ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG ALPHA TOCOPHEROL TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG ALPHA - TOCOPHEROL
TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: TỪ THỊ HỒNG NHI

Niên khóa

: 2009 – 2013


Tháng 7/2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG ALPHA - TOCOPHEROL

TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. NGUYỄN THANH ĐIỀN

TỪ THỊ HỒNG NHI

ThS. LÊ VĂN HUY


Tháng 7/2013

LỜI CẢM ƠN
Qua 4 năm học tập tại trường Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh, em đã được
tiếp thêm nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu, mà nó sẽ là nền tảng vững chắc cho
em trong cuộc sống sau này. Để có được những thành công bước đầu như ngày hôm
nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:
Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều
kiện cho em trong suốt thời gian học tập.
Các Thầy (Cô) trong Bộ môn Công nghệ Sinh học đã luôn tận tình hướng dẫn,
giảng dạy và giúp đỡ em.
ThS. Nguyễn Thanh Điền và ThS. Lê Văn Huy đã trực tiếp hướng dẫn và giúp
đỡtôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Các Thầy (Cô) phòng Sắc ký thuộc Viện Nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học và
Môi Trường – trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
Toàn thể lớp CNSH 35 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian

làm đề tài. Thành kính ghi ơn bố mẹ đã nuôi nấng, dạy bảo điều hay lẽ phải cho con
cũng như đã động viên, hỗ trợ con về tinh thần, vật chất để con có thể hoàn thành tốt
khóa luận này. Bố mẹ là nguồn động viên là người tạo thêm sức mạnh để con vượt qua
mọi khó khăn trở ngại trong cuộc sống.
TP. HCM tháng 7 năm 2013
Từ Thị HồngNhi


TÓM TẮT
Từ Thị Hồng Nhi, Đại Học Nông Lâm TP. HCM, tháng 7 năm 2013. “Đánh giá
hàm lượng alpha – tocopherol(vitamin E) trong một số loại thực phẩm bằng phương
pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)”.
GVHD: Th.S Nguyễn Thanh Điền – Th.S Lê Văn Huy – Bộ Môn Công Nghệ
Sinh Học – Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.
Đề tài được tiến hành từ tháng 12 đến tháng 6 năm 2013 tại Viện Nghiên cứu
Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường – Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Mục tiêu của đề tài:
Xây dựng quy trình tách, chiết và định lượng α – tocopherol trong một số mẫu
thực phẩm (tỏi Trung Quốc, tỏi Lý Sơn, rau cần tây, ớt Đà Lạt, lá dứa, rau ngót, trái
khế) bằng phương pháp HPLC.
Kết quả đạt được:
Xây dựng quy trình định lượng hàm lượng α – tocopherol trong một số mẫu
thực phẩm đạt được những kết quả:
Xây dựng được quy trình ly trích α – tocopherol trong điều kiện xà phòng hóa:
nồng độ KOH 0,375 mol/l, thời gian 40 phút và nhiệt độ 800C, điều kiện có sục khí
nitơ cho kết quả phân tách α – tocopherol tốt và ổn định dựa trên hình ảnh sắc ký đồ.
Xây dựng được quy trình định lượng α – tocopherol bằng HPLC đạt được
những thông số sau: độ tin cậy đường chuẩn α – tocopherol (R2 = 0,998), hiệu suất thu
hồi trung bình 4 mẫu (Rtb = 108%).
Kết quả khảo sát một số mẫu: mẫu rau ngót được phát hiện với hàm lượng

αlpha – tocopherol cao hơn hẳn (415,44mg/kg) so với các mẫu tỏi (243,7 mg/kg), ớt
Đà Lạt (99,83 mg/kg) và rau cần tây (60,64 mg/kg).

ii


SUMMARY
Tu Thi Hong Nhi, Nong Lam University, June 2013. “Investigation on level of
α– tocopherol (vitamin E)in edible plants”
Instructor: MSc. Nguyen Thanh Dien – MSc. Le Van Huy – Research Institute
for Biotechnology and Environment, Nong Lam University, Ho Chi Minh city.
The thesis was carried out from December 2012 to June 2013 at Research
Institute for Biotechnology and Environment, Nong Lam University.
Purpose of thesis:
To establish the procedure on extraction and quantitation of α – tocopherol in
edible plants (Ly Son garlic, Chinese garlic, sauropus androgynus, local celery,
pineapple leaves, carambola fruit, Dalat chilli) by high performance liquid
chromatography.
Results:
Extraction procedure, was conducted on optimum conditions such as purging
N2 at specific time, saponification conditions (KOH concentration: 0,375mol/l, time:
40 minute and temperature: 800C), show a good and stable extraction of α – tocopherol
demonstrating by chromatographic profile.
Quantitation procedure of α – tocopherol on edible plants by HPLC was well
performed with some parameters: high correlation efficiency (R2 = 0,998), high
recovery efficiency (108%).
The results of evaluation on some edible plants show that the level of α –
tocopherol on sauropus androgynus (415,44 mg/kg) are higer than that levels on garlic
(243,7 mg/kg), Dalat chilli (99,83 mg/kg) and local celery (60,64 mg/kg). In addition,
the levels of α – tocopherol on local celery, pineapple leaves and carambola fruit are

not detectable.

iii


MỤC LỤC
Lời cảm ơn ...................................................................................................................... ii
Tóm tắt ............................................................................................................................ ii
Summary ........................................................................................................................ iii
Mục lục .......................................................................................................................... iv
Danh sách chữ viết tắt .................................................................................................. vii
Danh sách các bảng ..................................................................................................... viii
Danh sách các hình ........................................................................................................ ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề ..............................................................................................................1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu ..............................................................................................1
1.3 Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................3
2.1. Giới thiệu về vitamin E .........................................................................................3
2.1.1 Khái niệm vitamin E .......................................................................................3
2.1.2 Lịch sử về vitamin E .......................................................................................3
2.1.3 Nguồn cung cấp vitamin E ..............................................................................3
2.1.4 Một số nghiên cứu định lượng vitamin E trong thực phẩm ............................4
2.1.5 Cấu trúc hóa học – phân loại ...........................................................................4
2.1.6. Tính chất của vitamin E .................................................................................6
2.1.6.1 Tính chất vật lý .........................................................................................6
2.1.6.2 Tính chất hóa học .....................................................................................6
2.1.6.3. Tính chất chống viêm ..............................................................................7
2.1.7 Chức năng của vitamin E ................................................................................7
2.1.8 Nhu cầu sử dụng vitamin E .............................................................................8

2.1.9 Hoạt tính sinh học của vitamin E ....................................................................9
2.2. Giới thiệu về HPLC (High pressure liquid chromatography – HPLC) ................9
2.2.1 Lịch sử phát triển của sắc ký ...........................................................................9
2.2.2 Hệ thống HPLC .............................................................................................10
2.2.3. Lựa chọn điều kiện sắc ký............................................................................12

iv


2.2.3.1 Lựa chọn pha tĩnh ...................................................................................12
2.2.3.2 Lựa chọn pha động .................................................................................12
2.2.3.3 Lựa chọn đầu dò .....................................................................................12
2.2.3.4 Lựa chọn điều kiện sắc ký trong phân tích Vitamin E ...........................13
2.2.4 Các yếu tố để đánh giá một quy trình phân tích ...........................................13
2.2.5 Ứng dụng của sắc ký lỏng cao áp .................................................................14
2.2.6 Ưu và nhược điểm của HPLC .......................................................................14
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................................15
3.1. Thời gian, địa điểm tiến hành .............................................................................15
3.1.1 Thời gian .......................................................................................................15
3.1.2Địa điểm .........................................................................................................15
3.2. Vật liệu ................................................................................................................15
3.2.1 Phương pháp thu mẫu ...................................................................................15
3.2.2 Hóa chất ........................................................................................................15
3.2.3. Thiết bị và dụng cụ.......................................................................................15
3.2.3.1 Thiết bị....................................................................................................15
3.2.3.2 Dụng cụ ..................................................................................................15
3.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................15
3.3.1 Nguyên tắc xác định hàm lượng vitamin E ...................................................15
3.3.2 Tối ưu quy trình ly trích vitamin E ...............................................................16
3.3.3 Tối ưu quy trình phân tích HPLC .................................................................17

3.3.4 Dựng đường chuẩn α – tocopherol................................................................18
3.3.5 Xác định hàm lượng vitamin E trong mẫu ....................................................18
3.3.6 Hiệu suất thu hồi của quy trình ly trích vitamin E ........................................19
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................20
4.1 Xây dựng đường chuẩn α – tocopherol ...............................................................20
4.2 Kết quả tối ưu quy trình ly trích mẫu tỏi .............................................................21
4.3. Kết quả tối ưu quy trình phân tích HPLC ...........................................................23
4.3.1 Ảnh hưởng của tốc độ dòng ..........................................................................23
4.3.2 Ảnh hưởng của bước sóng ............................................................................24
4.3.3 Ảnh hưởng của pha động ..............................................................................25
4.3.4 Điều kiện sắc ký ............................................................................................26
v


4.4 Khảo sát hàm lượng α – tocopherol trong các loại mẫu ......................................27
4.5 Kết quả hiệu suấtthu hồi của α – tocopherol trong các loại mẫu .........................30
_Toc363569277Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................31

5.1 Kết luận ................................................................................................................31
5.2 Đề nghị .................................................................................................................31
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................32

vi


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
FAO:

Food and Agriculture Organisation

HPLC:

High Performance Liquid Chromatography

MeOH:

Methanol

UV:

Ultraviolet

LC/MS:

Liquid Chromatography - Mass Spectrometry

GC/MS:

Gas chromatography - Mass spectroscopy

HPLC – RP: High Performance Liquid Chromatography – Reverse Phase
LOD:

Limit of detection

LOQ:

Limit of quantitation

ACN:

Acetonitrile

BHT:

Butylated hydroxytoluene

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Nhu cầu RRR – α – tocopherol đối với các độ tuổi.........................................8
Bảng 2.2 Một số dung môi và tính chất của chúng .......................................................11
Bảng 2.3 Các yếu tố cơ bản phân biệt pha thường và pha đảo .....................................12
Bảng 2.4 So sánh các loại đầu dò sử dụng trong HPLC ...............................................13
Bảng 3.1 Các điều kiện phân tích HPLC ......................................................................18
Bảng 4.1 Bảng tương quan nồng độ α – tocopherol và diện tích peak .........................20
Bảng 4.2 Bảng kết quả phân tích hàm lượng α – tocopherol trong mẫu ......................27
Bảng 4.3 Bảng hiệu suất thu hồi của quy trình trích mẫu .............................................30

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ
Hình 2.1 Một số nguồn vitamin E...................................................................................3
Hình 2.2 Các dạng cấu trúc của vitamin E .....................................................................5
Hình 2.3 Sơ đồ minh họa hệ thống HPLC ....................................................................10
Hình 3.1 Quy trình ly trích alpha - tocopherol ............................................................. 17
Hình 4.1 Đường chuẩn biểu thị diện tích peak và nồng độ chuẩn α – tocopherol. ......20
Hình 4.2 Sắc ký đồ của α – tocopherol ở nồng độ chuẩn 119,1 µg/ml. .......................21

Hình 4.3 Sắc ký đồ ly trích mẫu tỏi trong điều kiện không sục khí nitơ. .....................22
Hình 4.4 Sắc ký đồ mẫu tỏi trong điều kiện có sục khí nitơ.........................................22
Hình 4.5 Sắc ký đồ có sục khí nitơ và xà phòng hóa 30 phút, nhiệt độ 800C. .............23
Hình 4.6 Sắc ký đồ có sục khí nitơ và xà phòng hóa 40 phút, nhiệt độ 800C. .............23
Hình 4.7 Sắc đồ khảo sát tốc độ dòng 0,5 ml/phút. ......................................................24
Hình 4.8 Sắc đồ khảo sát bước sóng 254 nm. ...............................................................25
Hình 4.9 Sắc đồ khảo sát dung môi pha động Methanol/nước 30/70...........................25
Hình 4.10 Sắc đồ khảo sát dung môi pha động Methanol/acetonitrile/nước................26
Hình 4.11 Sắc đồ khảo sát dung môi pha động là dung dịch đệm phosphate. .............26
Hình 4.12 Sắc ký đồ mẫu tỏi Trung Quốc. ...................................................................28
Hình 4.13 Sắc ký đồ mẫu ớt Đà Lạt..............................................................................28
Hình 4.14 Sắc ký đồ mẫu khế. ......................................................................................29
Hình 4.15 Sắc ký đồ mẫu dứa. ......................................................................................29

ix


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Khai thác các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên để phục vụ cho nhu cầu sức
khỏe của con người từ lâu là hướng nghiên cứu thu hút sự quan tâm của rất nhiều nhà
khoa học. Trong đó khai thác các vitamin như: vitamin nhóm B, K, E từ các sản phẩm
thiên nhiên được nhiều nhóm nghiên cứu quan tâm. Trong các vitamin, vitamin E là
một loại chất dinh dưỡng có vai trò hết sức quan trọng với sức khỏe của con người, tác
dụng rõ nhất là chất chống oxy hóa, và được xem như hàng rào đầu tiên chống lại
những tác động có hại của gốc tự do đối với tế bào (FAO, 2002), phòng ngừa ung thư
(Jihyeung và ctv, 2010). Tuy nhiên, cơ thể con người lại không có khả năng tổng hợp
nên vitamin E nên cơ thể chỉ có thể thu nhận vitamin E từ nguồn thực phẩm tiêu thụ
hàng ngày.
Trong các loại thực phẩm, nguồn vitamin E chủ yếu từ mỡ thực vật (vegetable

fats) và các loại dầu và những sản phẩm từ dầu. Hơn nữa, các vitamin E có nguồn gốc
tự nhiên alpha – tocopherol (RRR – alpha – tocopherol) được đã cho thấy sinh khả
dụng (Bioavailability) cao gấp 3 lần các alpha – tocopherol tổng hợp (Chikako Kivose
và ctv, 1996). Do đó, đã có nhiều nghiên cứu đánh giá về hàm lượng của các vitamin E
từ các loại rau ăn khác nhau như tỏi, ớt, rau cần tây, rau ngót. Theo Ling Soon Ching
và Suhaila Mohamded, 2001 đã phát hiện có sự thay đổi về hàm lượng alpha –
tocopherol trong 62 loài thực vật ở các khu vực khác nhau thuộc vùng khí hậu nhiệt
đới như: rau ngót (426,8 mg/kg), tỏi (12,3 mg/kg, rau cần tây (136,4 mg/kg). Do đó đề
tài “Đánh giá hàm lượng alpha – tocopherol trong một số loại thực phẩm bằng phương
pháp sắc ký lỏng cao áp” được tiến hành nghiên cứu nhằm đánh giá bổ sung thêm các
cơ sở dữ liệu về hàm lượng alpha – tocopherol trên một số loại rau ở Việt Nam. Tạo
tiền đề cho những nghiên cứu sâu hơn về phương pháp phân tích hàm lượng alpha –
tocopherol có trong một số loại thực phẩm.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Xây dựng quy trình tách, chiết và định lượng α – tocopherol trong một số mẫu
thực phẩm (tỏi Trung Quốc, tỏi Lý Sơn, rau cần tây, ớt Đà Lạt, lá dứa, rau ngót, khế)
bằng phương pháp HPLC.Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến việc định lượng hàm
lượng α – tocopherol có trong các loại thực phẩm.
1


1.3 Đối tượng nghiên cứu
Mẫu thực phẩm được mua ngẫu nhiên tại chợ Tân Phú (tỏi Trung Quốc, tỏi Lý
Sơn) và chợ Linh Trung(Lá dứa, rau cần tây, rau ngót, trái khế, ớt Đà Lạt), mẫu đựng
trong túi nilông và được bảo quản ở nơi khô ráo tránh ánh sáng.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệuvề vitamin E
2.1.1 Khái niệm vitamin E
Vitamin E là tên gọi chung để chỉ hai lớp các phân tử bao gồm: tocopherol và
tocotrienol có hoạt tính vitamin E (alpha – tocopherol) trong dinh dưỡng. Vitamin E
không phải là tên gọi cho một chất hóa học cụ thể, mà chính xác hơn là cho bất kỳ chất
nào có trong tự nhiên mà có tính năng vitamin E trong dinh dưỡng.

Hình 2.1 Một số nguồn vitamin E (www.google.com.vn).
2.1.2 Lịch sử về vitamin E
Trong quá trình thí nghiệm cho ăn với chuột Herbert McLean Evans kết luận
vào năm 1922 với chế độ ăn thiếu vitamin E sẽ nảy sinh các vấn đề liên quan đến sinh
sản, mặc dù các chất khác đã có mặt. Tình trạng này có thể được thay đổi bằng cách
cho ăn bổ sung với mầm lúa mì. Phải mất vài năm cho đến năm 1936 khi chất này
được phân lập từ mầm lúa mì và công thức C29H50O2 được xác định.Các vitamin đã
được đưa ra tên của nó bởi Evans từ từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là “mang thai”. Cấu trúc
chính xác của vitamin E được công bố vào năm 1938.Cũng trong thời gian này, Paul
Karrer tổng hợp được vitamin E.
2.1.3 Nguồn cung cấp vitamin E
Chủ yếu là dầu thực vật, rau xà lách, rau cải, dầu mầm hạt (mầm lúa mì, lúa và ngô),
trong dầu của một số hạt có dầu (đậu tương, vừng, lạc, hạt hướng dương, dầu ô – liu)
3


hoặc trong tinh dầu của một số loại quả (quả bơ, quả gấc), α – tocopherol có trong hạt
cây hướng dương, dầu gấc, dầu bơ, còn đậu tương và dầu ngô lại chứa các dạng khác
nhiều hơn ( Ở động vật, vitamin E có trong
mỡ bò, mỡ cá nhưng với hàm lượng thấp.
2.1.4 Một số nghiên cứu định lượng vitamin E trong thực phẩm
Theo Nguyễn Kim Phi Phụng (2007),vitamin E thuộc nhóm các hợp chất
phenol, do đó khi tiến hành ly trích cần sử dụng các dung môi có độ phân cực tăng

dần: benzene, ethyl eter, chloroform, ethyl acetate, ethanol. Koning và ctv (1996) đề
xuất quy trình ly trích vitamin E sử dụng dung môi ly trích là hỗn hợp n-Hexane và
Ethyl acetate có thêm Butylated hydroxytoluene. Kết quả nghiên cứu của Ling Soon
Ching và Suhaila Mohamed (2001), dựa trên việc áp dụng quy trình ly trích Koning và
ctv đã công bố năm 1996 thì rau ngót có chứa hàm lượng vitamin E cao nhất trong 62
loài thực vật đã được tiến hành nghiên cứu (426,8 mg/100 g phần ăn được). Bên cạnh
việc xác định loại dung môi ly trích phù hợp và quy trình ly trích vitamin E hiệu quả
thì việc lựa chọn phương pháp phân tích đảm bảo độ chính xác cũng rất quan trọng
trong việc khảo sát hàm lượng Vitamin E. Các phương pháp phân tích vitamin E thông
dụng bao gồm phương pháp sinh hóa (cho phản ứng với HNO3 và FeCl3) và phương
pháp sắc ký (phương pháp sắc lý lỏng hiệu năng cao – HPLC). Gần đây đa số các
nghiên cứu phân tích vitamin E trên thực phẩm áp dụng phương pháp phân tích là
HPLC: nghiên cứu về các vitamin có tác dụng chống oxy hóa có trong ớt đỏ (Daood
và cộng sự, 1996), dùng phương pháp sắc ký lỏng để xác định hàm lượng tocopherol
và tocotrienol có trong các loại rau (Koning và cộng sự, 1996), phân tích vitamin E thu
được từ tỏi (Mazhar và cộng sự, 1997), xác định hàm lượng α – tocopherol trong 62
loài thực vật ăn được thuộc vùng khí hậu nhiệt đới (Ling Soon Ching và Suhaila
Mohamed, 2001). Do đó, HPLC là phương pháp phân tích vitamin E hiệu quả và có
khả năng ứng dụng cao.Vì vậy trong nghiên cứu này, kỹ thuật HPLC được lựa chọn là
phương pháp phân tích vitamin E trong các mẫu thực phẩm.
2.1.5Cấu trúc hóa học – phân loại
Có hai loại vitamin E: Loại có nguồn gốc thiên nhiên và loại tổng hợp (FAO,
2000). Vitamin E có nguồn gốc thiên nhiên: Ðược chiết xuất từ dầu thực vật như đậu
tương, ngô, mầm lúa mạch, các loại hạt có dầu như hạt hướng dương. Vitamin E thiên
nhiên là một đồng phân duy nhất của d – alpha tocopherol. Có 4 loại tocopherol là
4


alpha, beta, gamma và delta, nhưng alpha là dạng chính (Cũng là vitamin E thiên
nhiên) tồn tại trong cơ thể, có tác dụng cao nhất. Tuy nhiên các dạng khác như beta,

gamma và delta dù hoạt tính thấp hơn loại alpha nhưng cũng có tác dụng hỗ trợ rất lớn
cho sức khỏe con người.Mặc dù có tác dụng tốt nhất trong các loại tocopherol, nhưng
do chiết xuất từ các thực phẩm thiên nhiên nên không kinh tế, vì vậy người ta đã sản
xuất ra loại vitamin E tổng hợp. có công thức là dl – alpha tocopherol, gồm 8 đồng
phân nhưng chỉ có một đồng phân giống vitamin E thiên nhiên là d – alpha tocopherol
(chỉ chiếm 12,5%), vì vậy tác dụng của vitamin E tổng hợp thấp hơn so với loại có
nguồn gốc thiên nhiên.

Hình 2.2 Các dạng cấu trúc của vitamin E(www.google.com.vn).
Về cơ chế hấp thu và sử dụng hai loại vitamin E thiên nhiên và tổng hợp trong cơ thể
không có gì khác nhau, nhưng loại vitamin thiên nhiên được sử dụng nhiều hơn
khoảng 50% so với loại tổng hợp. Vì vậy muốn đạt được hiệu quả mong muốn thì khi
sử dụng vitamin E tổng hợp, phải uống tăng liều lên gấp 1,4 lần so với loại thiên
nhiên. Lượng vitamin E dư thừa trong cơ thể do không được sử dụng sẽ nhanh chóng
bị đào thải (FAO, 2001).
Đối tượng cần quan tâm trong hướng nghiên cứu này là α – tocopherol với cấu trúc
như hình 2.2.
5


2.1.6. Tính chất của vitamin E
2.1.6.1 Tính chất vật lý
Các tocopherol có công thức phân tử là C29H50O2.
Tocopherol là chất dầu lỏng không màu, hòa tan rất tốt trong dầu thực vật, rượu
etylic, đietyl ete, ete dầu hỏa.
 – tocopherol thiên nhiên có thể kết tinh chậm trong rượu metylic ở nhiệt độ
350C, sẽ thu được những tinh thể hình kim có nhiệt độ nóng chảy từ 2,5 – 3,50C, nhiệt
độ sôi 200 – 2200C áp suất 0,1 mmHg, Khối lượng riêng 0,950g/cm3.
Vitamin E khá bền đối với nhiệt, có thể chịu được nhiệt độ 1700C khi đun
trong không khí ( />Bị phá hủy nhanh chóng bởi tia tử ngoại.

2.1.6.2 Tính chất hóa học
a. Khả năng bị oxy hóa
Trong số các tính chất hóa học của tocopherol, tính chất quan trọng hơn cả là
khả năng bị oxy hóa bởi các chất oxy hóa như sắt (III) clorua FeCl3, axit nitric HNO3,
tạo nên các sản phẩm oxy hóa khác nhau.
Về khả năng chống bị oxy hóa thì γ – tocopherol mạnh nhất, còn α – tocopherol
mặc dù có hoạt tính sinh học cao song khả năng chống oxy hóa lại thấp hơn (FAO,
2002.
b. Tính chất chống gốc tự do
Chức vụ thiên nhiên của vitamin E là bảo vệ cơ thể chống những tác dụng độc
hại của những gốc tự do. Những gốc tự do này được tạo thành từ những quá trình
chuyển hóa bình thường hay dưới tác dụng của những nhân tố xung quanh.
Vitamin E làm chậm sự lão hóa của da và đồng thời có tác dụng bảo vệ màng tế
bào.Sự hiện diện của nó giúp cho mỡ trong tế bào được giữ gìn bởi vì những màng tế
bào được cấu tạo từ axit béo có nhiều nối đôi, rất dễ bị oxy hóa.
Sự oxy hóa của axit béo màng tế bào cho ra hàng loạt phản ứng mà kết quả cho
ra gốc Lipoperoxyd rất hoạt động vì không bền sẽ làm rối loạn chức năng sinh học
của màng tế bào.
Vitamin E có khả năng ngăn chặn phản ứng của các gốc tự do bằng cách
nhường một hyđro (H) của gốc phenol cho gốc lipoperoxyd để biến gốc tự do này
thành hyđroperoxyd không gây phản ứng vì tạo LOOH.Phản ứng như sau:
6


.

.

LOO + TocopherolT
- OH  L

LOOH + Tocopherol
T
-O
Hoặc:

c
hóaa thành gốc bền nên cchấm
Trong quáá trình phảnn ứng, tocoopherol bị chuyển
dứt nhhững phản ứng
ứ gốc.
Gốc tocop
pherol bị khhử oxy để trrở lại tocop
pherol bởi cchất khử oxxy hòa tan trong
t
nước, hiện diện trong
t
cytoso
ol của nhữnng tế bào.
Ngoài chứ
ức năng ngăăn chặn sự tạo thành những
n
gốc ttự do nơi tếế bào, vitam
min E
còn bảảo vệ những chất tạo nên
n tế bào nnhư protein và axit nuccleic.
pid trong bãã nhờn của tóc, làm lớ
ớp da
Vitamin E làm giảm sự peroxy hóa của lip
đầu bớ
ớt hiện tượnng kích thícch, nghĩa làà làm giảm sự

s khô xơ ccủa tóc.
2.1.6.3. Tính chấất chống viiêm
Vitamin E ức chế sự
ự peroxyd hhóa các lipid
d sẽ tạo thàành prostagglandins, là chất
trung gian sinh lý của sự viiêm. Nhiều nghiên cứuu dược học đã chứng tỏ
t hoạt tínhh của
vitam
min E trên sự
ự chống viêêm, vitaminn E làm giảm
m bệnh viêêm đỏ và bệệnh phù bởii vậy
khi ta bị nắng rátt da có thể dùng
d
vitamiin E để chữ
ữa.
Ngoài cácc tính chất trên vitaminn E còn có tính
t
chất làm
m ấm, giúp sự luân chuuyển
mạch máu li ti củ
ủa da.
min E
2.1.7 Chức năngg của vitam
Chống oxxy hóa
Tác động đến
đ cơ quan và quá trìnhh liên quan đến
đ sự sinh sản
s
Ngăn ngừ
ừa lão hóa.

Tác động đến hệ thốn
ng miễn dịcch.
ừa bệnh tim..
Ngăn ngừ
Ngăn ngừ
ừa ung thư.
Tác nhân làm giảm bệnh
b
tiểu đư
ường.
7


2.1.8 Nhu cầu sử dụng vitamin E
Vitamin E là một loại vitamin tan trong dầu nên nhu cầu của nó phụ thuộc vào
hàm lượng axit béo chưa no có trong thực phẩm. Khi PUFA (axit béo không bão hòa)
ăn vào tăng lên thì lượng vitamin E cung cấp có thể tăng lên gấp 4 lần, nghĩa là
khoảng từ 5mg– 20mg một ngày.
Nhu cầu bình thường cần khoảng 14 –19mg trong 24 giờ. Nếu thực phẩm chứa
30g axit linoleic thì cần cung cấp thêm 30g α – tocopherol.
Vitamin E được dùng như chất dinh dưỡng hỗ trợ cho việc bảo vệ cơ thể chống
lại một số loại bệnh mãn tính như bệnh tim, ung thư, đái tháo đường. Nếu dùng
vitamin E tổng hợp thì cần phải tăng lượng cung cấp lên khoảng 1,4 lần.
Bảng 2.1 Nhu cầu RRR – α – tocopherol đối với các độ tuổi
Nam mg/ngày

Nữ mg/ngày

(IU/ ngày)

(IU/ ngày)

0 – 6 thánh

4 mg (6 IU)

4 mg (6 IU)

Trẻ sơ sinh

7 – 12 tháng

5 mg (7,5 IU)

5 mg (7,5 IU)

Trẻ em

1 – 3 tuổi

6 mg (9 IU)

6 mg (9 IU)

Trẻ em

4 – 8 tuổi

7 mg (10,5 IU)

7 mg (10,5 IU)

Trẻ em

9 – 13 tuổi

11 mg (16,5 IU)

11 mg (16,5 IU)

Thanh niên

14 – 18 tuổi

15 mg (22,5 IU)

15 mg (22,5 IU)

Người trưởng thành

 19 tuổi

15 mg (22,5 IU)

15 mg (22,5 IU)

Phụ nữ có thai

Mọi độ tuổi

-

15 mg (22,5 IU)

Phụ nữ sau khi sinh

Mọi độ tuổi

-

19 mg (28,5 IU)

Đối tượng

Độ tuổi

Trẻ sơ sinh

(Dương Thanh Liêm, 2009)

Sự thiếu hụt và dư thừa vitamin E:Sự thiếu hụt vitamin E lâm sàng liên quan
đến sự kém hấp thu và tính bất thường trong sự vận chuyển lipid.Các đối tượng có
nguy cơ thiếu hụt vitamin E:
Người mắc bệnh kém hấp thu chất béo.
- Bệnh tiêu chảy mỡ.
- Rối loạn tụy tạng.
- Trẻ sinh thiếu tháng và trẻ sơ sinh trọng lượng lúc sinh thấp.
- Bệnh về máu di truyền.
- Bệnh xơ hóa tạo nang.
8

Sự dư thừa vitamin E: Vitamin E khi dùng ở liều thông thường hầu như không
gây tác dụng phụ. Lượng vitamin E dư thừa không được sử dụng được bài tiết ra
ngoàicơ thể. Khi lạm dụng vitamin E, dùng liều quá cao có thể gây buồn nôn, dạ dày
bị kích thích hoặc bị tiêu chảy, chóng mặt, nứt lưỡi, hoặc gây viêm thanh quản, những
triệu chứng này sẽ mất đi khi ngừng thuốc ( />2.1.9 Hoạt tính sinh học của vitamin E
Theo FAO, 2002 đã công bố thì chức năng chính của vitamin E trong cơ thể là
tác động như là chất chống oxy hóa. Nó được xem như là hàng rào phòng thủ trước
tiên chống lại quá trình peroxid hóa lipid. Vitamin E tác động ở mức độ tế bào để bảo
vệ màng tế bào khỏi sự tấn công của các gốc tự do làm tổn hại đến màng tế bào. Với
vai trò là chất thu dọn gốc tự do, vitamin E bảo vệ các acid béo không bão hòa (PUAF)
và cholesterol trong màng tế bào. Vitamin E có nhiệm vụ bảo vệ các tế bào hồng cầu
(có hàm lượng PUAF cao) khỏi bị tán huyết. Chức năng giống như là một chất chống
oxy hóa nội tế bào, vitamin E tiết kiệm Selenium, chất này chứa trong enzyme
Glutathion perosidase. Đây là thành phần khác của hệ thống phòng thủ chống oxy hóa
của cơ thể và bảo vệ những chất tương tự chất béo khác như vitamin A khỏi bị phân
hủy. Bên cạnh đó, vitamin E còn có tác dụng bảo vệ những chất tạo nên tế bào như
protein, acid nucleic, Vitamin E cũng có những tác động khác trong cơ thể bao gồm sự
chuyển hóa nucleic và protein, chức năng phân bào và sản xuất hormone.
2.2. Giới thiệu về HPLC (High pressure liquid chromatography – HPLC)
2.2.1 Lịch sử phát triển của sắc ký
Năm 1903, nhà bác học người Nga Txvet dùng cột Al2O3 tách các Picmen của
lá cây thành các vùng màu riêng biệt.
Ông giải thích hiện tượng này là do lực hấp phụ khác nhau của các sắc tố khác
nhau. Ông đặt tên phương pháp này là “sắc ký” nghĩa là “ghi lại màu sắc”.
Đến năm 1931 phương pháp này mới bắt đầu được chú ý đến, từ đó đến nay
phương pháp sắc ký đã không ngừng phát triển, được ứng dụng rộng rãi (Analytical
Chem. vol 62, 1990).

9


2.2.2 Hệ thống HPLC

Theo sơ đồ hình 2.3 một hệ thống HPLC bao gồm:
1: Bình chứa dung môi pha động.
2: Bộ phận khử khí.
3: Bơm cao áp.
4: Bộ phận tiêm mẫu (bằng tay hay Autosample).
5: Cột sắc kí (pha tĩnh).
6: Detector (nhận tín hiệu).
7: Hệ thống máy tính gắn với phần mềm nhận tín hiệu, xử lí dữ liệu và điều
khiển hệ thống HPLC.
8: In dữ liệu.
- Bình chứa dung môi giải ly cột: nơi chứa và bảo quản dung môi trong suốt
thời gian phân tích HPLC.
- Dung môi sử dụng có thể là nước, các loại dung dịch đệm (pha trong nước),
Ethanol, acetonitril hoặc hỗn hợp các loại trên.

10


Bảng 2.2 Một số dung môi và tính chất của chúng
Độ nhớt ở (20oC)

Sức căng bề mặt

Độ phân cực

Nước

1

72,75

Phân cực

Glycerin

11,9

62,47

Phân cực

Methanol

0,6

22,99

Phân cực

Ethanol

1,2

22,03

Phân cực

Hexan

0,31

1,11

Bán phân cực

Benzen

0,65

28,87

Không phân cực

Aceton

0,32

23,70

Không phân cực

Tên dung môi

(Trần Thị Lệ Minh, 2011)

- Bộ khử khí Degasse: loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động.
- Bơm cao áp:

mục đích để bơm pha động vào cột để thực hiện quá trình

chia tách sắc kí.
- Bộ phận tiêm mẫu: giúp đưa mẫu cần phân tích vào cột tách của máy HPLC
để tiến hành phân tích mẫu.
- Cột sắc kí: nơi diễn ra hiện tượng bắt giữ các hợp chất trong hỗn hợp cần phân
tích nhờ vào tương tác giữa hợp chất với hệ thống pha tĩnh, pha động và giữa pha động
và pha tĩnh với nhau của máy HPLC. Mỗi loại hợp chất khác nhau thì những lực tương
tác cũng khác nhau, dẫn đến thời gian hợp chất bị giữ lại trong cột sẽ khác nhau.
- Đầu dò (Detector): bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho
các tín hiệu ghi trên sắc đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của
chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích hợp.
- Bộ phận ghi tín hiệu: ghi sắc ký đồ thể hiện được dòng chất di ra khỏi cột sau
khi mẫu hân tích được bơm vào cột.
- Thiết bị lưu dữ liệu: lưu trữ và trích xuất dữ liệu sắc ký đồ.
- Trong nghiên cứu này, ta sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo
(RP – HPLC) vì phương pháp có thể lựa chọn nhiều loại dung môi giải ly, có thể áp
dụng kỹ thuật giải ly với dung môi có độ phân cực tăng dần.

11


2.2.3.Lựa chọn điều kiện sắc ký
2.2.3.1 Lựa chọnpha tĩnh
Có rất nhiều loại pha tĩnh có thể được sử dụng trong sắc ký lỏng. Tuy nhiên,
hiện nay hai loại phatĩnh phổ biến là pha thường (nomal phase) và pha đảo (revese
phase). Sự khác nhau của pha thường và pha đảo được thể hiện theo bảng 2.2

Bảng 2.3 Các yếu tố cơ bản phân biệt pha thường và pha đảo
Công dụng

Pha thường

Pha đảo

Pha tĩnh

Phân cực cao

Phân cực thấp

Pha động

Phân cực thấp

Phân cực cao

Tương tác

Hấp thụ (adsorption)

Kỵ nước (hydrophobic)

Trình tự rửa giải

Phân cực thấp đến cao

Độ dài chuỗi carbon ngắn

đến dài
(Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Hiện nay, đa phần các ứng dụng sắc ký dựa trên pha đảo bởi vì hệ số mâm lý
thuyết lớn, khả năng phân tách tốt, sử dụng được nhiều lần, dễ sử dụng và giá cả chấp
nhận được. Trong pha đảo, pha tĩnh là dạng tạo nối hóa học trên giá mang silica.
Người ta điều chế pha tạo nối bằng cách biến đổi các nhóm silanol bề mặt thành các
nhóm dẫn xuất. Có các loại pha tạo nối như sau:
- Các nhóm alkyl như: octadexyl (C18H37), ngoài ra còn có những nhóm khác với dây
carbon ngắn hơn: C1, C2, C8 và aryl.
- Các nhóm phân cực như amino, cyanopropyl, eter, diol.
- Các nhóm trao đổi ion như acid sunfonic, amino, ammonium tứ cấp.
2.2.3.2 Lựa chọn pha động
Có nhiều loại dung môi được sử dụng trong sắc ký. Dựa vào sự lựa chọn pha
tĩnh (pha thường hay pha đảo) sẽ quyết định đến việc sử dụng dung môi. Các dung môi
thường sử dụng trong pha thường: hexane, methylene chloride, chloroform, methanol,
acetonitrile. Trong khi đó các dung môi thường sử dụng trong pha đảo như:methanol,
acetonitrile, nước.
2.2.3.3 Lựa chọn đầu dò
Lựa chọn đầu dò tùy thuộc vào bản chất của chất cần phân tích, mức độ phát
hiện và đôi khi cả giá thành thiết bị.

12


Bảng 2.4 So sánh các loại đầu dò sử dụng trong HPLC
Đặc tính

UV

Huỳnh quang

Chiết xuất vi sai

Độ nhạy

ng

pg

µg

Độ chọn lọc

Chọn lọc

Chọn lọc cao

Phổ biến

Ảnh hưởng nhiệt độ

Nhỏ

Nhỏ

Lớn

Tạo gradient

Có thể

Có thể

Không thể

(Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Xu thế hiện nay của các phòng thí nghiệm chuẩn quốc tế là phải trang bị hệ
thống sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS) vì các yêu cầu về chất lượng nông thủy sản, thức
ăn gia súc, dược phẩm ngày càng nghiêng về phân tích kiểm nghiệm điều này có nghĩa
là các phân tích này thường phức tạp và đa số ở dạng vết. Do đó HPLC không đủ nhạy
nên khó có khả năng thực hiện các phân tích nói trên. Ngoài ra LC/MS dễ dàng thực
hiện với các hợp chất từ tương đối phân cực đến phân cực nhiều, khó bay hơi (GC/MS
rất khó thực hiện hay không thực hiện được) và cho các nghiên cứu về cấu trúc một số
hợp chất tự nhiên.
2.2.3.4 Lựa chọn điều kiện sắc ký trong phân tích Vitamin E
Phân tích Vitamin E thường được tiến hành với hệ thống sắc ký lỏng –
cộtphathường – đầu dò quang phổ (NP – HPLC – FLD). Đầu dò quang phổ được ưu
tiên sử dụng hơn so với đầu dò UV trong phân tích vitamin E trong những phân tích
với nền mẫu phức tạp bởi vì độ nhạy và độ chuyên biệt của đầu dò huỳnh quang
(Piironen, 2000). Trong khi đó, một số tác giả khác sử dụng sắc ký lỏng pha đảo
(HPLC – RP), và sắc ký lỏng khối phổ cho phân tích Vitamin E trong thực phẩm
(Adibi, 2002). Các loại dung môi thường được sử dụng trong phân tích vitamin E là sự
kết hợp của nước cất với các loại dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, acetonitrile,
methyl alcohol nên rất đa dạng.
Ví dụ hỗn hợp methanol/nước cất (96/4) (Ling Soon Ching và Suhaila Mohamded,
2001), hỗn hợp acetonitrile trong nước cất (95 – 100%) (Korchazhkina và ctv, 2006).
2.2.4 Các yếu tố để đánh giá một quy trình phân tích
Qui trình phân tích (Analytical Procedures) là sự mô tả chi tiết các bước cần

thiết để thực hiện một thử nghiệm (Analytical test). Qui trình bao gồm từ việc chuẩn bị
mẫu thử, mẫu chuẩn đối chiếu, các thuốc thử, việc sử dụng cá dụng cụ máy móc, việc
xây dựng đường cong chuẩn độ, cho đến việc sử dụng công thức để tính toán và biện
13


giải kết quả. Để đánh giá một qui trình phân tích, các nhà nghiên cứu đưa ra rất nhiều
các yếu tố như sau: tính đặc hiệu (Specificity), độ chính xác (Precision), độ lặp lại
(Repeatibility), độ chính xác trung gian (Intermediate Precision), độ sao lại
(Reproducibility), độ đúng (Accuracy), giới hạn phát hiện (Detection limit), giới hạn
định lượng (Quantitation limit), tính tuyến tính (Linearity) và miền giá trị (Range).
Tuy nhiên, theo Ashley S.Lister (2005) trong phân tích các thành phần hoạt động trong
dược phẩm (Active Pharmaceutical Ingredient, API) thì không cần phải xác định LOD
và LOQ vì phương pháp HPLC trong thực tế ít khi dùng để phân tích ở mức phát hiện
thấp trong các mẫu thực phẩm. Vì vậy, trong điều kiện của nghiên cứu này chúng tôi
tiến hành đánh giá các yếu tố quan trọng nhất như: xây dựng đường chuẩn vitamin E
với độ tin cậy cao (R2>0.99), phân tích mẫu với độ lặp lại, và đánh giá hiệu suất thu
hồi.
2.2.5 Ứng dụng của sắc ký lỏng cao áp
- Phân tách, phân tích đặc điểm, nhận dạng các chất phản ứng và sản phẩm các
phản ứng, các cấu tử chất tan (Phạm luận, 1999).
-Dược: nghiên cứu cấu trúc của các dược phẩm. Phân tích lượng kim loại
(Bismuth, Arsenic, Pb) trong các loại thuốc mê, thuốc ngủ.
- Công nghiệp: rút ngắn thời gian định lượng các một lượng nhỏ thuốc trừ sâu,
thuốc diệt cỏ, thực phẩm dinh dưỡng: nghiên cứu sự kém chất lượng, sự phân hủy các
chất trong thực phẩm.
- Trong sinh học phương pháp HPLC có khả năng tách các chất đặc thù như:
- Các hợp chất cao phân tử, ion thuộc đối tượng nghiên cứu y học, sinh học.
- Các hợp chất tự nhiên không bền, các chất kém bền nhiệt, các chất dễ nổ.
- Tách các acid nucleic, dược phẩm, steroit, vitamin, chất bảo quản thực phẩm,

chất bảo vệ thực vật, các phenol, các hydrocacbon trong dầu mỏ.
2.2.6 Ưu và nhược điểm của HPLC
Ưu điểm: Ngoài những ứng dụng rộng rãi đã nêu ở trên, HPLC còn có những
ưu điểm hơn sắc ký lỏng cổ điển: tốc độ nhanh, độ tách tốt, độ nhạy cao, cột tách dùng
được nhiều lần, mẫu chất thu lại dễ dàng vì hầu hết các detector không phá hủy mẫu.
Nhược điểm: Xét về đầu tư trang thiết bị lẫn phí tổn vận hành, HPLC là một kỹ
thuật đắt tiền.

14