PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN NHÓM VI KHUẨN NITRITE HÓA VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNGPHÂN GIẢI AMMONIA TRONG NƯỚC AOTÔM THẺ CHÂN TRẮNG(Penaeus vannamei)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN NHÓM VI KHUẨN NITRITE HÓA
VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNGPHÂN GIẢI AMMONIA
TRONG NƯỚC AOTÔM THẺ CHÂN TRẮNG(Penaeus vannamei)

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: TRẦN PHÁP

Niên khóa

: 2009 – 2013

Tháng 6/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN NHÓM VI KHUẨN NITRITE HÓA

VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI AMMONIA
TRONG NƯỚC AO TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei)

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. NGUYỄN THỊ THANH TRÚC

TRẦN PHÁP

ThS. TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG

Tháng 6/2013


LỜI CẢM ƠN
Tôi chân thành cảm ơn gia đình đã tạo mọi điều kiện cho tôi được học tập đến
ngày hôm nay. Con cảm ơn ba mẹ đã sinh thành, nuôi dưỡng, dạy bảo cho con nhiều
điều, lànguồn động viên và luônyêu thương, che chở con những lúc khó khăn.
Tôi gửi lời biết ơn sâu sắc đến Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí
Minh đã giảng dạy cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn, kiến thức xã hội, nhiều kỹ
năng cũng như đạo đức học làm người. Cảm ơn thầy Lê Đình Đôn vàcác thầy cô Bộ
môn, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ
Chí Minh.Cảm ơn cô chủ nhiệm Tô Thị Nhã Trầm đã chỉ bảo, giúp đỡ và tạo điều kiện
thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, đặc biệt em cảm ơn cô Nguyễn
Thị Thanh Trúc và cô Trương Phước Thiên Hoàng là người hướng dẫn trực tiếp, tận
tình giúp em thực hiện và hoàn thành đề tài tốt nghiệp này. Cảm ơn chị Kim đã hỗ trợ
tài chính cần thiết cho em thực hiện đề tài. Cảm ơn chú Tốt, chú Tình,anh Hiếu và các
hộ dân nuôi tôm đã chia sẽ nhiều kinh nghiệm quý báu, cung cấp thông tin mẫu cho tôi

phục vụ nghiên cứu.
Tôi thật lòng cảm ơn các bạn lớp DH09SH đã gắn bó, kề vai sát cánh cùng tôi
trong suốt quá trình học Đại học ở đây. Cảm ơn anh Tuấn, anh Ngọc, bạn Châu, Huy,
Đô, Cường, Quý, Trang làm đề tài chung phòng vi sinh với tôi. Cảm ơn bạn Phương
(DH09NH) và các bạn sinh viên dưới khóa (Hồng Vân, Tuấn DH11SM;Lỷ
CúaDH10SH) đã nhiệt tình phụ giúp tôi làm đề tài.
Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2013
Trần Pháp

i


TÓM TẮT
Đề tài: “Phân lập, tuyển chọn nhóm vi khuẩn nitrite hóa và thử nghiệm khả năng
phân giải ammonia trong nước ao tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)”.
Trong những nămgần đây, việc ứng dụng công nghệ sinh học để cải thiện môi
trường nước ao nuôi thủy sản đang nhận được sự quan tâm lớn vì tính hiệu quả và kinh
tế. Ao nuôi tôm thẻ chân trắng nếu được bổ sung vi khuẩn có lợi bản địa không chỉ
giúp môi trường nước ao nuôi tốt hơn mà còn duy trì được hệ vi sinh, bảo vệ môi
trường. Đề tài được thực hiện với mục đích làphân lập, tuyển chọn nhóm vi
khuẩnnitrite hóaphân giải ammonia cao và khảo sát mật độ vi khuẩn nitrite hóathích
hợp cần bổ sung vào ao tôm thẻ chân trắng nhằm xử lý ammonia có hiệu quả tối ưu.
Từ các mẫu bùn lắng trong ao nuôi tôm thẻ chân trắng khu nuôi tôm thị trấn
Khánh Hải, huyện Ninh Hải, tỉnh Ninh Thuận, đã phân lập được 5 nhóm vi khuẩn
nitrite hóa có khả năng phân giải được ammonia. Từ đây, tiếp tục khảo sát và tuyển
chọn2 nhóm vi khuẩn nitrite hóa có hoạt tính chuyển hóa ammonia cao để thực hiện
thử nghiệm khả năng cải thiện hiệu quả nước ao nuôi tôm thẻ chân trắng có dư lượng
ammonia. Thí nghiệm được thực hiện theo 5 mật độ vi khuẩn khác nhau từ 105 đến 109
(CFU/ml)với liều lượng dịch khuẩn bổ sung là 0,1% trong bình 20 lít so với đối chứng
(hoàn toàn không bổ sung dịch khuẩn) ở điều kiện có sụt khí. Kết quả cho thấyrằng ở

mật độ vi khuẩn bổ sung từ 105 (CFU/ml) trở lên đều cho hiệu suất xử lý ammonia lớn
hơn 64% (p < 0,01). Hiệu suất xử lý đạt cao nhất là 83,33% (p < 0,01) khi bổ sung vi
khuẩn với mật độ 109 (CFU/ml). Từ kết quả đó, đã đưa ra khuyến cáo mật độ vi khuẩn
nitrite hóa có trong chế phẩm vi sinh có thể dùng bón vào ao nuôi tôm khi cần cải
thiện dư lượng ammonia phù hợp và kinh tế nhất là 107 (CFU/ml) vì với mật độ này
hiệu suất xử lý đạt đến 77,5% (p < 0,01).

ii


SUMMARY
The thesis entitled: “Isolation, selection of nitrication bacteriaand the trial
capabilities ammonia resolutionin the white leg shrimp pond (Penaeus vannamei)”.
In recent years, the application of biotechnology to improve water aquaculture
ponds is receiving great attention because of its effectiveness and economics. If white
leg shrimppond is added local useful bacteria local not only pond water environment
will be better but also maintain microflora, environmental protection. The study was
implemented with the aim isto isolate and select of nitritying bacteriathat has activity
of ammonia metabolic and to survey concentration of nitrityingbacteria added to white
leg shrimp ponds to dispose of ammonia with optimum efficiency.
From sediment samples in the white leg shrimppondsat Khanh Hai Townlet,
Ninh Hai District, Ninh Thuan Province,five groups of nitritying bacteria that oxidize
ammonia have been isolated.Then, two groups of nitritying bacteria that highof
metabolic ammonia were selected to make interoperability testing to improve the
efficiency water of White shrimp pond with excess ammonia. The experiment was
carried out at five different bacteria concentrations from 105 to 109 (CFU/ml) with
additional doses of bacterial suspension is 0.1% in average 20 liters compared to
control (absolutely no additional bacterial ooze)in blow air conditions.The results
showed that the concentration of bacteria added 105 (CFU/ml) or higher, processor
performance ammonia are for greater than 64% (p < 0.01). Performance reached the

highest level handle is 83.33% (p < 0.01) when added bacteria at a concentration of
109 (CFU/ml).From the results, recommendations were given nitrication density of
bacteria in biological products can be used as apply in the pond to improve residual
ammonia the fit and the most economical is 107 (CFU/ml) because with this density
processor performance reached 77.5% (p <0.01).
Keywords: ammonia pollution, ammonium oxydizing bacteria, aquaculture,
native probiotic bacteria, nitrication,useful microorganisms,white leg shrimp.

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ....................................................................................................................... i
Tóm tắt ............................................................................................................................ ii
Summary ........................................................................................................................ iii
Mục lục ......................................................................................................................... iiv
Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................ vii
Danh sách các hình ...................................................................................................... viii
Danh sách các bảng .................................................................................................... viiii
CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU ....................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................1
1.2.Yêu cầu của đề tài......................................................................................................2
1.3.Nội dung thực hiện ....................................................................................................2
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..........................................................................3
2.1.Tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) ..................................................................3
2.2.Chu trình nitrogen......................................................................................................6
2.3.Vi khuẩn Nitrosomonas .............................................................................................8
2.4.Một số phương pháp giảm thiểu ô nhiễm các hợp chất chứa nitrogen ...................10
2.5.Sử dụng một số chế phẩm sinh học trong nuôi tôm ................................................10

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................12
3.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...........................................................................12
3.2.Vật liệu và phương pháp thực hiện đề tài ................................................................12
3.3.Phân lập nhóm vi khuẩn nitrite hóa. ........................................................................12
3.4.Thử nghiệm cải thiện nước ao nuôi tôm thẻ chân trắng ..........................................14
3.5.Phương pháp phân tích các chỉ tiêu quan tâm .........................................................16
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................20
iv


4.1. Phân lập nhóm vi khuẩn nitrite hóa ........................................................................20
4.2. Kết quả thí nghiệm 1:tuyển chọn nhóm vi khuẩn nitrite hóa .................................24
4.3. Kết quả thí nghiệm 2: khảo sát mật độ vi khuẩn nitrite hóa cần bổ sung ..............28
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................33
5.1. Kết luận...................................................................................................................33
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................33
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................34
PHỤ LỤC

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AMO

Ammonium Monooxygenase.

AOB

Ammonium Oxydizing Bacteria.

BOD

Biochemical Oxygen Demand (Nhu cầu oxy sinh hoá).

CFU

Colony Form Unit.

COD

Chemical Oxygen Demand (Nhu cầu oxy hoá học).

ctv

Cộng tác viên.

CV

Coefficient of Variation (Độ lệch tiêu chuẩn tương đối).

DO

Dissolved Oxygen (Nồng độ oxy hoà tan).

ĐC

Đối chứng.

FAO

Food and Argiculture Organization (Of The United Nations).

HAO

Hydroxylamine Oxydoreductase.

LSD

Least Significant Difference Test.

NOB

Nitrite Oxidizing Bacteria.

NT

Nghiệm thức.

PTN

Phòng thí nghiệm.

TAN

Total Ammonium Nitrogen.

TN

Thí nghiệm.

vi


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1Tôm thẻ chân trắng ........................................................................................... 3
Hình 2.2Chu trình nitrogen ............................................................................................. 6
Hình 3.1Sơ đồ chọn điểm thu mẫu bùn lắng trong ao nuôi tômthẻ .............................. 12
Hình 3.2Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 ................................................................................ 14
Hình 3.3Sơ đồ bố trí thí nghiệm2 ................................................................................. 15
Hình 4.1 Kết quả cấy trang mẫu bùn lắng thu được ..................................................... 20
Hình 4.2 Khuẩn lạc cấy phân lập .................................................................................. 21
Hình 4.3 Hình dạng tế bào vi khuẩn sau nhuộm Gram ................................................ 22
Hình 4.4Kết quả kiểm tra sinh hóa với thuốc thử Griss A và Griss B ......................... 23
Hình 4.5 Biểu đồ hàm lượng ammoniatheo thời gian (TN1) ....................................... 24
Hình 4.6Biểu đồ hàm lượng nitrite theo thời gian (TN1) ............................................. 26
Hình 4.7 Thí nghiệmcải thiện nước ao tôm thẻ chân trắng .......................................... 27
Hình 4.8Biểu đồ hàm lượng ammoniatheo thời gian (TN2) ........................................ 28
Hình 4.9Thí nghiệm dùng test NH4+/NH3..................................................................... 30
Hình 4.10Biểu đồ hàm lượng nitrite theo thời gian(TN2) ............................................ 31

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Thành phần các chất dựng đường chuẩn ammonium .................................... 17
Bảng 3.2 Tỷ lệ phần trăm NH3 trong TAN theo nhiệt độ và pH .................................. 17
Bảng 3.3 Thành phần các chất dựng đường chuẩn nitrite............................................. 19

Bảng 4.1 Hiệu suất xử lý ammoniatheo thời gian ở các nghiệm thức (TN1) ............... 24
Bảng 4.2 pH nước ao tôm thẻ theo thời gian ở các nghiệm thức (TN1)....................... 25
Bảng 4.3Hiệu suất xử lý ammoniatheo thời gian ở các nghiệm thức (TN2) ................ 28
Bảng 4.4pH nước ao tôm thẻ theo thời gian ở các nghiệm thức (TN2)........................ 30
Bảng 4.5Mật độ vi khuẩn nitrite hóa trong nước ao tôm thẻ theo thời gian ................. 31

viii


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) (Boone, 1931) là đối tượng đang được

quan tâm trong ngành nuôi trồng thủy sản Việt Nam. Tôm thẻ chân trắng được cho là dễ
nuôi hơn các giống tôm khác và đem lại kinh tế khá cao.
Tuy nhiên, nghề nuôi tôm ở Việt Nam đang phải đối mặt với nhiều thách thức, ảnh
hưởng đến tính bền vững của ngành. Đó là các tác động kinh tế, xã hội, môi trường của
ngành nuôi tôm và gần đây là các vấn đề về rào cản chất lượng sản phẩm và tranh chấp
thương mại giữa các nước xuất khẩu và nhập khẩu.Việc mở rộng quy mô, diện tích nuôi
trồng thủy hải sản tăng nhanh kéo theo việc lạm dụng thức ăn để nâng cao năng suất,
phân thải của vật nuôi nhiều hơn, phân bón thừa đã làm cho môi trường nước ao nuôi
ngày càng bị ô nhiễm nghiêm trọng, dịch bệnh phát triển nhanh (Nguyễn Chu Hồi, 2003).
Đồng thời đó cũng là nguyên nhân dẫn đến sự phát triển của vi khuẩn kỵ khí ở tầng đáy
ao nuôi sinh ra nhiều CH3, NH3 và H2S (Cao Ngọc Điệp và ctv, 2008). Nhiều nghiên cứu
cho thấy một số dòng vi khuẩn tham gia trong chu trình nitrogen có khả năng khử đạm
đặc biệt là những vi khuẩn có mang gene mã hóa như amo, nir, nor, nos, nar oxy hóa
NH3, khử nitrite, nitrate, oxide nitrogen để loại bỏ các dạng nitrogen liên kết trong nước
thành nitrogen tự do bay vào không khí hoàn tất chu trình nitrogen trong tự nhiên

(Zumft,1997).Ammonia là một độc tố trong nước (Arthur và ctv,1987)được loại bỏ nhờ
quá trình nitrite hóa bằng cách cung cấp nhiều O2 để tăng tốc độ oxy hóa nitrate hoặc
ammonium thành nitrite và chuyển thành N2 thoát ra ngoài không khí.
Việc đầu tư nghiên cứu và ứng dụng khoa học kỹ thuật, ứng dụng các phương pháp
xử lý, cải thiện chất lượng nước trong và sau quá trình nuôi trồng thủy hải sản nói chung
và nuôi tôm thẻ nói riêng bằng công nghệ sinh học là một yêu cầu tất yếu góp phần phát
triển nuôi trồng thủy sản theo hướng công nghiệp hiện đại ít hoặc không gây ô nhiễm môi
trường, giúp cải thiện và thúc đẩy phát triển kinh tế để ngành nuôi tôm thực sự đủ sức lớn
mạnh, có khả năng cạnh tranh với nhiều quốc gia trong khu vực cũng như trên thế
giới.Từ những lý do trên, đề tài: “Phân lập, tuyển chọn nhóm vi khuẩn nitrite hóa và thử

1


nghiệm khả năng phân giải ammonia trong nước ao tôm thẻ chân trắng (Penaeus
vannamei)” được thực hiện.
1.2.

Yêu cầu của đề tài
Phân lập và tuyển chọn nhóm vi khuẩnnitrite hóaphân giải ammoniacao.
Khảo sát mật độ vi khuẩn nitrite hóathích hợp cần bổ sung vào nước ao tôm thẻ

chân trắng nhằm xử lý ammonia có hiệu quả tối ưu.
1.3.

Nội dung thực hiện
Phân lập nhóm vi khuẩn nitrite hóatrong mẫu bùn lắng ao nuôi tôm thẻ chân trắng

trên môi trường Vinogradski.
Tuyển chọn nhóm vi khuẩn nitrite hóacó hoạt tính phân giải ammonia cao.

Thử nghiệmkhả năng cải thiện nước ao nuôi có dư lượng ammoniacủa nhóm vi
khuẩn nitrite hóađã tuyển chọn.

2


C
Chương
g 2 TỔN
NG QUA
AN TÀI LIỆU
L
2.1.

T
Tôm
thẻ châ
ân trắng(P
Penaeus van
nnamei)

2.1.1. Phân
P
loại kh
hoa học
Ng
gành: Arthro
opoda (Châân khớp)
Lớpp: Crustaceea (Giáp xácc)
Bộ: Decapodaa (Mười châân)

Họ
ọ: Penaeidaee (Tôm he)
Giốống: Litopeenaeus
Loàài:Penaeus vannamei(Boone, 19331)
Hình 2.1Tôm thẻ chhân trắng.

Tên tiếngg Anh: White leg shrim
mp

Tên tiếngg Việt: Tôm
m chân trắng (theo FAO
O), ở Việt Nam
N thường gọi là Tôm
m thẻ.
Tôm
m thẻ chânn trắng có kh
hoảng 110 loài trong đó
đ khoảng 10 loài đượ
ợc đưa vào nuôi
thương phẩm
p
với số lượng lớn
n, phân bố chủ yếu ở châu Mỹ L
La Tinh, Haawaii. Hiệnn nay
được nuuôi ở rất nhiều
n
nước trên thế ggiới như: Đài
Đ Loan, Trung Quốốc, Indonesia ,
Malaysiaa, Việt Nam
m.Nhờ có giá trị dinhhdưỡng caoo, dễ nuôi,, lớn nhanh

h và sản lư
ượng
lớntôm chân
c
trắng đã
đ và đang được ngườ
ời tiêu dùngg ở các thị ttrường lớn ưa chuộng.. Mỹ
là thị trư
ường tiêu thhụ tôm châân trắng lớnn nhất, tiếp theo là thịị trường Chhâu Âu và Nhật
N
Bản (Trầần Viết Mỹ
ỹ, 2009). Trrong nhữngg năm gần đây, ngànhh nuôi tôm ở Việt Nam
m đã
phát triểển mạnh, năăm 2004 xuuất khẩu thhuỷ sản đạtt giá trị 2,44 tỷ USD, sản lượng nuôi
trồng thủủy sản đạt mức
m 1,4 triệệu tấn/năm
m, chiếm 68%
% tổng sảnn lượng thủyy sản. Diệnn tích
nuôi trồn
ng và sản lư
ượng thủy sản
s mỗi năm
m một tăng, tính đến 20005 đạt 750
0 nghìn ha; năm
2010, sảnn lượng đạạt gần 470 nghìn
n
tấn (P
Phạm Văn Ty
T và Vũ N
Nguyên Thàn

nh, 2009).
2.1.2. Đặc
Đ điểm sinh thái và tập tính sốống
Theeo Vũ Thế Trụ(1995), tôm thẻ chhân trắng là loài tôm nhhiệt đới, cóó khả năng tthích
nghi vớii giới hạn rộng
r
về độ mặn và nhiiệt độ. Tôm
m có khả năăng thích ng
ghi với độ mặn
0,5 – 4‰
‰, thích hợ
ợp:7 – 34‰
‰ và tăng trư
ưởng tốt ở độ mặn khhá thấp: 10 – 15‰.Mặặc dù
tôm có khả
k năng thhích nghi với
v giới hạnn rộng về nhiệt
n
độ (155 – 33ºC), nhưng nhiệệt độ
thích hợ
ợp nhất cho sự phát triển của tôm
m là 23 – 30
0ºC. Nhiệt đđộ tối ưu cho tôm lúc nhỏ
3


(1g) là 30ºC và cho tôm lớn (12 – 18g) là 27ºC. Tuy nhiên, trong điều kiện nhiệt độ thấp
tôm mẫn cảm hơn với các bệnh do virus như bệnh đốm trắng và hội chứng Taura.
2.1.3. Đặc điểm dinh dưỡng và khả năng tăng trưởng
Tôm chân trắng là loài ăn tạp thiên về động vật, phổ thức ăn rộng, cường độ bắt

mồi khỏe, tôm sử dụng được nhiều loại thức ăn tự nhiên có kích cỡ phù hợp từ mùn bã
hữu cơ đến các động thực vật thủy sinh.Nhu cầu protein trong khẩu phần thức ăn cho tôm
chân trắng (20 – 35%), thấp hơn so với các loài tôm nuôi cùng họ khác (36 – 42%). Khả
năng chuyển hóa thức ăn của tôm rất cao, trong điều kiện nuôi thâm canh, hệ số chuyển
hóa thức ăn (FCR) dao động từ 1,1 – 1,3.
Tôm chân trắng lột xác vào ban đêm, thời gian giữa 2 lần lột xác khoảng 1 – 3 tuần,
tôm nhỏ (dưới 3g) trung bình 1 tuần lột xác 1 lần, thời gian giữa 2 lần lột xác tăng dần
theo tuổi tôm, đến giai đoạn tôm lớn (15 – 20g), trung bình 2,5 tuần tôm lột xác 1 lần.
Tôm có tốc độ tăng trưởng nhanh, trong điều kiện nuôi, với môi trường sinh thái phù
hợp, tôm có khả năng đạt 8 – 10g trong 60 – 80 ngày, hay đạt 35 – 40g trong khoảng 180
ngày. Tôm tăng trưởng nhanh hơn trong 60 ngày nuôi đầu, sau đó, mức tăng trọng giảm
dần theo thời gian nuôi. Nhờ đặc tính ăn tạp, bắt mồi khỏe, linh hoạt, nên tôm chân trắng
trong quần đàn có khả năng bắt mồi như nhau, vì thế tôm nuôi tăng trưởng khá đồng đều,
ít bị phân đàn.
2.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của tôm thẻ chân trắng
2.1.4.1.

Yếu tố pH

Trong ao nuôi tôm, pH thường được đo vào lúc 5 – 6 giờ và 16 giờ. Theo quy luật
tự nhiên, pH buổi sáng thường thấp hơn buổi chiều. Sự dao động pH trong ngày cho phép
nhỏ hơn 0,5 đơn vị, nếu lớn hơn 1 đơn vị/ngày phải can thiệp bằng hóa chất hoặc thay
nước để giảm khoảng cách dao động. Giá trị biến động tốt của pH trong quá trình nuôi
thường trong khoảng 7,0 – 9,2 tùy vào từng vùng đất và giai đoạn nuôi. pH tối ưu cho
tôm thẻ chân trắng là pH = 8,0 – 8,5 (Nguyễn Đức Cự và ctv, 2010). Nguyên nhân làm
pH dao động lớn trong ngày, chủ yếu là:
-

Độ kiềm trong ao quá thấp, nhỏ hơn 70 mg/l.

-

Tảo phát triển quá nhiều, độ trong nhỏ hơn 25 cm.

-

Vùng đất phèn pH < 4 nhưng khi cải tạo ao không bón đủ lượng vôi CaCO3 thì
trong thời gian nuôi, pH hay biến động lớn dù có bổ sung Dolimite.
4


2.1.4.2.

Hàm lượng Oxy hòa tan (DO)

Oxy hòa tan trong nước ao nhiều hay ít là vấn đề rất quan trọng đối với sinh trưởng
và phát triển của tôm. Khoảng 80% tổng lượng oxy trong ao do thực vật phù du cung
cấp, khoảng 15% từ quạt nước đưa vào và khoảng 5% từ không khí khuếch tán trực tiếp
vào nước ao. Hàm lượng oxy hòa tan thường thấp vào ban đêm (từ 1 – 6 giờ sáng) và cao
nhất vào lúc 10 – 16 giờ nhờ quang hợp của tảo.
Trong ao nuôi tôm hàm lượng oxy hòa tan lớn hơn 4 mg/l là tốt nhất, khi lượng oxy
dưới 4 mg/l tôm vẫn ăn bình thường, nhưng hiệu quả sử dụng thức ăn bắt đầu giảm và
tăng các nhân tố gây bệnh. Nếu lượng oxy tiếp tục xuống thấp hơn tôm sẽ ngừng ăn, bơi
trên mặt ao và tấp vào mé bờ ao, nếu không xử lý kịp thời hiện tượng thiếu oxy sẽ dễn
đến tôm chết (khi hàm lượng oxy hòa tan dưới 1 mg/l). Được cung cấp đủ oxy, tôm ăn
khỏe hơn (Thái Bá Hổ và Ngô Trọng Lư, 2003).
Tôm chân trắng thường lột xác đồng loạt vào ban đêm – thời điềm DO xuống thấp,
khi lột xác mang tôm hấp thu oxy kém nên nhu cầu oxy cần nhiều hơn lúc bình thường.
Nếu thiếu oxy xảy ra lúc lột xác, tôm sẽ chết đồng loạt ở đáy ao (vì quá trình lột xác sẽ
xảy ra ở đáy ao).

2.1.4.3.

Hàm lượng ammonia trong nước

Với loài tôm, ammonia có thể chiếm tới 40 – 90% các chất bài tiết Nitrogen (Vũ
Thế Trụ, 1995). Ammonia rất độc đối với tôm, khi nồng độ trong ao khoảng 1 mg/l có
khả năng gây hiện tượng tôm chết, khi nồng độ lớn hơn 0,1 mg/l sẽ ảnh hưởng tới sự tăng
trưởng của tôm. Do đó cần duy trì nồng độ NH3 nhỏ hơn 0,1 mg/l để an toàn cho tôm
(Boyd, 1998). Trong ao nuôi thủy sản NH3 có được từ các quá trình phân hủy các hợp
chất hữu cơ có chứa N, nhờ các vi khuẩn hiếu khí và yếm khí. NH3 (dạng tự do) hòa tan
trong nước tạo thành NH4+ (dạng ion) cho đến khi cân bằng.
NH3+ H2O ↔ NH4+ + OHKhi pH tăng, sự chuyển đổi từ NH4+ sang NH3 cũng tăng, gây độc cho tôm.NH3 có
độc tính cao hơn NH4+ vì NH3không mang điện tích dễ thấm qua tế bào mang cá, tôm,
đồng thời có khả năng hòa tan chất béo (Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành, 2009).Khi
hàm lượng NH3 trong nước cao sẽ làm cho sinh vật khó bài tiết NH3 từ máu và các mô ra
môi trường nước. Vì vậy, nồng độ ammonia trong máu tăng dẫn đến tổn hại các cơ quan
bên trong đăc biệt là gan và thận.

5


Giảm lượng ammonia bằng cách tăng lượng chế phẩm sinh học và khống chế pH
không để tăng cao hơn 8,5. Do nuôi mật độ cao, cần kiểm tra chặt chẽ sự biến động của
môi trường, khống chế các yếu tố để giảm thiểu sự ô nhiễm. Cần sử dụng các chế phẩm
vi sinh hợp lý, việc duy trì nồng độ thấp của NH3 cũng rất dễ dàng khi sử dụng vi sinh
đúng phương pháp.
2.1.4.4.

Một số yếu tố khác

Ngưỡng chịu đựng của tôm chân trắng tốt hơn tôm sú, nhưng chúng lại rất nhạy
cảm với một số hiện tượng gây stress như: giở nhá kiểm tra thức ăn, có tiếng động mạnh,
dùng chài kiểm tra… chúng thường búng mạnh, hay cong cứng thân, rồi thường bị đục
thân khi đưa lên khỏi mặt nước và có thể chết.
2.2.

Chu trình nitrogen
Chu trình nitrogen dựa trên quá trình tổng hợp bằng các vi khuẩn nitrate hóa từ

ammonia (NH3) thành nitrite (NO2) và cuối cùng thành nitrate (NO3-) (Hình 2.2).

Thực vật và khí quyển

CO2
NH3

Vi khuẩn
Nitrosomonas

NO2

CO2 và NH3

Cá, tôm,… và thức ăn

Vi khuẩn
Nitrobacter

Được chuyển hóa
bởi thực vật và sự

lưu thông của
nước

NO3-

Hình 2.2 Chu trình Nitrogen.
2.2.1. Nitrite và nitrate
Nitrite: là chất rất độc đối với cá nhưng ít độc hơn đối với tôm. Nitrite gây độc
chính yếu là tạo thành chất methemoglobin và giảm sự chuyển oxygen tới tế bào (Vũ Thế
Trụ, 1995). Những hiểu biết về ảnh hưởng của NO2- đến sự phát triển của tôm không
được biết nhiều, theo khuyến cáo của các nhà khoa học ngưỡng an toàn được áp dụng là
0,1 mg/l. Nồng độ của NO2- không vượt quá 0,5 mg/l (Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, 2012).
6


Nitrate: Độc tính của nitrate đối với tôm không cao. Tôm vẫn có thể sống trong môi
trường nước có hàm lượng nitrate lên đến 200mg/l. Tuy nhiên, theo khuyến cáo của các
nhà khoa học hàm lượng nitrate trong môi trường nuôi nên thấp hơn 60 mg/l.
Nồng độ nitrate cho phép trong môi trường nuôi trồng hải sản là dưới 10mg/l. Ở
nồng độ 10mg/l sẽ làm tảo phát triển. Tảo phát triển sẽ kết khối nổi lên mặt nước, khi bị
phân hủy gây ô nhiễm nước, làm nước đục và thối, giảm nổng độ oxy hòa tan. Khi nồng
độ nitrate lớn hơn 50mg/l sẽ gây sốc nghiêm trọng cho tôm (Vũ Thế Trụ, 1995; Phạm
Văn Ty và Vũ Nguyên Thành, 2009).
2.2.2. Quá trình nitrate hóa
Theo Lương Đức Phẩm và ctv (2009), quá trình nitrate hóa là quá trình chuyển hóa
ammonium thành nitrite và nitrate. Quá trình nitrate hóa gồm 2 giai đoạn:
 Giai đoạn thứ nhất biến NH3 thành nitrite (NO2-).
 Giai đoạn thứ hai là biến NO2- thành nitrate (NO3-).
Quá trình hoạt động vi khuẩn Nitrosomonas oxi hóa NH4+/NH3 thành NO2- và vi
khuẩn Nitrobacter oxy hóa NO2- thành NO3- . Quá trình diễn ra theo phương trình (H.J.

Jordening and J. Winter, 2010):
NH4+ + 1,5O2 → NO2- + 2H+ + H2O
NO2- + 0,5O2 →NO3Ta cũng thấy hai phân nhóm vi khuẩn tham gia hai giai đoạn này. Chúng chia năng
lượng cần thiết cho hoạt động sống của mình. Vi sinh vật thực hiện các quá trình oxy hóa
ở đây kèm theo sự đồng hóa CO2 gọi là những vi sinh vật hóa tự dưỡng vô cơ
(chemoautolitotroph) và là những cơ thể hiếu khí bắt buộc.
Ở giai đoạn thứ nhất ta thường gặp nhóm AOB – ammonium oxydizing bacteria:
 Nitrosomonas: tế bào hình cầu hay ovan, kích thước 0,5 – 1,5µm, chuyển
động, có tiên mao dài ở cực.
 Nitrosocytic: hình cầu, đường kính1,5µm, dính với nhau thành chuỗi, có màng
nhầy bao bọc, thường thấy ở biển.
 Nitrosopira: có dạng xoắn, chiều dài không nhất định (15 – 20µm), thường
phát triển ở đất sét ít canh tác.
Ở giai đoạn thứ hai ta thường gặp nhóm NOB – nitrite oxidizing bacteria:

7


 Nitrobacter: là trực khuẩn nhỏ, tròn, hình trứng hay hình quả lê, kích thước 1,0
– 1,2µm, không chuyển động, đứng riêng lẽ hay kết hợp với nhau thành nhóm
có màng nhầy bao quanh.
2.2.3. Quá trình khử nitrate
Quá trình vi sinh vật khử nitrate (hoặc nitrite) đến nitrogen phân tử kèm theo sự oxy
hóa các chất hữu cơ để giải phóng CO2 và H2O, được gọi là quá trình phản Nitrate hóa
(hoặc khử nitrate).Quá trình phản nitrate có thể xảy ra ở điều kiện kỵ khí và hiếu khí,
nhưng đặc biệt mạnh mẽ khi không có mặt oxy của không khí.
Phương trình tổng quát như sau: 10(H) + 2H+ + 2NO3+- → N2 + 6H2O
Vi khuẩn phản nitrate hóa là nhóm vi khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Chúng
là các loài kỵ khí không bắt buộc, hoạt động mạnh trong môi trường trung tính hoặc hơi
kiềm và kỵ khí.Những loài vi khuẩn phản nitrate hóa thường là: Pseudomonas,

Achromobacter, Azospirillum, Thiobacillus, Paracocus (Tô Minh Châu, 1999; Nguyễn
Đức Lượng và ctv, 2006; Lương Đức Phẩm và ctv, 2009).
2.3.

Vi khuẩnNitrosomonas

2.3.1. Phân loại khoa học
Giới:Bacteria
Ngành:Proteobacteria
Lớp:Beta Proteobacteria
Bộ:Nitrosomonasadales
Họ:Nitrosomonasdaceae
Giống:Nitrosomonassp.
Đến nay các nhà khoa học đã xác định được 10 loài trong nhóm Nitrosomonas bao
gồm: N. europaea, N. eurotropha, N. halophila, N. communis, N. marina, N. aestuarii, N.
nitrosa, N. ureae, N. oligotropha, N. cryotolerans.
2.3.2. Đặc điểm hình thái
Thông thường vi khuẩn Nitrosomonas có tế bào dạng hình cầu hoặc trục ngắn, di
động hoặc không di động, một số loài di động bằng tiên mao ở đầu cực, đứng riêng lẻ,
thành đôi hay thành chuỗi; Gram âm, biên độ nhiệt phát triển là 5 – 30ºC, nhiệt độ thích
hợp nhất là trong khoảng 20 – 30ºC. Chúng có thể chịu đựng ngưỡng pH trong dãy giá trị
từ 5,8 – 8,5. Nitrosomonas là vi khuẩn kỵ ánh sáng, thường kết thành khối gọi là tập đoàn
khuẩn keo.
8


2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt động của vi khuẩn Nitrosomonas
2.3.3.1.

Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng tới tốc độ phát triển của sinh vật, nhiệt độ càng tăng thì tốc độ
sinh trưởng càng tăng. Ở biên độ trên 25ºC vi khuẩn AOB có thể cạnh tranh hiệu quả với
vi khuẩn NOB. Biên độ giao động nhiệt và tốc độ tăng trưởng của vi khuẩn
Nitrosomonas: nhiệt độ tối ưu cho quá trình phát triển là 25 – 30ºC, tốc độ tăng trưởng
giảm 50% khi nhiệt độ giảm xuống còn 18ºC, tốc độ tăng trưởng giảm 75% khi nhiệt độ
xuống còn 8 – 10ºC, ngừng hoạt động ở 4ºC và chết ở 0ºC hoặc 49ºC.
2.3.3.2.

Yếu tố pH

Trong quá trình xử lý sinh học, pH là yếu tố ảnh hưởng rõ rệt nhất đến đời sống và
hoạt động của sinh vật. pH tối ưu: 7,5 – 8, pH < 7 Nitrosomonas chậm phát triển và bị ức
chế ở pH = 6,5, có khi pH <6 hoặc thấp hơn nữa.
2.3.3.3.

Hàm lượng DO (oxy hòa tan)

Nitrosomonas là vi khuẩn hiếu khí do đó DO rất cần thiết để phát triển. Khi DO < 2
mg/l, quá trình nitrate hóa khó xảy ra, hoạt động của AOB vượt trội hơn NOB.
2.3.3.4.

Ảnh hưởng của chất vi lượng và kim loại nặng

Các chất vi lượng rất cần thiết cho sự phát triển của sinh vật. Các kim loại nặng ức
chế hoạt động của sinh vật, khi tế bào tiếp xúc với 1 µM CdC2, 6µM HgCl2, 8 µM CuCl2
thì mức oxy hóa ammonium giảm xuống 90%.
2.3.4. Cơ chế quá trình nitrite hóa của vi khuẩn Nitrosomonas
Theo H.J. Jordening và J. Winter (2010) cơ chế quá trình nitrite hóa của vi khuẩn
Nitrosomonas: đầu tiên ammonium được thủy phân thành hydroxylamine bằng enzyme

AMO (Ammonium Monooxygenase). Sau đó, hydroxylamine được oxy hóa thành nitrite
nhờ enzyme HAO (Hydroxylamine Oxydoreductase). Quá trình này sinh ra năng lượng
và được vi khuẩn sử dụng để đồng hóa CO2 cho hoạt động sống của chúng.
NH4

+

AMO

HAO
NH2OH

NO2-

2NH4+ + O2 → 2NH2OH + 2H+
2NH4+ + 1,5O2 → NO2- + H2O + 2H+ + 275 KJ/mol
Quá trình trên được thực hiện nhờ các vi sinh vật tự dưỡng N. europaea, N.
oligocarbogenes, trong điều kiện hiếu khí, nguồn carbon sử dụng là CO2, HCO3-, CO3không cần bổ sung các nguồn carbon hữu cơ khác trong quá trình hoạt động. Trong điều
9


kiện DO > 0,6 mg/l, hoạt động oxy hóa ammonium của vi khuẩn Nitrosomonas đã diễn ra
bình thường. Ngoài ra, quá trình nitrite hóa còn có sự tham gia của các vi khuẩn oxy hóa
ammonium khác như: Nitrosopira, Nitrosococus, Nitrosolobus.
2.4.

Một số phương pháp giảm thiểu ô nhiễm các hợp chất chứa nitrogen
Khi môi trường, trước hết là nguồn chứa lượng ammonium quá ngưỡng, chúng ta

cần phải tìm mọi cách để giảm thiểu sự ô nhiễm của các chất này (Lương Đức Phẩm và

ctv, 2009).Có 3 biện pháp để giải quyết đó là:
- Loại bỏ ammoniac (NH3) ở dạng khí, pH môi trường là 11 – 13.
- Chuyển hóa ammonium (ở dạng NH4OH hoặc NH3) sang nitrate và từ nitrate đến
nitrogen phân tử (N2) nhờ vi sinh vật.
- Giảm thiểu NH4+ hoặc NO3-bằng cách nhờ vi sinh vật, tảo, thực vật thủy sinh hấp
thụ rồi chuyển thành các hợp chất hữu cơ chứa nitrogen trong hợp phần tế bào
(protein, enzyme, acid nucleic, lipo – protein). Sau đó, tách sinh khối của chúng.
Biện pháp này còn áp dụng cho giảm thiểu PO43+, các ion kim loại nặng rất có
hiệu quả.
2.5.

Sử dụng một số chế phẩm sinh học trong nuôi tôm
Probiotic là các loại vi khuẩn ở dạng sống được bổ sung vào thức ăn hay môi trường

ao. Probiotic có tác dụng cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, kích thích tăng trưởng, hoặc
làm sạch môi trường (như yucca, enzyme, macrogard).Ứng dụng công nghệ này, các vi
khuẩn vô hại và các enzyme được sản xuất dưới dạng chế phẩm sinh học với mục đích là:
-

Giảm các độc tố trong ao xuống mức thấp nhất (chủ yếu là NH3, H2S)

-

Cải thiện màu nước. Ổn định pH và cân bằng hệ sinh thái trong ao.

-

Giảm mùi hôi, các chất hữu cơ; giảm độ nhớt của nước; giảm tảo, ngăn cản sự nở
hoa của tảo và hấp thu nguồn tảo chết trong ao.

-

Cạnh tranh thức ăn làm giảm lượng vi khuẩn có hại (viriosis) trong ao; giảm tác
nhân gây bệnh tôm nuôi.

-

Tăng sự hòa tan oxy từ không khí vào nước ao.

-

Giúp tôm tiêu hóa và hấp thụ thức ăn tốt, giảm hệ số tiêu tốn thức ăn.

-

Tăng cường đề kháng, phòng bệnh cho tôm nuôi.

-

Giảm số lần thay nước trong quá trình nuôi.

10


Hiện nay, trong nước ao nuôi tôm chân trắng thâm canh, thường hạn chế việc thay
nước, do rất khó khống chế các mầm bệnh trong nguồn nước thay, dễ gây bệnh cho tôm.
Do đó, việc sử dụng chế phẩm sinh học là tối cần thiết và không thể thiếu được khi nuôi
mật độ cao trên 60 con/m2; cần dựa vào công dụng chính của từng loại để sử dụng cho
phù hợp; có thể kết hợp hai loại với nhau (với bản chất chúng hỗ trợ có lợi cho nhau) để
đạt hiệu quả cao hơn. FAO cũng coi việc nghiên cứu probiotic cùng với các chất kích

thích miễn dịch (immunostimulant) các chất nâng cao khả năng miễn dịch (immue
enchancers) như một trong những biện pháp chủ yếu để cải thiện chất lượng môi trường
nuôi thủy sản (Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành, 2009). Theo Boyd (1995) sử dụng
probiotic có thể ngăn ngừa mùi vị, giảm thành phần tảo lục, tảo lam, nitrite, nitrate,
ammonia và phosphate.
Chế phẩm vi sinh chủ yếu chứa các vi khuẩn tự dưỡng và dị dưỡng, hiếu khí và kỵ
khí không bắt buộc (sử dụng hoặc ít sử dụng oxy) sống chủ yếu vùng đáy ao, chúng hoạt
động tốt khi oxy vùng đáy ao lớn hơn 4mg/l, nếu lượng oxy thấp hơn, vi sinh vật phát
triển kém, hiệu quả sử dụng giảm.

11


Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 1/2013 đến tháng 6/2013 tại Viện nghiên cứu Công

nghệ Sinh học và Môi trường (Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh).
3.2.

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Vật liệu: mẫu nước, mẫu bùn thu nhận được.
Dụng cụ: sử dụng dụng cụ phổ biến ở phòng thí nghiệm vi sinh, bình chứa, máy sụt

khí, máy đo pH, đồ cạp bùn, máy đo OD.
Hóa chất: hóa chất pha môi trường, thuốcthử sinh hóa và các hóa chấtkhác.
Phương pháp thực hiện: phương pháp phân lập, đếm vi sinh tổng số; nhuộm Gram,
định danh vi khuẩn bằng sinh hóa, tăng sinh; các phương pháp phân tích: đo pH, đo các

chỉ tiêu quan tâm.
3.3.

Phân lập nhóm vi khuẩnnitrite hóa

Ao xử
lý chất
thải

Ao
chứa
lắng

Mương thải

Mương cấp

Ao nuôi

Hình 3.1Sơ đồ chọn điểm thu mẫu bùn lắng trong ao nuôi tôm thẻ chân trắng.
3.3.1. Thu mẫu
Địa phương thu mẫu: Khu nuôi tôm thẻ ở thị trấn Khánh Hải, huyện Ninh Hải, tỉnh
Ninh Thuận; khu nuôi tôm thẻ thôn Lương Cách, xã Hộ Hải, huyện Ninh Hải, tỉnh Ninh
Thuận.Tiến hành thu mẫu bùn lắng trong ao nuôi tôm thẻ chân trắng tại 3 điểm như hình
3.1 theo thời gian 3 giai đoạn nuôi: ao mới thả, ao2 tháng và ao thương phẩm (3 tháng)
với 3 lần lặp lại.Mẫu bùn lắng được thu bằng đồ cạp bùn; mỗi lần lấy khoảng 100 g bùn
lắng (theo phương pháp của Nguyễn Văn Mạnh và Bùi Thị Nga, 2011), thời gian thu mẫu
trong khoảng 15 – 17 giờ trong ngày. Tất cả mẫu bùn lắng sau khi thu được bảo quản
lạnh.

12


Pha loãng mẫu: Mẫu bùn lắng được lắc ngang 2 giờ/110 vòng/phút (theo phương
pháp của Cao Ngọc Điệp và ctv, 2008; Cao Ngọc Điệp và ctv, 2010) sau đó mẫu bùn
lắng được pha loãng bằng nước cất hoặc nước muối sinh lý đến nồng độ 10-5.
3.3.2. Phương pháp đếm vi sinh tổng số
Cấy trang 0,1 ml dung dịch mẫu bùn lắng ở các nồng độ đã được pha loãng lên môi
trường Vinogradski 1(Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2006), ủ ở nhiệt độ phòng:
(NH4)2SO4

2,0g

FeSO4

0,1g

K2HPO4

1.0g

CaCO3

1,0g

MgSO4.7H2O

0,5g

Agar

18 – 20 g

NaCl

2,0g

Nước cất vừa đủ

1 lít

pH = 7,6 – 7,8
Quan sát và đếm các khuẩn lạc mọc trên đĩa sau 3 ngày. Xác định tổng số vi sinh
vật (X) (bằng phương pháp đếm khuẩn lạc) có trong 1 ml mẫu theo công thức:
X (CFU/ml) =

∑N
∑ (ni × vi × fi)

Trong đó:
CFU: (Colony Form Unit) đơn vị hình thành khuẩn lạc.
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa có từ 25 – 300 khuẩn lạc ở độ pha
loãng i.
ni: số đĩa có khuẩn lạc trong khoảng đếm được ở một nồng độ pha loãng i.
vi: thể tích pha loãng i cho vào mỗi đĩa petri.
fi: bậc pha loãng.
Tiến hành làm thuần vi khuẩn bằng phương pháp cấy ria góc các khuẩn lạc từ đĩa
cấy trang khoảng 3 lần cho đến khi thấy các khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch đồng nhất. Sau
đó nhuộm Gram và quan sát tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi.
3.3.3. Định danh vi khuẩn phân lập được bằng kiểm tra sinh hóa

Nguyên tắc: phản ứng tạo màu hồng đặc trưng của nitrite với thuốc thử Griss A và
Griss B chứng tỏ có sự hiện diện của vi khuẩnnitrite hóa.Lấy 9 ml dịch tăng sinh vi
khuẩn vào ống nghiệm, thêm vào0,5ml thuốc thử Griss B và 0,5 ml thuốc thử Griss A
vào ống nghiệm trên, quan sát, ghi nhận kết quả và so sánh với ĐC (dịch tăng sinh không
bổ sung vi khuẩn).
13


3.3.4. Tăng sinh vi khuẩn
Để tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn sinh trưởng, phát triển và tạo sinh khối,đưa
vi khuẩn vào môi trường tăng sinh có chứa nguồn dinh dưỡng thích hợp (Lương Đức
Phẩm và ctv, 2009). Môi trường tăng sinh như sau:
(NH4)2SO4

: 2,5 g

K2HPO4

: 0,7 g

CaCl2.2H2O

: 0,0184 g

MgSO4.7H2O

: 0,1 g

NaHCO3

: 0,5 g

Na2HPO4

: 13,5 g

FeCl3.6H2O

: 0,0144 g

Nước cất

: 1000 ml

Điều chỉnh pH môi trường sau khi pha nằm trong khoảng 7,6 – 7,8. Ủ ở nhiệt độ 25
– 30⁰C trong máy lắc với tốc độ lắc 110 vòng/phút.
Sau khoảng hơn 3 ngày, cấy trang 0,1 ml dịch tăng sinh ở nồng độ thích hợp lên đĩa
thạch môi trường Vinogradski,đếm khuẩn lạc và ghi nhận kết quả tăng sinh.
Bảo quản vi khuẩn: vi khuẩn được làm thuần 3 lần trên môi trường chọn lọc được
tiến hành giữ giống trong thạch nghiêng, sau 2 – 3 tháng cấy chuyển một lần.
3.4.

Thử nghiệm khả năng xử lý nước ao nuôi tôm thẻ chân trắng dư lượng

ammoniacủa nhóm vi khuẩn nitrite hóa phân lập được
3.4.1. Thí nghiệm 1: tuyển chọn nhóm vi khuẩn nitrite hóa xử lý ammonia tốt

Nước ao nuôi tôm thẻ dư lượng ammonia
V = 500 ml

T1

T2

V1

V3

V2

ĐC

Bổ sung 0,5 ml mỗi nhóm vi khuẩn phân lập được
(T1, T2, V1, V2, V3) với mật độ 108 (CFU/ml)
Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1.

14

Theo dõi
các chỉ tiêu
NH3, NO2-,
pH qua
từng ngày

Tất cả các bình được sụt
khí 24/24, nhiệt độ
phòng tương đối 30⁰C


Bố trí thí nghiệm như Hình 3.3. Mỗi bình chứa 500 ml nước ao nuôi tôm thẻ chân

trắng có dư lượng ammonia với các nghiệm thức như sau:
NT1 (T1): bổ sung 0,5 ml dịch khuẩn tăng sinh T1 mật độ 108 (CFU/ml).
NT2 (T2): bổ sung 0,5 ml dịch khuẩn tăng sinh T2 mật độ 108 (CFU/ml).
NT3 (V1): bổ sung 0,5 ml dịch khuẩn tăng sinh V1 mật độ 108 (CFU/ml).
NT4 (V2): bổ sung 0,5 ml dịch khuẩn tăng sinh V2 mật độ 108 (CFU/ml).
NT5 (V3): bổ sung 0,5 ml dịch khuẩn tăng sinh V3 mật độ 108 (CFU/ml).
ĐC: không bổ sung dịch khuẩn.
Thí nghiệm có sụt khí ở tất cả các bình, theo dõi các chỉ tiêu ammonia, nitrite, pH
từng ngày với 3 lần lặp lại nhằm mục đích so sánh, chọn lọc nhóm vi khuẩn xử lý
ammonia tốt để phục vụ thí nghiệm tiếp theo.
3.4.2. Thí nghiệm 2: khảo sát mật độ vi khuẩn nitrite hóa bổ sung thích hợp để xử
lý nước ao nuôi tôm hiệu quả.

Nước ao nuôi tôm thẻ dư lượng ammonia
V = 20 lít

NT1

NT2

NT3

NT5

NT4

ĐC

Bổ sung 20 ml hai nhóm vi khuẩn(T2, V1) tỷ
lệ 1:1lần lượt với các mật độ

105, 106,107, 108, 109 (CFU/ml)

Theo dõi
các chỉ tiêu
NH3, NO2-,
pH qua
từng ngày

Tất cả các bình được sụt
khí 24/24, nhiệt độ
phòng tương đối 30⁰C

Hình 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.
Từ kết quả thí nghiệm 1, chọn ra 2 nhóm vi khuẩn V1, T2. Tăng sinh và phối trộn
theo tỷ lệ 1 : 1. Tiếp tục thực hiện thí nghiệm 2 được bố trí như Hình 3.3. Mỗi bình chứa
20 lít nước ao nuôi tôm thẻ chân trắng có dư lượng ammonia với các nghiệm thức như
sau:
15