PHÂN TÍCH SỰ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN TRÊN ĐOẠN GEN MÃ HÓA PROTEIN NSP2 CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO (PRRSV) Ngành học CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện NGUYỄN XUÂN THẮNG Niên khóa 2009 – 2013 Tháng 06

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
******

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN TÍCH SỰ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN
TRÊN ĐOẠN GEN MÃ HÓA PROTEIN NSP2 CỦA
VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN
VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO (PRRSV)

Ngành học

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

NGUYỄN XUÂN THẮNG

Niên khóa

2009 – 2013

Tháng 06/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
******

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN TÍCH SỰ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN
TRÊN ĐOẠN GEN MÃ HÓA PROTEIN NSP2 CỦA
VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN
VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO (PRRSV)

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

PGS. TS. NGUYỄN NGỌC HẢI

NGUYỄN XUÂN THẮNG

Tháng 06/2013


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến mẹ và các anh chị, những người đã
luôn yêu thương, quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện cho con học tập. Gia đình
mình luôn ở bên con và là chỗ dựa vững chắc nhất của con.
“Công cha nghĩa mẹ ơn thầy”. Thầy cô luôn là những người lái đò tận tụy đã giúp tôi
đi trên dòng sông kiến thức và dìu dắt tôi qua những năm đại học. Tôi xin cảm ơn các
Thầy Cô của trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh và Bộ môn Công nghệ
sinh học đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho tôi những kiến thức khoa học, kiến thức
chuyên ngành, cũng như những kinh nghiệm quý báu trong những năm học tại trường tạo
cho tôi nguồn động lực nghiên cứu khoa học. Thầy cô không những đã cho tôi kiến thức
về chuyên môn mà còn truyền đạt cho tôi cách đối nhân xử thế, và những kinh nghiệm
sống quý báu. Tôi xin chân thành biết ơn sự dạy dỗ tận tình của tập thể thầy cô ở trường
và những thầy cô đã đi qua cuộc đời tôi.

Đặc biệt tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến:
 PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn tôi thực hiên đề tài .
 Chị Vương Thị Thúy Vi, anh Võ Tấn Hùng, anh Võ Khánh Hưng, anh Nguyễn
Phan Thành …đã giúp đỡ và truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm quý báu trong
suốt quá trình tôi thực hiện đề tài.
Bốn năm đại học đã cho tôi có được những người bạn tốt. Các bạn đã bên cạnh,
chia sẻ và giúp đỡ tôi rất nhiều. Đời sinh viên của tôi thật có ý nghĩa và tuyệt vời khi có
các bạn: tập thể lớp DH09SH, các anh chị cựu sinh viên BM. CNSH, tập thể KTX phòng
16C/C, các anh chị em trong BM. CNSH đã động viên, giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá
trình học tập và thực hiện đề tài … Xin chân thành cảm ơn và mãi nhớ về các bạn thân
yêu.
Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2013
Nguyễn Xuân Thắng
i


TÓM TẮT
Việc phân tích di truyền của PRRS có ý nghĩa cực kỳ quan trọng trong dịch tễ học.
Từ thông tin di truyền của PRRS có thể xác định được nguồn gốc phát sinh dịch bệnh,
biến đổi di truyền đang xảy ra như thế nào đối với dịch bệnh. Đề tài “Phân tích sự biến
đổi di truyền trên đoạn gen mã hóa protein NSP2 của vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh
sản và hô hấp trên heo (PRRSV)” được tiến hành, mục đích là khảo sát sự biến chủng và
biến đổi thông tin di truyền của các chủng PRRS tại Việt Nam phục vụ cho các nghiên
cứu về kiểm soát và phòng chống dịch bệnh PRRS.
Hai mươi mẫu bệnh phẩm được sử dụng trong xét nghiệm cho kết quả 6 mẫu
dương tính bằng kĩ thuật RT-PCR. Cả 6 chủng trên được phân tích và xây dựng cây di
truyền để so sánh sự biến đổi di truyền.
Cả 6 mẫu khảo sát dương tính có sự đột biến trên đoạn gene NSP2 rõ rệt. Nhóm
chủng HP-PRRS 2007: SDH1 và SH1H1 có tỉ lệ tương đồng với chủng JXA1 rất cao
(98,7-99,2 %). Đây là 2 chủng có trình tự aa tương ứng đột biến ít nhất so với các chủng

còn lại (lần lượt 4 aa và 7 aa). Chủng 3DN3 có sự đột biến về trình tự aa tương ứng lớn
(25 đột biến thay thê) và đặc biệt có đột biến Cystein (C) bằng Arginine (R) có thể ảnh
hưởng cấu trúc protein. Chủng H2 là chủng thuộc nhóm HP-PRRS 2010 (độ tương đồng
97 – 97,6 %), có đột biến mất 12 nu (tương đương 4 aa Proline, Leucine, Asparagine và
Phenylalanine) và 16 đột biến thay thế aa khác,. Hai chủng DN1 và DN2 nằm ở nhóm các
chủng HP-PRRS, có tỉ lệ tương đồng khá cao với chủng tham khảo JXA1 (92,3 – 92,6
%). Hai chủng DN1 và DN2 có sự đột biến rất lớn trong trình tự aa với 29 và 30 đột biến
điểm thay đổi so với trình tự aa tương ứng của gene NSP2. Cả 6 chủng đang có sự đột
biến rõ rệt trình tự nucleotide và trình tự acid amin tương ứng trên đoạn gene NSP2.

ii


SUMMARY

PRRS genetic analysis is very important in epidemiology. Source and genetic
variation of disease can be identified from PRRS genetic information. Thesis "Analysis
genetic variation on NSP2 protein encoding gene of Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome Virus (PRRSV)" was conducted to examine strains and genetic
variation of Viet Nam PRRS strains for PRRS prevention and control studies.
6 positives in 20 disease samples detected by using RT-PCR technique were
analyzed and built phylogenetic tree to compare genetic variation.
NSP2 genes mutations were clear on 6 positive samples and divided into 3 groups.
Strains HP-PRRS 2007 group: SDH1, SH1H1 and JXA1 strains had high degree of
similarity (98.7-99.2 %). Amino acid sequence mutations of SDH1 và SH1H1 were less
than others (4 amino acid and 7 amino acid respectively). 3DN3 strain was also in HPPRRS 2007 branch. Amino acid sequence mutations of this strain was high (25
replacement mutations), specialy amino acid sequence mutations of this strain was high
(25 replacement mutations), specialy cysteine mutant (C) with arginine (R) may affect
protein structure. H2 strain is strains of HP-PRRS 2010 group (degree of similarity 97 –
97.6 %), it has 12 nucleotide loss mutation (equivalent to 4 amino acid: Proline, Leucine,

Asparagine and Phenylalanine) and 16 other amino acid replacement mutations, DN1 and
DN2 strains were in HP-PRRS strain branch, these were similar to JXA1 reference strain
(similarity degree: 92.3 - 92.6%). Compared with the corresponding amino acid sequence
of the gene NSP2, DN1 and DN2 strains had 29 and 30 point mutations. All of 6 strains
had clear nucleotide and acid amin sequences mutations on NSP2 gene.

iii


MỤC LỤC
Lời cảm ơn .............................................................................................................................i 
Tóm tắt ................................................................................................................................. ii 
Summary ............................................................................................................................. iii 
Mục lục ................................................................................................................................iv 
Danh sách chữ viết tắt .........................................................................................................vi 
Danh sách các bảng ........................................................................................................... vii 
Danh sách các hình ........................................................................................................... viii 
Chương 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1 
1.1.  Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1 
1.2.  Mục tiêu đề tài......................................................................................................... 2 
1.3.  Nội dung thực hiện .................................................................................................. 2 
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................... 3 
2.1.  Một số thông tin về Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS) ........ 3 
2.2 

Tác nhân gây bệnh .................................................................................................. 7 

2.3 

Triệu chứng bệnh .................................................................................................... 8 

2.4 

Cấu trúc bộ gen PRRSV ......................................................................................... 9 

2.4.1 

Tổ chức bộ gen PRRSV ................................................................................... 9 

2.4.2 

Protein không cấu trúc NSP2 ......................................................................... 11 

2.5 

Các phương pháp phát hiện PRRSV ..................................................................... 14 

2.6 

Phương pháp RT-PCR .......................................................................................... 17 

2.7 

Phương pháp Giải trình tự gene và xây dựng cây di truyền ................................. 18 

2.8 

Các nghiên cứu về gene mã hóa Protein NSP2 trong nước và trên thế giới ......... 20 

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 22 

3.1.  Thời gian và địa điểm ........................................................................................... 22 
3.2.  Vật liệu và hóa chất............................................................................................... 22 
3.2.1.  Vật liệu sinh học............................................................................................. 22 
3.2.2.  Dụng cụ và thiết bị ......................................................................................... 22 
3.2.3.  Hóa chất.......................................................................................................... 22 
3.3.  Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 24 
iv


3.3.1.  Ly trích RNA virus PRRS .............................................................................. 24 
3.3.2.  Khuếch đại vùng chứa đoạn NSP2 bằng RT-PCR ......................................... 25 
3.3.3.  Giải trình tự đoạn gen mã hóa protein NSP2 của PRRSV ............................. 27 
3.3.4.  Phân tích trình tự di truyền của các chủng PRRSV ....................................... 27 
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................... 31 
4.1.  Kiểm tra primer ..................................................................................................... 31 
4.2.  Kết quả chạy RT-PCR các mẫu thực địa PRRS ................................................... 34 
4.3.  Phân tích trình tự di truyền các mẫu nghiên cứu .................................................. 35 
4.4.  Phân tích trình tự acid amin từ trình tự di truyền các mẫu nghiên cứu ................ 39 
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................... 42 
5.1.  Kết luận ................................................................................................................. 42 
5.2.  Đề nghị .................................................................................................................. 43 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
PHỤ LỤC 

v


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
PRRS

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

PRRSV

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

ORF

Open Reading Frame

NSP

None Structure

RNA

Ribonucleic acid

RT-PCR

Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

IOE

Institute Of Export

FAO

Food and Agriculture Organization

MDS

Mistery Disease of Swine

PEARS

Porcine Endemic Abortion And Respiratory Syndrome

BED

Blue Ear Disease

HP-PRRS

Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

ELISA

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

EU

Europe

NA

North America

PCV

Porcine Circovirus type

GP

Glycoprotein

EAV

Office International des Epizooties

EDTA

Ethidium Tetra Acetat

IPMA

Immuno Peroxidase Monolayer Assay

cDNA

Complementary Deoxyribonucleic Acid

aa

Amino acid

nu

Nucleotide

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Chức năng các ORF của PRRSV ........................................................ 10
Bảng 3.1 Trình tự cặp primer khuếch đại vùng chứa đoạn NSP2 của PRRSV .. 26
Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR.................................................................. 27
Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR ...................................................... 28
Bảng 3.4 Các chủng virus trong mẫu bệnh phẩm được giải trình tự ................. 29
Bảng 3.5 Các chủng virus tham chiếu ở Việt Nam............................................. 30
Bảng 3.6 Các chủng virus tham chiếu trên thế giới ............................................ 30

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Dịch PRRS tại Mỹ tính tới tháng 10 năm 2012................................................. 4
Hình 2.2 Sự lây lan của dịch PRRS ở Đông Nam Á từ năm 2007 tới giữa năm 2010 .... 5
Hình 2.3 Đại thực bào trước và sau khi nhiễm PRRSV ................................................... 8
Hình 2.4 Triệu chứng bệnh ở heo nhiềm PRRS .............................................................. 9
Hình 2.5 Cấu trúc bộ gen virus PRRS ............................................................................ 10
Hình 2.6 Biểu đồ giả định protein NSP2 của PRRSV.................................................... 12
Hình 2.7 Xây dựng các chủng VR-2332 có NSP2 đột biến ........................................... 13
Hình 2.8 Sảy thai, thai chết lưu ở các giai đoạn thai kì khác nhau của bệnh PRRS ...... 15
Hình 2.9 Sơ đồ khối giải trình tự mao quản .......................................................... 19
Hình 2.10 Sơ đồ khối một máy diện di mao quản dùng giải trình tự DNA .................. 19
Hình 4.1 Kết quả Align primer NSP2 với các chủng PRRS tham khảo trên genbank... 32
Hình 4.2 Kết quả kiểm tra primer với mẫu PRRS bằng phản ửng RT-PCR .................. 33
Hình 4.3 Trình tự gen vùng NSP2 của PRRSV tại Việt Nam ........................................ 34
Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR ................................................................. 35

Hình 4.5 Kết quả Align của các mẫu giải trình tự với các mẫu trên genbank ............... 36
Hình 4.6 Cây di truyền PRRSV dựa trên trình tự ORF1a mã hóa protein NSP2........... 38
Hình 4.7 Align trình tự protein của các chủng khảo sát bằng BioEdit........................... 40

viii


Chương I MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi heo ở nước ta đã có bước phát triển

nhanh, tăng trưởng hàng năm khoảng 6 - 8%/năm, góp phần duy trì phát triển chung của
ngành Nông nghiệp khoảng từ 3 - 4%/năm. Một trong những yếu tố quan trọng quyết định
sự thành bại của ngành Chăn nuôi đó là dịch bệnh ở vật nuôi.
Các nhà chăn nuôi heo phải đối mặt với không ít khó khăn, đặc biệt là trong việc
kiểm soát và ngăn chặn các mầm bệnh. Trong đó, một trong những bệnh gây thiệt hại về
kinh tế nhiều nhất ở heo hiện nay là Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo (Porcine
Reproductive and Respiratory Syndrome-PRRS). Bệnh do virus PRRS gây ra, diễn biến
khá phức tạp, tỷ lệ nhiễm bệnh cao, xảy ra ở mọi lứa tuổi, gây nhiều khó khăn trong công
tác chẩn đoán và phòng ngừa.
Việc phân lập và chẩn đoán PRRSV đã có những thành công nhất định, nhưng
PRRSV là virus dễ bị đột biến, biến chủng thành chủng mới, khả năng gây bệnh và độc
lực biến đổi nhanh, gây khó khăn cho việc phòng ngừa dịch bệnh, tiêm chủng vaccine. Kể
từ năm 2006 khi bùng phát tại Việt Nam tới nay, dịch đã nhiều lần bùng phát trở lại ở
nước ta. Điển hình trong năm 2009, PRRS đã bùng phát trở lại Việt Nam với không dưới
10 địa phương trên cả 3 miền. Đầu năm 2013 này, bệnh lại tiếp tục bùng phát và gây
nhiều hậu quả nghiêm trọng ở 6 tỉnh trong cả nước (Báo cáo Chi Cục Thú Y, 2013)
Nhiều nghiên cứu cho thấy PRRSV đang có nhiều đột biến gen tại khu vực của gen

NSP2 của vùng ORF1a của các chủng này so với các chủng bình thường (Tian và ctv,
2007). Vùng trình tự mã hóa NSP2 là một trong những vùng có liên quan đến độc lực của
virus PRRS ngoài ORF5 và ORF7. Nhằm xác định khả năng biến đổi di truyền của
PRRSV, đề tài “Phân tích sự biến đổi di truyền trên đoạn gen mã hóa protein NSP2 của
virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRSV)” được thực hiện nhằm
phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo như đánh giá sự biến đổi di truyền trên các đoạn

1


gene khác, chế tạo vaccine… góp phần vào công tác chẩn đoán và ngăn ngừa căn bệnh
nguy hiểm này.
1.2.

Mục tiêu đề tài
Bước đầu khảo sát sự biến đổi di truyền của PRRSV trên đoạn gen mã hóa protein

NSP2 nhằm phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo như đánh giá sự biến đổi di truyền trên
các đoạn gene khác, chế tạo vaccine…
1.3.

Nội dung thực hiện

 Ly trích RNA tổng số, nhân đoạn gen mã hóa protein NSP2 của virus PRRS bằng
kỹ thuật RT-PCR
 Giải trình tự đoạn gen mã hóa protein NSP2 của virus PRRS thu nhận được.
 Xây dựng cây sinh dòng của các chủng PRRSV dựa trên đoạn gene mã hóa protein
NSP2 của các chủng PRRSV khảo sát và các chủng PRRSV khác trên thế giới và
tại Việt Nam.
 Đánh giá biến đổi di truyền của PRRSV thông qua trình tự của đoạn ORF1a mã

hóa NSP2 của các chủng PRRSV khảo sát và các chủng PRRSV tham chiếu trên
thế giới và tại Việt Nam.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.

Một số thông tin về Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS)
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo (Porcine reproductive and respiratory

syndrome - PRRS) là một bệnh do virus gây ra, gây thiệt hại lớn về kinh tế và được mô tả
lần đầu tiên ở Mỹ tại vùng bắc của bang California, bang Iowa và Minnesota vào năm
1987. Rất nhanh sau đó, năm 1988 bệnh đã lây lan sang Canada. Ở Châu Âu nhiều vùng
cũng ghi nhận dịch bệnh này như Đức (1990), Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh (1991),
Pháp (1992). Năm 1998, bệnh được phát hiện ở các nước châu Á như: Hàn Quốc, Nhật
Bản (IOE, 2010). Từ năm 2006 đến năm 2010, khu vực các nước Châu Á như Trung
Quốc, Việt Nam, Philippines và Thái Lan, liên tiếp bị các đợt dịch PRRS hoành hành với
chủng PRRSV độc lực cao (FAO, 2011). Năm 2010, bệnh đã ảnh hưởng đến toàn bộ các
quốc gia trong khu vực Đông Nam Á, kể cả Lào, Campuchia, trong đó nặng nề nhất là
Thái Lan (Klaas Dietze và ctv, 2011). Cho đến nay PRRS đã trở thành dịch bệnh lưu hành
ở nhiều châu lục trên thế giới, là một trong những bệnh gây tổn thất nặng nề về kinh tế
cho ngành chăn nuôi ở nhiều quốc gia. Bệnh do Nidovirales, họ Arteviridae gây ra. Các
triệu chứng thường gặp của heo mắc bệnh bao gồm rối loạn sinh sản, chết (đối với heo
con) và các biểu hiện rối loạn hô hấp đối với heo ở mọi lứa tuổi. PRRS được xếp vào
nhóm B trong danh mục các bệnh của Tổ chức sức khỏe động vật thế giới. Cho đến nay,
heo là động vật duy nhất mắc hội chứng này.
Thời gian đầu, do chưa xác định được nguyên nhân gây bệnh nên bệnh PRRS có
nhiều tên gọi như Bệnh bí ẩn ở heo (Mistery Disease of Swine - MDS), Hội chứng hô hấp

và sẩy thai ở heo (Porcine Endemic Abortion And Respiratory Syndrome – PEARS), và ở
Việt Nam PRRS thường được gọi là Bệnh heo tai xanh (Blue Ear Disease - BED) (Egli và
ctv, 2001). Năm 1992, Hội nghị quốc tế về hội chứng này được tổ chức ở Minnesota
(Mỹ), tổ chức Thú y thế giới (OIE) đã thống nhất tên gọi là Hội chứng rối loạn hô hấp và
sinh sản ở heo (Porcine reproductive and respiratory syndrome - PRRS).
Ở Mỹ - nơi bắt nguồn của dịch bệnh này, hằng năm thiệt hại hơn 1 tỉ đô la bao
gồm khoảng 664 triệu đô la xử lý các đợt dịch bùng phát và 447 triệu đô la cho các chi
3


phí liên quan. Theo khảo sát thì đây là bệnh gây ra nhiều khó khăn và thách thức nhất cho
các nhà chăn nuôi kể từ khi nó được phát hiện tại các trang trại từ những năm 1980
(National Pork Board, 2011).

Hình 2.1 Dịch PRRS tại Mỹ tính tới tháng 10 năm 2012.
().
Ở châu Á, các trường hợp đầu tiên của bệnh PRRS xuất hiện ở Trung Quốc và
nhanh chóng bùng phát thành dịch vào năm 1995; và tới năm 2006, dịch PRRS ở Trung
Quốc bùng phát mạnh bởi một chủng virus PRRS không điển hình – virus gây rối loạn
sinh sản và hô hấp độc lực cao ở heo (HP-PRRS) và kết quả là gây tổn thất rất lớn về kinh
tế cho ngành công nghiệp chăn nuôi lợn Trung Quốc (Tian và ctv, 2007).
Đối với Đông và Đông Nam Á, với mật độ heo cao nhất trên toàn thế giới, sự tồn
tại của căn bệnh này đặt ra một mối quan tâm ngày càng tăng về kinh tế xã hội. Với cấu
trúc của khu vực sản xuất, các mầm bệnh nguy hiểm có thể cùng phát dịch và gây hậu quả
nghiêm trọng hơn (FAO, 2011).

4


Hình 2.2 cho thấy tình hình dịch bệnh PRRS ở khu vực Đông Nam Á từ năm 2007

tới giữa năm 2010 được báo cáo ở Tổ chức Thú y Thế giới (OIE) vào năm 2011.

Hình 2.2 Sự lây lan của dịch PRRS ở Đông Nam Á từ năm 2007 tới giữa năm 2010.
(FAO, 2011).
Theo dữ liệu OIE, 445 ổ dịch PRRS đã xảy ra ở Trung Quốc trong năm 2006 ảnh
hưởng đến hơn 2 triệu con heo thịt, trong đó có 400.000 con heo bị chết, sau đó dịch
PRRS bắt đầu lan truyền đến Việt Nam. Trong khoảng thời gian từ năm 2006 đến năm
2010, dịch PRRS nhiều lần bùng phát trên diện rộng.

5


Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện vào năm 1997 trên đàn heo nhập từ Mỹ (10/51
con có huyết thanh dương tính bằng kỹ thuật ELISA phát hiện kháng thể) nhưng heo
không có triệu chứng bệnh. Số trại nhiễm và số heo dương tính kháng thể tăng qua các
năm, lần lượt là 35% số trại và 18% heo trong năm 1997 (Nguyễn Lương Hiền và ctv,
2000), 85% số trại và 36% heo vào năm 2003 (Trần Thị Bích Liên và Trần Thị Dân,
2007). Kết quả phân tích cấu trúc gene của virus PRRS gây bệnh tại Việt Nam cho thấy,
virus PRRS tại Việt Nam thuộc chủng Bắc Mỹ. Phân tích cấu trúc gene vùng NSP2 virus
này phát hiện hai sự thiếu hụt không liên tiếp về amino acid tại các vị trí 481 và từ 532 560. Virus phân lập từ Trung Quốc và Việt Nam cho thấy độ tương đồng khoảng 99% về
cấp độ gene (Feng và ctv, 2008; Zang, 2012; Văn Đăng Kỳ, 2011).
Từ tháng 3/2007, bệnh xuất hiện và gây thành dịch tại nhiều địa phương, làm tổn
thất lớn về kinh tế cho người chăn nuôi, cụ thể là: Năm 2007, dịch đã xuất hiện tại 324 xã,
thuộc 65 huyện của 18 tỉnh, thành phố. Tổng số lợn mắc bệnh là 70.577 con, số lợn chết
và phải tiêu huỷ là 20.366 con. Sang năm 2008, dịch xuất hiện tại 956 xã, phường, thuộc
103 huyện của 26 tỉnh, thành phố. Tổng số lợn mắc bệnh là 309.586 con, số lợn chết và
buộc phải tiêu huỷ là 300.906 con. Năm 2009, dịch xảy ra ở 69 xã thuộc 26 huyện của 13
tỉnh, thành phố: Bến Tre, Bình Dương, Đồng Nai, Tiền Giang, Vĩnh Long, Hưng Yên,
Quảng Ninh, Bắc Giang, Quảng Nam, Gia Lai, Bạc Liêu, Bà Rịa - Vũng Tàu và Đắk Lắk
với 7.030 lợn mắc bệnh và 5.847 lợn buộc phải tiêu huỷ. Năm 2010, dịch đã xuất hiện tại

1.978 xã, phường, thị trấn thuộc 286 quận, huyện của 49 tỉnh, thành phố. Tổng số lợn mắc
bệnh là 812.947 con, số lợn chết và buộc phải tiêu huỷ là 442.699 con. Đầu năm 2012 đến
nay, bệnh xảy ra tại 9 tỉnh phía Bắc (tháng 1 đến tháng 6) rồi đến Bạc Liêu, Đồng Nai,
Bình Dương và Long An (tháng 6/2012) nhưng quy mô ổ dịch nhỏ hơn so với năm 2010
(báo cáo của Cục Thú Y, tháng 9/2012)
Các nghiên cứu về bệnh trên những trại heo giống tại các tỉnh phía Nam cho thấy
tỷ lệ heo có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29%. Ở
các nước khác, tỷ lệ đàn trong vùng bệnh có huyết thanh dương tính rất cao, như ở Anh là
60-75%, Mỹ là 36% (Phòng Dịch Tễ – Cục Thú Y, 2007).

6


2.2

Tác nhân gây bệnh
Virus gây bệnh PRRS (gọi tắt là PRRSV) được xác định và phân lập vào năm 1991

ở viện Thú y Lelystad (Hà Lan) và được phân lớp vào họ Arteriviridae, giống Arterivirus,
bộ Nidovirales. PRRSV là một loại virus RNA mạch đơn, không màng bao. Kích thước
bộ gene khoảng 15 kb, bao gồm 8 khung đọc mã (ORF). Hai chủng chính được xác định
gồm: genotype 1 với prototype Lelystad (thường được gọi là chủng Châu Âu - EU) và
genotype 2 với prototype VR2332 (chủng Bắc Mỹ - NA). Gần đây, một biến thể của
genotype 2 có độc lực cao hơn đã gây nhiều tổn thất ở châu Á (Li và ctv, 2010; Wang và
ctv, 2007).
Virus thuộc dòng Bắc Mỹ còn có 1 phân nhánh lớn là PRRS kiểu Trung Quốc. Các
nghiên cứu phân tử cho thấy giữa virus PRRS chủng châu Âu và chủng châu Mỹ chỉ
tương đồng 60% về nguyên liệu di truyền. Mặc dù đôi khi triệu chứng gây bệnh trên hai
type PRRSV có nhiều nét chung, nhưng theo các nghiên cứu cho thấy hai type có sự khác
biệt lớn về bộ gene (55-80% mức độ tương đồng), đặc tính gây đáp ứng miễn dịch cũng

như độc lực virus (Oleksiewicz M.B. và ctv, 1998; Nelsen và ctv, 1999; Gao và ctv, 2004)
PRRSV xâm nhập và nhân lên trong các đại thực bào, đặc biệt là các đại thực bào
phổi. Khi hình thành các virion, virus phá hủy các đại thực bào, làm suy yếu khả năng đề
kháng của cơ thể. Bình thường, đại thực bào sẽ giết chết tất cả các vi khuẩn, virus xâm
nhập cơ thể, riêng đối với PRRSV, virus này không những không bị giết chết mà lại còn
có khả năng nhân lên, sau đó phá hủy đại thực bào (Phòng dịch tễ - Cục Thú Y, 2007).
Heo nhiễm bệnh thường bị bội nhiễm các bệnh khác như: Dịch tả heo, tụ huyết trùng, phó
thương hàn, bệnh do Streptococcus spp,… Đây là nguyên nhân chính gây chết nhiều heo
bệnh.

7


Hình 2.3 Đại thực bào trước và sau khi nhiễm PRRSV.
a)Các đại thực bào với các "chân giả" có tác dụng bắt giữ các tác nhân gây bệnh
như vi khuẩn, virus và tiêu diệt chúng b) Khi bị virus phá hủy, đại thực bào không
còn các "chân giả", mất khả năng bắt giữ và tiêu diệt tác nhân gây bệnh
(Nguồn: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH).
2.3

Triệu chứng bệnh
Triệu chứng bệnh của heo bị nhiễm PRRSV thường khác nhau tùy theo chủng

virus, đặc điểm giống heo, lứa tuổi, trạng thái miễn dịch của heo và các nhân tố kiểm soát
khác. Thời kì ủ bệnh có thể từ 3-37 ngày (FAO, 2011). Các triệu chứng của bệnh PRRS
gồm:
 Các triệu chứng về da: da thường có sự đổi màu từ ửng đỏ tới xanh, đặc biệt là
vùng da tai và vùng cơ quan sinh sản (hình 2.4). Có dấu hiệu phù nề ở dưới da, mí mắt,
chi sau, mõm…
 Các triệu chứng về hô hấp ở heo con và heo trưởng thành như khó thở, suy hô hấp.

Các triệu chứng về hô hấp thường trở nên nghiêm trọng hơn khi nhiễm các bệnh kế phát
do các vi sinh vật khác gây ra như Pasteurella multocida, Porcine Circovirus type 2
(PCV2), Mycoplasma hyopneumonia, Streptococcus suis, Salmonella cholerasuis,
Haemophilus parasuis, swine influenza virus… Tỉ lệ heo chết thường cao ở heo con (3050 %) và thấp hơn ở heo trưởng thành (4-20%) (OIE, 2008).

8


 Các triệu chứng về sinh sản ở heo nái: hôn mê, lờ đờ, giảm ham muốn tình dục,
sẩy thai, sinh non hoặc thai chết lưu. Heo con mới sinh thường yếu. Các bệnh về hô hấp
cũng thường xảy ra đối với heo nái bị nhiễm bệnh.
 Tuy nhiên các dấu hiệu lâm sàng nêu trên không hoàn toàn là đặc trưng cho bệnh
PRRS, mà còn xuất hiện ở các bệnh lây nhiễm do các tác nhân khác gây nên. Điều này dễ
gây nhầm lẫn trong chẩn đoán bệnh nếu chỉ dựa vào biểu hiện lâm sàng.

A

B
Hình 2.4 Triệu chứng bệnh ở heo nhiềm PRRS.
A. Da và cơ quan sinh dục đỏ; B. Tai màu tím xanh(Nguồn: Heo.com.vn).

2.4

Cấu trúc bộ gen PRRSV

2.4.1 Tổ chức bộ gen PRRSV
Chuỗi hệ gen đầy đủ của virus PRRS được xác lập vào năm 1993, nó có kích thước
khoảng 15,1 đến 15,5 kb và chứa 8 khoang đọc mở (ORF) để mã hóa 20 protein đã định
sẵn. Hệ gen cũng chứa 2 vùng không dịch mã (UTR) tại vị trí 59 và 39 (Thiel và ctv 1993,
Meulenberg và ctv 1993). Trong đó, chỉ có 3 khung ORF có ý nghĩa quan trọng trong

định danh virus, đó là ORFs 7, 6 và 5 quy định tổng hợp các protein tương ứng:
nucleocapsid (N) 15-kDa, matrix (M) 19-kDa và glycoproteins envelope (E) 25 kDa.

9


Hình 2.5 Cấu trúc bộ gen virus PRRS.
( />Bảng 2.1 Chức năng các ORF của PRRSV
Khung đọc mã ORF

Protein được mã hóa

Chức năng protein

ORF1a và ORF1b

Các enzyme sao chép RNA

Các protein không

polymerase

cấu trúc

ORF2

Glycoprotein màng nhỏ GP2a và
GP2b

ORF2-7

Nucleocapsid protein N

ORF3

Glycoprotein màng GP3

ORF4

Glycoprotein màng GP4

ORF5

Glycoprotein màng chính GP5

ORF6

Protein kết màng – M

ORF7

Nucleocapsid protein

Protein cấu trúc

(Nguồn Dea S.và ctv, 2000)
10


ORF1a và ORF1b là định vị xuôi dòng của 59-UTR, nó chiếm giữ khoảng 80% hệ

gen. ORF1a được dịch trực tiếp trong khi ORF1b được dịch bởi một khung dịch chuyển
ribosomal, độ lún xuống của chuỗi Protein ORF1ab lớn là sự thủy phân protein thành các
sản phẩm liên quan đến sự sao chép virus và bộ phận bản sao (Allende và ctv 1999,
Nelsen và ctv, 1999). ORFs 2-7 là định vị ngược dòng của 39- UTR, nó mã hóa một loạt
các protein cấu trúc thuộc virus có liên hệ với virion như: Protein bao bọc (E) và Protein
nhân capsit (N) (Meulenberg và ctv, 1993; Shen và ctv, 2000; Nelson , 1995). Các Protein
này đều được dịch từ một 39 UTR được định vị cố định trên các bộ gen ARN thông tin
(sgmRNAs) (Grebennikova và ctv, 2004). Chức năng cụ thể của từng ORF của PRRSV
được thể hiện trong bảng 2.1.
2.4.2 Protein không cấu trúc NSP2
Sản phẩm của ORF1a được phát hiện trong tế bào nhiễm virus nhưng không được
tìm thấy trong cấu trúc virion, vì vậy chúng được xem là những protein không cấu trúc.
ORF1a và ORF1b mã hóa các protein replicase, các protein phân tách ra ít nhất 13 protein
không cấu trúc liên quan đến việc nhân rộng và tái bản của virus (Den Boon và ctv, 1996)

Hình 2.6. Biểu đồ giả định protein NSP2 của PRRSV.
Vùng NSP1 đến NSP5 của PRRSV và EAV trên lược đồ. Vị trí giao nhau được đánh
dấu bởi hình tam giác và vị trí được chú thích. Vùng hoạt động các enzyme là hộp màu
đen, vùng không hoạt động PCP-1 trên EAV là hộp màu xám. Vùng TM (aa từ 876 đến
898, 911 đến 930, 963 đến 979 và 989 đến 1009). Hai vùng siêu biến đổi (HV)
(Jun Han và ctv, 2007).

11


Trong các protein không cấu trúc của PRRSV, NSP2 là sản phẩm lớn nhất của
protein replicase. NSP2 protease tương tự như nhóm protease giống papain (papain-like
protease) nhưng nó có đặc tính riêng biệt như hoạt tính protease cystein tự phân cắt nên
được xếp vào nhóm “chymotrypsin-like cystein protease” (Snijder và ctv, 1995). Protein
NSP2 của PRRSV có cấu trúc tương tự như NSP2 của EAV, gồm 3 vùng chính: vùng bảo

tồn với đầu N-terminal cystein protease (PL2); vùng không tương đồng và vùng siêu biến
đổi (HV-hypervariable); vùng kỵ nước C-terminusTM (TM) (Hình 2.6)
Vùng bảo tồn với đầu N-terminal cystein protease (PL2)
Vùng này có khoảng 100 aa, là vùng hoạt động trên chất nền giữa vùng giao nhau
của NSP2 và NSP3. Đây là vùng được dự đoán có tính bảo tồn cao (Bosch và ctv, 2004).
Để kiểm tra tính quan trọng của miền PL2, Jun Han và ctv (2007) đã tiến hành tạo một số
đột biến mất nucleotide (nu) trên vùng PL2 trên NSP2 (Y47-S180). Kết quả, việc mất lõi
PL2 trên NSP2 đã gây chết cho virus.
Ngoài ra, vai trò của vùng đầu và cuối của PL2 cũng được xác định bằng cách tạo
một trong hai đột biến xóa vùng trên A13-V35[V7-NSP213-35] hoặc vùng dưới S181L323[V7-NSP2181-323], sau đó tạo dòng và nuôi cấy trên môi trường MACR-145. Kết
quả sự phiên mã cho thấy V7-NSP213-35 hoạt động bình thường còn V7-NSP2181323 chết. Điều này chứng tỏ aa 181-323 có ảnh hưởng đến hoạt động của PL2 (Jun Han
và ctv, 2007).
Vùng kỵ nước C-terminusTM (TM) và đuôi C
Vùng carboxyl của NSP2 thì có tính bảo tồn cao trên các chủng PRRSV và chứa
khoảng 3 đến 4 vùng hydrophotic TM (aa 876-898, 911-930, 963-979, 989-1009). Đặc
điểm này giống với EAV, vì vậy vùng kỵ nước C chịu trách nhiệm cho các mô đích của
các protein không cấu trúc trên màng tế bào để hoàn thành việc nhân rộng virus (Van der
Meer và ctv, 1998). Các đột biến xóa toàn bộ vùng W876-Q1009 hay vị trí giao nhau
981G/G, vùng A880-A937[V7-NSP2880-937], vùng S1070-A1162[V7-NSP210701162] đã gây chết cho virus (Jun Han và ctv, 2007).

12


Hình 2.7 Xây dựng các chủng VR-2332 có NSP2 đột biến.
Đột biến đã xóa trong khung NSP2 đã được hình thành để đạt được sản phẩm bằng
PCR. Với mục đích biểu hiện gen ra ngoài, gen GFP đã được chèn vào vị trí mà
các aa vùng 324-434 của NSP2 đã bị xóa để tạo ra đột biến V7-NSP2324-434GFP (Jun Han và ctv, 2007).
Vùng không tương đồng và vùng siêu biến đổi (HV-hypervariable)
Là vùng nằm giữa vùng PL2 và vùng TM, khoảng 150-850 aa, khác nhau rất cao
giữa các giống và đặc biệt là giữa các chủng PRRSV (Nellsen và ctv, 1999; Allende và

ctv, 1999). Theo ghi nhận của Jun Han và ctv (2007) vùng này không cần thiết cho việc
nhân lên của virus.

13


Theo Pedersen và ctv (1999), protein NSP2 (cùng với NSP3) có liên quan đến sự
cảm ứng hình thành túi màng kép (Double-membrance vesicle). Hơn nữa, NSP2 mang
tính kháng nguyên cao (Oleksiewics và ctv, 2001). Gen NSP2 cho thấy sự đa dạng di
truyền cao nhất trong bộ gen virus, cũng như tính đa hình về kích thước rất đáng kể, gồm
sự xen vào 108 base và sự mất 3-333 base (Fang và ctv, 2004). Điển hình, theo Tian và
ctv (2007) những chủng PRRSV độc lực cao, có sự mất không liên tiếp 90 base được xem
như là một chỉ thị phân tử (marker) cho di truyền dịch tễ. NSP2 sở hữu 2 đặc điểm quan
trọng làm cho nó có tiềm năng cho việc xây dựng marker virus: một là có thể chèn được
một đoạn gen từ bên ngoài vào và việc có thể xóa bỏ trình tự trong NSP2; hai là: có tính
miễn dịch cao.
NSP2 của PRRSV mã hóa các protein chức năng, được đánh giá là có tính không
đồng nhất cao và biến đổi. Trình tự mã hóa NSP2 cũng khác nhau giữa 2 chủng PRRSV
EU và NA, tương đồng khoảng 40% trình tự aa (Nellsen và ctv, 1999). Hơn nữa vùng
NSP2 chính là nguyên nhân dẫn đến sự khác nhau về chiều dài giữa 2 type PRRSV EU và
NA (Tian và ctv, 2007).
2.5

Các phương pháp phát hiện PRRSV

Dựa trên biểu hiện lâm sàng
Chủ yếu phát hiện heo bị bệnh dựa vào các biểu hiện lâm sàng như: các vấn đề về
sinh sản ở heo nái (tỉ lệ thụ thai thấp, sảy thai ở giai đoạn cuối, tỉ lệ heo sinh non cao, thai
chết lưu, heo con yếu hoặc chết (hình 2.8), các bệnh về hô hấp (khó thở, ho…), các dấu
hiệu lâm sàng như sốt cao, bỏ ăn, da mẩn đỏ, xảy ra ở bất kì lứa tuổi heo

(Lurchachaiwong và ctv, 2008). Theo hướng dẫn của Cục Thú Y nước ta, để phát hiện
heo bệnh tai xanh, phải thường xuyên kiểm tra sức khỏe đàn heo nuôi và sử dụng định
nghĩa ca bệnh lâm sàng như sau: Heo sốt cao trên 400C, khó thở, có những vết bầm, thâm
tím trên da, tai tím xanh, heo ở các lứa tuổi khác nhau đều có thể mắc bệnh (Phan Trung
Nghĩa, 2010)

14


Hình 2.8: Sảy thai, thai chết lưu ở các giai đoạn thai kì khác nhau của bệnh PRRS.
(Nguồn: ).
Tuy nhiên, phương pháp này nhận diện bệnh không rõ ràng vì các biểu hiện bệnh
biến động tùy thuộc chủng virus, tình trạng đàn heo, các yếu tố môi trường, cũng như việc
dễ nhầm lẫn với các bệnh do các tác nhân virus và vi khuẩn khác gây ra. Bên cạnh đó,
thời gian để phát hiện heo nhiễm bệnh lâu, chỉ phát hiện khi heo đã phát bệnh nên gây
khó khăn cho các biện pháp cách ly và phòng ngừa. Tuy nhiên hiện nay, đây lại là phương
pháp phát hiện phổ biến nhất ở các trại chăn nuôi cũng như các trung tâm thú y ở nước ta.
Phân lập virus
Phân lập virus được xem như là tiêu chuẩn vàng cho việc phát hiện PRRSV.
PRRSV có thể được phân lập từ mẫu huyết thanh, mô cơ quan như phổi, lách, tim, hạch
bạch huyết... Đại thực bào phổi hay dòng tế bào MARC-145 rất thích hợp làm hệ thống
nuôi cấy virus. Việc phân lập thành công virus PRRSV phụ thuộc rất nhiều vào tuổi heo
bị nhiễm, điều kiện lấy mẫu, giai đoạn lấy mẫu,… Nhược điểm của phương pháp này là
tiến hành khó khăn, tốn thời gian (OIE, 2010), rất khó để phân lập được PRRSV type EU
vì type này thường không sao chép trong tế bào dòng mà chỉ sao chép trên đại thực bào
phổi heo (PAM - Porcine Alveolar Macrophages).
Huyết thanh học

15