NGHIÊN CỨU SỰ TẠO PHÔI SOMA VÀ TÁI SINH CHỒI CÂY MACCA (Macadamia) in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
**************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SỰ TẠO PHÔI SOMA VÀ TÁI SINH CHỒI
CÂY MACCA (Macadamia) in vitro

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : PHAN THỦY QUYÊN
Niên khóa

: 2009 – 2013

Tháng 6/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
**************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SỰ TẠO PHÔI SOMA VÀ TÁI SINH CHỒI
CÂY MACCA (Macadamia) in vitro

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. TRẦN THỊ LỆ MINH

PHAN THỦY QUYÊN

KS. TÔ THỊ NHÃ TRẦM

Tháng 6/2013


LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn
Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã tận tình truyền đạt
kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tại trường.
Chân thành cảm ơn cô Trần Thị Lệ Minh và đặc biệt cô Tô Thị Nhã Trầm đã tận
tình hướng dẫn giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Xin cảm ơn tất cả các bạn sinh viên, các anh chị tại bộ môn Công nghệ Sinh học.
Cảm ơn chị Đỗ Ngọc Thanh Mai đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Xin cảm ơn tất cả các bạn lớp DH09SH đã hỗ trợ giúp đỡ, động viên và chia sẽ
những khó khăn tôi trong thời gian thực hiện đề tài này.
Con xin cảm ơn ba má cùng những người thân trong gia đình đã luôn yêu thương,
động viên và tạo điều kiện cho con trong suốt thời gian học tập.

TP Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 6 năm 2013

Sinh viên thực hiện
Phan Thủy Quyên

i


TÓM TẮT
Macca là một loại cây quả khô có nguồn gốc từ Australia được mệnh danh là “nữ
hoàng quả khô”. Khi dùng có tác dụng làm giảm cholesteron, phòng trị xơ cứng động
mạch, có hàm lượng protein trong nhân đạt 9,2% gồm 20 loại axit amin trong đó có 8
loại axit amin thiết yếu cho cơ thể con người. Cây macca được trồng thử nghiệm ở
Việt Nam trong những năm gần đây và mang lại hiệu quả kinh tế cao. Tuy nhiên, hiện
nay cây macca được nhân giống bằng phương pháp thủ công truyền thống như chiết
ghép, giâm cành hoặc gieo hạt nên chưa đáp ứng đủ nhu cầu về số lượng cây giống,
khả năng chống chịu bệnh còn kém và dễ thoái hóa giống (Allen, 1965). Giải pháp đặt
ra là thay thế nhân giống thủ công truyền thống bằng phương pháp nuôi cấy mô. Xuất
phát từ yêu cầu thực tiễn trên nên đề tài “Nghiên cứu sự tạo phôi soma và tái sinh chồi
cây macca (Macadamia) in vitro” được thực hiện.
Nội dung chính của đề tài gồm tiến hành thí nghiệm khảo sát thời gian khử trùng
mẫu lá và đoạn thân macca, thí nghiệm tạo phôi từ sẹo, phát sinh chồi từ phôi và đoạn
thân cây macca in vitro.
Kết quả thí nghiệm đạt được, mẫu lá macca được khử trùng tốt nhất với NaOCl
50% trong thời gian 20 phút, mẫu đốt thân được khử trùng tốt nhất với NaOCl 50%
trong thời gian 25 phút. Môi trường WPM có bổ sung 1 mg/l BA, 0,3 mg/l IBA và 0,1
mg/l Ki cho tỷ lệ tạo phôi tốt nhất (61,67%) sau 28 ngày nuôi cấy. Phôi được nuôi cấy
trên môi trường WPM có bổ sung 0,1mg/l IBA và 2mg/l BA cho khả năng tái sinh chồi
tối ưu nhất (23,33%). Đối với mẫu thân macca in vitro trên môi trường WPM bổ sung
2 mg/l BA, 0,5 mg/l TDZ và 1,5 mg/l Ki cho kết quả tạo chồi tối ưu (đạt 100%).

ii

SUMMARY

Macca which is one kind of dried fruit originated from Australia is called “the
Queen of dried fruit”. Using it can bring some useful effects such as reducing the
amount of cholesteron, preventing arteriosclerosis. There is also an amount of
endonuclear protein reaching 9.2% including 20 kinds of amino acids, of which 8
kinds are essential for human. Macca place have been planted experimentally in Viet
Nam in recent years and have had high economic result. However, nowadays, macca
plants are mainly multiplicated by traditional methods such as grafting, raising, or
scattering seeds. Therefore, there are not enough demand for breed plants, the capacity
of against disease is bad, and it is easy to be dysgenic. Solution is replacing traditional
methods with growing tissue culture method. Thus, the thesis “the study of somatic
embryogenesis formation and shoot formation proliferation of macca (Macadamia) in
vitro” is performed.
Study content: Investigatethe time of sterilization NaOCl 50% of macca leaf
sample and macca nude sample, the ability of somatic embryogenesis formation, the
ability of shoot of somatic embryogenesis and macca nude sample.
Some results of this thesis: Macca leaf sample is treatment achieved sterilized with
NaOCl 50% in 20 minutes, macca shoot sample is best sterile in NaOCl 50% in 25
minutes. Callus grown in WPM medium supplemented 1 mg/l BA, 0.3 mg/l IBA and
0.1 mg/l Ki have the best rate of somatic embryogenesis formation (61.67%) after 28
days cultured. Somatic embryogenesis grown in WPM medium supplemented 0.1 mg/l
IBA and 1.5mg/l BA have the best ability of shoot (23.33%). The experiment
surveying the ability of shoot of macca nude sample has the best result (100%) when
macca shoot samples grown in WPM medium supplemented 2 mg/l BA, 0.5 mg/l TDZ
and 1.5 mg/l Ki.
Key words: macca, shoot, somatic embryogenesis.

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn............................................................................................................................ i
Tóm tắt................................................................................................................................. ii
Summary............................................................................................................................. iii
Mục lục ............................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt ................................................................................................. vii
Danh sách các bảng .......................................................................................................... viii
Danh sách các hình ............................................................................................................. ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề ...................................................................................................................... 1
1.2 Yêu cầu .......................................................................................................................... 2
1.3 Nội dung nghiên cứu ..................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................... 3
2.1. Giới thiệu về cây Macca ............................................................................................... 3
2.1.1 Phân loại thực vật của cây Macca .............................................................................. 3
2.1.2 Nguồn gốc cây macca................................................................................................. 3
2.1.3 Giá trị của cây Macca ................................................................................................. 3
2.1.4 Đặc điểm thực vật học của cây macca ....................................................................... 4
2.1.5 Đặc điểm sinh học của cây macca .............................................................................. 4
2.1.6 Yếu tố môi trường sinh thái ảnh hưởng đến cây macca ............................................. 5
2.2. Tình hình nghiên cứu cây macca trên thế giới và ở Việt Nam..................................... 6
2.2.1 Tình hình nghiên cứu cây macca trên thế giới ........................................................... 6
2.2.2 Tình hình nghiên cứu cây macca ở Việt Nam ............................................................ 7
2.3. Quá trình phát sinh mô sẹo thành cây hoàn chỉnh........................................................ 8
2.3.1 Khái niệm về tạo mô sẹo ............................................................................................ 8
2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới sư tạo mô sẹo .................................................................... 8

2.4. Quá trình tạo phôi soma từ mô sẹo............................................................................... 9
2.4.1 Khái niệm phôi soma .................................................................................................. 9

iv


2.4.2 Đặc điểm của tế bào sinh phôi.................................................................................. 10
2.4.3 Các giai đoạn phát triển của phôi soma.................................................................... 10
2.4.4. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến phôi soma ........................ 11
2.4.4.1 Ảnh hưởng của auxin trong cảm ứng tạo phôi soma............................................. 11
2.4.4.2 Ảnh hưởng của cytokinin trong môi trường có auxin đến quá trình ..................... 12
2.5 Sự phát sinh chồi từ phôi soma ................................................................................... 12
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 14
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................................... 14
3.2. Vật liệu, trang thiết bị ................................................................................................. 14
3.2.1 Vật liệu thí nghiệm ................................................................................................... 14
3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ .......................................................................................... 14
3.2.3 Môi trường nuôi cấy ................................................................................................. 14
3.2.4 Điều kiện nuôi cấy .................................................................................................... 14
3.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 14
3.3.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng NaOCl 50% đến khả năng sống ............. 14
3.3.2 Ảnh hưởng của BA, IBA và Kinetin đến sự phát sinh phôi soma từ mô sẹo ......... 16
3.3.3 Ảnh hưởng của IBA và BA lên sự tái sinh chồi từ phôi soma ................................ 17
3.3.4 Ảnh hưởng của BA, TDZ và Kinetin lên sự tái sinh chồi từ mẫu thân .................... 17
3.4 Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................................... 18
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................................... 19
4.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng NaOCl 50% đến khả năng sống ............... 19
4.1.1 Vô trùng mẫu lá macca ............................................................................................ 19
4.1.2 Vô trùng mẫu đốt thân macca ................................................................................ 20
4.2 Sự phát sinh phôi soma từ mô sẹo có nguồn gốc từ lá.............................................. 22

4.3 Sự tái sinh chồi từ phôi soma lá macca ....................................................................... 26
4.4 Sự tái sinh chồi từ mẫu thân cây macca ...................................................................... 28
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................................. 31
5.1 Kết luận ....................................................................................................................... 31
5.2 Đề nghị ........................................................................................................................ 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 32
PHỤ LỤC
v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BA

: (C12H11) Benzyl adenine

CW

: Nước dừa

G

: Gram

IBA

: Indole-3-butyric acid

Ki

: Kinetin (6-furfurylaminopurine)

L

: Lít

MS

: Murashige và Skoog (1962)

MT

: Môi trường

NAA

: α-naphtalen acetic acid

NaOCl

: Sodium hypochlorite

NT

: Nghiệm thức

TDZ

: Thidiazuron

WPM

: Woody Plant Medium

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang
Bảng 3.1 Khảo sát thời gian khử trùng bằng NaOCl 50% đến tỷ lệ ...........................15
Bảng 3.2 Khảo sát thời gian khử trùng bằng NaOCl 50% đến tỷ lệ sống ...................15
Bảng 3.3 Khảo sát sự phát sinh phôi soma từ mẫu mô sẹo .........................................16
Bảng 3.4 Khảo sát sự tái sinh chồi từ phôi soma .........................................................17
Bảng 3.5 Khảo sát sự tái sinh chồi từ mẫu thân cây macca .........................................18
Bảng 4.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng bằng NaOCl 50% đến tỉ lệ sống ...............20
Bảng 4.2 Ảnh hưởng thời gian khử trùng bằng NaOCl 50 % đến tỉ lệ sống ...............21
Bảng 4.3 Khảo sát sự phát sinh phôi soma từ mẫu mô sẹo có nguồn gốc từ lá...........23
Bảng 4.4 Tái sinh chồi từ phôi soma phát sinh từ mô sẹo có nguồn gốc từ lá ............26
Bảng 4.5 Sự tái sinh chồi từ mẫu thân cây macca in vitro...........................................28

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Trái cây macca ................................................................................................3
Hình 4.1 Mẫu lá macca sau khi khử trùng với NaOCl 50% ......................................20
Hình 4.2 Mẫu đoạn thân macca sau khi khử trùng với NaOCl 50% ...........................21
Hình 4.3 Phôi hình thành từ mẫu mô sẹo có nguồn gốc từ lá macca ..........................24

Hình 4.4 Chồi cảm ứng từ phôi ở các môi trường khác nhau .....................................25
Hình 4.5 Chồi macca tái sinh từ phôi ..........................................................................27
Hình 4.6 Chồi cảm ứng từ đoạn thân sau 60 ngày nuôi cấy ở các môi trường. ..........30

viii


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Macca là một loại cây quả khô có nguồn gốc từ Australia được mệnh danh là “nữ
hoàng quả khô”. Hạt macca được sử dụng chủ yếu để chế biến thực phẩm, hiện hạt
macca thô trên thị trường thế giới có giá 1,5 ̶ 2 USD/kg, giá trị thu được 4.500 ̶
6.000 USD/ha trở lên. So với cà phê hiện nay chỉ thu từ 3.500 ̶ 4.000 USD/ha thì thu
nhập từ cây macca cao hơn nhiều, với năng suất trên 3 tấn hạt thô/ha/năm.
So với các hạt giống ăn được phổ biến khác như hạnh nhân, điều, hạt macca có
hàm lượng chất béo cao và ít chất đạm, trong nhân macca có chứa nhiều tinh bột,
đường, chất khoáng và nhiều loại vitamin khác. Đây là loại thực phẩm cao cấp, ngon,
bổ dưỡng, giàu chất béo, giàu nhiệt năng. Hạt macca còn có thể dùng làm tinh dầu
dưỡng da, dược liệu. Vỏ hạt có thể làm than hoạt tính, làm chất đốt và có thể làm giá
thể để ươm cây rất được ưa chuộng trên thị trường thế giới và tương lai sẽ là cây trồng
mũi nhọn trong các loại cây công nghiệp.
Cây macca được trồng thử nghiệm ở Việt Nam trong những năm gần đây và mang
lại hiệu quả kinh tế cao, giá mỗi cây macca giống vào khoảng 40.000 đồng. Qua
nghiên cứu tại Viện Khoa học Kỹ thuật Nông Lâm nghiệp Tây Nguyên, các giống
macca H2, 508 và OC có tỷ lệ ra hoa, đậu quả cao. Đặc biệt, giống OC khá phù hợp
với điều kiện sinh thái ở Tây Nguyên. Tuy nhiên, hiện nay cây macca chủ yếu được
nhân giống bằng phương pháp chiết ghép, giâm cành hoặc gieo hạt nên chưa đáp ứng
đủ nhu cầu về số lượng cây giống, khả năng chống chịu bệnh còn kém và dễ thoái hóa
giống. Giải pháp đặt ra là thay thế nhân giống thủ công truyền thống bằng phương
pháp nuôi cấy mô. Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn trên nên đề tài “Nghiên cứu sự tạo

phôi soma và tái sinh chồi cây macca (Macadamia) in vitro” đã được thực hiện.

1


1.2 Yêu cầu
Khảo sát được thời gian khử trùng mẫu lá và đoạn thân macca bằng NaOCl 50%;
tạo được phôi từ mẫu mô sẹo macca, từ đó tạo chồi từ phôi; phát sinh chồi từ đoạn thân
cây macca in vitro.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Nội dung chính của đề tài bao gồm tiến hành thí nghiệm khảo sát thời gian khử
trùng mẫu lá và đoạn thân macca bằng NaOCl 50%, tiến hành thí nghiệm tạo phôi từ
sẹo trên môi trường WPM có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng Ki, sau đó khảo sát
ảnh hưởng của BA tới sự phát sinh chồi từ phôi trên môi trường WPM và ảnh hưởng
của Ki đến sự phát sinh chồi từ đoạn thân cây macca in vitro.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu về cây macca
2.1.1 Phân loại thực vật của cây macca
Giới

: Plantae

Ngành

: Angiosperms

Lớp

: Eudicots

Bộ

: Proteales

Họ

: Proteaceate

Chi

: Macadamia

Loài

: Macadamia integrifolia
Hình 2.1 Trái macca
( />
2.1.2 Nguồn gốc cây macca
Cây macca có nguồn gốc từ Australia, được phát hiện ở vùng Queensland, có tên
khoa học là Macadamia. Năm 1881 Purvis đưa cây macca vào trồng ở Hawai (Mỹ).
Hiện nay, cây macca được trồng phổ biến ở Australia, Mỹ, Braxin, Peru, Mehico,
Kenia, Zimbabuê, Nam Phi, Srilanca, Trung Quốc, Thái Lan, Indonexia với diện tích
trên 50.000 ha, sản lượng khoảng 10 vạn tấn/năm (Wagner và Wright,1995).
2.1.3 Giá trị của cây macca
Cây macca là một loại cây quả khô, nhân ăn được, có hàm lượng dầu khoảng 78%,

cao hơn hẳn lạc (44,8%), điều (47%). Thành phần dầu trong quả có trên 87% là acid
béo không no. Hạt macca khi dùng có tác dụng làm giảm cholesteron, phòng trị xơ
cứng động mạch. Hàm lượng protein trong nhân có tới 9,2%, gồm 20 loại acid amin
trong đó có 8 loại acid amin cần thiết cho cơ thể con người. Ngoài ra trong nhân macca
có chứa nhiều tinh bột, đường, chất khoáng và nhiều loại vitamin khác. Đây là loại
thực phẩm cao cấp, ngon, bổ dưỡng, giàu chất béo, giàu nhiệt năng, có thể dùng chế
biến nhân bánh sôcôla, nước uống, dầu xa lát. Ngoài ra, hạt macca còn có thể dùng làm
tinh dầu dưỡng da, dược liệu. Vỏ hạt có thể làm than hoạt tính, làm chất đốt và có thể

3


làm giá thể để ươm cây macca rất được ưa chuộng trên thị trường thế giới (Wenkham
và Miller, 1965) và tương lai sẽ là cây trồng mũi nhọn trong các loại cây công nghiệp
(Nguyễn Công Tạn, 2002).
2.1.4 Đặc điểm thực vật học của cây macca
Cây macca là loại cây thân gỗ lớn, có thể cao đến 18 m, tán rộng 15 m. Cây macca
ở vùng nguyên sản có sản lượng trên 100 tuổi, tuổi thọ kinh tế khoảng 40 – 60 năm.
Macca mang đặc điểm chung của họ Protaceae, rễ cọc kém phát triển, rễ bàng rộng và
rất rậm, chủ yếu phân bố trong tầng đất 70 cm trở lại, trong đó 70% tập trung tần đất
mặt từ 0 – 30 cm. Thân macca thẳng đứng, chia cành rất nhiều, tán rộng, dễ đổ. Cành
tròn đều, có nhiều mụn lồi, vỏ nhám không xẻ cành, vết cắt trên vỏ có màu đỏ tối, gỗ
rất cứng. Cây macca có từ 3 đến 4 lá mọc cách nhau trên đường xoáy ốc. Lá cứng, mép
lá lượn sóng, mặt lá thường uốn lượn, lá nguyên mép hoặc có răng cưa, đôi khi răng
cưa nhọn cứng như gai, gân nỗi rất dễ thấy. Hoa macca tựa đuôi sóc mọc từ cành
khoảng 1,5 đến 2 tuổi, có những cành 3 tuổi vẫn trổ hoa, tập trung chủ yếu ở đầu cuối
đoạn cành. Hoa thường mọc thành chùm đôi hoặc 3 ̶ 4 bông. Quả hạt macca kích
thước khoảng 2,5 cm nặng khoảng 8 ̶ 9 g, vỏ quả dày 2 ̶ 3 mm. Quả thường mọc
thành chùm khoảng 17 – 20 quả. Vỏ quả gồm 2 lớp gồm lớp vỏ ngoài láng bóng tạo
nên bởi những tế bào dạng sợi và lớp áo trong tạo nên bởi tế bào nhu mô, khi lớp vỏ

này chuyển màu từ trắng sang nâu rồi đen là dấu hiệu cho thấy quả đã chín. Hạt rất
cứng, gồm lớp vỏ dày 2 – 3 mm, nhân được tạo nên bởi 2 tử diệp hình bán cấu chứa
đầy phôi nhũ và phôi hình cầu rất nhỏ gắn giữa 2 tử diệp và nằm sát châu khổng (lổ
nảy mầm). Tuy rất nhỏ nhưng phôi thành thục vẫn có đủ trục phôi, mầm thân và mầm
rễ (Nguyễn Công Tạn, 2002).
2.1.5 Đặc điểm sinh học của cây macca
Cây macca mỗi năm phát triển cành 3 đến 4 lần, hiện tượng phát triển cành thường
gặp là ba chồi nách của ba nách lá mọc xoáy, đồng thời phát triển ra 9 đến 12 chồi non.
Hoa phát triển thành ba thời kì là hình thành chồi hoa, vươn dài của hoa và hoa nở. Khi
chồi hoa được hình thành thì mắt thường có thể thấy rõ lúc đó chồi hoa bước vào giai
đoạn ngủ kéo dài từ 50 đến 96 ngày tùy theo đặc điểm vùng khí hậu, sau đó hoa tự
vươn dài, thời kỳ vươn dài thường mất khoảng 60 ngày. Thời kỳ hoa nở thì muộn hơn
thời kỳ hình thành chồi hoa khoảng từ 137 đền 153 ngày. Khi hoa nở, vòi nhị cái mọc
4


dài và uốn cong, sau đó phần uốn cong lớn nhất làm nứt đường gân nối trên búp cánh
hoa, lúc này búp cánh hoa chuyển màu từ xanh sang trắng sữa. Cây macca là loài tự
thụ phấn, tuy nhiên nhiều nghiên cứu cho thấy phần lớn các trường hợp tự thụ phấn
đều bất dục (Loebel, 1986).
Trong quá trình phát triển của quả, rụng non là vấn đề rất thường gặp. Trên
một chùm có thể có trên 300 bông hoa, ban đầu có thể từ 6 đến 35% đậu thành quả
nhưng kết quả thường chỉ có 0,3% phát triển được thành quả chín già. Phần lớn các
tác giả nghiên cứu đều đi đến nhận xét nguyên nhân chính dẫn đến rụng quả là vấn
đề dinh dưỡng. Nghiên cứu về nhịp điệu rụng quả và biến động dinh dưỡng trong lá
cây. Nhịp điệu tăng trọng nhanh của quả non rất trùng hợp với nhịp điệu rụng quả
nhiều

(Hứa Huệ Sách, 1995; Từ Hiểu Linh, 1996). Cây macca có đặc điểm là hoa

nhiều, nên hàm lượng dinh dưỡng cần cung cấp nhiều đạm và lân. Ngoài vấn đề dinh
dưỡng thì các yếu tố thời tiết như nóng, hạn kéo dài, bão, lũ cũng có thể gây rụng quả
nhiều, nhất là trong thời gian từ 35 đến 41 ngày sau khi hoa tàn.
Sau khi hoa tàn quả non được hình thành, cần khoảng 215 ngày để quả lớn và
chín, khi đó hàm lượng dầu trong nhân đạt khoảng 75 – 79%. Hàm lượng dầu trong
nhân không ngừng tăng lên khi quả chín, trong khi hàm lượng đạm không ngừng giảm
xuống. Hàm lượng đường sau khi hoa tàn không ngừng tăng lên cho tới khoảng ngày
thứ 111 sau đó bắt đầu giảm dần, biến động theo tuổi quả, của hàm lượng nước, đạm
và dầu trong nhân hạt macca (Từ Tiểu Linh, 1996). Phân tích trên cho thấy khoảng từ
ngày thứ 90 sau khi hoa tàn hàm lượng dầu có xu hướng tăng dần cho đến ngày thứ
120. Đây là thời kỳ hàm lượng dầu tăng nhanh có thể đạt từ 32,59% đến 36,1% và đến
ngày thứ 150 hàm lượng dầu có thể đạt trên 60%, khi quả chín đạt trên 72%.
2.1.6 Yếu tố môi trường sinh thái ảnh hưởng đến cây macca
Cây macca có thể chịu được nhiệt độ ̶ 4oC ( ̶ 6oC đối cới cây trưởng thành) và kéo
dài 7 ngày. Nếu nhiệt độ vượt qua 38oC kéo dài có thể gây phản ứng xấu về sinh lý
(T rầ n Tác Tuyền, 1995). Để gây trồng macca trên quy mô thương mại người ta
thường đưa ra khuyến cáo lựa chọn vùng gây trồng có nhiệt độ không thấp hơn 13oC
và không cao hơn 32oC. Nhiệt độ tốt nhất cho cây sinh trưởng là 20 – 25oC. Nhiệt độ
tốt nhất cho phân hóa hình thành chồi hoa là 15 – 18oC kéo dài từ 4 đền 8 tuần. Vì vậy
nhiệt độ bình quân ban đêm khoảng 20 – 21oC. Trong giai đoạn phát triển quả non và
5


tích lũy dầu, nhiệt độ ban ngày thích hợp là 15 – 25oC, giai đoạn tiếp theo là giai đoạn
tích lũy dầu chủ yếu. Ở nhiều độ 15oC và 35oC phù hợp cho tăng trưởng nhân, tỷ lệ
nhân và tỷ lệ dầu đều thấp ở 35oC, chất lượng nhân và hàm lượng dầu thấp hơn 72%.
Lượng mưa thích hợp với cây macca thường không thấp hơn 1000 mm/năm và
phải phân bố đều, với lượng mưa thấp hơn 1000 mm/năm sản lượng macca không cao,
quả bé, nhân phát triển không đều. Cây macca thích hợp ở các vùng núi cao, ở nước ta
khu vực trung du miền núi phía bắc có độ cao từ 700 – 1000 m (nhất là vùng Tây Bắc)

đây là nơi có điều kiện lí tưởng để gây trồng macca với quy mô thương mại (Nguyễn
Công Tạn, 2002).
Cây macca thân to, thẳng, tán rộng và nặng, rễ cọc không sâu nên dễ đổ khi gió to,
bão lụt. Cây có thể phát triển tốt trên nhiều loại đất, nhưng thường đòi hỏi tầng đất sâu,
tốt nhất là sâu 1 m, thoát nước tốt và giàu hữu cơ, đất không bị bí chặt, độ pH thích
hợp từ 5,0 – 5,5; đất phèn, mặn, đất trên đá vôi đều không thích hợp với cây macca.
Cây macca rất nhạy cảm với dinh dưỡng khoáng đặc biệt là với lân, đất quá nhiều lân
hoặc bón lân quá liều có thể gây ngộ độc cho cây, biểu hiện thường gặp là lá mất màu
xanh. Đất feralit có hàm lượng magie cao cũng có thể gây ra bệnh vàng lá, sinh trưởng
kém, sản lượng thấp (Loebel, 1986).
2.2. Tình hình nghiên cứu cây macca trên thế giới và ở Việt Nam
2.2.1 Tình hình nghiên cứu cây macca trên thế giới
Trên thế giới hiện có 17 triệu cây macca, diện tích 78.000 ha tại các nước
Australia, Mỹ, Braxin, Kenia, Costarica, Nam Phi, Goatemala, Trung Quốc. Sản lượng
macca hạt đạt gần 12 vạn tấn/năm, sản lượng nhân đã qua chế biến đạt 3 vạn tấn/năm.
Thị trường tiêu thụ chủ yếulàMỹ, Nhật Bản, Châu Âu, Australia, Trung Quốc
(WagnervàWright, 1995).
Năm 2006, các nhà khoa học Australia, Richard và Bhalla đã nghiên cứu sự tái
sinh cây từ mẫu lá cây macca (Maca tetraphylla L.Jonhson). Kết quả cho thấy trên môi
trường MS có bổ sung 10 hoặc 15 µM TDZ chồi bất định được tạo ra từ mô non của
quả(140 – 190 ngày tuổi). Việc bổ sung 2% CW, 0,001 µM IAA và 10 µM TDZ vào
môi trường nuôi cấy sẽ kích thích sản xuất chồi đáng kể gấp 1,5 – 2 lần so với thực
hiện trên môi trường chỉ chứa TDZ và CW (Richard và Bhalla, 2006).

6


Năm 2008, các nhà khoa học Kenya đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tái
sinh chồi Macadamia integrifolia trong ống nghiệm. Theo Gitonga và cộng sự (2008),
tần số hình thành chồi cao nhất đạt 98%, số chồi từ một mẫu là 8,1 chồi, chiều dài chồi

đạt 3,3 cm khi nuôi cấy trên môi trường WPM được bổ sung với BAP 2 mg/l, IBA 1
mg/l và GA 31 mg/l.
2.2.2 Tình hình nghiên cứu cây macca ở Việt Nam
Ở Việt Nam, cây macca được đưa vào trồng sớm nhất ở Ba Vì vào năm 1994.
Cây macca đầu tiên được trồng ở Tây Nguyên tại nhà máy cao su ĐakLak, xã
Cuôr Đăng, huyện CưM’gar, tỉnh ĐakLak năm 1996. Viện Khoa học Kỹ thuật
Nông Lâm nghiệp Tây Nguyên bắt đầu nghiên cứu trồng thử nghiệm giống macca
nhập nội từ Trung Quốc tại Buôn Ma Thuột vào năm 2002. Năm 2004, Viện tiến hành
trồng khảo nghiệm cây macca trên địa bàn các tỉnh Tây Nguyên (Gia Lai, Đăk Nông,
Lâm Đồng) sau đó tiếp tục nhập nội các giống macca Thái Lan và Úc. Quá trình theo
dõi cho thấy cây macca ghép trồng tại Buôn Ma Thuột sau 3 năm bắt đầu ra hoa đậu
quả. Tính đến nay Viện đã có 17 giống, trong đó có 8 giống cho quả. Song song với
quá trình khảo nghiệm các giống macca thương mại tốt nhất trên thế giới, Viện Khoa
học Kỹ thuật Nông Lâm nghiệp Tây Nguyên còn tiến hành nghiên cứu chọn lọc giống
qua phương pháp chọn lọc cây trội từ quần thể trồng bằng hạt. Qua nghiên cứu cho
thấy, với điều kiện sinh thái vùng Tây Nguyên, cây macca thực sinh sau 3 – 4 năm
bước đầu cho quả và Viện đã chọn được một số cá thể cho năng suất cao từ quần thể
trồng bằng hạt. Bên cạnh việc khảo nghiệm và đánh giá giống, Viện Khoa học Kỹ
thuật Nông Lâm nghiệp Tây Nguyên đã tiến hành khảo nghiệm nghiên cứu về cây
macca bằng phương pháp ghép và giâm hom, kết quả cho thấy phương pháp ghép đoạn
chồi và buộc kín chồi ghép bằng dây PE tự hủy cho tỷ lệ sống cao nhất (76%) (Đặng
Minh Đức Phong, 2011).
Năm 2011, Giáo sư Hoàng Hòe là nhà khoa học đầu tiên chính thức kiến nghị lên
Chính phủ về phát triển cây macca, đi khảo sát cây macca ở Australia, nhập khoảng
10.000 cây macca đưa vào trồng thí điểm ở Nghệ An, Sơn La, Lai Châu và nhiều vùng
khác (Nguyễn Công Tạn, 2002).

7

2.3. Quá trình phát sinh mô sẹo thành cây hoàn chỉnh
2.3.1 Khái niệm về tạo mô sẹo
Mô sẹo (callus) là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô và các
cơ quan phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt (có vết thương, xử lý các chất điều hoà
sinh trưởng thực vật…). Các tế bào thuộc các mô hoặc cơ quan này phải chịu một sự
phản phân hóa trước lần phân chia đầu tiên. Sự phản phân hóa có vai trò rất quan
trọng, nó cho phép một tế bào trưởng thành trẻ hóa. Sự trẻ hóa giúp tế bào tái lập khả
năng phân chia và tạo phôi vô tính trong điều kiện thích hợp. Các tế bào thuộc các mô
hoặc các cơ quan đã phân hóa của các cây song tử diệp thường phân hóa dưới tác động
của auxin ở dạng riêng lẻ hay kết hợp với cytokinin tạo ra mô sẹo. Mô sẹo tạo ra do
các tế bào nhu mô chịu phản phân hóa hoặc do sự phân chia các tế bào thượng tầng, sự
xáo trộn trong các mô phân sinh sơ khởi hay xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan
(Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới sư tạo mô sẹo
Sự tạo mô sẹo từ mẫu cấy ban đầu có thể chịu ảnh hưởng của các yếu tố bên trong
như loại mẫu, tuổi mẫu,… hay các yếu tố bên ngoài như các điều kiện chiếu sáng,
nhiệt độ, vết thương, chất điều hòa sinh trưởng.
Chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quan trọng trong sư hình thành và phát sinh
mô sẹo, đặc biệt là auxin và cytokinin. Auxin cần thiết cho quá trình cảm ứng mô sẹo
từ mẫu cấy ban đầu. Việc sử dụng auxin có thể làm thay đổi đặc điểm sinh lý đã được
chương trình hóa từ toàn bộ mô thực vật. Để đáp ứng lại việc cảm ứng với auxin, tế
bào chuyển sang trạng thái phản phân hóa và bắt đầu hình thành khối mô không tổ
chức. Dưới điều kiện của môi trường nuôi cấy, khối mô này sẽ phát sinh khối tế bào có
khả năng phát sinh hình thành phôi hoặc không phát sinh thành phôi. Cytokinin có vai
trò quan trọng trong sự phân chia tế bào, tác động của cytokinin lên sự tăng trưởng của
tế bào trong môi trường nuôi cấy mô phụ thuộc vào sự hiện diện của auxin. Những mô
sẹo có thể hình thành trong môi trường không có sự hiện diện của cytokinin thường
được cho là do yếu tố cytokinin nội sinh.
Ở các cây song tử diệp, auxin gây ra tình trạng rối loạn tổ chức của mô phân sinh
ngọn rễ, làm chậm sự kéo dài rễ, kích thích hoạt động của chu luân và nội bì, dưới ảnh

8


hưởng của auxin, sẽ tạo ra một vùng tế bào phân sinh, giống như các vùng mô phân
sinh thứ cấp và sau đó người ta phát hiện nhiều vùng mô phân sinh rễ. Ở thân, auxin
kích thích hoạt động ở thượng tầng và có thể cảm ứng sự phản phân hóa của các tế bào
nhu mô vỏ trong, libe 1, libe 2, các tia tủy và tủy để tạo nên những vùng mô phân sinh
rộng lớn. Các tế bào vỏ ngoài và các tế bào biểu bì thường chỉ phù ra mà không phân
chia. Sự biến đổi các mô phân sinh mới được tạo ra thường không theo kiểu phân hóa
bình thường để cho ra hệ thống dẫn truyền bình thường (Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị
Thủy Tiên, 2002). Dựa vào các đặc điểm trên có thể xác định được hình thái mô sẹo phát
triển theo thời gian dưới kính hiển vi quang học.
Ưu điểm của nuôi cấy mô sẹo trên môi trường rắn thì thao tác thí nghiệm đơn
giản, dễ vận chuyển mẫu nhưng nhược điểm là thể tích nuôi cấy bé nên khó phát triển
ở quy mô công nghiệp.
2.4. Quá trình tạo phôi soma từ mô sẹo
2.4.1 Khái niệm phôi soma
Phôi vô tính, phôi soma, phôi sinh dưỡng hay phối thế hệ đều là cùng một khái
niệm để miêu tả một cấu trúc lưỡng cực bất định bao gồm cực chồi và cực rễ, mà dưới
những điều kiện thích hợp thì có thể phát triển thành một cơ thể có chức năng hoàn
chỉnh (Dương Tấn Nhựt, 2011). Một số tác giả phân biệt sự khác nhau của các loại phôi
dựa vào nguồn gốc ban đầu. Nguồn gốc phôi vô tính khá đa dạng; phôi vô tính có thể
có nguồn gốc từ mô mẹ hoặc tiểu bào tử và hạt nhân, trái lại phôi soma bắt nguồn từ tế
bào soma.
Phát sinh phôi soma là quá trình mà tế bào soma trải qua các điều kiện cảm ứng để
hình thành những tế bào sinh phôi và xảy ra một loạt những biến đổi về sinh hóa, hình
thái dẫn đến hình thành phôi soma. Tính toàn năng của tế bào là nền tảng trong phát
sinh phôi soma. Có hai con đường phát sinh phôi soma:


Phát sinh phôi trực tiếp thể hiện là phôi soma được hình thành trực tiếp trên

bề mặt của mẫu cấy ban đầu không qua giai đoạn trung gian mô sẹo. Trong trường hợp
này vẫn có sự hình thành mô sẹo trên bề mặt mẫu cấy nhưng mô sẹo tăng sinh không
đáng kể và mô sẹo xuất hiện trước sự hình thành phôi.


Phát sinh phôi gián tiếp thể hiện là phát sinh phôi soma thông qua mô sẹo

và thông thường mô sẹo sẽ tăng sinh dồi dào trước khi được cảm ứng hình thành phôi.
9


Trong sự phát sinh phôi trực tiếp, các tế bào có khả năng phát sinh luôn luôn hiện
diện và sự hiện diện của chương trình phát sinh phôi phụ thuộc vào những điều kiện
thuận lợi. Trong khi sự phát sinh phôi gián tiếp cần phải có sự tái lập chương trình tế
bào, chủ yếu là cần thiết cho sự phản biệt hóa để thu được những tế bào có khả năng
phát sinh phôi (Francisco và cộng sự, 2006).
2.4.2 Đặc điểm của tế bào sinh phôi
Trong hầu hết các hệ thống sinh phôi được mô tả cho đền bây giờ, tế bào sinh phôi
chỉ ra những đặc điểm thông thường như của tế bào mô phân sinh như: tế bào có kích
thước nhỏ, đẳng kính, có hoạt động biến dưỡng mạnh, tốc độ phân chia cao, tế bào
chất đậm đặc với những hạt tinh bột, nhân lớn, hạch nhân giãn nỡ, không bào nhỏ,
vách tế bào mỏng. Dựa vào những đặc điểm trên để phân biệt các tế bào có khả năng
sinh phôi với các tế bào không có khả năng sinh phôi (Dương Tấn Nhựt, 2010).
2.4.3 Các giai đoạn phát triển của phôi soma
Nhìn chung các giai đoạn phát triển của phôi soma cũng gần giống với của phôi
hữu tính. Phôi soma trải qua các giai đoạn như: Phôi hình cầu, phôi hình tim, phôi hình
cá đuối, phôi trưởng thành.

Ở thực vật, sự tái sinh thông qua phôi soma gồm có 5 bước: nuôi cấy lát cắt trên
môi trường có bổ sung chất điều hoà sinh trưởng thực vật (auxin, cytokinin). Tăng sinh
khối tế bào mô sẹo được hình thành trên môi trường đặc hoặc lỏng có bổ sung chất
điều hòa sinh trưởng. Chuyển khối tế bào có khả năng phát sinh phôi soma sang môi
trường loại bỏ dần hoặc không có chất điều hòa sinh trưởng để phôi soma trải qua các
bước tiền trưởng thành. Trong giai đoạn này, sự tăng sinh của khối tế bào có khả năng
sinh phôi sẽ bị ức chế và kích thích sự hình thành và phát triển của phôi soma. Phôi
soma trưởng thành trong môi trường có bổ sung cytokinin hoặc giảm áp suất thẩm
thấu. Tái sinh cây trên môi trường loại bỏ chất điều hòa sinh trưởng (Dương Tấn Nhựt,
2010).
Trong mỗi giai đoạn, các tế bào sẽ chịu tác động của các tác nhân khác nhau.
Trong đó, giai đoạn cảm ứng được xem là quan trọng nhất cho sự phát sinh phôi soma.
Đó được xem như là sự khởi đầu nhằm khơi mào cho các đặc tính phản phân hóa để tế
bào có khả năng sinh phôi (Francisco và cộng sự, 2006).

10


2.4.4. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến phôi soma
2.4.4.1 Ảnh hưởng của auxin trong cảm ứng tạo phôi soma
Auxin là yếu tố cần thiết cho sự phát triển của phôi, nó có ảnh hưởng khác nhau
trong từng giai đoạn của quá trình phát sinh phôi. Sự hiện diện của auxin riêng lẻ hay
kết hợp với cytokinin là cần thiết cho sự thành lập các tế bào hay nhóm các tế bào có
khả năng sinh phôi, tuy nhiên auxin lại cản trở sự sinh phôi ở các pha tiếp theo. Nhu
cầu về auxin cũng như nồng độ auxin cho sự cảm ứng phôi thay đổi tùy thuộc vào kiểu
gene thực vật và loại mô sử dụng trong nuôi cấy. Auxin liên quan đến sự khơi mào khả
năng sinh phôi, chủ yếu trong giai đoạn sớm phôi, sau đó sẽ quay lại ức chế sự phát
triển của phôi. Khi loại bỏ auxin ra khỏi môi trường nuôi cấy, các khối tế bào sinh phôi
sẽ trải qua quá trình biệt hóa từ dạng hình cầu sang hình tim, dạng cá đuối và thành cây
con. Ở giai đoạn phôi hình tim, người ta cho rằng, hàm lượng auxin là lớn nhất. Vai trò

của auxin trong sự cảm ứng tạo phôi thông qua sự acid hóa vách tế bào và tế bào chất.
Ở cà rốt, khi cảm ứng phát sinh phôi soma cần có sự có mặt của auxin sau đó
chuyển sang môi trường nuôi cấy không có hoặc có auxin ở nồng độ thấp. Trong
nghiên cứu tạo dịch treo tế bào cây đinh lăng sau khi phát sinh mô sẹo trên môi trường
MS có bổ sung 2,4 ̶ D 2 mg/l và 20% thể tích nước dừa, khối sẹo được chuyển sang
môi trường có 2,4 ̶ D 2 mg/l giảm đi một nửa kết hợp với BA và nước dừa là môi
trường rất tốt cho quá trình phát sinh phôi soma.
Tác dụng của auxin lên sự phát sinh phôi soma có thể là do ảnh hưởng của auxin
lên sự biểu hiện gene, từ nó nó làm xuất hiện nhiều thay đổi khiến tế bào có thể đước
tái lập sang trạng thái có thể sinh phôi. Có nhiều cách để làm ngừng lại các kiểu biểu
hiện gene tại thời điểm đó của mô cấy để thay thế sự biểu hiện đó bằng một chương
trình sinh phôi. Một trong những cơ chế có thể làm ngưng các biểu hiện của gene là
methyl hóa DNA. Ngoài ra, auxin còn có vai trò trong sự thành lập các tế bào có khả
năng sinh phôi là do chúng ảnh hưởng đến tính lưỡng cực của tế bào và kích thích các
phân chia không cân xứng sau đó (Dương Tấn Nhựt, 2010).

11


2.4.4.2 Ảnh hưởng của cytokinin trong môi trường có auxin đến quá trình hình
thành phôi
Cytokinin là chất điều hòa sinh trưởng thực vật cần thiết cho sự sinh phôi soma ở
một số loài thực vật. Cytokinin có tác dụng kích thích sự tăng trưởng tế bào với điều
kiện có mặt auxin trong môi trường. Cytokinin có tác động lên cả hai bước của sự phân
chia tế bào: phân nhân và phân bào. Trong sự nuôi cấy các mô nghèo cytokinin, auxin
kích thích sự phân đôi nhiễm sắc thể, thậm chí tạo tế bào hai nhân, nhưng không có sự
phân vách. Sự phân vách chỉ xảy ra khi có cytokinin ngoại sinh (Bùi Trang Việt,
2000). Cytokinin hỗ trợ auxin trong sự tăng trưởng, nhưng đồng thời cũng có sự đối
kháng của auxin (giúp tạo rễ) và cytokinin (kích thích tạo chồi), sự cân bằng giữa hai
hormone này là một trong những yếu tố kiểm soát sự phát triển.

Nhiều tác giả ghi nhận rằng, việc kết hợp cytokinin và auxin được cảm ứng tạo
phôi ở nhiều loại thực vật. Việc thêm cytokinin vào môi trường đã cảm ứng tạo phôi ở
dưa đỏ. Loại cytokinin rất thích hợp với thân gỗ là TDZ, chỉ với hàm lượng TDZ rất
nhỏ cũng đủ kích thích quá trình phát sinh phôi. Ở tiêu, phôi soma được tạo nên trên
môi trường có 2,4 ̶ D và TDZ, nhưng nếu môi trường chỉ có 2,4 ̶ D thì quá trình tạo
phôi không xảy ra.
2.4.4.3 Sự phát sinh chồi từ phôi soma
Quá trình hình thành cơ quan trong mô xảy ra qua hai giai đoạn: Giai đoạn thứ
nhất là tái phân lập, trong giai đoạn này xảy ra quá trình chuyển các tế bào biệt hóa
thành mô sẹo. Giai đoạn thứ hai là hình thành các mầm mống cơ quan bằng phương
pháp phóng xạ tế bào đã thấy rằng những tế bào của những mầm mống nhu mô mà ở
đấy được hình thành mầm mống cơ quan, tổng hợp DNA và protein xảy ra rất nhanh,
hàm lượng đường cũng tăng. Trong quá trình phân hóa, ở các mô sẹo không có tổ chức
được hình thành các cấu trúc hình thái dẫn đến sự tạo chồi, rễ, cành hoa và cây hoàn
chỉnh. Quá trình phân hóa này được thực hiện bằng cách thay đổi một số chất và các
chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy. Đối với mô sẹo, xu thế tạo cơ
quan giảm dần khi mô cấy chuyển nhiều lần vì khi cấy chuyển nhiều lần như thế
thường hình thành các tế bào đa bội và lệch bội, ngoài ra có thể mất các yếu tố di
truyền.

12


Mô sẹo khi hình thành thường có hai loại: loại xốp, chưa nhiều tế bào xốp với
nhân nhỏ, tế bào chất lỏng và không bào to. Loại cứng, các tế bào cứng, chắc thành
khối, nhân to, tế bào chất đậm đặc và không bào nhỏ (Vũ Văn Vụ, 1994).
Dạng mô sẹo cũng có ảnh hưởng đến khả năng tái sinh cơ quan của khối mô.
Nguyên nhân cò thể do các tế bào mô sẹo sẽ mất đi khả năng tổng hợp một số chất
thiết yếu cho sự tái sinh của nó khi số lần cấy chuyển tăng lên. Vì vậy khi nuôi cấy mô
sẹo nhằm mục đích tái sinh chồi, nhất thiết phải tìm môi trường thích hợp cho sự hình

thành khối mô sẹo cứng, chắc, các khối mô sẹo chắc cần được loại bỏ trong các lần cấy
chuyển vì đôi khi dạng mô sẹo này phát triển rất nhanh và lấn át các mô sẹo cứng có
khả năng phát sinh phôi.

13


Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2012 đến tháng 6/2013 tại phòng nuôi cấy mô
Bộ môn Công nghệ Sinh học, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu, trang thiết bị
3.2.1 Vật liệu thí nghiệm
Mẫu lá và thân cây macca được thu thập từ vườn ươm Bộ môn Công nghệ Sinh
học, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ
Trang thiết bị: tủ cấy, nồi hấp, máy đo pH, cân điện tử, đèn huỳnh quang.
Dụng cụ: dao, kéo, dao cấy, đĩa, pipet, bình tam giác, đèn cồn, chai thủy tinh.
3.2.3 Môi trường nuôi cấy
Môi trường được sử dụng là WPM (Lloyd và McCown,1981).
Môi trường bổ sung chất điều hòa sinh trưởng có nồng độ thay đổi tùy theo mục
đích của từng thí nghiệm. Môi trường trước khi hấp được điều chỉnh pH về 5,8 ± 0,05,
hấp khử trùng bằng autoclave ở 1 atm (121oC) trong 20 phút.
3.2.4 Điều kiện nuôi cấy
Thời gian chiếu sáng: 16 giờ / ngày
Nhiệt độ: 25 ± 2oC; độ ẩm: 50 ̶ 60%.
Cường độ chiếu sáng: 2000 – 3000 lux.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, ba lần lặp lại.
3.3.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng NaOCl 50% đến khả năng sống

của mẫu lá và đoạn thân cây macca
Bước tiến hành: lá và đoạn thân cây macca ngoài vườn ươm được cắt bỏ lớp rìa
xung quanh, sau đó dùng cồn 70o rửa sạch theo một chiều từ trên xuống để tránh dập
mẫu và rửa tiếp với xà bông cho thật sạch rồi chuyển vào bình tam giác. Rửa mẫu lại
bằng nước cất vô trùng ba lần, sau đó chuyển mẫu sang bình tam giác vô trùng và đưa
vào tủ cấy. Thực hiện thao tác khử trùng mẫu cấy trong điều kiện vô trùng. Mẫu cấy

14


được lắc qua cồn 70o trong 30 giây. Sau đó được lắc với NaOCl 50% bổ sung vào 2
giọt Tween 20 trong thời gian được bố trí trên từng nghiệm thức; tiếp tục lắc với kháng
sinh streptomicine (nồng độ g/ml) trong 30 phút. Sau khi khử trùng xong loại bỏ
những phần hư hại, cắt mẫu thành từng mảnh dài 1 ̶ 1,5 cm đối với mẫu thân, đối với
mẫu lá cắt mẫu thành từng mảnh hình vuông cạnh 1 cm sau đó được cấy vào môi
trường WPM.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được tiến hành với mẫu lá và đoạn thân cây macca.
Mỗi thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 20 mẫu, lặp lại 3 lần, bố trí theo
kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố.
Bảng 3.1 Khảo sát thời gian khử trùng bằng NaOCl 50% đến tỷ lệ sống của mẫu lá
Nghiệm thức

Môi trường

Thời gian khử trùng (phút)

Mẫu/chai

Tổng mẫu

A1

WPM

15

4

60

A2

WPM

20

4

60

A3

WPM

25

4

60

A4

WPM

30

4

60

Bảng 3.2 Khảo sát thời gian khử trùng bằng NaOCl 50% đến tỷ lệ sống của mẫu thân
Nghiệm thức

Môi trường

Thời gian khử trùng (phút)

Mẫu/chai

Tổng mẫu

B1

WPM

15

4

60

B2

WPM

20

4

60

B3

WPM

25

4

60

B4

WPM

30

4

60

Chỉ tiêu theo dõi:


Tỷ lệ mẫu sống (%) = (tổng số mẫu sống và sạch nấm khuẩn/tổng số mẫu thí

nghiệm) x 100.


Trạng thái mẫu sau 3 tuần nuôi cấy.

15