Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus đối kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo rũ trên một số cây trồng cạn pot

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN Bacillus
ĐỐI KHÁNG NẤM Fusarium oxysporum GÂY BỆNH HÉO RŨ
TRÊN MỘT SỐ CÂY TRỒNG CẠN
Vũ Thuý Nga
Summary
Isolation and selection of Bacillus antagonistic to wilt caused by Fusarium oxysporum
The result of study showed that some Bacillus strains can antagonistic wilt caused Fusarium
oxysporum. The result of identification by sequence rARN 16S method showed that the sequence
rARN 16S of 5.1 strain has 100% base similar Bacillus subtilis strain, the sequence rARN 16S of M
strain has 99% base similar Bacillus velezensis and the sequence rARN 16S of B17 has 99,1%
base similar Bacillus polyfermenticus. According to European Comunity, species are selected have
high biosafety and it is promissing to apply in common. All of them can grow very good in MT1,
King and PDA medium at pH 6,5-7 and temperate 25-30
0
C.
Keywords: Bacillus, strain, wilt, antagonistic, Bacillus polyfermenticus, Bacillus velezensis,
Bacillus subtilis.
I. T VN 
Bacillus thuộc nhóm vi khuNn sống phổ
biến trong đất. Một số chủng Bacillus đã
được sử dụng để sản xuất các chế phNm
sinh học trừ côn trùng gây hại cây trồng
như Bacillus thuringiensis var Kurstaki trừ
sâu tơ, Bacillus thuringiensis var Bralensis
trừ muỗi, các chế phNm này đã được sản
xuất với khối lượng lớn phục vụ sản xuất.
Một số chủng Bacillus khác còn có khả
năng ức chế một số loại nấm gây bệnh cây
trồng cũng đang được các nhà khoa học
quan tâm nghiên cứu nhằm khai thác có
hiệu quả khả năng này. Công trình nghiên

cứu được thực hiện theo hướng phân lập
tuyển chọn một số chủng Bacillus có khả
năng ức chế loại nấm gây bệnh héo rũ cây
trồng cạn Fusarium oxysporum, là loại ký
sinh gây hại nghiêm trọng nhiều loại cây
trồng, rất khó phòng trừ bằng thuốc hoá
học. Bài báo trình bày kết quả nghiên cứu
bước đầu phân lập, tuyển chọn nhằm bổ
sung vào quỹ gen vi sinh vật một số chủng
Bacillus có khả năng ức chế nấm Fusarium
oxysporum gây bệnh cây trồng cạn có thể
ứng dụng sản xuất phân bón sinh học phục
vụ sản xuất.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CU
1. Vật liệu nghiên cứu
- Các mu t, phân chung hoai mc,
mu cây trng thuc h cà, h bu bí, h
u ưc thu thp t mt s nơi như: Hà
Ni, Bc Giang, Thanh Hóa, Hà Tây, Hòa
Bình và Vĩnh Phúc.
- Chng nm bnh Fusarium
oxysporum gây bnh cho t, dưa hu, lc
ưc lưu gi trong b ging qu gen vi sinh
vt nông nghip ti B môn Vi sinh vt -
Vin Th nhưng Nông hóa.
- Ging lc L50 do Trung tâm u  -
Vin Cây lương thc và Cây thc phNm cung
cp. Ging dưa hu Hc M Nhân 224, t
cay F1 nhp ni t Hàn Quc do Trung tâm

Ging cây trng Trung ương 1 cung cp.
- Môi trưng phân lp, nuôi cy, nhân
ging vi sinh vt (VSV) như: King, MT1,
PDA, Czapeck, Ashby, Pikovskaya).
2. Phương pháp nghiên cứu
- Phân lp vi khuNn Bacillus: Các mu
t, cây và phân  ưc thu thp, bo qun 
nhit  phòng. Sau ó ly 10 gram mu
nghin mn cho vào bình tam giác cha 90 ml
nưc ct kh trùng, x lý  nhit  cao
80 - 100
0
C trong thi gian 5 - 10 phút. Cy
trên môi trưng King, thu nhn khuNn lc
ln u, tip tc làm sch nhiu ln  ưc
khuNn lc thun khit, th hot tính i
kháng và gi li các khuNn lc có hot tính
cao  làm các thí nghim tip theo.
- c im sinh hc ca các chng VSV
ưc xác nh theo các phương pháp nghiên
cu vi sinh vt hc thông thưng.
- Phân loi theo phương pháp truyn
thng, h thng BIOLOG và phương
pháp PCR.
- Phương pháp ánh giá hot tính i
kháng nm bnh theo 10TCN 867:2006.
- Phương pháp ánh giá trên cây trong
iu kin phòng thí nghim và nhà lưi.
Tin hành thí nghim trng cây trong nhà
lưi i vi ging lc L50, ging dưa hu

Hc M Nhân 224, ging t cay F1 trên nn
t kh trùng. Công thc thí nghim ưc lp
li 5 ln vi khay hoc r cha 8 - 10 kg t.
Các chng vi khuNn Bacillus và nm bnh
Fusarium oxysporum ưc nhim vào t, r
cây con hoc ht ã ny mm vi mt 
tương ương nhau t 10
8
CFU/g t. Tin
hành theo dõi trong thi gian thí nghim 45 -
60 ngày, ánh giá ch tiêu trng lưng khô
thân lá và xác nh t l cây bnh.
- S liu thí nghim ưc x lý theo
chương trình phn mm IRRISTAT 4.0.
III. KT QU VÀ THO LUN
Thu thp, phân lp, tuyn chn và ánh
giá hot tính sinh hc ca các chng
Bacillus i kháng nm bnh Fusarium
oxysporum.
ã thu thp ưc 103 mu t. Tin
hành phân lp, tuyn chn và xác nh ưc
mt s chng Bacillus có hot tính i
kháng nm bnh Fusarium oxysporum
tương i cao và n nh (Bng 1).
Bảng 1. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus có hoạt tính đối kháng
TT
Ký hiệu
chủng
Khả năng
tạo màng

Vòng đối kháng nấm Fusarium oxysporum (mm)
Gây bệnh trên ớt Gây bệnh trên lạc Gây bệnh trên dưa hấu
1 B17 + 20,5 18,0 21,0
2 M + 21,5 19,5 22,0
3 5.1 + 20,0 15,5 19,0
+: Có khả năng tạo màng
Số liệu Bảng 1 cho thấy các chủng
được lựa chọn đều có vòng đối kháng nấm
bệnh ở mức độ cao, đạt từ 15,5 đến 22 mm
và ổn định qua các lần đánh giá.

Hình 1. Vòng đối kháng nấm Fusarium
oxysporum của các chủng Bacillus
2. Đặc điểm sinh học, phân loại các
chủng vi khun Bacillus phân lập và
tuyển chọn
Đã xác định được các đặc điểm sinh học
của các chủng vi khuNn Bacillus đã được
phân lập và tuyển chọn. Kết quả được trình
bày trong Bảng 2 cho thấy đây là các chủng
có khả năng tạo bào tử sau 48 giờ nuôi cấy.
Bảng 2. Đặc điểm sinh học của các chủng vi khun Bacillus
Đặc điểm sinh hoc
Chủng vi khuẩn Bacillus phân lập và tuyển chọn
B17 M 5.1
Hình dạng tế bào Hình que Hình que Hình que
Hình dạng khuẩn lạc Khuẩn lạc màu vàng nhạt,
bề mặt nhăn, có vòng tròn
đồng tâm ở giữa
Khuẩn lạc khô, màu

trắng vàng, mép không
đều, nhân có vòng tròn

Khuẩn lạc màu trắng hơi
vàng, bề mặt khô, hơi
nhăn, mép không đều
Bào tử Xuất hiện nhiều sau 48 giờ
nuôi cấy
Xuất hiện nhiều sau 48
giờ nuôi cấy
Xuất hiện nhiều sau 48
giờ nuôi cấy
Phản ứng gram + + +
Nhiệt độ thích hợp 25 - 35
0
C 25 - 35
0
C 25 - 35
0
C
pH 6 - 8 6 - 8 6 - 8
Quan hệ với ôxy Hiếu khí Hiếu khí Hiếu khí
Khả năng phân giải casein Yếu Không Yếu
Khả năng phân giải kitin sau
48 giờ nuôi cấy (mm)
38 37 32
Phản ứng catalaza + + +
+: Có phản ứng
Trên cơ sở phương pháp định tên VSV
bằng kỹ thuật phân tử (16S ARN riboxom),

h thng nh danh BIOLOG và h thng
phân loi Bergey’s ã xác nh ưc tên
của các vi khuNn Bacillus phân lập, tuyển
chọn trong nghiên cứu (Bảng 3)
Bảng 3. Kết quả xác định tên và độ an toàn
sinh học của các chủng vi khun Bacillus
STT

Ký
hiệu
chủng

Tên vi sinh vật
Mức độ
an toàn
CNSH
1 B17 Bacillus polyfermenticus 1
2 M Bacillus velezensis 1
3 5.1 Bacillus subtilis 1
Để xác định độ an toàn của các chủng
Bacillus sau khi được phân lập và tuyển
chọn, chúng tôi đã so sánh các chủng VSV
nêu trên với danh mục vi khuNn trong phân
nhóm các tác nhân sinh học theo Định
hướng an toàn công nghệ sinh học của
CHLB Đức và Cộng đồng châu Âu
(Sichere Biotechnologie: Eingruppierung
biologischer Agenzen: Bakterien- 1998).
Kết quả (Bảng 3) cho thấy: 3 chủng vi
khuNn Bacillus được phân lập và tuyển

chọn thuộc nhóm các vi khuNn có độ an
toàn cao (độ nguy hiểm cấp 1). Theo
Hướng dẫn số 90/679/EWG ngày 26 tháng
11 năm 1990 của Cộng đồng châu Âu thì
VSV thuộc độ nguy hiểm cấp 1 là các
VSV không có khả năng gây bệnh đối với
người và động vật.
3. Một số điều kiện sinh trưởng và phát
triển của các chủng Bacillus
Tiến hành nuôi cấy các chủng phân lập
được trên môi trường dinh dưỡng, kết quả
cho thấy trên môi trường MT1, King, PDA
các chủng vi khuNn Bacillus phát triển mạnh
và hình thành các khuNn lạc điển hình, trên
môi trường Pikovskaya và Ashby chúng
không phát triển hoặc phát triển yếu (Bảng 4).
Bảng 4. Khả năng phát triển của khun lạc
vi khun Bacillus trên một số môi trường
nghiên cứu
Chủng
vi
khuẩn

Khả năng phát triển trên môi trường
MT1 PDA Ashby

King

Pikovskaya

B17 ++

++

-

++

+/-

M ++

++

-

++

+/-

5.1 ++

++

-

++

-

Ghi chú: ++: Phát triển mạnh, khuNn lạc điển hình.
+/-: Phát triển yếu.
+: Phát triển bình thường.
-: Không phát triển, khuNn lạc không điển hình.
Tiến hành xác định một số điều kiện
nhiệt độ cũng như pH ảnh hưởng đến sự
phát triển của các chủng vi khuNn phân lập
được. Trên cơ sở các kết quả thu được có
thể nhận thấy cả 3 chủng B17, M, 5.1 đều
có thể phát triển mạnh trong điều kiện pH
6,5 - 7 và nhiệt độ 25 - 30
0
C, không phát
triển hoặc phát triển yếu trong điều kiện pH
thấp 4 - 4,5. Chúng đều phát triển được ở
nhiệt độ cao 37
0
C, hoạt tính ức chế nấm
bệnh Fusarium oxysporum tương đối ổn
định trong các lần thí nghiệm (Bảng 5).
Bảng 5. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến
khả năng phát triển của các chủng vi khun
Bacillus
Chủng
vi
khuẩn

pH Nhiệt độ (
0
C)

4 - 4,5

6,5 - 7

8 - 8,5

25 30 37
B17 +/-

++

+

++

++

+

M +/-

++

+

++

++

+

5.1 - ++

+

++

++

+

Ghi chú: ++: Phát triển mạnh, khuNn lạc điển hình.
+/-: Phát triển yếu.
+: Phát triển bình thường.
-: Không phát triển, khuNn lạc không điển hình.
4. Đánh giá hoạt tính đối kháng nấm gây
bệnh Fusarium oxysporum của các chủng
vi khun Bacillus đối với một số cây
trồng
Kết quả đánh giá hoạt tính đối kháng
của các chủng Bacillus đối với nấm
Fusarium oxysporum trên cây ớt, dưa hấu
và lạc thể hiện trong Bảng 6.
Bảng 6. Ảnh hưởng của các chủng Bacillus đến sinh trưởng của một số cây trồng
TT

Công thức thí nghiệm
Cây lạc Cây ớt Cây dưa hấu
Trọng
lượng

khô thân
lá (g/cây)
Tỉ lệ cây
héo chết
(%)
Trọng
lượng
khô thân
lá (g/cây)
Tỉ lệ cây
héo chết
(%)
Trọng
lượng
khô thân
lá (g/cây)
Tỉ lệ cây
héo chết
(%)
1 Đối chứng (không nhiễm VSV) 2,965 0 2,614 0 1,795 0
2 Nhiễm nấm bệnh F. oxysporum - 92,7 - 96,6 - 98,0
3 Nhiễm chủng B17 3,181 0 2,562 0 1,767 0
4 Nhiễm chủng M 3,223 0 0 1,815 0
5 Nhiễm chủng 5.1 3,160 0 2,574 0 1,810 0
6 Nhiễm chủng B17+ F. oxysporum 3,040 7,3 2.735 7,0 1,837 8,2
7 Nhiễm chủng M + F. oxysporum 3,045 6,7 2,641 7,1 1,793 7,5
8 Nhiễm chủng 5.1+ F. oxysporum 3,145 8,3 2,581 7,4 1,799 7,8
CV% 13,3 7,2 1,3
LSD0,05 0,5401 0,335 0,39
Tỉ lệ cây bị bệnh héo rũ ở các công

thức nhiễm vi khuNn Bacillus B17, M, 5.1
đều thấp hơn so với đối chứng nhiễm nấm
bệnh Fusarium oxysporum và chỉ đạt từ 6,7
đến 8,3. Trọng lượng khô thân lá ở các
công thức nhiễm vi khuNn đối kháng đều
không sai khác so với công thức đối chứng
không nhiễm. Do vậy có thể nói nhiễm vi
sinh vật đối kháng B17, M, 5.1 không ảnh
hưởng đến sinh trưởng của cây.
IV. KT LUN VÀ  N GHN
1. Kết luận
ã phân lp, tuyn chn ưc 3 chng
vi khuNn Bacillus ó là chng B17, M và
5.1 có hot tính i kháng vi nm bnh
Fusarium oxysporum. Trình t gen rARN
16S ca chng 5.1 ging 100%
(1400/1400) vi on 16S ca vi khuNn
Bacillus subtilis. Trình t gen rARN 16S
ca chng M ging 99% (1333/1339) vi
on 16S ca vi khuNn Bacillus velezensis.
Chng B17 có 99,1% bazơ ging vi loài
Bacillus polyfermenticus. ây là nhng
chng có  an toàn cao thuc các vi sinh
vt không có kh năng gây bnh i vi
ngưi và ng vt.
Các chng vi khuNn Bacillus B17, M,
5.1 u phát trin mnh và hình thành các
khuNn lc in hình trên môi trưng: MT1,
King, PDA trên môi trưng Pikovskaya và
Ashby chúng không phát trin hoc phát

trin yu. C 3 chng u có th phát trin
mnh trong iu kin pH 6,5 - 7 và nhit 
25 - 30
0
C. Chúng không phát trin hoc
phát trin yu trong iu kin pH thp 4 -
4,5 nhưng phát trin ưc trong iu kin
nhit  cao 37
0
C.
Các chng vi khuNn Bacillus phân lp
u không nh hưng n sinh trưng ca
cây thí nghim. Trng lưng khô thân lá
ca cây lc, t và dưa hu  công thc
nhim vi khuNn Bacillus B17, M, 5.1 không
sai khác so vi i chng vi mc tin cy
cho phép. T l cây cht do ưc nhim vi
sinh vt u gim hơn so vi i chng.
2. Đề nghị
Vi khuNn Bacillus i kháng nm bnh
Fusarium oxysporum có tim năng ln trong
nghiên cu kim soát sinh hc các ngun
bnh trên cây trng, do ó cn ưc tip tc
nghiên cu thêm v cơ ch i kháng.
TÀI LIU THAM KHO
1 guyễn Lân Dũng, 1976. Thực tập vi
sinh vt. NXB. i hc và THCN, Hà
Ni.
2 guyễn Lân Dũng, 1978. Mt s
phương pháp nghiên cu vi sinh vt hc

tp 1, 2, 3. Nhà xut bn Khoa hc K
thut, Hà Ni.
3 Phạm Chí Thành, 1988. Phương pháp
thí nghim ng rung. Giáo trình,
Trưng i hc Nông nghip 1, Hà
Ni.
4 10TC 867: 2006. Vi sinh vt - Phương
pháp ánh giá hot tính i kháng nm
gây bnh vùng r cây trng cn.
gười phản biện: Bùi Huy Hiền
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
6