KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA DỊCH TREO TẾ BÀO TAXUS WALLICHIANA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ÐÀO TẠO
TRƯỜNG ÐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ
ĐẾN SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA DỊCH TREO
TẾ BÀO TAXUS WALLICHIANA

Ngành học:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện:

TRANG NGUYỄN ĐĂNG KHOA

Niên khóa:

2011 – 2013

Tháng 12 năm 2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ÐÀO TẠO
TRƯỜNG ÐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ
ĐẾN SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA DỊCH TREO
TẾ BÀO TAXUS WALLICHIANA

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. NGUYỄN TRUNG HẬU

TRANG NGUYỄN ĐĂNG KHOA

Tháng 12 năm 2013


LỜI CẢM ƠN
Thực tế, không có sự thành công nào mà không gắn liền với những hỗ trợ, giúp
đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác. Trong suốt thời gian học
tập ở Trường Đại học đến khi đi thực tập đến nay.Tôi đã nhận được rất nhiều sự quan
tâm, giúp đỡ của Quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè.
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, Tôi xin gửi đến Quý Thầy Cô trường Đại học
Nông Lâm Tp.HCM đã dùng những tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn
kiến thức quý báu cho Tôi trong suốt thời gian học tập ở trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS.Trần Thị Lệ Minh đã tận tình hướng dẫn em từ
những bước đầu tiên của của khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS.Nguyễn Trung Hậu, KS. Nguyễn Đức Minh
Hùng đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn trong suốt quá trình làm và hoàn thành đề tài.
Thầy đã cho Tôi những lời khuyên cũng như những lời động viên mà Tôi nghĩ rằng nó
đã giúp Tôi vượt qua những nỗi lo sợ của chính bản thân Tôi vàt thấy mình tự tin hơn
trong suốt quá trình làm đề tài.

Tôi xin cảm ơn Cô Thu Hồng, chị Tú Uyên, Chị Phước Huệ, Anh Viễn Phương,
Anh Cao Khải, Anh Anh Quân, bạn Bùi Loan vì mọi người luôn là những người bạn
thân thiết nhất, luôn chia sẻ niềm vui nỗi buồn, giúp đỡ, động viên Tôi trong những lúc
khó khăn.
Con xin cảm ơn Cha Mẹ đã sinh ra con và tạo điều kiện cho con có một cuộc
sống đủ đầy, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho con học tập đến ngày hôm nay. Cha Mẹ
đã cho con niềm hy vọng vào tương lai, gia đình đã cho con một tổ ấm hạnh phúc và là
chỗ dựa vững chắc cho con mỗi khi con gặp khó khăn.
Tôi xin cảm ơn những người bạn Xuân Danh, Văn Đẩu, Minh Trọng . . . đã luôn
đồng hành bên cạnh, ủng hộ, chia sẻ, giúp đỡ Tôi trong suốt 5 năm đại học.
Cuối cùng, Tôi xin kinh chúc tất cả Quý Thầy Cô và các bạn sức khỏe dồi dào và
thành công trong mọi linh vực của cuộc sống.
TP. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 11 năm 2013
Sinh viên
Trang Nguyễn Đăng Khoa
i


TÓM TẮT
Đề tài “Khảo sát sự ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự tăng trưởng của dịch
treo tế bào Taxus wallichiana” được thực hiện nhằm tìm ra công thức tối ưu nhất cho
sự tăng sinh khối tế bào khi nuôi trong môi trưởng lỏng lắc. Dịch treo tế bào Taxus
wallichiana được tạo ra từ mô sẹo có nguồn gốc từ thân non cây Thông đỏ trên môi
trường khóang B5 có bổ sung sung 2,4D 4 mg/L và kinetin 1 mg/L.
Nội dung đề tài gồm 5 thí nghiệm. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của
trọng lượng mô sẹo ban đầu đến sự tăng trưởng của dịch treo tế bào. Thí nghiệm 2:
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến sự tăng sinh khối của
dịch treo tế bào. Thí nghiệm 3: Tìm hiểu ảnh hưởng của hàm lượng saccharose đến sự
tăng trưởng của dịch treo tế bào. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng
casein hydrolysate đến sự tăng trưởng của dịch treo tế bào.

Kết quả thí nghiệm đã cho thấy sử dụng 3 g tế bào mô sẹo làm nguồn vật liệu ban
đầu cho vào 100 ml môi trường lỏng lắc, có hiệu quả nhất trong việc làm tăng nhanh
sinh khối dịch treo tế bào. Khả năng tăng sinh khối tế bào tốt nhất với môi trường B5
có bổ sung 2,4D 5 mg/L kết hợp với kinetin 0,5 mg/L. Sự tăng trưởng của dịch treo tế
bào có ưu thế hơn trong trong nghiệm thức có bổ sung saccharose 30 g/L so với 2
nghiệm thức còn lại là 20 g/L và 40 g/L. Nồng độ casein hydrolysate thích hợp nhất
cho chỉ số tăng trưởng của dịch treo tế bào là 750mg/L.
Từ khóa: dịch treo tế bào, Taxus wallichiana

ii


SUMMARY
The thesis entitled “Investigating the effects of plant growth elements on the
development of Taxus wallichiana cell suspension cultures” was carried out to identify
the optimal dosage of plant growth regulators and organic compounds for the growth
of cellular biomass. Cell suspension cultures were derived from calli of young stem of
Taxus wallichiana on B5 medium supplied with 4 mg/L 2,4D and 0.25mg/L kinetin.
This study consisted of five main experiments: experiment 1: surveyed the effect
of initial callus weight on the development of cell suspension cultures; experiment 2:
surveyed the growth regulator dosage on biomass of cell suspension cultures;
experiment 3: identified saccharose content required for the proper growth of
suspension culture; experiment 4: investigated the casein hydrolysate dose to the
growth of cell suspension culture; and experiment 5: surveyed the dynamic growth of
cell suspension culture in the combination of different nutrient formula.
We found that: Using 3g calli as initial material showed highest development of
cell suspension cultures. Highest biomass of suspension cells was observed in B5
growing medium added 5mg/L 2-4D and 0.5mg/L kinetin. The supplementation of
saccharose at 30g/L showed higher cell growth in the comparison with those in 20 or
40g/L- saccharose added media. The growth of cell suspension cultures showed

highest at 750mg/L casein hydrolate.
Key words: Taxus wallichiana, cell suspension

iii


MỤC LỤC
trang
LỜI CẢM ƠN................................................................................................................... i
TÓM TẮT........................................................................................................................ii
SUMMARY................................................................................................................... iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .....................................................................................vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ........................................................................................ viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ............................................................................................. ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1
1.2 Yêu cầu đề tài ............................................................................................................ 2
1.3 Nội dung thực hiện .................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1 Sơ lược về thực vật nhóm Taxus ............................................................................... 3
2.1.1 Nguồn gốc- lịch sử ................................................................................................. 3
2.1.2 Vị trí phân loại ........................................................................................................ 3
2.1.3 Thành phần hóa học................................................................................................ 6
2.2 Sơ lược về cây thông đỏ ........................................................................................... 6
2.2.1 Giá trị kinh tế và trong ngành y dược ..................................................................... 6
2.2.2 Đặc điểm hình thái.................................................................................................. 6
2.2.3 Đặc điểm sinh trưởng ............................................................................................. 7
2.3 Sơ lược về hợp chất Taxol ......................................................................................... 7
2.3.1 Công thức hóa học .................................................................................................. 7
2.3.2 Cơ chế hoạt động của Taxol ................................................................................... 8

2.4 Sơ lược về sản xuất Taxol ......................................................................................... 8
2.5 Sơ lược về nuôi cấy tế bào Taxus .............................................................................. 9
2.5.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến việc nuôi cấy tế bào Taxus ......................................... 9
2.5.1.1 Nguyên liệu nuôi cấy ........................................................................................... 9
2.5.1.2 Môi trường khoáng ............................................................................................ 10
2.5.1.3 Các chất điều hòa sinh trưởng ........................................................................... 10
2.5.1.4 Các yếu tố khác ................................................................................................. 10
2.5.2 Những ưu điểm của việc nuôi cấy tế bào Taxus để thu nhận Taxol..................... 10
iv


2.5.3. Sơ lược về quá trình nuôi cấy tế bào thực vật ..................................................... 11
2.5.3.1 Khái niệm .......................................................................................................... 11
2.5.3.2 Lịch sử nuôi cấy phát triển tế bào thực vật ....................................................... 11
2.5.4 Ưu điểm của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật .................................................... 13
2.6 Nuôi cấy tế bào thực vật để thu nhận hợp chất thứ cấp........................................... 13
2.7 Ảnh hưởng của một số yếu tố vật lý trên sự tăng trưởng của dịch treo bào Taxus . 14
2.7.1 Ánh sáng ............................................................................................................... 14
2.7.2 Nhiệt độ ................................................................................................................ 14
2.7.3 pH ......................................................................................................................... 14
2.7.4.Áp suất thẩm thấu ................................................................................................. 14
2.7.5 Môi trường nuôi cấy ............................................................................................. 15
2.7.6 Vai trò của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cây ........................................ 16
2.8 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về nuôi cấy tế bào cây thông đỏ thu nhận
hợp chất Taxol ............................................................................................................... 18
CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .......................................................... 20
NGHIÊN CỨU .............................................................................................................. 20
3.1 Đối tượng và địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 20
3.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu...................................................................... 20
3.2.1 Hóa chất ................................................................................................................ 20

3.2.2 Dụng cụ thiết bị .................................................................................................... 20
3.3 Điều kiện nghiên cứu............................................................................................... 21
3.4. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 21
3.4.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát................................................................................... 21
3.4.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm ............................................................................ 22
3.4.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát trọng lượng mô sẹo ban đầu đến sự tăng trưởng của
dịch treo tế bào .............................................................................................................. 22
Mục đích: Xác định công thức chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự tăng sinh khối dịch
treo tế bào. ....................................................................................................................... 22
3.4.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng casein hydrolysate đến sự
tăng trưởng của dịch treo tế bào .................................................................................... 23
3.5. Phương pháp phân tích thí nghiệm ......................................................................... 23
3.5.1 Phương pháp xác định sự tăng sinh khối tế bào ................................................... 23
v


3.5.2 Phương pháp phân tích số liệu thí nghiệm ........................................................... 24
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 25
4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát trọng lượng mô sẹo ban đầu đến sự tăng trưởng của dịch
treo tế bào ...................................................................................................................... 25
4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến sự
tăng trưởng của dịch treo bào (2,4D và kinetin)............................................................ 27
4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng saccharose trong môi trường
nuôi cấy lên sự tăng trưởng của dịch treo tế bào ........................................................... 29
4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng casein hydrolysate đến sự tăng
trưởng của dịch treo tế bào ............................................................................................ 30
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 32
5.1 Kết luận.................................................................................................................... 32
5.2 Đề nghị .................................................................................................................... 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 33

PHỤ LỤC

vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D

2,4-Dichlorophenol acetic aicd

B5

Gamborg, Miller và Ojima

BA

Benzyl adenine

BA

6-Benzylaminopurin

Cw

Coconut water (nước dừa)

ĐHSTTV

Điều hòa sinh trưởng thực vật

GA

Gibberellin

IAA

Indol – 3 acetic acid

IBA

Indol – 3 butyric acid

Ki

Kinetin

LV

Litvay

MS

Murashige – Skoog, 1962

NAA

α- naphthaleneneacetic acid

PVP

Polyvinyl pyrrolidone

SCV

(Cettled Cell Volume) thể tích tế bào lắng

TDZ

Thidiazuron

WPM

Llooyd - Mc Cown, 1980

vii


DANH MỤC BẢNG
trang
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của trọng lượng mô sẹo bao đầu đến khả năng tăng sinh khối tế
bào sau 06 tuần nuôi ........................................................................................................ 26 
Bảng 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D và kinetin 0,5mg/L
đến tăng sinh khối dịch treo bào sau 06 tuần nuôi cấy (bổ sung 30g/L saccharose)....... 28 
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D và kinetin 1mg/L
đến tăng sinh khối dịch treo bào sau 06 tuần nuôi cấy (bổ sung 30g/L saccharose)....... 28 
Bảng 4.4 Ảnh hưởng của hàm lượng saccharose trong môi trường nuôi cấy lên sự tăng
trưởng của dịch treo tế bào .............................................................................................. 29 
Bảng 4.5 Ảnh hưởng của hàm lượng Casein hydrolysate trong môi trường nuôi cấy
trên sự tăng trưởng của dịch treo tế bào .......................................................................... 31 

viii


DANH MỤC HÌNH ẢNH
trang
Hình 2.3. Các loại Taxus trên thế giới .............................................................................. 5
Hình 2.4 Taxol (paclitaxel) ............................................................................................... 8
Hình 3.1 Cây thông đỏ 2 năm tuổi được trồng tại vườn thực nghiệm dùng làm nguồn
vật liệu tạo mô sẹo ........................................................................................................... 20
Hình 3.2 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ............................................................................. 21
Hình 3.3 Nguồn mô sẹo Thông đỏ được sử dụng để làm mẫu thí nghiệm ..................... 22
Hình 4.1 (a) Tạo dịch treo tế bào từ nguồn mô sẹo ban đầu........................................... 25
(b) Hệ thống máy lắc và các bình nuôi tế bào ................................................................. 25
Hình 4.3 Cụm tế bào của dịch treo với môi trường B5 bổ sung 2,4D 4 mg/L và kinetin
1 mg/L.............................................................................................................................. 26
Hình 4.4 Sự tăng sinh khối tế bào sau 06 tuần nuôi ....................................................... 27
Hình 4.7 Dịch treo tế bào với môi trường B5 bổ sung 2,4D 5 mg/L và kinetin 0,5
mg/L................................................................................................................................. 29
Hình 4.9 Sự tăng trưởng của dịch treo tế bào ................................................................. 30
Hình 4.11 Ảnh hưởng của nồng độ casein hydrolysate đến sự tăng trưởng của dịch
treo tế bào ........................................................................................................................ 31

ix


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Bệnh ung thư hiện đang là căn bệnh gây tử vong với tỉ lệ cao nhất. Theo thống
kê của các cơ sở, tổ chức y tế Trung Ương của các nước, hàng năm trên thế giới có
hơn một triệu trường hợp mắc bệnh ung thư được phát hiện thêm, trong đó tỷ lệ tử

vong là hơn 65%. Ở Việt Nam, trong những năm gần đây số người mang bệnh ung thư
không ngừng tăng cao với một hệ số rất lớn, đồng thời tỉ lệ tử vong luôn rất cao, tới
hơn 75%. Theo báo cáo của Viện Ung Thư Quốc Gia Hoa Kỳ năm 2007, một trong
những nguyên nhân chính là do tình trạng thiếu thuốc đặc trị cho căn bệnh ung thư.
Taxol, một alkaloid diterpenoid được thu nhận từ các bộ phận của những cây
thuộc nhóm Taxus (trong đó có cây thông đỏ ở Việt Nam), được sử dụng làm thuốc trị
bệnh ung thư do có đặc tính cố định vi ống làm chu trình sinh trưởng của chính các tế
bào ung thư bị rối lọan, gây chết những tế bào này. Taxol đã được chính thức sử dụng
làm thuốc chữa bệnh ung thư vú, ung thư cổ tử cung từ năm 1992 và cho đến nay.
Taxol đã được sử dụng trong thành phần của hầu hết các lọai thuốc đặc trị cho phần
lớn các loại bệnh như ung thư phổi, ung thư dạ dày, ung thư ruột kết, ung thư cổ, đầu
hay ngay cả các khối u hắc tố ác tính khác.
Taxol có nhiều trong vỏ cây Taxus wallichiana Zucc (thông đỏ Himalaya) hiện
đang được bảo tồn tại tỉnh Lâm Đồng và tỉnh Khánh Hòa với một số lượng rất ít và
đang bị đe dọa tuyệt chủng do nạn chặt phá rừng. Taxus wallichiana là loại cây thuộc
nhóm tăng trưởng rất chậm, việc thu hoạch vỏ cây để chiết xuất Taxol sẽ làm cây chết,
gây thiệt hại cho nguồn tài nguyên rừng và ảnh hường đến môi trường sinh thái Quốc
gia. Việc nuôi cấy tế bào Taxus wallichiana để thu nhận hợp chất Taxol là một việc
làm hết sức cần thiết giúp khai thác được nguồn dược liệu quý hiếm này mà không làm
ảnh hưởng đến nguồn giống tự nhiên cũng như môi trường sinh thái của Việt Nam. Vì
vậy, đề tài: “Khảo sát sự ảnh hưởng của một số yếu tố đến tăng trưởng của dịch treo tế
bào Taxus wallichiana” đã được thực hiện.

1


1.2 Yêu cầu đề tài
Xác được môi trường thích hợp và trọng lượng mẫu ban đầu đưa vào nuôi nhằm
tối ưu hóa sự tăng trưởng của dịch treo tế bào thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc).
1.3 Nội dung thực hiện

 Xác định trọng lượng mô sẹo ban đầu có ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của
dịch treo bào.
 Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D và Kinetin có ảnh hưởng đến
sự tăng sinh khối của dịch treo bào.
 Xác định hàm lượng Saccharrose và Casein Hydrolyste trong môi trường nuôi
cấy có ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của dịch treo bào.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về thực vật nhóm Taxus
2.1.1 Nguồn gốc- lịch sử
Các loài thực vật thuộc nhóm Taxus đã được con người biết đến và sử dụng hàng
ngàn năm nay. Trước đây, người ta biết thông đỏ là loại cây có độc tính rất cao và rất
nguy hiểm. Đa số trường hợp ngộ độc ở súc vật (ngựa, bò) là do chúng ăn phải lá của
loại cây này. Một người có thể tử vong nếu ăn phải khoảng 150 lá thông đỏ. Đã có
những trường hợp tử vong do uống rượu vang ngâm trong thùng làm bằng gỗ thông
đỏ. Các biểu hiện nhiễm độc chủ yếu là giãn đồng tử, nôn mửa, loạn mạch, và tử vong
do ngừng tim. Ngày nay, các nhà khoa học đã xác định các độc tố đó chủ yếu là do các
hợp chất Taxine.
2.1.2 Vị trí phân loại
Giới

Plantae (thực vật)

Phân giới

Tracheobionta (thựcvật có mạch)

Nhóm

Spermatophyta (thực vật có hạt)

Phân nhóm

Coniferophyta (Thông)

Lớp

Pinopsida

Bộ

Taxales
Họ

Taxaceae (Thông đỏ)
Giống

Taxus

Thực vật thuộc nhóm Taxus có hơn 10 loài khác nhau phân bố ở nhiều vùng ôn
đới ẩm, vùng cận nhiệt đới, vùng nhiệt đới núi cao bắc bán cầu từ châu Mỹ, châu Âu
đến châu Á (hình 1, 2 và 3) gồm:
-

Taxus brevifoia (thông đỏ Thái Bình Dương)

-

Taxus baccata (thông đỏ châu Âu)

-

Taxus cuspidate (thông đỏ Nhật Bản)

-

Taxus chinesis (thông đỏ Trung Quốc)

-

Taxus globosa (thông đỏ Mexico)

-

Taxus marei (thông đỏ Đài Loan)

-

Taxus wallichiana (thông đỏ Himalaya)
3


-

Taxus sumatrana (thông đỏ Sumatra)

-

Taxus floridana (thông đỏ Florida)

-

Taxus canadensis (thông đỏ Canada)

Trong đó có 3 loài ở khu vực Trung và Đông Á. 3 – 4 loài ở phía bắc Châu Mỹ
và 2 loài ở Việt Nam là T. Chinensis (Thông đỏ lá ngắn) và T. wallichiana Zucc
(Thông đỏ lá dài).
Thông đỏ lá ngắn phân bố ở Trung Quốc, Ấn Độ, Malaysia, Việt Nam. Ở Việt
Nam, cây phân bố rãi rác ở 1 số vùng núi thuộc các tỉnh Lào Cai (Hoàng Liên Sơn),
Hà Tây (Ba Vì), Nghệ An (Quỳ Châu) độ cao: 900 – 1600m (Vũ Văn Dũng và ctv,
1996, Sách đỏ Việt Nam, 1996).
Thông đỏ lá dài phân bố ở Nepal (vùng núi Himalaya), phía bắc Mianma, Đông –
Nam Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Philippin, Việt Nam. Ở Việt Nam, loài này cũng
chỉ thấy ở một số vùng núi cao thuộc các tỉnh Lào Cai (Hoàng Liên Sơn), Khánh Hòa,
Lâm Đồng (Đà Lạt, Đơn Dương), Hà Giang (Thái An, Quản Bạ), độ cao phân bố từ
1400 đến 1600m.

4


a)

b)
Taxus baccata

d)

c)

e)

f)

Taxus chinesi

Taxus wallichiana

Hình 2.3. Các loại Taxus trên thế giới

a) Taxus brevifoia , d) Taxus chinesi
( />b) Taxus cuspidate ( />c) Taxus floridana , e) Taxus wallichiana
( />na_1955.html)

5


2.1.3 Thành phần hóa học
Trong các bộ phận của cây thuộc nhóm Taxus có rất nhiều hợp chất khác nhau.
Cấu tử chính và đặc trưng nhất của nhóm cây này là Diterpenoid. Các hợp chất này
thường gọi chung là Taxoid, trong đó Taxol và đồng phân Taxoltere là hai hợp chất
quan trọng này được tạo ra do sự chuyển hóa hợp chất 10-deacetybacctin III (một hợp
chất trung gian quan trọng có trong lá của các loại thực vật nhóm Taxus) (Nguyễn Hữu
Toàn Phan và cộng sự, 1998)
2.2 Sơ lược về cây thông đỏ
2.2.1 Giá trị kinh tế và trong ngành y dược
Thông đỏ là loài cây quý có giá trị kinh tế cao. Gỗ thông đỏ chắc, không cong
vênh, không nứt nẻ, chịu ẩm, chịu ướt, có thể dùng làm gỗ xây dựng và các đồ gia

dụng. Lá là loại thuốc dân gian được dùng từ lâu đời để trị hen suyễn, viêm phế quản,
chứng tiêu hóa không bình thường (Võ Văn Chi, 2004). Song thông đỏ cũng là loài
cây độc nổi tiếng, gia súc khi ăn phải loài cây này sẽ bị ngộ độc. Thông đỏ được xếp
vào nhóm thực vật hiếm ở Việt Nam (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1999; Trần Văn Tiến,
1999). Theo chuyên gia Nguyễn Đức Tố Lưu và Philip Ian Thomat, ở Việt Nam, thông
đỏ (Taxus wallichiana) là loài chỉ mới gặp ‘ở Lâm Đồng với số cây còn lại ước tính
chỉ trên 250 cây. Trong sách đỏ Việt Nam 2007, thông đỏ được xếp vào cấp VU – loài
sẽ nguy cấp, còn trong nghị định 32/2006/NĐ-CP của chính phủ, thông đỏ được xếp
vào nhóm IA – nghiêm cấm khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại (The Bee.net,
2011).
2.2.2 Đặc điểm hình thái
Cây Thông đỏ thuộc họ thanh tùng (Taxaceae). Phân bố ở các nước như Việt
Nam, Ấn Độ, Trung Quốc, Myanmar, Philippines, Indonesia, Nepa. Ở Việt nam,
Taxus wallichiana có mặt ở các tỉnh Lào Cai, Yên Bái, Sơn La, Nghệ An, Hà Tĩnh,
Phú Yên, Khánh Hòa và Lâm Đồng.
Cây thông đỏ thuộc loài đại mộc, cây mọc cao đến 30m. Vỏ ngoài có màu nâu đỏ
nhạt, hơi dày, bong vảy, thịt màu đỏ sẫm, giác có màu vàng trắng, lõi màu nâu đậm.
Thân cây nhẵn, cành xòe rộng, cành non màu lục, gốc cành mang chồi do những vảy
màu lục xếp lợp. Lá mọc cách xếp thành hai dãy mặt trên lá có màu lục, mặt dưới hơi
vàng. Lá dài khoảng 2,5 – 4 cm, rộng 2 – 4 cm, thót dần và nhọn phía đầu lá, lá mọc
tạo thành một góc 60 – 90o so với trục của cành mang lá. Thông đỏ hầu như không có
cuống lá và là cây đơn tính biệt chu. Hoa đơn tính khác gốc. Hoa đực thông đỏ gồm 8
– 10 nhị, mỗi nhị có 4 – 8 túi phấn mọc ở các nách lá vùng đĩnh cành và thường tạo
6


thành cụm màu vàng nhạt, hình trứng cuống ngắn. Hoa cái mọc riêng lẽ ở nhánh, phân
bố dọc theo suốt đọan cành. Hoa đực và hoa cái chỉ phân bố ở cành mới. Quả thông đỏ
có hình ô van hay hình trứng, có muống nhỏ, gốc quả được bọc bởi các vảy xếp thành
lớp tạo đế, quả non có màu nâu sẩm, quả chín có màu nâu nhạt hay màu đỏ nhạt, mềm,

nhiều nước, ngọt.
2.2.3 Đặc điểm sinh trưởng
Thông đỏ là loại cây có biên độ sinh thái hẹp, ưa bóng, thường phân bổ ở những
vùng núi cao có độ dốc trên 300 hay các vùng cận nhiệt đới ẩm trên đỉnh núi đá vôi ở
độ cao 1000- 2000 m. Điều kiện thổ nhưỡng, địa hình cũng đặc biệt: đất có thảm mục
dày, xốp có lớp mặt màu đen, ở tầng sâu có màu nâu trắng, đất có kết cấu tơi, có thành
phần cơ giới nhẹ trên bề mặt đất, có các khối đá Granit xen kẽ, rải rác tạo nên địa hình
lồi lõm chia cắt mạnh (Nguyễn Thượng Hiền, 1998).
Thông đỏ được xem là nhóm cây khỏa tử chịu bóng hoặc hơi ưa sáng, thường
mọc dưới tán một số cây gỗ thuộc các họ Lauraceae, Magnoliaceae, Fagaceae,
Illiaceae.
Thông đỏ thích hợp vùng khí hậu có hai mùa rõ rệt trong năm, mùa mưa kéo dài
từ tháng 4 đến tháng 10, lượng mưa trung bình từ 1600-1800 mm, nhiệt độ bình quân
200C, độ ẩm 80-90%.
Thông đỏ thường ra lá non vào mùa xuân và hè, hoa đực xuất hiện sớm hơn hoa
cái từ cuối mùa đông, đến giữa mùa xuân năm sau cả hoa đực và hoa cái mới nở.
Thông đỏ sinh trưởng rất chậm, tái sinh tự nhiên từ hạt rất khó. Tuy vậy, nếu trên đỉnh
núi có vài cây to, vẫn có thể tìm thấy cây con mọc từ hạt.
2.3 Sơ lược về hợp chất Taxol
2.3.1 Công thức hóa học
Công thức hóa học của taxol là C47H51NO14. Trọng lượng phân tử 853,9. Cấu tạo
gồm một nhân Taxane với bốn vòng oxatane ở vị trí C4, C5 và một ester ở vị trí C13.
Taxol có dạng tinh thể nhỏ, rất mịn, màu trắng, không tan trong nước chỉ tan
trong một số dung môi hữu cơ như cồn ethylic, methanol, chlorofrom, nhiệt độ nóng
chảy khỏang 216 – 2170C.

7


Hình 2.4 Taxol (paclitaxel)

( />
2.3.2 Cơ chế hoạt động của Taxol
Taxol và Taxotere chỉ hoạt động duy nhất trên hoạt động phân chia của tế bào
ung thư. Taxol chỉ tác động trên vi ống của tế bào ung thư nhưng không tác động lên
DNA tế bào như các lọai thuốc trị ung thư khác.
Trong tế bào, vi ống có nhiệm vụ kiểm soát vị trí của nhiễm sắc thể trong suốt
quá trình phân chia tế bào và luôn ở trạng thái cân bằng động (một đầu vi ống luôn
không ngừng trùng hợp (polimer hóa), một đầu luôn khử trùng hợp (khử polimer hóa),
tốc độ polimer hóa và khử polimer hóa gần như luôn bằng nhau, chỉ thay đổi khi có sự
biến đổi của trạng thái tế bào.
Khi có sự hiện diện Taxol trong tế bào, Taxol sẽ bám vào vách trong vi ống, kích
thích sự polimer hóa đồng thời ngăn cản sự khử polimer hóa đầu còn lại, làm mất tính
cân bằng của vi ống, phá vỡ chức năng thông thường của vi ống, ảnh hưởng trực tiếp
đến sự phân chia tế bào và gây chết tế bào.
2.4 Sơ lược về sản xuất Taxol
Taxol có nhiều trong các bộ phận của cây thông đỏ, đặc biệt là vỏ cây, lá và phần
lỏi thân cây. Tuy nhiên, việc tách chiết Taxol từ các bộ phận của này rất khó khăn,
hiệu suất rất thấp và vô cùng tốn kém. Đồng thời, vỏ cây Taxus rất mỏng và phát triển
rất chậm, việc khai thác vỏ cây sẽ làm chết cây. Hiện nay, có bốn phương pháp sản
xuất và thu nhận Taxol mà không cần phải khai thác vỏ cây Taxus:
+ Tổng hợp hóa học: tổng hợp nhân tạo nhưng giá thành quá cao, khó có thể
đưa ra thị trường.
+ Bán tổng hợp từ tiền chất tự nhiên: tổng hợp từ tiền chất Taxol 10 –
deacetylbaccatin III có trong lá cây Taxus.

8


+ Sản xuất từ nấm hay vi khuẩn: sản xuất Taxol từ vi sinh vật có nhiều hứa hẹn
nhưng chưa có kết quả khả quan.

+ Nuôi cấy tế bào Taxus: phương pháp này được xem là ổn định và hiệu quả
nhất hiện tại.
2.5 Sơ lược về nuôi cấy tế bào Taxus
Phần lớn các nghiên cứu về phương pháp nuôi cấy tế bào Taxus để thu nhận
Taxol cùng các hợp chất liên quan đều được thực hiện trên các loài Taxus wallichiana
(thông đỏ Himalaya), Taxus brevifoia (thông đỏ Thái Bình Dương), Taxus baccata
(thông đỏ Châu Âu), Taxus cuspidata (thông đỏ Nhật Bản), Taxus chinesis (thông đỏ
Trung Quốc).
Quá trình nuôi cấy tế bào Taxus gồm các giai đoạn như: nuôi mô sẹo, nuôi cấy
huyền phù tế bào, kích thích quá trình sinh tổng hợp Taxol. Mô sẹo được tạo ra từ mẫu
cấy được đặt trên môi trường thích hợp. Huyền phù tế bào được tạo ra bằng cách nuôi
cấy tế bào mô sẹo trong môi trường lỏng được đặt trên hệ thống lắc liên tục. Sự sinh
tổng hợp Taxol có thể xảy ra trực tiếp trong trong quá trình nuôi cấy tế bào hoặc gián
tiếp hay gián tiếp bằng cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy các tiền chất hoặc các
chất kích ứng tổng hợp taxol.
Việc nuôi cấy tế bào trong môi trường nhân tạo vẫn có thể buộc tế bào sản sinh
các hợp chất thứ cấp tương tự như trong cơ thể thực vật. Điều này được thực hiện dễ
dàng do mỗi tế bào thực vật đều là đơn vị cơ sở cấu trúc và chức năng độc lập, có khả
năng thực hiện mọi sự chuyển hóa, tăng trưởng, phát triển cũng như sinh sản của cơ
thể thực vật nói riêng và mọi sinh vật sống nói chung.
Việc thu nhận hợp chất thứ cấp đều có thể từ mô sẹo, từ huyền phù tế bào, từ các
cơ quan nuôi cấy hay từ lông rễ. Tuy nhiên, huyền phù tế bào là hệ thống nuôi cấy
thường được sử dụng nhất và đã được áp dụng thành công với rất nhiều loại thực vật
khác nhau nhằm sản xuất nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau cũng như nhân nhanh
giống các loại thực vật.
2.5.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến việc nuôi cấy tế bào Taxus
2.5.1.1 Nguyên liệu nuôi cấy
Nguyên liệu nuôi cấy hay mẫu nuôi cấy dùng tạo mô sẹo Taxus có thể là thân, lá,
lá non, thân non, phôi hợp tử, tử y, chồi, vỏ, trong đó, thân non là nguyên liệu thích
hợp nhất cho mục đích nuôi cấy tế bào Taxus để thu nhận Taxol.

9


2.5.1.2 Môi trường khoáng
Thành phần môi trường nuôi cấy đóng vai trò rất quan trọng trong việc tạo mô
sẹo hay tạo huyền phù tế bào. Trong các môi trường khoáng cơ bản như: môi trường
MS, môi trường B5 (Gamborg), môi trường SH, môi trường WPM, môi trường Vasin
& Went, môi trường Litva, môi trường Harvey (Vũ Văn Vụ, 1999)
2.5.1.3 Các chất điều hòa sinh trưởng
Thành phần, nồng độ cũng như tỉ lệ phối hợp giữa các chất điều hòa sinh trưởng
thực vật trong môi trường nuôi cấy có một vai trò quan trọng có thể ảnh hưởng trực
tiếp đến sự thành công hay thất bại của quá trình nuôi cấy tế bào. Auxin, Cytokinin,
đặc biệt 2,4-D, Kinetin, Benzyl adenin, acid gibberellic và một số các chất kích thích
sinh trưởng khác thường được sử dụng trong nuôi cấy tế bào Taxu(Vũ Văn Vụ, 1999)
2.5.1.4 Các yếu tố khác
Điều kiện nuôi cấy (ánh sáng, nhiệt độ, pH, áp suất thẩm thấu, nống độ khí O2,
CO2) cùng một số chất chống oxi hóa cũng là các yếu tố cần phải quan tâm đến khi
nuôi cấy tế bào Taxus (Lê Thị Thủy Tiên, 2007)
2.5.2 Những ưu điểm của việc nuôi cấy tế bào Taxus để thu nhận Taxol
Những thuận lợi của việc sản xuất Taxol bằng phương pháp nuôi cấy tế
bào Taxus:
+ Hệ thống tế bào cung cấp sản phẩm đồng nhất, liên tục, không bị hạn chế,
không phụ thuộc mùa màng, sâu – dịch bệnh, thiên tai.
+ Các hệ thống tế bào có thể được nuôi cấy trong các bình phản ứng sinh học
lớn (bioreactor) và có thể được cảm ứng để sản xuất một lượng lớn Taxol bằng cách
thay đổi điều kiện môi trường hay điều kiện nuôi cấy.
+ Các hệ thống tế bào có thể chỉ sản xuất một phổ các chất rất hạn chế so với
khi ly trích các chất từ các bộ phận khác, giúp ích cho việc tinh sạch sản phẩm về sau
được đơn giản hơn.

+ Hệ thống tế bào sẽ dễ dàng thích nghi với những thay đổi điều kiện môi
trường hơn so với cây ngoài tự nhiên.
+ Bên cạnh việc cung cấp Taxol, các hệ thống tế bào nuôi cấy cũng có thể cung
cấp nhiều tiền chất của Taxane, nhằm mục đích sử dụng để bán tổng hợp Taxol hay
bán tổng hợp các dẫn xuất khác của Taxol.

10


2.5.3. Sơ lược về quá trình nuôi cấy tế bào thực vật
2.5.3.1 Khái niệm
Nuôi cấy tế bào hay tế bào thực vật là thuật ngữ mô tả phương thức nuôi cấy các
bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa các môi trường thích hợp ở điều kiện vô
trùng. Môi trường các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các
hormone tăng trưởng (Vũ Văn Vụ, 1999)
2.5.3.2 Lịch sử nuôi cấy phát triển tế bào thực vật
Năm 1838, hai nhà sinh vật Đức Schleiden và Schwam đã nêu rõ mọi cơ thể sinh
vật phức tạp đều gồm những đơn vị nhỏ là các tế bào hợp thành. Các tế bào đã phân
hóa đều mang các thông tin di truyền có trong các tế bào đầu tiên như trứng sau khi
thụ tinh sẽ xây dựng thành toàn bộ cơ thể.
Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa giả thuyết của Schleiden và
Schwam vào thực nghiệm để chứng minh tính toàn thế của tế bào nhưng ông đã thất
bại trong nuôi cấy tế bào đã phân hóa từ cây một lá mầm.
Năm 1934, White nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cà chua
(Lycopersicum esculentum). Cũng trong thời gian này, ở Pháp đã tiến hành nuôi cấy tế
bào tượng tầng một số cây thân gỗ và biết được tác dụng kích thích sinh trưởng mô sẹo
của indole-3-acetic acid (IAA) và ba nhóm vitamin B do White đề nghị Thiamin (B1),
Pyridoxin (B6), Nicotinic acid. Việc phát hiện IAA, NAA, 2,4-D và kinetin cùng với
phát hiện vitamin và nước dừa là những bước tiến rất quan trọng trong giai đoạn thứ
hai của nuôi cấy mô thực vật.

Năm 1954, Skoog và Miller đã công bố kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của
Cytokinin và Auxin. Nếu Cytokinin/Auxin thấp ảnh hưởng đến sự sinh rễ và ngược lại
sẽ kích thích tạo chồi, mở đầu cho giai đoạn thứ ba cho lịch sử nuôi cấy tế bào thực
vật.
Từ năm 1945 đến 1954, kỹ thuật tách và nuôi tế bào đơn (các tế bào sống độc lập
không dính với các tế bào khác) đã phát triển. Nuir,Hidebrandt và Riker đã tách các tế
bào của mô sẹo thành một huyền phù các tế bào đơn bằng cách lắc dịch lỏng trên máy
lắc.
Năm 1956, Nickell đã nuôi cấy liên tục một huyền phù tế bào đơn cây đậu
(Phaseolus vulgaris).

11


Năm 1959, Melchers và Beckman đã nuôi cấy liên tục các tế bào đơn trong bình
có dung tích khá lớn bằng cách sục khí liên tục và thỉnh thoảng thu hoạch tế bào.
Năm 1960, Moerl phát hiện đỉnh sinh trưởng của địa lan (Cymbidium) khi đem
nuôi cấy sẽ hình thành các protocom. Khi cắt và nuôi cấy tiếp thì được các protocom
mới, khi để trong điều kiện thích hợp có thể phát triển thành cây con. Morel có thể
phục tráng tạo các dòng vô tính không bị nhiễm virus.
Cũng năm 1960, Bergman công bố phương pháp lọc đơn giản để thu được huyền
phù không có các tế bào dính cụm. Cùng với kỹ thuật gieo tế bào của Bergman, Các
tác giả khác đã chứng minh được tính toàn năng của tế bào thực vật trong việc tạo cây
hoàn chỉnh từ một tế bào.
Năm 1970, tác giả Nagata và Takebe thành công trong việc làm cho các tế bào
protolast tách từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia và tạo nên một quần thể tế
bào trong môi trường lỏng, các Protolast có khả năng dung hợp với nhau trong các
điều kiện nhất định và hấp thu các phân tử bên ngoài, các nhà khoa học nuôi cấy tế bào
thực vật hy vọng vào kỹ thuật này để nhân giống có kết quả hơn.
Năm 1965, Ledoux nói về biến tính của tế bào thực vật. Ông cho rằng các tế bào

đều có khả năng hấp thu DNA ngoại lai trong tế bào.
Năm 1967, nhóm Bourgin và Nisch lai tạo thành công cây đơn bội từ túi phấn
cây thuốc lá.
Từ năm 1980 đến 1992 các thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gene thực
vật được công bố. Ngoài phương pháp chuyển gene thông qua vi khuẩn, còn có các
phương pháp chuyển gene như kỹ thuật sử dụng xung điện (electroporation), kỹ thuật
vi tiêm (micro-injection), sử dụng siêu âm (ultrasonic gene transfer), súng bắn gene
(gene bombardment).
Sau năm 1975, Việt Nam bắt đầu chú trọng đến kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật
bằng các phương pháp cơ bản như nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy mô sẹo và Protolast tại
phòng thí nghiệm Viện Sinh Học, Viện Khoa Học Việt Nam do tiến sĩ Lê Thị Muội khởi
xướng.
Năm 1978 công bố thành công khi nuôi cấy bao phấn lúa và thuốc lá (Lê Thị
Muội và ctv, 1978: Lê Thị Xuân và ctv.,1978). Tiếp đó là thành công nuôi cấy
Protolast khoai tây (Lê Thị Muội và Nguyễn Đức Thành, 1978; Nguyễn Đức Thành và
Lê Thị Muôi, 1980, 1981).

12


Từ giữa 1980 đến nay, nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật phát triển
mạnh như chọn dòng tế bào kháng bệnh (Lê Bích Thủy và ctv., 1994), chọn dòng chịu
muối, chịu mất nước (Nguyễn Tường Vân và ctv., 1994; Định Thị Tòng và ctv, 1994).
Nuôi cấy bao phấn để tạo dòng thuần đã được ứng dụng nhiều tại Viện Công Nghệ
Sinh Học và Di Truyền Giống Nông Nghiệp. Nuôi cấy các cây dược liệu quí để bào
tồn nguồn gene và tạo các dòng tế bào có hàm lượng hoạt chất sinh học quan trọng
cũng phát triển (Phan Huy Bảo và Lê Thị Xuân, 1998; Phan thị Bảy và cộng sự., 1995;
Bùi Bá Bổng, 1995).
2.5.4 Ưu điểm của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật
Nuôi cấy tế bào thực vật trong điều kiện in vitro để sản xuất các hợp chất thứ cấp

có một số ưu điểm như sau:
- Các tế bào thực vật có thể được nuôi cấy trong các điều kiện nhân tạo mà không
phụ thuộc vào thời tiết, khí hậu và địa lý. Không cần thiết để vận chuyển và bảo quản
một số lượng lớn các nguyên liệu thô.
- Có thể kiểm soát chất lượng và hiệu suất của sản phẩm bằng cách loại bỏ các
trở ngại trong quá trình sản xuất như là chất lượng của nguyên liệu thô, sự đồng nhất
giữa các lô sản xuất và sự hư hỏng trong quá trình vận chuyển và bảo quản.
- Một số sản phẩm trao đổi chất được sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền phù có
chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh.
2.6 Nuôi cấy tế bào thực vật để thu nhận hợp chất thứ cấp
Dịch treo tế bào là một môi trường lỏng lắc liên tục, trong đó có sự hiện diện của
những tế bào cô lập hoặc những cụm nhỏ các tế bào có khả năng sinh phôi (có thể tái
sinh thành một thực vật nguyên vẹn). Dịch treo tế bào là nguồn nguyên liệu thích hợp
để sản xuất các hợp chất thứ cấp vì có thể tạo ra những hợp chất thứ cấp tương tự như
cây mẹ ở qui mô công nghiệp (Tong Jen-Fu, 1998).
Sự sản xuất và tích lũy các hợp chất thứ cấp là vấn đề then chốt trong nuôi cấy tế
bào.Vấn đề này phụ thuộc vào loài thực vật, dòng tế bào và loại sản phẩm sẽ được tạo
ra (Jaziri và cộng sự, 1996).
Một trong những giới hạn chính của việc sử dụng dịch treo tế bào để thu hợp chất
thứ cấp là môi trường tăng trưởng của dịch treo tế bào không phải là môi trường kích
thích sự sản xuất các hợp chất thứ cấp, trừ một số ít trường hợp đặc biệt. Sự cải tiến
môi trường và điều kiện nuôi cấy dịch treo tế bào đã mở ra những hứa hẹn cho phương

13


pháp nuôi cấy tế bào để thu sinh khối đồng thời với các sản phẩm thứ cấp có giá trị
(Sato và cộng sự, 1984).
2.7 Ảnh hưởng của một số yếu tố vật lý trên sự tăng trưởng của dịch treo bào
Taxus

2.7.1 Ánh sáng
Ánh sáng trắng có tác động cản sự tăng trưởng của dịch treo tế bào Taxus, làm
giảm trọng lượng tươi lẫn trọng lượng khô so với khi được nuôi trong môi trường tối
(Fett-Neto và cộng sự, 1987). Ánh sáng là yếu tố kích thích sự sinh tổng hợp các hợp
chất phenol, các hợp chất này sau khi được tạo ra có thể liên kết với một số enzyme
liên quan đến sự tăng trưởng của tế bào và ngăn cản sự hoạt động của các enzyme này.
2.7.2 Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng đáng kể đến sự tang trưởng của dịch treo tế bào Taxus và sự
tích lũy taxol trong tế bào. Tốc độ tăng trưởng của dịch treo tế bào Taxus cũng như
trọng lượng khô tế bào cao nhất khi nuôi ở nhiệt độ 240C nhưng giảm đáng kể khi
nhiệt độ tăng cao hơn. Sự gia tăng nhiệt độ sẽ tạo ra một sốc nhiệt ảnh hưởng đến các
hoạt động của tế bào (Lê Thị Thủy Tiên, 2007)
2.7.3 pH
pH của môi trường là yếu tố quan trọng duy trì trao đổi chất trong tế bào. Giá trị
của pH trong môi trường thích hợp cho sinnh trưởng và phát triển của nhiều loài thực
vật biến đổi từ 5,6 – 6,0. Theo Nguyễn Như Khanh (1990) khi pH thấp (môi trường
acid) sẽ hoạt hóa các enzyme hydrolaza dẫn đến sự kìm hãm sinh trưởng, kích thích sự
lão hóa tế bào. Ngoài ra, sự bền vững và hấp thu một loạt các chất phụ thuộc vào pH
môi trường. Sự hấp phụ sắt cũng thuộc vào pH môi trường.
2.7.4.Áp suất thẩm thấu
Nồng độ saccharose ảnh hưởng quan trọng đến sự tang trưởng của dịch treo tế
bào. Nồng độ saccharose cao gây ra những biến đổi về sinh lý lẫn hình thái của tế bào
Taxus trong dịch treo. Khi đó, cụm tế bào thường nhỏ hơn, tỷ lệ giữa trọng lượng khô
và trọng lượng tươi giảm, tế bào bị co nguyên sinh và chậm tang trường.
Nồng độ saccharose cao gây ra một stress áp suất thẩm thấu, ngăn cản các hoạt
động biến dưỡng của tế bào và kết quả là ngăn cản sự tăng trưởng của dịch treo tế bào.
Tốc độ tăng trưởng của dịch treo tế bào cao nhất ở nồng độ saccharose 20- 30 g/l và

14