KHẢO SÁT ẢNHHƯỞNG CỦABA KẾT HỢP NAA ĐẾN KHẢ NĂNG TẠOCHỒI VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ VẬT LÝ ĐẾNSỰ SINH TRƯỞNG CỦA CÂY CẨM CHƯỚNG (Dianthus caryophyllus L.) in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA BA KẾT HỢP NAA ĐẾN KHẢ NĂNG
TẠO CHỒI VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ VẬT LÝ ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG
CỦA CÂY CẨM CHƯỚNG (Dianthus caryophyllus L.) in vitro

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: VŨ THỊ KIM UYÊN

Niên khóa

: 2009 – 2013

Tháng 06/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA BA KẾT HỢP NAA ĐẾN KHẢ NĂNG
TẠO CHỒI VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ VẬT LÝ ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG
CỦA CÂY CẨM CHƯỚNG (Dianthus caryophyllus L.) in vitro

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

KS. TRỊNH VIỆT NGA

VŨ THỊ KIM UYÊN

ThS. NGUYỄN THỊ KIM LINH

Tháng 06/2013


LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô và cán bộ phòng Công nghệ Tế bào Thực vật,
Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận.
Em xin gởi lời biết ơn sâu sắc đến cô Trịnh Việt Nga và cô Nguyễn Thị Kim Linh
và đã tận tình hướng dẫn em thực hiện đề tài này.
Em xin gởi lời cám ơn chân thành tới anh Nguyễn Như Hiến đã góp ý, hướng dẫn
và giúp đỡ em rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Xin cám ơn cô Hằng, chị Vân, chị Bích và em Phi đã luôn quan tâm, lo lắng và
động viên em trong thời gian thực hiện khóa luận.
Em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm
Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng tất cả quý
thầy cô đã tạo mọi điều kiện học tập và truyền đạt kiến thức cho sinh viên chúng em.
Xin gởi lời cảm ơn đến tập thể lớp DH09SH, đặc biệt là hai bạn Kiều và Ngân đã

luôn ở bên em, hỗ trợ, giúp đỡ và động viên em trong suốt bốn năm qua.
Đặc biệt nhất, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ba, Má, anh chị em trong gia đình,
những người thân yêu nhất đã luôn quan tâm, chăm sóc và tạo mọi điều kiện tốt nhất
cho em trong suốt quá trình học tập tại trường, giúp em có thêm niềm tin và nghị lực
trong cuộc sống để em vững bước trên đường đời.
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2013
Vũ Thị Kim Uyên

i


TÓM TẮT
Cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.) là một trong những loài hoa cắt cành phổ biến
nhất trên thế giới. Cẩm chướng được nhiều người ưa chuộng vì vẻ đẹp, sự đa dạng về
sắc màu và mùi thơm nhẹ nhàng. Ngày nay, nhu cầu sử dụng hoa ngày một tăng cao,
vì thế, các phương pháp nhân giống cũng đang được tập trung nghiên cứu. Vi nhân
giống quang tự dưỡng là một phương pháp tiên tiến và hiệu quả trong sản xuất cây con
chất lượng cao. Bên cạnh đó, để cải thiện chất lượng cây giống và giảm giá thành sản
phẩm, các kỹ thuật nuôi cấy cũng không ngừng được cải tiến. Đề tài được thực hiện
nhằm khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố vật lý lên sự sinh trưởng của cây cẩm chướng
in vitro.
Trong thí nghiệm 1, chồi cây cẩm chướng in vitro được nuôi cấy trên môi trường
MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng và môi trường MS có bổ sung BA ở 4
mức nồng độ (1, 2, 3 và 4 mg l-1) kết hợp với NAA ở 2 mức nồng độ (0,2 và 1 mg l-1),
thí nghiệm này cung cấp nguồn mẫu cho 2 thí nghiệm tiếp theo. Trong thí nghiệm 2,
cây cẩm chướng in vitro được nuôi cấy trong erlen 325 ml ở điều kiện nuôi cấy dị
dưỡng và trong 4 kiểu bình nuôi cấy khác (erlen 325 ml, chai hình trụ 374 ml, erlen
450 ml và túi nylon 500 ml) ở điều kiện quang tự dưỡng. Trong thí nghiệm 3, cây cẩm
chướng in vitro được nuôi cấy dưới hệ thống 3 bóng Philips ánh sáng trắng ở điều kiện
nuôi cấy dị dưỡng và dưới 4 hệ thống chiếu sáng khác (ánh sáng tự nhiên, 3 bóng

Philips ánh sáng trắng, 3 bóng Osram ánh sáng trắng và 1 bóng Osram ánh sáng trắng
kết hợp 1 bóng Osram ánh sáng tím) ở điều kiện quang tự dưỡng.
Các kết quả thu được cho thấy môi trường thích hợp cho nhân chồi là MS bổ sung
30 g l-1 sucrose, 8 g l-1 agar, 2 mg l-1 BA và 1 mg l-1 NAA. Cây cẩm chướng in vitro
tăng trưởng tốt khi nuôi cấy trong túi nylon có gắn 2 màng trao đổi khí trên môi trường
không bổ sung đường. Dưới điều kiện nuôi cấy quang tự dưỡng, khả năng sinh trưởng
của các cây cẩm chướng in vitro cũng được cải thiện đáng kể khi sử dụng 3 bóng đèn
Osram ánh sáng trắng có cường độ ánh sáng là 75 ± 5 μmol m-2 s-1.

ii


SUMMARY
The thesis title: “Investigation on the effects of BA combined with NAA on shoot
multiplication and the effects of some physical factors on growth of in vitro carnation
(Dianthus caryophyllus L.)”.
Carnation (Dianthus caryophyllus L.) is one of the world’s most popular cut
flower. This flower is favored by its beauty, diversity of colors and soothing scents.
Nowadays, in order to meet the increasing demand for carnation plants, the research
forcus is on breeding methods. Photoautotrophic micropropagation is an advanced and
efficient method on the production of hight quality plants. Besides, in order to promote
the quality of plants and to reduce the product cost, the culture technique of plants
needs to be continuously improved. The purpose of the thesis was to investigate the
effects of some physical factors on the in vitro growth of carnation plants.
In the first experiment, shoots were cultured on MS medium had no growth
regulators and on MS medium supplemented with BA at four level of concentration
(1, 2, 3 and 4 mg l-1) combined with NAA at two of concentration (0,2 and 1 mg l-1),
this experiment provided materials for next two experiments. In the second
experiment, plants were cultured in 325 ml erlen in heterotrophic conditions and in
four different culture systems (325 ml erlen, 375 ml cylindrical vessel, 450 ml erlen

and 500 ml plastic bag) in photoautotrophic conditions. In the third experiment, plants
were cultured under three tubes of white light Philips in heterotrophic culture
conditions and under four different lighting systems (natural light, three tubes of white
light Philips, three tubes of white light Osram and one tube of white light Osram
combined with one tube of violet light Osram) in photoautotrophic conditions.
The results shows that the suitable medium for shoot multiplication is MS
supplemented with 30 g l-1 sucrose, 8 g l-1 agar, 2 mg l-1 BA and 1 mg l-1 NAA. Plants
grew well on the sugar – free medium in nylon bags, attached by two microporous
filters. The plant growth was significantly promoted by the use of 3 tubes of white
light Osram at light intensity of 75 ± 5 μmol m-2 s-1 under photoautotrophic condition.
Keywords: carnation, photoautotrophic, microporous filter, light intensity, shoot
multiplication.
iii


MỤC LỤC

Trang
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ i
Tóm tắt .............................................................................................................................ii
Summary........................................................................................................................ iii
Mục lục ........................................................................................................................... vi
Danh sách các chữ viết tắt .............................................................................................. vi
Danh sách các bảng .......................................................................................................vii
Danh sách các hình ...................................................................................................... viii
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2. Yêu cầu của đề tài..................................................................................................... 2
1.3. Nội dung thực hiện ................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3

2.1. Giới thiệu về cây cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.) ..................................... 3
2.1.1. Vị trí phân loại của cây cẩm chướng ..................................................................... 3
2.1.2. Nguồn gốc và phân bố của cây cẩm chướng ......................................................... 3
2.1.3. Đặc điểm hình thái và sinh thái của cây cẩm chướng ........................................... 3
2.1.3.1. Đặc điểm hình thái của cây cẩm chướng ............................................................ 3
2.1.3.2. Đặc điểm sinh thái của cây cẩm chướng ............................................................ 4
2.1.4. Giá trị kinh tế của hoa cẩm chướng ....................................................................... 5
2.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................................................... 6
2.2.1. Khái niệm .............................................................................................................. 6
2.2.2. Thuận lợi của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................ 6
2.2.3. Quy trình nhân giống vô tính in vitro .................................................................... 7
2.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro ..................................................... 8
2.2.4.1. Mẫu nuôi cấy ...................................................................................................... 8
2.2.4.2. Môi trường nuôi cấy ........................................................................................... 8
2.2.4.3. Điều kiện nuôi cấy .............................................................................................. 8
2.3. Chất điều hòa sinh trưởng thực vật........................................................................... 9
iv


2.4. Các phương pháp nhân giống vô tính in vitro ........................................................ 12
2.4.1. Phương pháp vi nhân giống truyền thống ........................................................... 12
2.4.2. Phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng ...................................................... 13
2.5. Vai trò của ánh sáng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ........................................ 14
2.5.1. Ảnh hưởng của ánh sáng đối với sự sinh trưởng và phát triển của thực vật ....... 15
2.5.2. Tầm quan trọng của ánh sáng trong vi nhân giống ............................................. 15
2.6. Giới thiệu một số kiểu bình nuôi cấy trên thế giới ................................................. 16
2.7. Một số công trình nghiên cứu liên quan đến đề tài ................................................ 16
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 18
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 18
3.2. Vật liệu ................................................................................................................... 18

3.2.1. Mẫu cấy thí nghiệm ............................................................................................. 18
3.2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ............................................................................ 19
3.2.3. Môi trường sử dụng cho thí nghiệm .................................................................... 19
3.3. Phương pháp thí nghiệm......................................................................................... 21
3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp NAA đến khả năng tạo chồi ....... 21
3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của các kiểu bình nuôi cấy đến sự sinh trưởng .................. 22
3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của hệ thống ánh sáng đến sự sinh trưởng ......................... 23
3.4. Cách tính số liệu ..................................................................................................... 24
3.5. Phân tích thống kê .................................................................................................. 25
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 26
4.1. Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng tạo chồi ................................ 26
4.2. Ảnh hưởng của các kiểu bình nuôi cấy đến sự sinh trưởng ................................... 29
4.3. Ảnh hưởng của hệ thống ánh sáng đến sự sinh trưởng .......................................... 35
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 42
5.1. Kết luận................................................................................................................... 42
5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 43
PHỤ LỤC

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BA

:

6-benzyladenine

CĐAS

:

Cường độ ánh sáng

Ctv

:

Cộng tác viên

EDTA

:

Ethylene diamine tetra acetate

GTTLK

:

Gia tăng trọng lượng khô

GTTLT

:

Gia tăng trọng lượng tươi

IAA

:

indole-3-acetic acid

IBA

:

indole-3-butyric acid

LED

:

Light Emitting Diote

MS

:

Murashige and Skoog (1962)

NAA

:

α-naphthaleneacetic acid

NT

:

Nghiệm thức

RGR

:

Relative Growth Rate

Rubisco

:

Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase oxygenase

V

:

Thể tích

2,4-D

:

2,4-dichlorophenoxyacetic acid

vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm của các môi trường có bổ sung BA và NAA ................... 21
Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm của các kiểu bình nuôi cấy ảnh hưởng đến ...................... 22
Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm của các hệ thống chiếu sáng ảnh hưởng đến ................... 23
Bảng 3.4 Tiến trình tăng cường độ ánh sáng của thí nghiệm ...................................... 23
Bảng 4.1 Số chồi, chiều cao chồi và hệ số nhân chồi cẩm chướng in vitro ................ 26
Bảng 4.2 Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây cẩm chướng in vitro................................. 29
Bảng 4.3 Sự khác biệt của các kiểu bình nuôi cấy ...................................................... 31
Bảng 4.4 Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây cẩm chướng in vitro................................. 32
Bảng 4.5 Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây cẩm chướng in vitro................................. 33
Bảng 4.6 Tốc độ tăng trưởng tương đối/ngày của cây cẩm chướng in vitro ............... 34
Bảng 4.7 Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây cẩm chướng in vitro................................. 36
Bảng 4.8 Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây cẩm chướng in vitro................................. 37
Bảng 4.9 Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây cẩm chướng in vitro .................................. 38
Bảng 4.10 Cường độ ánh sáng của giàn nuôi cấy ......................................................... 39
Bảng 4.11 Tốc độ tăng trưởng tương đối/ngày của cây cẩm chướng in vitro .............. 41

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Một số hình ảnh về loài cẩm chướng Dianthus caryophyllus L. .................... 5
Hình 3.1 Mẫu cấy dùng cho thí nghiệm........................................................................ 18
Hình 3.2 Các loại bóng đèn sử dụng trong thí nghiệm ................................................. 19
Hình 3.3 Các kiểu bình nuôi cấy sử dụng trong thí nghiệm ......................................... 20
Hình 4.1 Chồi cây cẩm chướng nuôi cấy trên môi trường MS ..................................... 28

Hình 4.2 Cây cẩm chướng in vitro nuôi cấy trong các kiểu bình cấy .......................... 29
Hình 4.3 Cây cẩm chướng in vitro nuôi cấy trong các kiểu bình cấy .......................... 32
Hình 4.4 Cây cẩm chướng in vitro nuôi cấy dưới các hệ thống chiếu sáng ................. 35
Hình 4.5 Cây cẩm chướng in vitro nuôi cấy dưới các hệ thống chiếu sáng ................. 38

viii


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, cùng với sự phát triển nhanh chóng của xã hội, nhu cầu sử dụng hoa để
trang trí trở thành một phần không thể thiếu trong cuộc sống. Hoa tươi trở thành một
loại sản phẩm mang giá trị kinh tế cao và chiếm vị trí đặc biệt trong thị trường sản
phẩm hàng hóa nông nghiệp thế giới. Trong đó, hoa cẩm chướng là một trong những
loại hoa cắt cành có giá trị thương mại hàng đầu trên thị trường hoa thế giới và Việt Nam.
Hiện nay, trên thế giới hoa cẩm chướng có rất nhiều chủng loại và màu sắc khác nhau.
Để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ hoa của người tiêu dùng, các phương pháp nhân giống
cũng không ngừng được cải tiến. Phương pháp nhân giống vô tính in vitro rất có hiệu
quả trong việc tạo ra giống sạch bệnh có chất lượng đồng đều và đồng nhất về mặt di
truyền. Nuôi cấy mô truyền thống không quan tâm đến các yếu tố môi trường, và
thường dựa nhiều vào các thành phần hóa học như đường, vitamin, các chất điều hòa
sinh trưởng và một số chất khác. Hơn nữa, do đòi hỏi điều kiện vô trùng tuyệt đối nên
làm tăng chi phí sản xuất dẫn đến tăng giá thành sản phẩm. Mặt khác, tỷ lệ sống của
cây in vitro khi đưa ra vườn ươm thấp. Vì thế, vi nhân giống quang tự dưỡng là
phương pháp thích hợp để khắc phục những hạn chế trên.
Phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng có nhiều ưu điểm hơn phương pháp
truyền thống. Nó thúc đẩy sự tăng trưởng của cây in vitro, rút ngắn thời gian nuôi cấy
và do đó làm hạ giá thành cây in vitro.
Song song với những nghiên cứu về quang tự dưỡng, hệ thống nuôi cấy cũng
không ngừng được cải tiến để nâng cao chất lượng giống cây in vitro và giảm giá

thành sản phẩm. Nghiên cứu về hệ thống các kiểu bình nuôi cấy thích hợp như: bình
tam giác, bình thủy tinh hình trụ, hộp nhựa, túi nylon và một số kiểu bình khác cũng
đang rất được quan tâm nghiên cứu.
Trong thực tế, để sản xuất cây giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực
vật, nhất thiết phải sử dụng năng lượng nhân tạo bằng đèn huỳnh quang – một loại đèn
được sử dụng rộng rãi trong cuộc sống hằng ngày của con người. Ánh sáng đèn huỳnh
quang có những vùng bước sóng ngắn không có lợi cho sinh trưởng và phát triển của
thực vật. Trong thời gian gần đây, nhiều nghiên cứu đã quan tâm sử dụng các loại ánh
1


sáng nhân tạo như: đèn compact, đèn LED tiết kiệm điện trong nuôi cấy mô và nhiều
ưu điểm khác nữa như: kích thước nhỏ, gọn, tuổi thọ cao, vùng quang phổ dễ kiểm
soát, ít tỏa nhiệt.
Nâng cao chất lượng cây giống đồng thời tiết kiệm chi phí, giảm giá thành sản xuất
là mục tiêu hàng đầu mà các phòng thí nghiệm vi nhân giống đang hướng tới.
Từ những yêu cầu đó, tôi tiến hành đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp
NAA đến khả năng tạo chồi và một số yếu tố vật lý đến sự sinh trưởng của cây cẩm
chướng (Dianthus caryophyllus L.) in vitro”.
1.2. Yêu cầu của đề tài
Xác định được nồng độ BA kết hợp NAA thích hợp cho nhân chồi cẩm chướng
in vitro, đánh giá ảnh hưởng của một số kiểu bình nuôi cấy và một số hệ thống chiếu
sáng đến sự sinh trưởng của cây cẩm chướng in vitro.
1.3. Nội dung thực hiện
Nuôi cấy chồi cây cẩm chướng trên môi trường MS không bổ sung chất điều hòa
sinh trưởng và môi trường MS có bổ sung BA ở 4 nồng độ (1, 2, 3 và 4 mg/l) kết hợp
NAA ở 2 nồng độ (0,2 và 1 mg/l) để xác định ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến
khả năng tạo chồi cẩm chướng in vitro, làm nguồn nguyên liệu cho các quá trình nhân
giống tiếp theo.
Nuôi cấy cây cẩm chướng trong erlen 325 ml ở điều kiện nuôi cấy dị dưỡng và

trong 4 kiểu bình nuôi cấy (erlen 325 ml, chai hình trụ 375 ml, erlen 450 ml và túi
nylon 500 ml) ở điều kiện quang tự dưỡng nhằm xác định được ảnh hưởng của các
kiểu bình nuôi cấy đến sự sinh trưởng của cây in vitro.
Nuôi cấy cây cẩm chướng dưới hệ thống 3 tuýp Philips ánh sáng trắng ở điều kiện
nuôi cấy dị dưỡng và dưới 4 hệ thống ánh sáng (ánh sáng tự nhiên, 3 bóng Philips ánh
sáng trắng, 3 bóng Osram ánh sáng trắng, 1 bóng Osram ánh sáng trắng kết hợp 1 bóng
Osram ánh sáng tím) ở điều kiện quang tự dưỡng nhằm xác định được ảnh hưởng của
các hệ thống chiếu sáng đến sự sinh trưởng của cây in vitro.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về cây cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.)
2.1.1. Vị trí phân loại
Cẩm chướng Dianthus caryophyllus L. thuộc:
Ngành

: Magnoliophyta

Lớp

: Magnoliopsida

Bộ

: Caryophyllales

Họ

: Caryophyllaceae

Chi

: Dianthus

Loài

: Dianthus caryophyllus L.

2.1.2. Nguồn gốc và phân bố của cây cẩm chướng
Dianthus caryophyllus L. có nguồn gốc ở phía Bắc Địa Trung Hải, được trồng chủ
yếu ở các nước Italia, Mehico, Hà Lan, Colombia, Nhật Bản, Isarel, Mỹ và Trung
Quốc, v.v. Dianthus caryophyllus L. được du nhập vào Việt Nam nửa đầu thế kỷ XX.
Tất cả các giống hoa hiện có ở nước ta đều được nhập từ Hà Lan, Pháp, Đức, Italia,
Trung Quốc, Thái Lan. Loài hoa này được nhiều người ưa thích vì mùi thơm nhẹ
nhàng, hình dáng và màu sắc đẹp. Hoa thường được dùng để cắm lọ, cắm lẵng. Cây
được trồng ở bồn hoa, chậu kiểng, trồng trong vườn hoa. Hiện nay, các công ty giống
trên khắp thế giới đã tạo ra hàng trăm chủng loại hoa có màu sắc khác nhau và có khả
năng kháng bệnh.
2.1.3. Đặc điểm hình thái và sinh thái của cây cẩm chướng
2.1.3.1. Đặc điểm hình thái của cây cẩm chướng
Cẩm chướng là loài cây thân thảo, nhỏ và mảnh mai, cao từ 0,5 đến 1,0 m. Đốt
thân rất dễ gãy. Mỗi đốt có một mắt, trên mắt mang lá và mầm nách. Cẩm chướng
thường có thân màu xanh nhạt, bao phủ bởi một lớp phấn trắng. Phấn có tác dụng quan
trọng trong chống thoát hơi nước và bảo vệ cây khỏi bị sâu bệnh hại.
Cẩm chướng có lá kép, mọc từ các đốt thân. Lá dài, mép không có răng cưa, phần
trên hơi uốn cong, mọc đối xứng. Phiến lá dày, hình lưỡi mác, gốc lá thành bẹ không
cuống. Mặt lá nhẵn, không có độ bóng. Trên mặt lá có phủ một lớp phấn trắng, mỏng
và mịn. Lớp phấn có tác dụng làm giảm bốc hơi nước.

3


Cẩm chướng có bộ rễ chùm và phát triển mạnh. Chiều dài của rễ từ 15 đến 20 cm.
Khi vun gốc cẩm chướng sẽ ra rễ phụ ở các đốt thân sát gốc. Rễ phụ cùng với các rễ
chính tạo thành bộ rễ khỏe mạnh để giữ cây, hút nước và các chất dinh dưỡng nuôi cây.
Hoa có hai dạng là hoa đơn và hoa kép, mọc 2 – 3 chùm trên cành hoặc mọc đơn,
hình tán có mùi thơm. Hoa có 4 lá bắc, đài hoa hình ống, tràng hoa hình quạt, phía
trong nhăn nheo. Hoa đơn sắc như: hồng, đỏ, tím, vàng, da cam, trắng, v.v. và nhiều
loài mang nhiều màu sắc khác nhau trên cùng một hoa. Cánh hoa không có sọc đồng
tâm, bìa ngoài nguyên hay có răng cạn nhỏ. Hoa cẩm chướng đẹp tự nhiên, có mùi
thơm thoang thoảng, nhẹ nhàng. Nụ hoa có đường kính khoảng 2 – 2,5 cm. Hoa nở
hoàn toàn có đường kính khoảng 6 – 7 cm.
2.1.3.2. Đặc điểm về sinh thái của cây cẩm chướng
Cẩm chướng được trồng ở những nơi mát mẻ, nhiệt độ thích hợp khoảng 17 – 25oC
(ban ngày), nhiệt độ tối thích là 19 – 21oC. Nhiệt độ quá thấp (dưới 10oC) hay quá cao
(trên 40oC) đều ảnh hưởng không tốt đến sự sinh trưởng và phát triển của cây.
Cẩm chướng là loài ưa sáng, ánh sáng thích hợp khoảng 1500 – 3000 lux (ban ngày),
ánh sáng tối thích là 2000 – 2500 lux. Trong quá trình phát triển cơ quan sinh sản, nếu
cường độ ánh sáng cao (trên 3000 lux) cây sẽ ra hoa sớm. Nếu cường độ ánh sáng thấp
(dưới 1000 lux) quá trình ra hoa sẽ chậm lại.
Cẩm chướng thích nghi với môi trường không khí tương đối khô, độ ẩm thích hợp
khoảng 60 – 70% (ngày và đêm), tốt nhất là 70% (ngày và đêm). Độ ẩm tương đối của
không khí và đất ảnh hưởng đến sự quang hợp và hô hấp của cây cẩm chướng. Nếu độ
ẩm ổn định sẽ tạo điều kiện cho cây hút dinh dưỡng thuận lợi, cây sinh trưởng tốt,
năng suất và phẩm chất hoa cao.
Cẩm chướng ưa đất thịt, nhiều mùn, tơi xốp và thoát nước. Cây hoa cẩm chướng
phát triển tốt ở đất có pH khoảng 6 – 7, các kim loại nặng trong đất ít. Cẩm chướng có
nhu cầu về phân bón rất cao. Cây trồng thiếu phân bị còi cọc, hoa nhỏ, màu sắc hoa
nhạt, dễ bị sâu bệnh. Bón phân không đủ và không hợp lý sẽ không điều khiển được

thời gian ra hoa. Các yếu tố dinh dưỡng như: N, K, Ca, B có ý nghĩa hết sức quan
trọng đối với sự sinh trưởng, phát triển, năng suất và chất lượng của hoa cẩm chướng.
Cẩm chướng bị các loài vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, virus) gây nên các bệnh như:
bệnh khô héo, đốm lá, xoăn tràng hoa, đốm hoa, thối hoa, thối cành, thối nhụy, thối rễ,
bệnh khô vằn, khảm lá, đốm vòng.
4


2.1.4. Giá trị kinh tế của hoa cẩm chướng
Sản phẩm hoa và cây cảnh có vai trò quan trọng trong cuộc sống khi thu nhập và
nhu cầu thẩm mỹ của con người ngày càng cao. Điều đó làm cho sản xuất và kinh
doanh hoa kiểng trên thế giới ngày càng phát triển. Hoa cẩm chướng được nhiều người
ưa chuộng vì có mùi thơm dễ chịu và đa dạng về màu sắc như: hồng, vàng, trắng, cam,
kem, vàng viền đỏ, hồng viền tím, đỏ viền trắng, hồng viền trắng.
Cây hoa cẩm chướng được trồng rộng rãi ở châu Âu, châu Á, châu Phi, châu Mỹ.
Một số nước trồng nhiều hoa cẩm chướng như Colombia, có các cánh đồng trồng hoa
cẩm chướng bao quanh Bogota (sản phẩm chủ yếu được xuất sang Mỹ). Trại trồng hoa
lớn nhất Kenya rộng 250 ha chủ yếu trồng hoa cẩm chướng. Hoa cẩm chướng cũng
được trồng nhiều ở Trung Quốc, Ecudor, Malaysia, Thái Lan.
Ở nước ta, hoa cẩm chướng được trồng nhiều ở Hà Nội, Hải Phòng, Đà Lạt, thành
phố Hồ Chí Minh, Bến Tre, Đồng Thá. Theo đánh giá, cẩm chướng là loại hoa có
nhiều triển vọng trong sản xuất cũng như xuất khẩu ở nước ta.

Hình 2.1 Một số hình ảnh về loài cẩm chướng Dianthus caryophyllus L.
( />5


2.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.1. Khái niệm
Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay còn gọi là nuôi cấy in vitro là công cụ cần thiết

trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành công nghệ sinh học.
Nhờ áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn
gấp nhiều lần so với tự nhiên. Do đó tạo ra hàng loạt cá thể mới đồng nhất, giữ nguyên
tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa giống mới vào sản xuất.
Hơn nữa, dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản nhiều giống cây
trồng quý hiếm.
Nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô bắt đầu bằng một cơ quan, bộ phận,
mô hay tế bào thực vật vô trùng đặt vào môi trường dinh dưỡng thích hợp. Chồi mới
hay mô sẹo mà mẫu cấy này tạo ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để
nhân giống.
2.2.2. Thuận lợi của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nhân giống vô tính in vitro nhanh hơn nhân giống vô tính in vivo; có thể tạo được
một số loài thực vật mà không thể tiến hành in vivo do nhân giống in vitro có thể cảm
ứng được sự trẻ hóa của mô; sự tăng trưởng của những cây nhân giống vô tính in vitro
thường nhanh hơn những cây được nhân giống vô tính in vivo; việc nhân giống cây in
vitro tạo được những cây sạch bệnh do có sự chọn lọc các đối tượng sạch bệnh để đưa
vào nuôi cấy, đồng thời cũng có thể xử lý mẫu cấy của các cây có mang mầm bệnh
trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy; nuôi cấy in vitro chỉ sử dụng những mẫu cấy
ban đầu rất nhỏ nên có thể chọn lọc kỹ lưỡng và dễ dàng; việc nhân giống in vitro giúp
làm giảm không gian sử dụng so với nhân giống in vivo và giảm các chi phí về năng
lượng đối với trường hợp các loài cây cần được nhân giống trong nhà kính; do cây in
vitro được nuôi cấy trong điều kiện hoàn toàn thích hợp (nguồn dinh dưỡng và điều
kiện môi trường), do đó có thể sản xuất cây con quanh năm; có thể sử dụng cây nhân
giống in vitro để làm cây mẹ cho các bước nhân giống kế tiếp; có thể tạo ra các đột
biến điểm trong quá trình nuôi cấy; phương pháp nhân giống in vitro đặc biệt hữu
dụng để tạo ra các ngân hàng gen; các tế bào trần và huyền phù tế bào là đối tượng hữu
dụng trong việc lai soma và một số loại cây bị mất khả năng sinh sản hữu tính có thể
được duy trì và nhân giống bằng phương pháp nhân giống in vitro.

6

2.2.3. Quy trình nhân giống vô tính in vitro
Quy trình nhân giống vô tính in vitro được thực hiện theo 5 giai đoạn sau:
™ Giai đoạn 1: Khử trùng mẫu nuôi cấy
Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùng và vẫn còn
khả năng tăng trưởng để đưa vào nuôi cấy in vitro. Đây là giai đoạn rất quan trọng,
quyết định toàn bộ quá trình nhân giống in vitro.
Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên. Tuy
nhiên, vấn đề là ở chỗ phải tìm được nồng độ của tác nhân vô trùng và thời gian khử
trùng thích hợp.
™ Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy
Mục đích của giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy.
Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các phytohormone ngoại sinh
đưa vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, bên cạnh điều kiện đó cũng cần quan tâm tới
tuổi sinh lý của mẫu cấy. Mô non, chưa phân hóa có khả năng tái sinh cao hơn các mô
trưởng thành.
™ Giai đoạn 3: Nhân nhanh
Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình. Để tăng hệ số nhân,
người ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh
trưởng (auxin, cytokinin, gibberellins, v.v.), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch
chiết nấm men, v.v kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Tùy thuộc vào
từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành qua
các cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các chồi nách (vi giâm
cành) hoặc thông qua việc tạo ra cây từ phôi vô tính.
™ Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt được kích thích nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giai đoạn
3 sang môi trường tạo rễ. Thường từ 2 đến 3 tuần, từ những chồi riêng lẽ này sẽ xuất
hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này, người ta thường bổ sung vào môi
trường nuôi cấy các auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật quan trọng có

chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy.
™ Giai đoạn 5: Đưa cây ra vườn ươm
Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định
khả năng ứng dụng quá trình này vào thực tiễn sản xuất. Cây con in vitro sẽ được
7


chuyển từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng. Do đó phải đảm bảo
các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ, ánh sáng, ẩm độ, giá thể, v.v.) phù hợp để cây con
đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như khi đưa ra ruộng sản xuất.
2.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro
2.2.4.1. Mẫu nuôi cấy
Việc chọn mẫu thực vật để sử dụng trong quá trình nuôi cấy có vai trò quyết định,
nếu chọn sai mẫu chúng ta sẽ không thu nhận được kết quả, hoặc thu được những cây
sẽ không phát triển mạnh, thậm chí cây có thể ngưng phát triển ở một giai đoạn nhất
định (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
Mẫu thường được dùng là các mô non như chồi đỉnh, chồi nách hay chồi bất định
sẽ tái sinh tốt hơn mô già hay mô thành thục.
Mẫu cấy thích hợp cho nuôi cấy mô phải có mô phân sinh hay những tế bào có khả
năng biểu hiện tính toàn thế (Dương Công Kiên, 2002).
2.2.4.2. Môi trường nuôi cấy
Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát sinh hình thái
của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần môi trường nuôi cấy.
Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ
phận nuôi cấy. Mặt khác, môi trường còn thay đổi tùy thuộc vào sự phân hóa của mô
cấy, tùy theo trường hợp duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hay tái sinh
cây hoàn chỉnh. Vì vậy, lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp trong nuôi cấy mô là
rất cần thiết.
Nhìn chung, tất cả các công thức môi trường được sử dụng trong nuôi cấy mô đều
gồm năm thành phần chính: khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin, đường và các

chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Ngoài ra, người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ
có thành phần xác định (amino acid, EDTA, v.v.) và một số chất có thành phần không
xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men, v.v. vào trong môi trường tùy theo từng
đối tượng nuôi cấy.
2.2.4.3. Điều kiện nuôi cấy
Nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sinh trưởng và phát triển cây in vitro qua các tiến
trình sinh lý như hô hấp, hình thành tế bào và cơ quan, nhiệt độ thích hợp nhất thường
được dùng trong nuôi cấy mô tế bào là 20 – 27oC (Trần Văn Minh, 2004).

8


Nhiều nghiên cứu cho thấy ánh sáng hấp thu đóng vai trò quan trọng trong tạo hình
nuôi cấy in vitro. Cường độ ánh sáng là nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng
đến khả năng nuôi cấy in vitro ở những cây có diệp lục tố. Các loại cây khác nhau thì
yêu cầu mức độ ánh sáng khác nhau. Bức xạ ánh sáng cao hơn trong nuôi cấy dị dưỡng
có thể làm mất diệp lục và hoại tử lá (Hartmann và ctv, 1997). Rất nhiều nghiên cứu có hệ
thống về tác động của quang chu kỳ trong sự phát triển của mô nuôi cấy, nhưng thời
gian ngày dài hơn từ 12 đến 16 giờ thường là thích hợp nhất. Trong nuôi cấy mô, người
ta cho rằng chất lượng ánh sáng là quan trọng trong giai đoạn thuần hóa cây non và có
thể bị kích thích bởi xử lý ánh sáng xanh trước khi di chuyển cây từ nuôi cấy.
Thành phần chất khí trong bình nuôi cấy có tác động đến sự sinh trưởng của chồi
và cây in vitro. O2, CO2, và ethylene là những thành phần chất khí được quan tâm và
khảo sát nhiều. Tất cả sự đóng kín và nắp đậy sử dụng cho nuôi cấy mô thường là các
vật liệu trao đổi khí được ở vài mức độ khác nhau (Hartmann và ctv, 1997).
pH của môi trường trong nuôi cấy mô thường ở khoảng 5,8 – 6,0 là tốt nhất. Nếu
pH môi trường thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 7,0 đều ức chế sự phát triển của mô
(Nguyễn Văn Uyển, 1993).
Agar được xem như là giá thể trong hầu hết môi trường dinh dưỡng, thường được
sử dụng để tạo môi trường đặc hay môi trường bán lỏng để nuôi cấy mô tế bào thực

vật. Nồng độ agar thường sử dụng trong nuôi cấy mô là 0,6 – 0,8%. Độ tinh khiết của
agar trong môi trường nuôi cấy rất quan trọng. Người ta chứng minh rằng trong agar
có chứa Ca, Mg, K và Na và sự thay đổi hàm lượng agar sẽ làm thay đổi hàm lượng
khoáng trong môi trường nuôi cấy. Vì vậy trong các thí nghiệm đòi hỏi khắt khe về sự
biến dưỡng của mô, người ta chỉ sử dụng agar có độ tinh khiết cao (Nguyễn Đức
Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006).
2.3. Chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật là những hợp chất hữu cơ khác với những
chất dinh dưỡng, với một hàm lượng nhỏ kích thích, ức chế hoặc bổ sung một quá
trình sinh lý ở thực vật. Chất điều hòa sinh trưởng có tác động kích thích ở nồng độ
thấp và tăng dần đến ảnh hưởng tối đa. Khi nồng độ vượt qua mức kích thích tối đa sẽ
gây ảnh hưởng ức chế (Nguyễn Minh Chơn, 2004). Mặc dù chúng không tham gia trực
tiếp vào quá trình trao đổi chất, nhưng có tác dụng đến quá trình sinh trưởng và phát
triển của cây.
9


Bốn nhóm chất điều hòa sinh trưởng quan trọng trong nuôi cấy mô thực vật là auxin,
gibberellin, cytokinin và acid abscisic (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006).
Auxin
Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng rất thường xuyên
trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kích thích sự hình thành mô sẹo, huyền phù
tế bào và điều tiết sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được sử dụng phối hợp với
các cytokinin.
Auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol acetic acid (IAA). IAA có
dẫn xuất là naphthyl acetic acid (NAA) và 2,4-dichlorophenoxyl acetic acid (2,4-D).
NAA được Went và Thimann phát hiện năm 1937 và là một auxin nhân tạo có
hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA. Trong cây, IAA tập trung nhiều trong các
mô non (chồi, lá đang phát triển), trong hạt được hình thành, trong hạt nảy mầm
(Trịnh Xuân Vũ và ctv, 1976).

Tác động của auxin: Sự vận chuyển auxin có vai trò quan trọng trong sự tăng
trưởng và phân hóa, auxin giúp kéo dài và phân chia tế bào, các hiện tượng hướng
động, ưu thế ngọn, lão suy, rụng, đậu, tăng trưởng và chín của quả, v.v. (Nguyễn Văn
Kế, 2000); auxin hoạt hóa sự phân bào, sinh trưởng kéo dài, cần cho sự tạo mạch dẫn và
ra rễ, tăng trưởng của quả, tạo quả không hạt, kích thích sinh trưởng của ống
phấn (Bùi Trang Việt, 2000); auxin chẳng những kích thích sự tăng trưởng của chồi
non mà còn khởi phát cho sự tạo mới. Ở nồng độ thấp và thường kết hợp với cytokinin
thì auxin khởi phát mô phân sinh ngọn, vượt quá nồng độ giới hạn thì auxin ngăn cản
sự phát triển của lá mới hay của mô phân sinh bên (Bùi Trang Việt, 2000).
Ứng dụng của một số auxin: IAA kích thích sự ra rễ, đặc biệt là rễ bất định trên
cành giâm, cành chiết và trên mô nuôi cấy. Trong nuôi cấy mô, auxin (IBA và NAA)
cũng có tác dụng tạo rễ tốt; để kéo dài sự chín của quả và dùng bảo quản quả lâu, sử
dụng dung dịch NAA (10 – 20 ppm); để tăng đậu quả, tăng sinh trưởng của quả và tạo
quả không hạt, người ta xử lý auxin dưới dạng NAA 20 ppm, 2,4-D 10 ppm cho một
số cây trồng như cà chua, cam, chanh; 2,4-D có hiệu quả trong việc tạo mô sẹo ở
nhiều loại thực vật và ở nồng độ cao 2,4 D có tác dụng diệt cỏ hại cây trồng.
Cytokinin
Cytokinin là chất điều hòa tăng trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào
(hiệu quả trong việc kích thích sinh tổng hợp protein). Khi phối hợp với auxin thì
cytokinin kích thích sự phân chia tế bào và điều khiển sự phát sinh hình thái.
10


Cytokinin thường gặp là kinetin và 6-benzylaminopurine (BA). Cytokinin có hàm
lượng cao nhất ở phôi, quả non, rễ (Trịnh Xuân Vũ và ctv, 1976).
Vai trò sinh học và ứng dụng: Trong giai đoạn đầu của phát sinh phôi soma, sự có
mặt của auxin là rất cần thiết để kích thích sự phân bào, nhưng giai đoạn sau phôi phải
được nuôi cấy trên môi trường có cytokinin để biệt hóa chồi (Vũ Văn Vụ, 1999).
Cytokinin cùng auxin điều tiết chu trình tế bào, kích thích sự phân chia tế bào một
cách mạnh mẽ. Nếu auxin/cytokinin > 1: kích thích ra rễ; auxin/cytokinin < 1: kích

thích hình thành chồi; auxin/cytokinin = 1: kích thích hình thành mô sẹo (Nguyễn Văn
Uyển và ctv, 1993); cytokinin kích thích sự phát triển mầm hoa; cytokinin cảm ứng
hình thành chồi cây từ mô sẹo nuôi cấy, duy trì sự trẻ hóa của các cơ quan và loại bỏ
ưu thế ngọn cũng như hạn chế sự phát triển của rễ; cytokinin được sử dụng chủ yếu
trong nuôi cấy mô thực vật: TDZ (thidiazuron), BA (6-benzylaminopurine), Kinetin
(6-furfuryl amino purine) và cytokinin tự nhiên trong nước dừa được ứng dụng rộng
rãi trong môi trường tạo chồi in vitro.
Gibberellin
Gibberellin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật gồm hơn 80 hợp chất khác
nhau. Hoạt động của mỗi hợp chất phụ thuộc vào khả năng di chuyển qua mô hoặc sự
biến đổi nó thành một dạng hoạt động khác.
Mô thực vật nói chung tăng trưởng và phát triển không cần đến sự hiện diện của
gibberellin trong môi trường nuôi cấy, nhưng acid gibberellic thường được dùng trong
môi trường nuôi cấy có mật độ tế bào thấp. Tác động chính của gibberellin là kéo dài
thân, kích thích sự kéo dài lóng. Gibberellin kích thích mạnh sự phân chia tế bào mô
vỏ và biểu bì.
Acid abscisic
Acid abscisic là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật tự nhiên, được tạo ra từ
acid mevalonic hoặc do sự phân giải carotenoid. Acid abscisic đóng vai trò như một
chất kìm hãm sự tăng trưởng của thực vật, gây nên sự hưu miên của hột, sự lão suy và
rụng lá. Acid abscisic còn đóng vai trò điều hòa sự đóng kín khí khẩu, điều khiển sự
hấp thu nước và các ion của rễ. Trong nuôi cấy mô, acid abscisic còn điều khiển sự
phát sinh hình thái của mẫu cấy.

11


2.4. Các phương pháp nhân giống vô tính in vitro
2.4.1. Phương pháp vi nhân giống truyền thống
Phương pháp vi nhân giống truyền thống quan tâm đến các thành phần hóa học

(chất vô cơ, chất điều hòa tăng trưởng thực vật, nồng độ đường, amino acid, vitamin, v.v.)
hay đặc tính hóa học như pH của môi trường nuôi cấy hơn là các yếu tố vật lý và môi trường
(ánh sáng, thành phần không khí, độ ẩm, trao đổi khí, nhiệt độ) trong hộp nuôi cấy để
thúc đẩy hay ngăn cản sự tăng trưởng của cây.
Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng nuôi cấy mô theo phương pháp
truyền thống có ảnh hưởng không tốt đến sinh trưởng và phát triển của cây trong giai
đoạn in vitro cũng như ngoài vườn ươm (sinh trưởng chậm, xuất hiện biến dị hình thái
và chất lượng, mẫn cảm với stress ở giai đoạn thuần hóa sau ống nghiệm).
Trong nuôi cấy mô truyền thống thì đường được xem là nguồn carbon duy nhất
cho sự phát triển của cây con in vitro. Đường hiện diện trong môi trường nuôi cấy
ảnh hưởng đến tốc độ quang hợp của cây. Các nghiên cứu sinh hóa đã chứng minh
rằng đường kìm hãm hoạt động của enzyme rubisco. Sự kém hoạt động của rubisco
cũng có nghĩa là cường độ quang hợp của cây in vitro thấp (Hdider và Desjardins, 1995).
Ngoài ra, theo kết quả nghiên cứu của Kozai và Iwanami (1988) thì cây chỉ hấp thụ
khoảng 2 – 8% lượng đường có trong môi trường, điều này gây sự lãng phí trong sản xuất.
Nồng độ đường cao là nguyên nhân của sự gia tăng áp suất thẩm thấu của môi trường,
làm cản trở quá trình hấp thu nước và muối khoáng của rễ. Đường và vitamin còn là
chất hữu cơ thích hợp cho sự phát triển của vi sinh vật. Các nghiên cứu và trong thực tế
đã chứng minh sự hiện diện của đường và vitamin trong môi trường nuôi cấy làm tỷ lệ
nhiễm nấm và vi khuẩn cao, dẫn đến chi phí sản xuất và giá thành sản phẩm tăng.
Kozai cho rằng nên giảm hoặc loại bỏ hoàn toàn đường và vitamin khỏi thành phần
môi trường nuôi cấy, song song đó phải tăng cường nồng độ CO2 và cường độ ánh sáng
(Kozai và ctv, 1995).
Ngoài ra, việc sử dụng các hộp kín, các bình tam giác đậy bằng nút cao su hay giấy bạc
đã làm cho độ ẩm trong bình nuôi cấy thường cao hơn 95% (Fujiwara và Kozai, 1995). Độ
ẩm cao, áp suất hơi nước bão hòa làm cho tốc độ thoát hơi nước của các khí khổng
kém, làm giảm tích lũy chất khô và gây rối loạn sinh lý và cấu trúc hình thái (hiện
tượng thủy tinh thể). Các cây này sẽ bị mất nước nhanh chóng khi đưa ra khỏi ống
nghiệm, kết quả là tỷ lệ cây chết cao trong giai đoạn ex vitro.
12

Bình nuôi cấy kín còn ảnh hưởng đến thành phần không khí trong bình. Ngay sau
khi bật đèn, nồng độ CO2 trong ống nghiệm giảm xuống rất nhanh do hoạt động quang
hợp của cây cấy mô. Vì vậy, trong suốt thời gian chiếu sáng, cây trong ống nghiệm
ở trạng thái thiếu CO2 trầm trọng nên chúng phải sử dụng đường của môi trường
(Nguyễn Văn Uyển, 1996). Ngoài ra, nồng độ ethylen thường tăng cao trong các bình
nuôi cấy kín. Ethylen được biết đến như là một chất điều hòa tăng trưởng thực vật, tuy
nhiên ở nồng độ cao ethylen là một chất độc đối với cây.
Ánh sáng được sử dụng trong hầu hết các phòng nuôi cấy mô có cường độ khoảng
30 – 50 μmol m-2 s-1, thấp hơn nhiều so với điều kiện tự nhiên. Cường độ ánh sáng
thấp làm giảm khả năng quang hợp, dẫn đến việc cây không sử dụng hiệu quả nguồn
carbon từ CO2 mà phải tăng cường dị dưỡng bằng cách hấp thu carbon từ đường trong
môi trường nuôi cấy.
Vì vậy, mặc dù có nhiều ưu điểm hơn so với những phương pháp nhân giống
thông thường, nhưng phương pháp vi nhân giống truyền thống vẫn chưa đáp ứng được
nhu cầu của người dân do giá thành và chất lượng cây nuôi cấy mô còn hạn chế.
2.4.2. Phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng
Vi nhân giống quang tự dưỡng (photoautotrophic micropropagation) là một
phương pháp mới đã được giáo sư Toyoki Kozai và các cộng sự tập trung nghiên cứu
từ cuối thập niên 80 của thế kỷ trước nhằm hạ giá thành cây con và tự động hóa
quá trình nuôi cấy.
Phương pháp này chú ý tới các tác nhân vật lý của môi trường nuôi cấy (sự khuếch
tán các khí hòa tan) và các yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của cây con trong
bình nuôi cấy (cường độ chiếu sáng, thời lượng chiếu sáng, thành phần không khí, độ
ẩm, nhiệt độ, tốc độ luân chuyển của không khí trong bình nuôi cấy) thay vì chỉ nghiên
cứu các thành phần hóa học của môi trường nuôi cấy (Nguyễn Thị Quỳnh và ctv, 1999).
Trong vi nhân giống quang tự dưỡng, đường không được sử dụng trong môi trường
nuôi cấy. Nói đúng hơn là không sử dụng các cơ chất hữu cơ bao gồm cả các chất điều
hòa tăng trưởng thực vật, vitamin, amino acid, ngoại trừ các chất khoáng được cho vào

môi trường (Nguyễn Thị Quỳnh và Kozai, 1998). Cơ sở của phương pháp này xuất
phát từ những nghiên cứu gần đây đã cho thấy tất cả các cơ quan dùng trong nuôi cấy
mô có diệp lục tố (những mẫu nuôi cấy có mang lá, các phôi vô tính ở giai đoạn có lá
mầm và các cây in vitro) đều có khả năng quang hợp. Các cơ quan này có thể nhận
13


CO2 trong không khí làm nguồn carbon trong quá trình quang hợp mà không cần
đường và vitamin trong quá trình nuôi cấy (Kozai, 1991).
Phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng tạo điều kiện tối đa cho cây trong bình
nuôi cấy sử dụng khí CO2 có sẵn trong không khí làm nguồn carbon chính cho quá trình
tăng trưởng và phát triển của cây. Việc sử dụng các màng trao đổi khí giúp gia tăng tốc
độ trao đổi khí trong và ngoài bình nuôi cấy, làm gia tăng nồng độ khí CO2 trong bình.
Sự gia tăng khác biệt giữa nồng độ CO2 bên trong và bên ngoài bình nuôi cấy cùng với
sự gia tăng cường độ ánh sáng làm cho hiệu suất quang hợp tăng (Kozai, 1996).
Phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng có nhiều ưu điểm hơn phương pháp vi
nhân giống truyền thống như: giảm những bất thường về hình thái và sinh lý của cây
in vitro; tỷ lệ đột biến thấp do không sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng; không đòi
hỏi điều kiện nuôi cấy hoàn toàn vô trùng, với điều kiện cây (mẫu cấy) sạch bệnh;
nguy cơ nhiễm nấm, khuẩn thấp do không có đường và các chất hữu cơ khác trong môi
trường nuôi cấy; có thể tự động hóa quá trình sản xuất; giảm chi phí nhân công. Vì
thế, phương pháp mới này ngoài việc thúc đẩy sự tăng trưởng và phát triển của cây in
vitro tốt hơn còn có tác dụng rút ngắn thời gian nuôi cấy và góp phần làm hạ giá thành
cây con in vitro.
2.5. Vai trò của ánh sáng trong nuôi cấy tế bào thực vật
2.5.1. Ảnh hưởng của ánh sáng đối với sự sinh trưởng và phát triển của thực vật
Ánh sáng là yếu tố vô cùng quan trọng cho sự sinh trưởng của cây vì nó rất cần cho
quá trình quang hợp. Nhờ quá trình quang hợp mà cây tổng hợp được các chất hữu cơ
làm nguyên liệu để xây dựng nên cơ thể và tích lũy năng lượng ở trong câ y cho
quá trình sinh trưởng.

Ánh sáng có ảnh hưởng đến toàn bộ đời sống của thực vật từ khi hạt nảy mầm,
sinh trưởng, phát triển cho đến khi cây ra hoa, kết trái rồi chết. Ánh sáng có ảnh hưởng
nhất định đến hình thái và cấu tạo của cây.
Ánh sáng còn ảnh hưởng đến hệ rễ của thực vật. Đối với một số cây có rễ trong
không khí (rễ khí sinh) thì ánh sáng giúp cho quá trình tạo diệp lục trong rễ nên rễ
có thể quang hợp như một số loài phong lan trong họ Lan (Orchidaceae). Còn hệ rễ ở
dưới đất không chịu sự tác động trực tiếp của ánh sáng. Rễ của các cây ưa sáng
phát triển hơn rễ của cây ưa bóng.

14


Lá là cơ quan trực tiếp hấp thụ ánh sáng nên chịu ảnh hưởng nhiều đối với sự
thay đổi cường độ ánh sáng. Do có sự phân bố ánh sáng không đồng đều trên tán cây
nên cách sắp xếp lá không giống nhau ở tầng dưới, lá thường nằm ngang để có thể
tiếp nhận được nhiều nhất ánh sáng tán xạ; các lá ở tầng trên tiếp xúc trực tiếp với
ánh sáng nên thường xếp nghiêng nhằm hạn chế bớt diện tích tiếp xúc với cường độ
ánh sáng cao.
Cây sinh trưởng trong điều kiện chiếu sáng khác nhau có đặc điểm hình thái,
giải phẫu khác nhau. Trên cùng một cây, lá ở ngọn thường dày, nhỏ, cứng, lá được phủ
một lớp cutin dày, mô giậu phát triển, có nhiều gân và lá có màu nhạt. còn lá ở trong
tầng bị che bóng có phiến lá lớn, lá mỏng và mềm, có lớp cutin mỏng, có mô giậu kém
phát triển, gân ít và lá có màu lục đậm.
Ngoài cường độ ánh sáng thì chất lượng ánh sáng cũng có ảnh hưởng đến sinh
trưởng. Ánh sáng có bước sóng dài như ánh sáng đỏ hay tia hồng ngoại làm giãn tế
bào nên làm tăng chiều cao, chiều dài của cây. Ngược lại những tia có bước sóng ngắn
như tia xanh tím, tia tử ngoại thì kích thích sự phân chia tế bào và ức chế giãn tế bào,
làm cho cây thấp lùn.
2.5.2. Tầm quan trọng của ánh sáng trong vi nhân giống
Cường độ ánh sáng mà thực vật sử dụng trong phản ứng quang hợp có bước sóng

từ 400 đến 700 nm, thực vật hấp thu tốt nhất từ 600 đến 680 nm. Sự phát sinh hình
thái do ánh sáng (sự nảy mầm, kéo dài đốt thân, v.v.) xảy ra ở những dải bước sóng từ
400 đến 500 nm (xanh lục), từ 600 đến 700 nm (đỏ) và từ 700 đến 800 nm (đỏ xa).
Sự phân phối phổ ánh sáng, quang kỳ và hướng chiếu sáng cũng đóng vai trò quan
trọng trong quá trình sinh trưởng của thực vật nuôi cấy mô. Hiện nay, ánh sáng trắng
(phổ ánh sáng từ 400 đến 700 nm) của đèn huỳnh quang được sử dụng phổ biến trong
các phòng nuôi cấy mô. Ánh sáng đơn sắc từ đèn LED cũng đã và đang được nghiên
cứu là nguồn sáng trong nhân giống thực vật.
Một trong những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo rễ của mẫu cấy là ánh sáng.
Ánh sáng góp phần vào việc tạo rễ và chồi bất định của đoạn cắt. Quá trình tạo rễ cần
cường độ ánh sáng thấp, vì cường độ ánh sáng cao quá sẽ ngăn cản sự hình thành rễ.
Đối với một số loài, quang kỳ có thể ảnh hưởng đến sự tạo rễ. Chất lượng ánh sáng
cũng ảnh hưởng đến sự ra rễ, ánh sáng đỏ cam thích hợp cho sự ra rễ hơn ánh sáng
xanh da trời (Dương Tấn Nhựt, 2011).
15