. Không dùng agar trong môi trường pH < 4 và có nhiều chất oxy hóa
mạnh.
b) Giá thể agarose

6


Agarose là một trong hai phân đoạn của agar. Agarose được cấu tạo từ các β-D
(13)galactopyranose và 3,6-anhydro α-L (14)galactopyranose. Các đường đơn này
liên kết với nhau thành chuỗi bao gồm 20 - 160 đơn vị. Phân đoạn còn lại của agar là
agaropectin, cũng được cấu tạo từ các đường đơn như agarose, tuy nhiên chứa nhiều
gốc phosphate. Agarose được ly trích từ agar, được xử lý để loại bỏ các gốc sulphate.
Quy trình chế tạo agarose bao gồm nhiều khâu phức tạp, cho nên giá thành của
agarose đắt hơn agar rất nhiều. Vì vậy, chỉ nên sử dụng agarose cho các quá trình nuôi
cấy xác đáng. Shillito và ctv (1983) sử dụng agarose trong môi trường nuôi cấy

protoplast; Chaleff và Stolarz (1981) sử dụng agarose trong môi trường nuôi cấy bao
phấn.
c) Giá thể gelrite
Gelrite là một thương hiệu của hãng Merck &Co, Inc (Rahway, NJ) Kelco
Division, USA. Thành phần hóa học là polysaccharide bao gồm glucuronic acid,
rhamnoza và glucose (http://Plant cell Culture Gelrite®).
Gelrite là nhân tố làm đặc môi trường thường được sử dụng để thay thế agar.
Gelrite là một hetero-polysaccharide được tạo ra từ vi khuẩn Pseudomonas elodea.
Gelrite được cấu tạo bởi K-glucuronate, rhamnose và cellobiose. Các sản phẩm gelrite
trên thương mại chứa một lượng đáng kể K, Na, Ca, Mg. Khi đun nóng môi trường
chứa 0,1% gelrite hay ít hơn, các ion K+, Ca2+, Mg2+ làm cho polysaccharid của gelrite
hình thành nên dạng gel. Theo nhiều tác giả, các nguyên tố này không được tìm thấy
trong agar (Scherer và ctv, 1988).
Theo Scherer (1988), nước được liên kết không chặt trong gel của gelrite. Cho
nên các chất hòa tan dễ dàng thoát ra khỏi gel của gelrite hơn là gel của agar.
Gelrite là một chất thay thế agar trong nuôi cấy mô thực vật bởi vì giá thành của
nó rẻ hơn agar, và nó tạo ra một gel trong suốt, dễ dàng cho quá trình quan sát mô thực
vật và sự nhiễm vi sinh vật lên mô.
Trên thế giới, người ta đã sử dụng gelrite để nuôi cấy nhiều loại cây thân thảo,
bán gỗ. Có nhiều bài báo cho biết về sự thành công của việc sử dụng gelrite trong nuôi
cấy mô sẹo, hình thành trực tiếp hoặc gián tiếp các cơ quan hoặc phôi sinh dưỡng, chồi
hay rễ của nhiều loại thực vật. Trong phần lớn trường hợp, kết quả tốt như trên môi
trường agar. Một số trường hợp, kết quả thu được tốt hơn (George, 1993).

7


Anders và ctv (1988) ghi nhận, số cây con được tạo từ phôi sinh dưỡng của các
giống mía đường khác nhau trên môi trường chứa gelrite thì tốt hơn trên môi trường
chứa agar (hầu hết các loại agar đều được thử nghiệm).

Koetje và ctv (1989) nhận thấy, quá trình sinh tạo phôi từ mô sẹo lúa trên môi
trường N6 chứa gelrite thì tốt hơn trên môi trường chứa Bacto–agar và trên môi trường
chứa Bacto-agar, sự tăng trưởng mô sẹo lúa giảm nghiêm trọng.
d) Giá thể phytagel
Phytagel là một hetero-polysaccharide, được tạo ra từ vi khuẩn Pseudomonas
elodea, là một sản phẩm thương mại của gelrite do công ty Sigma sản xuất (Arregui và
ctv, 2003). Phytagel được cấu tạo bởi glucuronic rhamnose và glucose. Nó tạo ra một
loại gel trong suốt, không màu, độ dính cao, rất tiện lợi trong việc phát hiện sự nhiễm.
Trong một lít môi trường, thường sử dụng 1,5 – 2,5g. Quá trình đông của phytagel cần
có sự hiện diện của các cation (đặc biệt là cation hóa trị 2). Phần lớn các môi trường
nuôi cấy mô thực vật có nồng độ Ca2+ và Mg2+ đủ cho quá trình đông đặc của phytagel
(Nguyễn Thị Hồng Nhung, 2002). Phytagel là một chất có thể thay thế agar. Hàm
lượng N hữu cơ trong agar cao hơn nhiều so với trong phytagel, đây là một biểu hiện
của sự kém tinh khiết của agar so với phytagel (Arregui và ctv, 2003).
Một nghiên cứu so sánh hiệu quả của việc sử dụng phytagel so với agar lên sự
tạo củ của khoai tây được tiến hành trên 6 dòng khoai tây (Jaerla, Blanka, Claustar,
Kennebec, Desiree, Baraka). Trên môi trường chứa 6% đường, không có kích thích tố,
sự tạo củ trên phytagel tốt hơn trên agar Difco Bacto (Arregui và ctv, 2003).
e) Giá thể gelatin
Gelatin ở nồng độ cao (10%) cũng có hiệu quả tạo gel nhưng bị hạn chế sử dụng
bởi vì nó có nhiệt độ nóng chảy thấp (25oC).
f) Giá thểAgargel
Agargel là hỗn hợp của agar và phytagel do Sigma sản xuất.Ưu điểm của giá thể
này có tác dụng giảm hiện tượng thủy tinh thể trong nuôi cấy in vitro, sử dụng 3,5 - 5g
agargel cho 1 lít môi trường nuôi cấy mô thực vật. Hơn nữa, loại gel này cũng có độ
trong cao nên chúng ta dễ dàng phát hiện vi sinh vật nhiễm trong môi trường
( />g) Giá thể Isubgol

8

Isubgol là một chất nhầy được chiết xuất từ vỏ của Plantago ovata, sử dụng như
là một tác nhân làm đặc môi trường nuôi cấy mô thực vật và vi sinh vật. Vỏ hạt
Plantago có thể được hấp thụ một lượng nước gấp 7 - 15 lần trọng lượng của nó.
Isubgol là một chất keo và là một polysaccharide tự nhiên được cấu tạo chủ yếu từ
xylose, arabinose, galatouronic acid, rhamnose và galactose (Babbara và Jain, 1998).
Các thuộc tính của ‘isubgol’ như tính nhầy polysaccharide và tính chất keo,
kháng lại các hoạt động của enzyme, khả năng làm đông tốt thậm chí trong nước lạnh,
độ trong của gel rất cao. Nó rất có thể trở thành yếu tố thay thế hoàn toàn agar trong
nuôi cấy mô thực vật. Giá của ‘isubgol’ ở Ấn Độ bằng 1/3 giá của agar sử dụng trong
các nghiên cứu của Babbara và bằng 1/100 giá agar Difco (Babbara và Jain, 1998).
h) Giá thể Transfergel
Được sử dụng làm đông môi trường nuôi cấy chồi mầm, chồi đỉnh, phôi soma.
Các chất tạo gel khác như Bacto agar, gellam gum có tác dụng tương tự như agar
nhưng giá thành cao hơn do có độ tinh khiết cao hơn và có nhiều công dụng hỗ trợ
khác cho nuôi cấy mô.
i) Giá thể Sea Plaque(k)
Công ty FMC Corp gần đây đã phát triển một loại agarose được tinh sạch cao gọi
là Sea Plaque(k), loại này có thể được dùng để phục hồi các protoplast đơn (single
protoplast) trong nuôi cấy. Cellophane đục lỗ (perforated cellophane), cầu giấy lọc
(filter paper bridge), bấc giấy lọc (filter paper wick), bọt polyurethane (polyurethane
foam) và xốp polyester (polyester fleece) là các phương thức thay đổi giá thể được
dùng trong môi trường nuôi cấy mô hoặc tế bào.
Ngoài các loại giá thể trên còn có một số loại giá thể khác như: Kelcogel,
Alginates, 'Kappa' – carrageenan. Mỗi giá thể có những ưu điểm riêng thích hợp với
mỗi giai đoạn của quá trình nuôi cấy, tuy nhiên các giá thể này có giá thành cao nên sử
dụng rất hạn chế.
2.1.4.3 Giá thể trên môi trường lỏng
Sự tăng trưởng các mô thực vật trên môi trường đặc nhìn chung là chậm hơn so
với môi trường lỏng. Mặt khác trọng lượng khô thu được khi nuôi cấy mô thực vật trên

các loại môi trường đặc tỷ lệ nghịch với nồng độ agar có trong môi trường (George,
1993).

9


Các nghiên cứu trong lĩnh vực nuôi cấy mô trên thế giới gần đây đã chứng minh
vai trò kìm hãm của agar đối với sự phát triển của cây nuôi cấy. Agar làm cho môi
trường thiếu độ thông thoáng và cản trở việc khuếch tán các khí hòa tan cũng như sự
hấp thụ nước và các chất khoáng của cây nuôi cấy. Rễ của cây nuôi cấytrên giá thể
agar có hệ thống bó mạch thường phát triển yếu, do đó trong những ngày đầu ở vườn
ươm cây phát triển chậm và có tỉ lệ chết cao (Nguyễn Thị Quỳnh và ctv, 2000).
Theo Romberger và Tabor (1971), gel làm giảm sự khuếch tán của các hợp chất
có phân tử lượng lớn. Họ cho rằng nguyên nhân làm giảm tốc độ tăng trưởng của mô
là do sự cố định enzyme invertase từ mô vào trong gel. Sự cố định này làm giảm lượng
glucose và fructose trong mô thực vật.
Theo Debergh (1983), các vi lượng và phosphate có lẽ được hấp thu bởi agar, vì
vậy cho nên chúng trở thành các ion mà ít được mô thực vật sử dụng.
Sự hấp thu ion nitrate vào chồi và cây con được đặt cấy trên môi trường agar ít
hơn trên môi trường lỏng (George, 1993).
Các thành phần môi trường mà mô thực vật có thể sử dụng được khi nuôi cấy
trên môi trường agar đặc thì ít hơn trên môi trường lỏng hoặc lỏng lắc bởi vì trong môi
trường agar có thế nước giảm và độ nhớt cao (hạn chế sự khuếch tán). Điều này dẫn
đến ít hơn một nửa bề mặt mô thực vật tiếp xúc với môi trường. Khi thế nước giảm
dẫn đến sự giảm hấp thu ion vào mô thực vật (George, 1993).
Yong Soo Park, Syuuichi Kakuta, Atsushi Kano và Mitsuyasu Okabe (1996) ở
trường Shizuoka University, Nhật Bản nuôi cấy thành công các thể ‘protocorm-like
bodies’ của lan Phalaenopsis trong môi trường lỏng có giá thể là bông không thấm.
2.1.4.4 Những vật liệu xốp làm giá thể
Các mô cũng như các cơ quan thực vật phát triển tốt hơn trên vật liệu xốp, trơ về

sinh học hơn là trên giấy lọc. Các mô hiếu khí trên thực vật và mô rễ đều phát triển tốt
trên vật liệu xốp hơn là môi trường được làm đặc bởi agar hay trên môi trường lỏng,
tĩnh. Các giá thể có cấu trúc xốp và nhiều lỗ thông khí, như perlite, vermiculite, sợi
cellulose, rockwool, florialite (hỗn hợp vermiculite và cellulose) giúp cho môi trường
vùng rễ được thông thoáng, nhờ vậy mô thực vật dễ dàng hấp thu nước và muối
khoáng hơn (Nguyễn Thị Quỳnh và ctv, 2000). Các chồi của nhiều loại thực vật đã
phát triển tốt trên rockwool được làm ẩm với môi trường. Tanaka và ctv (1991) đã

10


nuôi nhiều loại thực vật khác nhau trên rockwool bên trong các túi nhựa được làm từ
các tấm film fluorocarbon không thấm nước, nhưng thấm khí khá tốt.
Nguyễn Thị Quỳnh và ctv (2000), nghiên cứu ảnh hưởng của các giá thể agar,
gelrite, florialite, cát, vermiculite lên sự tăng trưởng cây hông (Paulownia
fortunei)trong điều kiện nuôi cấy dị dưỡng và quang tự dưỡng. Các giá thể có cơ cấu
xốp như vermiculite, florialite, perlite giúp cây tăng trưởng tốt hơn trên giá thể agar và
gelrite.
Dương Tấn Nhựt, T. Takamura, H. Watanabe, K. Okamoto và M. Tanaka (2003),
nghiên cứu sự đáp ứng của chồi dâu invitro đối với chất lượng ánh sáng bằng cách
nuôi cấy các chồi dâu trong hệ thống ‘Culture Pack’ - rockwool System.
2.1.4.5 Giá thể từ BC
Giá thể từ BClà một hướng nghiên cứu mới nhằm khắc phục một số nhược điểm
của các loại giá thể trên. Giá thể BC đã được một nhóm nghiên cứu khoa sinh học
thuộc trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM bước đầu nghiên cứu sử dụng
trong nuôi cấy mô, tuy nhiên các nghiên cứu này chỉ dừng lại ở một số nghiên cứu cơ
bản mà chưa cụ thể hóa các điều kiện ứng dụng.
Vi sinh vật được dùng để sản xuất giá thểBClà vi khuẩn Acetobacter xylinum.
2.2. Đặc điểm cấu tạo của giống vi khuẩn Acetobacter
Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadiaeace, phân bố rộng rãi

trong tự nhiên và có thể được phân lập từ không khí, đất, nước, lương thực thực phẩm,
dấm, rượu, bia hay hoa quả. Có khoảng 20 loài thuộc giống Acetobacter đã được phân
lập và mô tả, trong đó khá nhiều loài có ý nghĩa kinh tế.
2.2.1 Đặc điểm cấu tạo chung
Nhìn chung vi khuẩn Acetobacter có dạng hình que. Tuy nhiên tuỳ điều kiện nuôi
cấy (nhiệt độ, thành phần môi trường nuôi cấy) mà các vi khuẩn Acetobacter có thể
sinh ra các tế bào có hình thái khác biệt dạng
kéo dài hoặc phình to ra.
Tế bào đứng riêng lẽ hoặc kết thành từng
chuỗi. Kích thước thay đổi tuỳ loài (0,3 -0,6 x
1,0 - 8, 0μm). Có thể di động (có tiên mao đơn
hoặc chu mao), hoặc không di động (không có

11


tiên mao). Không sinh nha bào tử, hiếu khí bắt buộc và chịu được độ acid cao.Hình
2.1 Vi khuẩn A.xylinum
Vi khuẩn Acetobacter có khả năng đồng
hoá nhiều nguồn thức ăn carbon khác nhau
ngoài trừ tinh bột.

Nguồn:gspot
.com/2009/02/pohon-kelapa-termasukdalam-keluarga.html

Một số loài Acetobacter có khả năng tạo thành váng trên môi trường lỏng, khả
năng tạo thành váng thay đổi tuỳ loại:
Acetobacter xylinum: tạo thành váng cellulose khá dày và chắc.
Acetobacter orleanoe: tạo thành váng mỏng nhưng chắc.
Acetobacter pasteurianum: tạo thành váng khô và nhăn nheo.

Acetobacter suboxydans: tạo thành váng mỏng dễ tan rã.
Acetobacter curvum: sinh acid acetic với nồng độ cao nhưng tạo thành váng
không chắc chắn (Nguyễn Thúy Hương, 2003).
2.2.2 Tình hình nghiên cứu về màng BC ở Việt Nam và trên thế giới
Trên thế giới màng bacterial cellulose (BC) đã được ứng dụng rất nhiều trong các
lĩnh vực khác nhau như dùng làm màng phân tách cho quá trình xử lý nước, chất mang
đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào, dùng làm chất biến đổi độ nhớt trong
sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay
thay thế thực phẩm. Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng BC đã được ứng dụng làm da
tạm thời thay thế da thật trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo
điều trị các bệnh tim mạch; làm mặt nạ dưỡng da cho người.
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở mức độ khiêm tốn.
Trong đó các nghiên cứu mới chỉ ở giai đoạn bước đầu còn cơ bản. Các kết quả ứng
dụng hầu như chỉ dừng lại ở điều kiện thí nghiệm. Trong những năm gần đây phòng
thí nghiệm Thực vật – Vi sinh thuộc Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2 đã phân lập
và tuyển chọn được chủng A.xylinum BHN2 có khả năng tạo màng BC. Đồng thời
nghiên cứu này bước đầu cho thấy màng BC từ chủng A. xylinum BHN2 có khả năng
ứng dụng trị bỏng cho thỏ và là cơ sở để tạo ra màng trị bỏng cho người (Trịnh Thị
Trang Đài, 2012).

12


2.2.3. Đặc điểm của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum
2.2.3.1 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Acetobacter xylinum
Acetobacter xylinum (A. aceti ssp. Xylinum, A. xylinus) có nguồn từ Philippin.
Acetobacter xylinum thuộc nhóm vi khuẩn acetic. Theo hệ thống phân loại của nhà
khoa

học

Bergey

thì

Acetobacter

xylinum

thuộclớp

Schizommycetes,

bộ

Pseudomonadales, họ Pseudomonadieae.Gần đây Acetobacter xylinumđã được xếp
vào giống mới Gluconacetobacter.
A. xylinum là vi khuẩn Gram âm có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di
động hay không di động, không sinh bào tử. A.xylinum là loại vi khuẩn dài khoảng
2 μm, đứng riêng lẽ hoặc xếp thành chuỗi, có khả năng tạo váng hemicellulose khá
dày, bắt màu với thuốc nhuộm Iod và H2SO4(Nguyễn Lân Dũng và ctv, 1975; Holt và
ctv, 1994; Kojima và ctv, 1998).
2.2.3.2 Đặc điểm sinh lý và sinh hoá của vi khuẩn A. xylinum
A. xylinum là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, cho phản ứng catalase dương tính; có
khả năng oxy hóa tiếp tục ethanol thành acetic acid CH3COOH, CO2 và H2O; chuyển
hóa được glucose thành acid, glycerol thành dihydroxyaceton; nguồn carbohydrate mà
A. xylinum sử dụng có khả năng tạo sinh khối cao là glucose, frutose, maltose; tổng
hợp được cellulose nhưng không có khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer và
không tạo sắc tố nâu (Nguyễn Lân Dũng, 1975; Holt và ctv, 1994).
A. xylinum sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau và tùy thuộc vào chủng mà

nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất. Chúng chuyển hóa glucose thành gluconic
acid, điều này làm pH môi trường giảm từ 1 đến 2 đơn vị (Kojima và ctv, 1998).
A.xylinum tạo nên lớp cellulose dày là do trong môi trường nuôi cấy nước dừa có
bổ sung các chất dinh dưỡng cần thiết. Cellulose là những polysaccharide không tan
trong nước mà tan trong môi trường kiềm. Cellulose cũng là thành phần chính của
màng tế bào thực vật.
A.r xylinum sống thích hợp ở pH < 5, nhiệt độ 28-32oC. Ở nhiệt độ này quá trình
hình thành BClà tốt nhất (Nguyễn Thúy Hương, 2003).
2.2.3.3 Một vài đặc điểm của cellulose vi khuẩn (Bacterial cellulose – BC)
Cellulose là một polymer không phân nhánh bao gồm những gốc glucopyranose
nối với nhau bằng liên kếtβ-1,4. Các nghiên cứu cơ bản về BC cho thấy, BC có cấu
trúc hóa học giống y hệt PC (plant cellulose – cellulose thực vật). Tuy nhiên, cấu trúc
13


đa phân và thuộc tính của BC khác với PC. Các sợi mới sinh ra của BC kết lại với
nhau để hình thành nên các sợi sơ cấp (subfibri), có chiều rộng khoảng 1,5nm, là
những sợi mảnh nhất có nguồn gốc tự nhiên. Các sợi cơ bản kết lại thành vi sợi
(microfibril). Các vi sợi nằm trong bó (bundle), và cuối cùng hình thành các dải
(ribbon).
Brown (1978) đã nghiên cứu các tính chất của BC như độ cứng, độ dính, độ dai,
và ảnh hưởng của các dung dịch đường, muối, và các chất gum (HM pectin, LM
pectin) lên tính chất của BC. Các mảnh PC có độ cứng là 3,68 kg, độ dính 0,37 kg, độ
dai 0,36 kg (các chỉ số tương ứng theo thứ tự ở mực tươi là 3,68 kg, 0,34 kg, 0,23 kg).
Độ cứng của các miếng BC giảm khi chúng được nhúng vào dung dịch đường, HM
pectin, LM pectin, carrageenanvà ngược lại độ cứng tăng khi được nhúng vào dung
dịch muối.

b
a

Hình 2.2 Các sợi nano cellulose dưới kính hiển vi điện tử. a) cellulose vi khuẩn (BC); b)
cellulose thực vật (PC).
Nguồn:
m/2010_12_01_archive.html

Nguồn: />
Các dải có chiều dày 3 – 4 nm x chiều rộng 70 – 80 nm; hoặc 3,2 x 133 nm; hoặc
4,1 x117 nm. Trong khi chiều dài của các sợi cellulose được tạo ra từ gỗ thông là
30000 – 75000 nm hay gỗ bulô là(Betula) 14000 – 40000 nm. Bielecki nghiên cứu
nhận thấy những dải vi sợi cellulose mịn có chiều dài thay đổi từ 1 – 9 µm làm hình
thành nên cấu trúc lưới dày đặc, được ổn định bởi các liên kết hydrogen. BC khác với
PC về chỉ số kết chặt, về mức độ polymer hóa. Thông thường BC có mức độ polymer
hóa từ 2000 – 6000; tuy nhiên trong một vài trường hợp đạt tới 16000 – 20000, trong
khi mức polymer hóa ở thực vật là 13000 – 14000(Brown, 1978; Hirai và Horii, 1999).
14