KHẢO SÁT HIỆU ỨNG TĂNG TRƯỞNG CỦA OLIGOCHITOSAN CHẾ TẠO BẰNG KỸ THUẬT BỨC XẠ TRÊN TẢO Spirulina platensis

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HIỆU ỨNG TĂNG TRƯỞNG CỦA
OLIGOCHITOSAN CHẾ TẠO BẰNG
KỸ THUẬT BỨC XẠ TRÊN TẢO
Spirulina platensis

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ THÚY HẰNG
Niên khóa

: 2009-2013

Tháng 06/2013

 
 


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
 

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HIỆU ỨNG TĂNG TRƯỞNG CỦA
OLIGOCHITOSAN CHẾ TẠO BẰNG
KỸ THUẬT BỨC XẠ TRÊN TẢO
Spirulina platensis

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. NGUYỄN THỊ KIM LINH

NGUYỄN THỊ THÚY HẰNG

TS. LÊ QUANG LUÂN

Tháng 06/2013
 
 


LỜI CẢM ƠN
Em thành kính gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm
Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả các
quý thầy cô đã truyền đạt cho em kiến thức và kinh nghiệm trong suốt quá trình học
tập tại trường.
Em xin chân thành cảm ơn đến thầy Lê Quang Luân và cô Nguyễn Thị Kim
Linh đã tạo điều kiện tốt nhất, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian
thực hiện khóa luận tốt nghiệp.

Em xin gửi đến chị Uyên, chị Trang hiện đang làm việc tại Trung tâm Hạt nhân
Tp.Hồ Chí Minh, chị Bích đang làm tại phòng vi tảo, Bộ môn Công nghệ Sinh học lời
cảm ơn chân thành nhất.
Cảm ơn các bạn cùng làm tại phòng vi tảo cũng như các bạn lớp DH09SH đã
giúp đỡ, chia sẻ với tôi trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp này.
Con xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến gia đình, ba mẹ đã động viên,
giúp đỡ con cả về tinh thần lẫn vật chất để con hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này.

TP.Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2013
Sinh viên
Nguyễn Thị Thúy Hằng

i 

 


TÓM TẮT
Spirulina platensis là một trong những loại tảo có giá trị dinh dưỡng rất cao,
đem lại lợi ích cho con người rất nhiều trong các ngành thực phẩm, dược phẩm. Vì thế
việc tăng sinh khối tảo bằng cách bổ sung thêm các chất điều hòa tăng trưởng vào môi
trường nuôi cấy mà vẫn giữ được các hàm lượng dinh dưỡng có trong tảo luôn được
chú ý và quan tâm đặc biệt.
Chitosan từ lâu cũng đã được biết đến như là một chất điều hòa sinh trưởng
thực vật, chất kích thích sinh trưởng cho tôm, cua, cá, làm chất mang dược phẩm,
enzyme, tế bào, màng phủ vết thương. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng
chitosan được cắt mạch bằng kỹ thuật bức xạ ở dạng bột tạo oligochitosan và bổ sung
vào môi trường nuôi cấy tảoSpirulina platensis để khảo sát hiệu ứng kích thích trên tảo
qua các thí nghiệm: chiếu xạ chitosan trên nguồn xạ gamma Co-60, khảo sát hiệu ứng
kích thích của oligochitosan được chiếu xạ bằng kỹ thuật bức xạ với các trọng lượng

phân tử khác nhau. Trọng lượng phân tửoligochitosan gây hiệu ứng tăng trưởng tối ưu
lên tảo được xác định, sau đótiếp tục khảo sát ở các nồng độ khác nhau và thời gian bổ
sung vào môi trường nuôi cấy.
Kết quả cho thấy chitosan sau khi chiếu xạ có trọng lượng phân tử khoảng từ
3,7 – 28,9 kDa và oligochitosan có Mw là 15,4 kDa với nồng độ 100 ppm được bổ
sung vào ngày thứ 4 của quá trình nuôi tảo gây hiệu ứng kích thích cao trên tảo
Spirulina platensis.

ii 

 


SUMMARY
Name of subject: EFFECT OF OLIGOCHITOSAN CREATED BY IRRADIATION
ON THE GROWTH OF Spirulina platensis
The research was carried out from January to May, 2013 at the department of
biotechnology, Nong Lam University, Ho Chi Minh City.
Spirulinaplatensisisone

of

forpeoplebyfood

thealgaehaveveryhighnutrient

value,

useful

industry,

pharmaceutical.

Sotheincreasealgaebiomassbyaddingregulatorsgrowthinculture
mediumwhichretainsthenutritional contentinalgae always pay attention and special
care.
Chitosanhaslongbeen

knownas

aqualityplantgrowth

regulators,

growthstimulantsforshrimp, crabs andfish, aspharmaceuticalcarriers, enzymes, cells,
woundcoatings.This

study,chitosandisconnectedbyradiationtechniques

forcreatingoligochitosanpowderandadded

tothe

was

used
culture

mediumtosurveySpirulinaplatensisstimulatingeffectonalgaethroughexperiments:

irradiationof

chitosanon

co-60

gammaradiationsource,

surveystimulatingeffectsofoligochitosanirradiatedbyradiationtechniqueswithdifferentm
olecularweights. After determiningthemolecularweightoligochitosancausethe

best

effectsonalgalgrowth,the experiment on different concentrations of oligochitosan and
time added it to the culture medium has been carried out.
The resultsshowed thatchitosanafterirradiationwithmolecular weightsranged
from3.7 to 28.9kDaand Mw~15.4kDawitha concentration of100ppmwas addedon the 4
dayofthealgaecausedhigherstimulationeffectonSpirulinaplatensis. 
Keywords:

chitosan,

oligochitosan,

Spirulinaplatensis,molecularweight, concentration. 

iii 

 

irradiation,


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ i
Tóm tắt ............................................................................................................................. ii
Summary ......................................................................................................................... iii
Danh sách các chữ viết tắt .............................................................................................. vi
Danh sách các bảng ....................................................................................................... vii
Danh sách các hình ....................................................................................................... viii
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2. Yêu cầu ..................................................................................................................... 2
1.3. Nội dung thực hiện ................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1. Tảo Spirulina platensis ............................................................................................. 3
2.1.1. Giới thiệu tảo Spirulina platensis .......................................................................... 3
2.1.2. Chu kỳ sinh trưởng của tảo.................................................................................... 4
2.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của tảo .................................................... 4
2.1.4. Một số ứng dụng của tảo Spirulina platensis ........................................................ 8
2.2. Sơ lược về chitin, chitosan, oligochitosan ................................................................ 9
2.2.1. Chitin ..................................................................................................................... 9
2.2.1.1 Cấu trúc phân tử chitin ........................................................................................ 9
2.2.1.2 Tính chất của chitin ............................................................................................. 9
2.2.2. Chitosan ............................................................................................................... 10
2.2.2.1 Cấu trúc phân tử chitoan.................................................................................... 10
2.2.2.2 Tính chất của chitoan......................................................................................... 10
2.2.3. Oligochitosan ....................................................................................................... 11
2.3. Nguồn của chitin, chitosan, oligochitosan.............................................................. 11

2.4. Phương pháp chế tạo chitin, chitosan, oligochitosan ............................................. 12
2.4.1. Phương pháp chế tạo chitin ................................................................................. 12
2.4.2. Phương pháp chế tạo chitosan ............................................................................. 12
iv 

 


2.4.3. Phương pháp chế tạo oligochtosan ...................................................................... 13
2.4.3.1 Phương pháp sinh học ....................................................................................... 13
2.4.3.2 Phương pháp hóa học ........................................................................................ 14
2.4.3.3 Phương pháp bức xạ .......................................................................................... 16
2.5. Ứng dụng của chitin, chitosan, oligochitosan ........................................................ 17
2.5.1. Ứng dụng trong nông nghiệp và công nghệ sinh học .......................................... 17
2.5.2. Ứng dụng trong các lĩnh vực khác ...................................................................... 18
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 19
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện ............................................................................. 19
3.2. Vật liệu ................................................................................................................... 19
3.2.1. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm ................................................................................ 19
3.2.2. Môi trường nuôi cấy tảo ...................................................................................... 19
3.3. Điều kiện thí nghiệm .............................................................................................. 20
3.4. Các bước tiến hành thí nghiệm ............................................................................... 20
3.4.1. Chuẩn bị môi trường Zarrouk .............................................................................. 20
3.4.2. Chuẩn bị dung dịch oligochitosan ....................................................................... 20
3.5. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 21
3.5.1. Cắt mạch chitosan dạng bột bằng kỹ thuật bức xạ .............................................. 21
3.5.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát hiệu ứng kích thích của oligochitosan theo Mw ........... 21
3.5.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát hiệu ứng kích thích theo nồng độ ................................. 22
3.5.4. Thí nghiệm 3: Khảo sát hiệu ứng kích thích theo thời gian ................................ 23
3.6. Phương pháp xử lý thống kê số liệu ....................................................................... 24

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 25
4.1. Cắt mạch chitosan dạng bột bằng kỹ thuật bức xạ ................................................. 25
4.2. Hiệu ứng kích thích tăng trưởng của oligochitosan theo Mw ................................ 26
4.3. Hiệu ứng kích thích tăng trưởng của oligochitosan theo nồng độ.......................... 29
4.4. Hiệu ứng kích thích tăng trưởng theo thời gian ..................................................... 31
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 35
5.1. Kết luận................................................................................................................... 35
5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 36
PHỤ LỤ
v 

 


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ctv

Cộng tác viên

CV

Coefficient of Variation

ĐC

Đối chứng

EDTA

Ethylene diamin tetra acetic

GPC

Gel permeation chromatography

HPLC

High performance liquid chromatography

Mw

Molecular weight

NT

Nghiệm thức

NTĐC

Nghiệm thức đối chứng

SVĐC

So với đối chứng

vi 

 

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1Thành phần đa lượng ...................................................................................... 19
Bảng 3.2Thành phần vi lượng ....................................................................................... 20
Bảng 3.3Các nghiệm thức khảo sát ở thí nghiệm 1 ...................................................... 21
Bảng 3.4 Các nghiệm thức khảo sát ở thí nghiệm 2 ..................................................... 22
Bảng 3.5Các nghiệm thức khảo sát ở thí nghiệm 3 ...................................................... 23
Bảng 4.1 Ảnh hưởng của liều xạ đến Mw .................................................................... 26
Bảng 4.2Ảnh hưởng của oligochitosan với Mw khác nhau lên tảo .............................. 27
Bảng 4.3Ảnh hưởng theo nồng độ của oligochitosan lên tảo ....................................... 29
Bảng 4.4 Ảnh hưởng của oligochitosan theo thời gian lên tảo ..................................... 32

vii 

 


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cấu trúc tảo Spirulina platensis ....................................................................... 3
Hình 2.2 Cấu trúc phân tử chitin ..................................................................................... 9
Hình 2.3 Cấu trúc phân tử chitosan .............................................................................. 10
Hình 4.1 Tảo sau các ngày nuôi cấy thí nghiệm 1 ........................................................ 28
Hình 4.2 Tảo sau các ngày nuôi cấy thí nghiệm 2 ........................................................ 31
Hình 4.3 Tảo sau các ngày nuôi cấy thí nghiệm 3 ........................................................ 33

viii 

 

 

Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay các sản phẩm được chế tạo bởi công nghệ bức xạ được sử dụng khá
phổ biến trong nhiều lĩnh vực như: dược học và y học, công nghệ sinh học, xử lý nước
thải, công nghiệp, nông nghiệp, thực phẩm. Một trong các sản phẩm đó là chitosan có
trọng lượng phân tử thấp (oligochitosan). Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng
oligochitosan như là một chất vừa có khả năng kích thích sự hấp thu các chất dinh
dưỡng của thực vật đồng thời còn có tác dụng giúp cây trồng kháng lại một số bệnh do
vi sinh vật gây nên, giúp cây trồng chống chịu tốt với các bất lợi của môi trường.
Bên cạnh đó nhu cầu sử dụng các loại thực phẩm vừa có giá trị dinh dưỡng cao
vừa tốt cho sức khỏe của người dân ngày càng cao. Tảo lam Spirulina platensis là loại
tảo được quan tâm nhiều trong các ứng dụng dinh dưỡng, trong dược phẩm và công
nghiệp hóa mỹ phẩm cho con người bởi vì tảo chứa nhiều chlorophyll, protein, các acid
béo thiết yếu và vitamin. Vì có những giá trị dinh dưỡng và giá trị sinh học đặc biệt như
thế tảo Spirulina đã được coi là một loại thực phẩm chức năng, một thức ăn cho sức
khoẻ và đã được nhiều nước, nhất là những nước công nghiệp phát triển đã đưa vào
nuôi trồng công nghiệp và sử dụng rộng rãi dưới nhiều dạng chế phẩm khác nhau.
Ứng dụng của Spirulina platensis trong thực tiễn y sinh học lẫn đời sống của con
người ngày càng được mở rộng nhiều hơn. Các nghiên cứu nhằm tăng sinh khối và
khảo nghiệm ảnh hưởng của các điều kiện khác nhau lên tảo này được chú ý và quan
tâm đặc biệt. Vấn đề đặt ra là làm sao để tăng sinh khối Spirulina trong quá trình nuôi
cấy ở điều kiện phòng thí nghiệm nhằm đáp ứng tốt các ứng dụng quan trọng trên.
Chính vì vậy, việc ứng dụng sản phẩm từ các polymer tự nhiên chế tạo bằng
công nghệ bức xạ vào quy trình nuôi trồng tảo, nghiên cứu để tìm ra các thành phần
dinh dưỡng mới bổ sung vào môi trường nuôi tảo, tăng sinh khối tảo nhưng vẫn giữ
được giá trị dinh dưỡng, chất lượng tốt và đặc biệt là an toàn cho người tiêu dùng là

vấn đề cần được quan tâm.
Do những vấn đề cấp thiết về tình hình nuôi tảo hiện nay ở nước ta, đề tài “Khảo
sát hiệu ứng tăng trưởng của oligochitosan chế tạo bằng kỹ thuật bức xạtrên
tảoSpirulina platensis”được tiến hànhnhằm tìm ra một loại oligochitosan với trọng
1 

 


 

lượng phân tử và nồng độ thích hợp có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển
đối với giống tảo Spirulina platensis và có thể gia tăng hàm lượng các thành phần dinh
dưỡng có trong tảo, góp phần nâng cao giá trị dinh dưỡng của loại tảo này.
1.2. Yêu cầu
Xác định được trọng lượng phân tử, nồng độ của oligochitosan và thời gian bổ
sung vào môi trường nuôi cấy ảnh hưởng tốt đến sự sinh trưởng và phát triển của tảo.
1.3.Nội dung thực hiện
-

Cắt mạch chitosan ở dạng rắn bằng phương pháp chiếu xạ với các liều xạ khác
nhau.

-

Khảo sát sự ảnh hưởng của oligochitosan theo trọng lượng phân tử lên tảo.

-

Khảo sát sự ảnh hưởng theo nồng độ của oliogochitosan có trọng lượng phân tử

tối ưu đã được lựa chọn lên sự tăng sinh tảo.

-

Khảo sát thời gian bổ sung oligochitosan có trọng lượng phân tử và nồng độ tối
ưu vào môi trường nuôi tảo.

2 

 


 

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tảo Spirulina platensis
2.1.1. Giới thiệu tảo Spirulina platensis
Tảo Spirulina platensisthuộc họ Oscillatoriaseae, bộ Oscillatoriales, lớp
Hormogoiophyceae, ngành Cyanophyta ( tảo lam).
Spirulina platensislà một loài vi tảo có dạng xoắn hình lò xo, màu xanh lam với
kích thước chỉ khoảng 0,25 mm. Chúng sống trong môi trường giàu bicarbonat (HCO3và độ kiềm cao (pH từ 8,5 -9,5). Chúng có những đặc tính ưu việt và giá trị dinh
dưỡng cao.Spirulina platensis xuất hiện cách đây hơn 3 tỷ năm. Nó là vi khuẩn lam cổ
có lịch sử lâu đời hơn tảo nhân thật hoặc thực vật bậc cao tới hơn 1 tỷ năm.

Hình 2.1 Cấu trúc tảo Spirulina platensis().

Hơn 1 ngàn năm trước tổ tiên của những người Aztect ở Mexico đã biết thu hái
Spirulina từ các hồ kiềm tính, phơi dưới ánh nắng mặt trời và dùng làm thực phẩm.
Hiện nay tập tính này vẫn phổ biến trong cộng đồng người Kanembous ở Chad. Tên
gọi Spirulina do nhà tảo học Deurben đặt năm 1927, dựa trên hình thái của tảo là dạng

sợi xoắn ốc (spiralis).
Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu Spirulina platensisphục vụ cho
việc sản xuất tảo làm thức ăn, dược phẩm, mỹ phẩm cho con người. Từ đó, nó đã xuất
hiện trong khẩu phần ăn trong các chương trình chống suy dinh dưỡng trẻ em. ỞViệt
Nam tảo Spirulina platensis được giáo sư Ripley D.Fox đưa vào Việt Nam từ năm

3 

 


 

1985. Hiện nay nước ta đã có nhiều cơ sở nuôi trồng tảo Spirulina như: Vĩnh Hảo
(Bình Thuận),Suối Nghệ (Đồng Nai), Đắc Min (Đắk Lắk).
2.1.2. Chu kì sinh trưởng của tảoSpirulina platensis
Sự sinh trưởng của tảo được diễn tả bằng sự phân chia tế bào. Với chế độ dinh
dưỡng thích hợp và điều kiện sinh lý học thuận lợi, quá trính sinh trưởng của tảo trải
qua ít nhất các pha sau (trích dẫn bởi Lê Thị Phương Hồng, 1996).
Pha chậm: Sự vô hiệu hóa các enzyme, sự giảm tốc độ trao đổi chất của tảo
giống, tế bào gia tăng kích thước nhưng không có sự phân chia, một số yếu tố khuyếch
tán được tạo ra do chính các tế bào thì cần cho quá trình cố định carbon, hoạt động trao
đổi chất của các tế bào đã ức chế sự hoạt động của các độc tố nào đó có mặt trong môi
trường, hay do cấy tảo vào môi trường có chứa một vài chất có nồng độ quá cao.
Pha tăng trưởng: là giai đoạn mà tế bào phân chia rất nhanh và liên tục. Tốc độ
tăng trưởng trong giai đoạn này tùy thuộc vào kích thước tế bào, cường độ ánh sáng,
nhiệt độ.
Pha tăng trưởng chậm: Khi có một vài nhân tố xuất hiện như : sự giảm sút của
yếu tố dinh dưỡng nào đó, tỷ lệ cung cấp oxy và carbonic, sự thay đổi pH, sự hạn chế
ánh sáng, sự xuất hiện các yếu tố ngăn cản sự phân chia các tế bào do một chất độc

nào đó....thì quá trình sinh trưởng của tảo bị ức chế, đây là giai đoạn đầu của pha tăng
trưởng chậm. Tuy nhiên, pha này diễn ra rất nhanh với sự cân bằng được tạo ra giữa
tốc độ tăng trưởng và các nhân tố giới hạn, nó được xem là pha quân bình.
Pha suy tàn: Khi các chất dinh dưỡng trở nên cạn kiệt không đủ cung cấp cho sự
sinh trưởng và trao đổi chất đến mức trở nên độc hại, tảo sẽ bị suy tàn gọi là pha chết.
2.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của tảoSpirulina platensis
 Ánh sáng ảnh hưởng đến sự phát triển của tảo
Cũng như các loài thực vật khác, tảo tổng hợp cacbon vô cơ thành các vật chất
hữu cơ nhờ quá trình quang hợp do đó ánh sáng đóng vai trò quan trọng trong quá
trình này. Cường độ ánh sáng cần thiết cho nuôi cấy tảo thay đổi tùy theo mật độ tảo,
độ sâu nước nuôi, dụng cụ nuôi cấy. Quá trình quang hợp của tảo sẽ gia tăng khi
cường độ bức xạ mặt trời gia tăng và sẽ giảm khi cường độ bức xạ mặt trời giảm
(Trương Quốc Phú, 2006). Ở điều kiện phòng thí nghiệm, ánh sáng được xác định cho
sự phát triển của tảo Spirulina là 150 – 200 μmol/m2/s. Tảo sử dụng chất chlorophyll
và một số chất màu quang hợp để hấp thụ ánh sáng mặt trời để biến đổi năng lượng
4 

 


 

hóa học dự trữ trong ATP và một số chất khử khác (Lê Văn Cát, 2006). Năng lượng
mà tảo hấp thu được chuyển hóa từ dạng carbon vô cơ (khí CO2, độ kiềm HCO3ˉ thành
dạng carbon hữu cơ ở dạng đơn giản nhất là đường đơn qua quá trình quang hợp. Theo
Garham và ctv (2000) tảo có đặc điểm hiệu ứng lại với sự tăng lên của cường độ ánh
sáng. Để cho tảo phát triển cần một mức độ nhất định về cường độ ánh sáng, tuy nhiên
nếu ánh sáng quá mạnh sẽ hạn chế sự phát triển của tảo do đó tảo sẽ giảm quang hợp.
Ở điều kiện thiếu ánh sáng trong thời gian dài chúng sẽ thích nghi bằng cách tăng hàm
lượng chlorophyll trong cơ thể. Đặc tính ánh sáng khác nhau sẽ tạo ra chlorophyll khác

nhau và cũng ảnh hưởng đến quang hợp của tảo, mặc khác nó còn ảnh hưởng đến sinh
trưởng và tỷ lệ sinh khối. Cường độ ánh sánh thích hợp khi nuôi trong bình thuỷ tinh
dung tích nhỏ khoảng 1000lux, với bể nuôi lớn cường độ ánh sáng là 5000 – 10000 lux
(Trương Sỹ Kỳ, 2004).
 Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển của tảo
Mỗi loài tảo cần nuôi ở một khoảng nhiệt độ nước thích hợp, ngoài ngưỡng
nhiệt độ tảo sẽ không phát triển và có thể bị chết. Nhiệt độ tốt nhất cho sự phát triển
của tảo Spirulina platensis nằm trong khoảng 35 – 37°C, ở 40°Ctế bào tảo sẽ bị tổn hại
(Richmond, 1988). Tuy nhiên, tảo Spirulina platensis có thể nuôi trong 5 mức nhiệt độ
khác nhau là 26 – 34°C, ở mức nhiệt độ 26°C với mật độ nuôi cấy ban đầu 5000 tế
bào/ml, nuôi trong môi trường Zarouk (Godia và ctv,2002) thì sau 25 ngày nuôi cấy
tảo có thể đạt mật độ tối đa 2508148 tế bào/ml (Nguyễn Phúc Hậu, 2008). Nhiệt độ
thấp nhất giới hạn sự phát triển của tảo 29°C trong điều kiện pH = 9,5 và cường độ ánh
sáng 6 klux (Biotechmol bioeng, 2007). Nhiệt độ không những ảnh hưởng trực tiếp
hoặc gián tiếp lên quá trình trao đổi chất mà còn tác động lên cấu trúc tế bào (Payer,
1980). Nuôi tảo trong phòng sẽ dễ dàng khống chế được nhiệt độ còn khi nuôi ngoài
trời thời tiết thay đổi bất thường nên không khống chế được nhiệt độ.
Mặc dù có một số loài tảo có khả năng chịu được phạm vi pH rất rộng (6 -11). Tuy
nhiên, phạm vi pH thích hợp cho sự phát triển của hầu hết các loài tảo là 7 – 9, tối ưu
là 8,2 – 8,7. Đối với Spirulina platensis có thể sống và phát triển nhanh trong môi
trường giàu bicarbonic và độ kiềm cao khoảng từ 8,5 – 11 (Zarrouk, 1966). Spirulina
platensis có thể sống trong 4 mức pH khác nhau từ 4 – 10, ở mức pH =8 với mật độ
nuôi cấy ban đầu là 5000 tế bào/ml trong môi trường Zarouk (Godia và ctv,2002) thì
sau 15 ngày nuôi cấy tảo có thể đạt mật độ tối đa là 458642 tế bào/ml (Nguyễn Phúc
5 

 


 

Hậu, 2008). Spirulina platensis có thể thích nghi với môi trường thay đổi pH, tuy
nhiên sự thay đổi này xảy ra đột ngột sẽ dẫn đến sự phá hủy tế bào, điều này xảy ra đối
với môi trường có dung dịch đệm không tốt. Dung dịch đệm được đề nghị là 0,2 M
NaHCO3 (Zarouk, 1966).
Sự hấp thu ion NO3ˉsẽ dẫn đến sự tăng pH của môi trường và ngược lại sự hấp
thu NH4+ sẽ làm giảm pH (Oh–Hama, 1986). pH có thể khống chế trong phạm vi thích
hợp bằng cách sục khí hay bổ sung Ca(HCO3)2. Trong quá trình nuôi cấy mật độ tảo
càng cao sự thay đổi pH trong ngày càng lớn, thấp nhất vào sáng sớm và rất cao vào
lúc xế chiều. Ngoài các yếu tố trên, sục khí cũng có vai trò quan trọng giúp tảo lơ lửng
trong nước tránh lắng xuống đáy, làm tảo có cơ hội tiếp xúc đều với ánh sáng và chất
dinh dưỡng. Đồng thời, sục khí hạn chế sự phân tầng nhiệt độ, sự kết tủa của kim loại
cũng như sự lắng xuống đáy của các kim loại nặng.
 Dinh dưỡng ảnh hưởng đến sự phát triển của tảo
Nitrogen được tảo sử dụng để tạo ra các amino acid, acid nucleic, chlorophyll
và các hợp chất hữu cơ chứa nitơ khác. Nitơ chiếm 1 – 10% trọng lượng khô của tế
bào tảo (Đặng Đình Kim, 1999). Hầu hết các loài tảo đều có thể sử dụng NO3ˉở màng
tế bào (Graham, 2000). Nitrat được sử dụng nhưng với nồng độ rất thấp (Đặng Đình
Kim, 1999). Theo Reynold (1986) tỷ lệ N:P tốt nhất cho S.platensis là 6-8:1. Các muối
amonium cũng được tảo sử dụng trong thời gian dài như NH4+ nhưng nồng độ phải
thấp hơn 100 mg/l trong khi NO3ˉđược tảo sử dụng chính. Việc bổ sung amonium vào
tế bào tảo khi đang hấp thu nitrate thì ngày lập tức sẽ hạn chế hoàn toàn quá trình này.
Tế bào Spirulina platensis tăng trưởng tốt nhất khi hàm lượng ure bổ sung vào môi
trường nuôi cấy là 500 mg/l với cường độ ánh sáng là 5600lux. Trong khi đó để thu
được tảo có năng suất cao cần tạo được môi trường có nồng độ đạm cao đến 172 mg/l
(Muzapharop và Taubaep, 1974). Tốc độ phát triển của tảo tốt nhất khi nồng độ
nitrogen và phospho với hàm lượng là 25 và 2 mg/l (Monstert, 1987). Sự thay đổi quá
trình trao đổi chất kết hợp với tốc độ phát triểncủa tế bào tảo giảm dưới điều kiện thiếu
nitrogen (Oh-Hama, 1986). Nguồn nitrogen cung cấp không những ảnh hưởng đến quá
trình phát triển của tảo mà nó còn ảnh hưởng đến thành phần sinh hoá của tế bào tảo.

 

6 

 


 

Lân là một trong những nhân tố chính trong thành phần của tảo. Lân có vai trò
chính trong đa số các quá trình xảy ra trong tế bào đặc biệt là quá trình chuyển hoá
năng lượng và tổng hợp acid nucleic. Giống như đạm, lân cũng là yếu tố giới hạn sinh
trưởng của tảo. Tảo sử dụng chủ yếu là phospho vô cơ. Phospho hữu cơ thường được
thuỷ phân bởi các enzym ngoại bào như phosphoesterase, phosphatase để chuyển sang
dạng phospho vô cơ dễ tiêu. Việc hấp thu lân ở tảo được kích thích bởi ánh sáng. Lân
thường tồn tại ở hai dạng phosphat hữu cơ hoặc phospho vô cơ hoà tan. Tảo chỉ có thể
sử dụng phosphat hữu cơ hoà tan. Khi môi trường thiếu phosphat hữu cơ hoà tan, tảo
có thể tiết ra enzym alkaline phosphatase, đây là một loại enzym ngoại bào có khả
năng giải phóng phosphat trong phạm vi chất hữu cơ. Hơn nữa, khi hàm lượng
phosphat hữu cơ hoà tan biến động trong khoảng thời gian ngắn thì tảo có thể hấp thu
và dự trữ phosphat trong tế bào. Trong thời gian biến động, một tế bào tảo có thể dự
trữ phosphat đủ cho sự phân chia 20 tế bào (Graham, 2000). Trong ao nuôi, sự phân
huỷ thức ăn thừa và phân sẽ liên tục bổ sung phosphorus vào trong nước (Boyd, 1998).
Kali thường có nồng độ cao trong nước thiên nhiên. Ý nghĩa Kali trong đời
sống thuỷ sinh vật rất lớn: Kali xúc tiến quá trình quang hợp bằng cách thúc đẩy quá
trình vận chuyển glucid từ phiến lá vào các cơ quan khác. Khi thiếu kali sự hình thành
các liên kết cao năng bị chậm lại và hàm lượng phospho trong các acid nucleotic bị
giảm. Kali chiếm 1 – 2% trọng lượng khô của tế bào và là cation chính trong tế bào
chất. Đã có những nghiên cứu về nhu cầu kali cho quá trình tạo men (Hawker,
Marshner Krauss, 1979) và tổng hợp tinh bột (Besford, 1978).

Natri: Ion Na+ phổ biến rộng rãi trong nước thiên nhiên và mức độ phổ biến
trong các cation chiếm vị trí hàng đầu. Trong nước ngọt chiếm khoảng 5– 15%, trong
thành phần cơ thể của thuỷ sinh vật chiếm khoảng 0,5–1% trọng lượng cơ thể chúng.
Magiê: Mg2+ rất quan trọng đối với thực vật vì nó có cấu tử trung tâm của diệp
lục tố. Thiếu Mg2+ thực vật không tạo được diệp lục tố nên không quang hợp được vật
chất hữu cơ. Mg2+ rất cần thiết cho việc hấp thu và di chuyển lân. Mg là thành phần
của chlorophyll, ribôsom và nhiễm sắc thể (Metzler, 1977). Mg2+ cũng cần thiết trong
chức năng của enzym.
Ca2+: Là sản phẩm của quá trình phân hoá đất đá, đặcbiệt là quá trình rửa trôi đá
vôi, dolomit và thạch cao. Ion Ca2+ thường kết hợp với ion CO32-, HCO3ˉ, SO42-dạng
HCO3ˉ dễ chuyển hoá thành CaCO3 và phóng thích CO2 cho quá trình quang hợp của
7 

 


 

thực vật phù du trong nước. Ca2+ làm cho nước bớt chua, làm tăng độ hoà tan, đồng
hoá các chất dinh dưỡng khác như đạm phospho, tạo sự quân bình giữa các muối dinh
dưỡng trong nước, giúp cho vi sinh vật hoạt động tốt hơn, cung cấp Ca2+ cho thực vật.
Fe: Sắt là một trong những nhân tố rất cần thiết cho đời sống thuỷ sinh vật mặc
dù nhu cầu về nó không lớn lắm. Chất diệp lục cây xanh không thể tạothành được nếu
không có sắt, mặc dù trong thành phần diệp lục không có sắt.Hàm lượng sắt trong
nước ngọt cao hơn trong nước biển đến hàng chục ppm.
Hàm lượng các muối sắt hòa tan tỉ lệ nghịch với pH (pH càng cao muối hòa tan
của sắt càng thấp), do đó khi quá trình quang hợp của thực vật phù du trong ao xảy ra
mạnh làm pH của nước tăng, các muối hòa tan của sắt hầu như hết hẳn (Trương Quốc
Phú, 2003).
Mangan: Ở hàm lượng thấp (0,001 ppm – 0,002ppm) có tác dụng kích thích sự

tăng trưởng của thực vật, hàm lượng Mn+ thích hợp cho tảo là 0,005 ppm – 0,2ppm.
Cu2+cũng là nguyên tố vi lượng cần cho thực vật phát triển. Tiếp xúc với lượng
đồng cao sẽ ức chế thực vật phát triển hoặc giết chết thực vật do phá hủy chức năng
của tế bào đảm nhận các quá trình quang hợp, hô hấp, tổng hợp chlorophyll và phân
chia tế bào của thực vật.
Zn2+: là thành phần cấu tạo carbonicanhydrase (xúc tác phản ứng hydrase hóa),
làm tăng khả năng vận chuyển oxy.
2.1.4. Một số ứng dụng của tảo Spirulina platensis
Theo Mustafas và ctv (1994) Spirulina platensis được thêm vào làm thức ăn bổ
sung cho Pagrus major với tỷ lệ 5% đã làm tăng tốc độ tăng trưởng của cá, hiệu quả
chuyển đổi thức ăn và hiệu suất sử dụng protein mà thành phần protein có trong thịt cá
không bị ảnh hưởng xấu. Nghiên cứu về sự ảnh hưởng của các nguồn protein khác
nhau lên khẩu phần ăn của tôm thẻ, Ali (1992) phát hiện:Spirulina platensis và đậu
phộng cho sức tăng trưởng của tôm tốt hơn có ý nghĩa so với bánh dầu dừa, hiệu quả
sử dụng protein thô và giá trị sinh học của Spirulina platensis cao hơn có ý nghĩa so
với đậu phộng. Theo Nguyễn Huỳnh Quang Thái, 2008, bổ sung tảo Spirulina
platensis vào thức ăn làm tăng tỷ lệ sống của cá chép Nhật từ 46,8% (NTĐC) lên
62,2% (NT1), 83,3% (NT2) và 80% (NT3). Tuy nhiên, tảo Spirulina platensis bổ sung
vào thức ăn không ảnh hưởng đến sự phát triển về trọng lượng của cá chép Nhật, trong

8 

 


 

khi 6–9% g/kg sẽ giúp cho cá nhanh nhẹn và khỏe mạnh hơn so với thức ăn có hàm
lượng tảo Spirulina platensis thấp hoặc không có tảo trongthức ăn.
Ngoài ra, do tảo Spirulina platensis có nhiều giá trị dinh dưỡng và giá trị sinh

họccao nên tảo được coi là một loại thực phẩm chức năng như nguồn thức ăn bổ
dưỡng cho con người, cho vật nuôi, nguồn hoá chất và vật liệu phân bón vi sinh...Hiện
tảo được nhiều nước trên thế giới nghiên cứu và phát triển.
2.2. Sơ lược về chitin, chitosan và oligochitosan
2.2.1. Chitin
2.2.1.1 Cấu trúc phân tử chitin
Giống như cellulose, chitin là một glycan chứa liên kết β(1-4) nhưng được cấu
tạo bởi các đơn vị 2-acetamido-2-Dglucose, hay còn gọi là các đơn vị Nacetylglucosesamine.

Hình 2.2 Cấu trúc phân tử chitin ().
Chitin là một polymer tự nhiên nhiều thứ hai sau cellulose. Các phân tử chitin sau
khi tổng hợp liên kết với nhau bằng liên kết hydrogen giữa các nhóm -NH- trong phân
tửnày với các nhóm C=O của mạch lân cận. Chitin có 3 dạng là α, β và γ:
 Dạng anpha có sự sắp xếp đối song của các mạch lân cận nhau (↑↓↑).
 Dạng beta là kiểu hình dạng có cấu tạo mạch song song (↑↑↑).
 Dạng gamma là dạng mà trong đó hai trong ba mạch là song song, mạch còn lại
thì đối song (↑↑↓). Dạng gamma là dạng bền nhất và có thể được chuyển thành dạng
anpha sau khi xử lý với Liti thiocynate.
2.2.1.2 Tính chất của chitin
Chitin ở thể rắn và có độ kết tinh cao do gốc – NHCOCH3 ở C2 (cacbon số 2)
làm tăng liên kết hydro giữa các mạch và trong mạch.Chitin là một polysacacharide
bền trong môi trường kiềm nhưng kém bền trong môi trường acid.
9 

 


 

Chitin có màu trắng, không tan trong nước, trong acid loãng, trong kiềm loãng,

các thuốc thử Schwetzer và các dung môi hữu cơ như rượu, este... nhưng nó hòa tan
trong một số dung dịch như hydrochloride, acid đậm đặc (acid nitric, formic, acid
khan). Đặc biệt nó còn hòa tan trong dung dịch đặc nóng của muối thioxianat liti
LiSCN và muối thixianat canxi Ca(SCN)2 tạo thành dung dịch keo.
Chitin ổn định với các chất oxy hoá khử như KMnO4, H2O2, NaClO hay
Ca(ClO)2. Lợi dụng tính chất này để khử màu chitin.
Khi đun nóng trong môi trường kiềm đậm đặc, chitin bị khử gốc acetyl tạo
thành chitosan.
2.2.2. Chitosan
2.2.2.1 Cấu trúc phân tử chitosan
Chitosan là một polymer tự nhiên được hình thành từ N-deacetyl chitin, mang
điện tích dương, không có độc tính, có khả năng phân hủy sinh học và tương hợp sinh
học. Chitosan có cấu tạo từ các đơn vị glucosamine, hay các 2-amino-2-deoxy-Dglucose liên kết với nhau bởi nối β(1-4) glucosidase (RE. Cannon và SM. Anderson, 1991).

Hình 2.3 Cấu trúc phân tử chitosan ().
Thuật ngữ chitosan được dùng khi hàm lượng nitơ cao hơn 7% khối lượng phân
tử hay khi độ deacetyl cao hơn 60%. Sự khác biệt cơ bản của chitin và chitosan là khả
năng hòa tan của chúng trong dung dịch acid loãng, chitosan hòa tan nhiều trong các
dung dịch còn chitin hầu như không tan (N. Gagné, 1993).
2.2.2.2 Tính chất của chitosan
Trọng lượng phân tử của chitosan tùy thuộc vào điều kiện sản xuất thường nằm
trong khoảng 10000 – 1000000 dalton với mức độ deacetyl hóa thường 70 – 90%.
Chitosan ở thể rắn, màu trắng ngà, không mùi, không vị, không tan trong nước,
kiềm, acid đậm đặc, nhưng tan tốt trong dung dịch acid acetic loãng (0,5 - 1,5%) tạo
thành dung dịch keo, trong suốt.
10 

 

 

Chitosan là một poliamine, nó được xem như một polymer catioic có khả năng
cho các ion kim loại nặng bám dính vào các bề mặt tích điện âm tạo ra phức chất với
kim loại và tủa xuống, loại các ion kim loại nặng ra khỏi dung dịch.
Chitosan có tác dụng kháng khuẩn tốt, nhất là trên các khuẩn gây bệnh như
E.coli, Staphylococus aureus, Pseudomonas aeruginosa và tác dụng diệt nấm nhất là
nấm Candida albicans.
Chitosan có nhiệt độ nóng chảy là 309 - 311°C.
Chitosan có cấu trúc siêu lỗ, dễ tạo màng, tạo hạt, khả năng hấp phụ tốt, tính
chất cơ lý bền vững, ổn định, thường được dùng cố định enzyme qua cầu nối
glutaraldehyde.
Chitosan phản ứng với các acid đậm đặc tạo thành muối khó tan, tác dụng với
iod và acid sulfuric thành phản ứng màu tím, có thể dùng trong phân tích định tính
chitosan.
Ngoài các tính năng trên của chitosan, nó còn được xem là nguồn nguyên liệu
vô cùng quý giá để cho ra các dẫn xuất chitosan rất hấp dẫn trong các lĩnh vực thực
phẩm, sinh học và bảo vệ môi trường...
2.2.3. Oligochitosan
Oligochitosan là một phân đoạn có phân tử lượng trung bình nhỏ hơn 20 kDa và
độ polymer hóa dp < 100. Trong đó phần oligomer tan trong môi trường trung tính có
phân tử lượng nhỏ hơn 50 kDa.
Oligochitosan là đoạn mạch polymer của β-D-glucosamine liên kết với nhau
bằng liên kết 1,4 glucosidase.
2.3. Nguồn của chitin, chitosan, oligochitosan
Chitin được tìm thấy nhiều trong vỏ các loài giáp xác, động vật biển không
xương sống, côn trùng, thành tế bào nấm.... Song chitin được sản xuất chủ yếu từ vỏ
các loài giáp xác qua quá trình khử protein và loại khoáng. Lượng tổng hợp hằng năm
của polysaccharide này từ hệ sinh thái nước ngọt và nước mặn ước tính lần lượt là 600
và 1600 triệu tấn. Hàm lượng chitin trong các loài giáp xác vào khoảng 2 - 12% trọng

lượng cơ thể. Hàm lượng chitin trong các loài giáp xác thay đổi phụ thuộc vào quy
trình điều chế, mùa thu hoạch, độ tuổi, chế độ môi trường dinh dưỡng của các loài giáp
xác. Thông thường vỏ các loài giáp xác như tôm, cua, chứa khoảng 13 - 42% chitin.

11 

 


 

Chitin được deacetyl hóa hoàn toàn được tìm thấy trong nhiều loại nấm, tuy
nhiên chitosan thường chủ yếu sản xuất từ quá trình deacetyl hóa chitin.
2.4. Phương pháp chế tạo chitin, chitosan và oligochitosan
2.4.1. Phương pháp chế tạo chitin
Hiện nay có rất nhiều quy trình khác nhau được áp dụng để sản xuất chitin. Các
phương pháp này phải đạt yêu cầu là loại bỏ các thành phần khác, và có thể sử dụng
luôn các thành phần đó cho những mục đích khác. Thông thường việc cô lập protein
bao gồm khử khoáng, loại protein và tẩy trắng (J. Synowiecki và ctv,2003).
Việc khử khoáng có thể đạt được sau từ 1đến 3 giờ khi chiết xuất bằng dung
dịch HCl loãng có nồng độ từ 1% đến 8% ở nhiệt độ phòng. Sự khử khoáng có thể
thực hiện hoàn toàn khi lượng acid sử dụng lớn hơn hàm lượng khoáng. Để tránh xảy
ra sự cắt mạch của chitin người ta có thể dùng EDTA để loại khoáng. Để hàm lượng
khoáng còn lại ít có thể kéo dài thời gian phản ứng lên đến 24 giờ song điều đó cũng
không gây nên sự cắt mạch chitin.
Việc loại protein được thực hiện với dung dịch NaOH hoặc KOH. Hiệu quả của
việc khử protein bằng kiềm phụ thuộc vào nhiệt độ phản ứng, nồng độ kiềm, và tỉ lệ
dung dịch kiềm với lượng vỏ giáp xác. Thông thường, khoảng nồng độ của dung dịch
kiềm là từ 1 - 10%, nhiệt độ từ 65°C đến 100°C. Hầu như tất cả protein chứa trong vỏ
tôm và vỏ cua được loại bỏ hết khi sử dụng nhiệt độ 90°C và tỉ lệ khối lượng vỏ đối

với dung dịch là 1/20 (khối lượng/ thể tích). Khoảng thời gian phản ứng là từ 0,5 giờ
đến 6 giờ. Kéo dài thời gian sẽ dẫn đến sự cắt mạch và deacetyl hóa polysacacharide.
Người ta cũng có thể dùng enzyme loại protein từ vỏ các loài giáp xác. Việc loại các
chất còn lại trong chitin có thể được làm bằng cách chiết xuất ở nhiệt độ phòng với
aceton, chloroform, ethyl acetate hay cồn và hỗn hợp este.Việc tẩy trắng thường được
thực hiện bằng việc xử lý với dung dịch NaOCl hay H2O2.
Ngày nay có rất nhiều công ty đang sản xuất chitin và chitosan ở quy mô công
nghiệp. Đa số ở Hoa Kỳ và Nhật Bản, từ đây một lượng lớn chitin và chitosan được
sản xuất hằng năm từ vỏ tôm và cua.
2.4.2. Phương pháp chế tạo chitosan
Chitosan được điều chế bằng cách N-deacetyl chitin từ vỏ tôm và cua. Việc tạo ra
nhóm amin từ acetamindodeoxy carbohydrate có thể được thực hiện trong các điều kiện
acid hoặc kiềm nhưng một số trở ngại về mặt lập thể có thể gây cản trở phản ứng. Nhiều
12 

 


 

nỗ lực đã đưa ra nhưng nhóm N- acetyl không thể được loại bỏ bằng acid nếu không
kèm theo sự thủy phân mạch polysacacharide (A.Tolaimate và ctv,2000).
Có rất nhiều tác giả đề nghị quy trình điều chế chitosan khác nhau, song nhìn
chung điều này được thực hiện ở những sự kết hợp khác nhau của nhiệt độ (80°C đến
140°C), nồng độ kiềm (30% đến 60%) và thời gian lên đến 10 giờ(J. Synowiecki và
ctv,2003). Những thông số này phải được kiểm soát chặt chẽ bởi những ảnh hưởng của
chúng tới độdeacetyl, khối lượngphân tử, sự phân bố khối lượng, cũng như sự phân bố
của các đơn vị deacetyl dọc theo mạch polymer. Và những tính chất này phản ánh sự
hữu ích của chitosan trong nhiều ứng dụng, đặc biệt trong công nghệ dược.
Các thí nghiệm được thực hiện trên α- chitin thu được từ vỏ tôm cho thấy kết

quả sự điều chế chitosan ở nồng độ kiềm không cao, nhiệt độ thấp và kéo dài thời gian
sẽ làm cho các phần được deacetyl hóa trong mạch polymmer phân bố một cách ngẫu
nhiên, nếu quá trình thực hiện ở nhiệt độ cao, làm tăng độ deacetyl hóa trong mạch
nhưng mặt khác cũng làm giảm kích thước của phân tử(A. Tolaimate và ctv, 2000).
2.4.3. Các phương pháp chế tạo oligochitosan
Các oligochitosan tự nhiên có thể thu trực tiếp bằng cách tách chiết và tinh chế
chúng nhưng chủ yếu chế tạo từ các polychitosan. Có rất nhiều phương pháp khác
nhau để điều chế oligochitosan từ chitosan đã được các tác giả trong và ngoài nước sử
dụng như dùng các tác nhân hóa học (acid HCl, H3PO4, HNO2...), các tác nhân oxi hóa
(K2S2O8, NaNO3, H2O2,..), dùng enzyme sinh học và phương pháp vật lý (bức xạ UV,
gama Co – 60, sóng siêu âm, nồi hấp áp suất cao...). Tuy nhiên, hiện tại có 3 phương
pháp chế tạo oligochitosan được sử dụng chủ yếu là: phương pháp sinh học, phương
pháp hóa học và phương pháp bức xạ.
2.4.3.1 Phương pháp sinh học
Đây chính là quá trình thủy phân các phân tử polysacacharide có mạch dài hơn
nhằm tạo nên các oligosaccharide có mạch ngắn hơn nhờ tác dụng của các enzyme.
Phương pháp dùng enzyme để chế tạo polysacacharide đã được con người áp dụng từ
rất lâu trong công nghệ lên men, điển hình là quá trình chế tạo mạch nha từ tinh bột
nhờ hoạt động thủy phân của enzyme amylase tách từ các mầm của hạt ngũ cốc.
Động học của phản ứng xúc tác enzyme trong quá trình lên men diễn ra khá
phức tạp và phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như nồng độ enzyme, nồng độ cơ
chất, điều kiện của môi trường phản ứng (nhiệt độ, pH,...) và cấu trúc của polymer.
13 

 


 

Điều đặc trưng cho phản ứng xúc tác là phản ứng có tính đặc hiệu cao, mỗi loại

enzyme chỉ tác dụng đối với một hay một số loại cơ chất nhất định, thậm chí đối với
một cấu trúc hay một loại liên kết nhất định. Người ta có thể thu nhận enzyme từ các
nguồn khác nhau như thực vật, động vật hay vi sinh vật.
Quá trình thủy phân polymer tự nhiên nói chung và polysacacharide nói riêng
được tiến hành trong dung dịch với sự có mặt của các hệ đệm tương ứng cho từng loại
enzyme. Các enzyme có bản chất là protein và rất nhạy cảm với nhiệt độ, thường là
chúng bị bất hoạt ở nhiệt độ cao và không có khả năng phục hồi, vì vậy khi muốn dùng
phản ứng trong công nghệ enzyme người ta nâng nhiệt độ phản ứng lên 100°C trong
vòng từ 3 đến 10 phút. Điều đáng chú ý ở đây là trong sản phẩm cuối cùng của quá
trình thủy phân polysaccharide bằng enzyme luôn luôn là một hỗn hợp bao gồm các
oligosaccharide có khối lượng phân tử khác nhau. Các phân đoạn này được tách bằng
phương pháp sắc ký cột (fractionnation) và khối lượng phân tử trung bình (Mw) cuả
chúng xác định bằng sắc ký gel (GPC) và / hoặc là sắc ký lỏng cao áp (HPLC).
Bằng phương pháp enzyme, Izume đã thủy phân 2,27g chitosan bằng
chitosanase trong 6 giờ đã thu được hỗn hợp oligo D – glucosamin bao gồm di, tri,
tetra và penta D – glucosamin với hàm lượng tương ứng như sau:238 mg, 719 mg và
207 mg. Tương tự, Rochas và Heyraud (1981) đã thủy phân K - caraghinan bằng
k-caraghinase đã thu được hỗn hợp oligoneocarabio từ mono đến penta. Mặt khác,
theo kết quả của Chabrecek (1991) khi tiến hành thủy phân natri hyaluronate bằng
enzyme hyaronidase theo thời gian từ30-2880 phút đã thu được các hỗn hợp sản phẩm
oligohyaluronate có Mw khác nhau. Điều đáng chú ý ở đây là độ phân bố khối lượng
phân tử (D = Mw/Mn) tăng dần và đạt giá trị cao nhất sau 180 phút xử lý
(D0 = 1,28, D180 = 2,34) và sau đó giảm xuống ( D2880 = 1,4 ).Như vậy thời gian phản
ứng càng dài thì giá trị Mw càng giảm và độ phân bố đồng nhất hơn.
Nói chung phương pháp thủy phân bằng enzyme thích hợp cho mục đích chế
tạo oligosaccharide có khối lượng phân tử thấp (di hoặc mono) nếu thời gian phản ứng
đủ dài.
2.4.3.2 Phương pháp hóa học
Cũng giống như phương pháp enzyme là thủy phân các polysaccharide mạch
dài thành các oligosaccharide có mạch ngắn hơn, nhưng khác nhau ở chỗ là trong quá

trình này tác nhân thủy phân không phải là enzyme mà là tác nhân hóa học. Phương
14 

 


 

pháp này đơn giản hơn nhiều so với phương pháp enzyme, giá thành thấp và cũng
được con người sử dụng từ lâu để chế tạo một số loại đường như maltose.
Trong quá trình chế tạo bằng phương pháp hóa học thì tác nhân thủy phân
thường dùng là các acid vô cơ mạnh như HCL, HNO3,... hoặc các chất kiềm mạnh như
NaOH, KOH,... ở nhiệt độ cao (thường là 80°C – 100°C). Các tác nhân này chủ yếu có
tác dụng thủy phân các liên kết glucoside trong mạch của phân tử polysacharide. Nếu
như enzyme thủy phân các liên kết này một cách đặc hiệu. Môi trường phản ứng trong
phương pháp này là dung dịch nước, nhưng quá trình xảy ra không phụ thuộc nghiêm
ngặt vào điều kiện môi trường như pH, đệm,... như trong trường hợp của enzyme. Điều
đáng chú ý ở đây là tốc độ phản ứng thủy phân thường phụ thuộc chủ yếu vào nhiệt độ
cũng như nồng độ của các tác nhân hóa học. Thông thường khi tăng nhiệt độ hoặc nồng
độ của các tác nhân thủy phân thì tốc độ phản ứng sẽ diễn ra nhanh hơn và triệt để hơn.
Năm 2002, J. Zhishen và S. Dongfeng đã nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ
và thời gian phản ứng lên việc chế tạo chitosan trọng lượng phân tử thấp bởi tác nhân
acid phosphoric 85% với thời gian và nhiệt độ phản ứng khác nhau. Ở nhiệt độ phòng,
khối lượng phân tử trung bình của các chitosan có khối lượng phân tử thấp là từ 71
kDa đến 214 kDa sau 35 ngày xử lý. Tốc độ giảm khi gia tăng thời gian thủy phân.
Sản lượng chitosan cũng giảm từ 68,4% đến 40,2% sau 35 ngày. Tại nhiệt độ 40°C,
60°C, 80°C, khối lượng phân tử giảm dần theo thứ tự là từ 37 kDa, 35 kDa và 20 kDa
trong 8 giờ thủy phân, sản lượng chitosan còn lại ở mức độ cao so với nhiệt độ phòng
là 86,5%, 71,4% và 61,3% khi xử lý theo thứ tự 40°C, 60°C, 80°C. Thời gian phản
ứng khác nhau đã tạo ra những sản phẩm chitosan có khối lượng phân tử khác nhau. Ở

60°C, khối lượng phân tử của sản phẩm giảm từ 214 kDa xuống còn 74 kDa trong thời
gian là 4 giờ, sau đó giảm một cách chậm dần và đạt 19 kDa trong 15 giờ. Một điều
được nhận thấy là tính tan trong nước của chitosan cũng được gia tăng khi khối lượng
phân tử giảm xuống. Từ kết quả cho thấy năng suất của phản ứng và khối lượng phân
tử của chitosan phụ thuộc khá lớn vào nhiệt độ và thời gian phản ứng. Như vậy nhiệt
độ và thời gian thủy phân của chitosan trong dung dịch acid phosphoric 85% được xác
định rõ là: nhiệt độ60°C và thời gian là 15 giờ có thể thu được chitosan có khối lượng
phân tử từ 19 kDa đến 20 kDa. Độ hòa tan trong nước của chitosan cũng gia tăng khi
khối lượng phân tử giảm. Những chitosan có khối lượng phân tử thấp này có thể rất
hữu dụng như là một hợp chất có hoạt tính sinh học.
15