Nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên cây cam hàm yên tuyên quang và tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng nấm của chúng

NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY CAM
HÀM YÊN - TUYÊN QUANG VÀ TIỀM NĂNG SINH
TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG NẤM CỦA CHÚNG

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC
Chuyên ngành : Vi sinh vật học
Mã ngành :60 42 01 03

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. PHAN THỊ HỒNG THẢO

Hà Nội - 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




LƠI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây la công trinh nghiên cưu cua riêng tôi .Các sô liệu, kêt
quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bô trong bất ky
công trinh nao khac.
Tôi xin cam đoan răng moi sư giup đơ cho việc thưc hiện Luận văn nay đa
đươc cam ơn va cac thông tin trich dân trong Luận văn đa đươc chi ro nguôn gôc
.

Hà Nội, Ngày 25 tháng 11 năm 2015
Học viên

Đào Ánh Vân

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phan Thị Hồng Thảo –
Trưởng phòng Vi sinh vật Đất, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam người đã truyền thụ cho tôi những kiến thức chuyên ngành,
hướng dẫn, định hướng nghiên cứu và tận tình giúp đỡ tôitrong suôt quá trình học
tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Xin chân thành cảm ơn các thầy, cô thuộc Viện Công nghệ Sinh học – Viện
Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong quá trình học tập
Xin chân thành cảm ơn các cán bộ Phòng Vi sinh vật Đất, Viện Công nghệ
Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã động viên, giúp đỡ
và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suôt quá trình thực hiện đề tài này.
Tôi xin cám ơn sư hỗ trợ kính phí thực hiện tư đề tài “Nghiên cứu sư đa dạng
của xạ khuẩn nội sinh trên cây có múi đặc sản ở miền Bắc Việt Nam và tiềm năng
sinh tổng hợp các chất kháng khuẩn và kích thích tăng trưởng thực vật của chúng”
Mã sô đề tài: VAST.ĐLT.12/15-16 thuộc cấp quản lý Viện Hàn lâm KHCNVN
vàPhòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học đã tạo
điều kiện và cung cấp các thiết bị để tôi có thể tham gia thực hiện đề tài.
Cuôi cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè, những người đã luôn
quan tâm giúp đỡ và động viên tôi để có được thành quả ngày hôm nay.
Hà Nội, Ngày 25 tháng 11 năm 2015
Học viên
Đào Ánh Vân

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

STT

Tên viết tắt

Tên đây đủ

1

CFU

Đơn vị hình thành khuẩn lạc

2

DNA

Deoxyribosenucleoic Acid

3

EDTA

Ethylene diamine tetra-acetic acid

4

HTKS

Hoạt tính kháng sinh

5

ISP

Internationl Streptomyces Project

6

KTCC

Khuẩn ty cơ chất

7

KTKK

Khuẩn ty khí sinh

8

PCR

Polymerase Chain Reaction: Phản ứng khuếch đại gen

9

rDNA

Ribosomal Deoxyribosenucleoic Acid

10

RNA

Ribonucleic acid

11

rRNA

Ribosomal Ribonucleic acid

12

SDS

Sodium dodecyl sulfate

13

TAE

Tris-acetat EDTA

14

VSV

Vi sinh vật

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
1.1

Tên bảng

Trang

3.1

Tổng hợp một sô nghiên cứu trên thế giới về các loài xạ khuẩn nội cộng sinh
trên thưc vật.
Kết quả phân lập xạ khuẩn nội sinh tư mẫu rễ Cam Hàm Yên Tuyên Quang

27

3.2

trên một sô môi trường khác nhau
Tỷ lệ các xạ khuẩn phân lập chia theo đa dạng nhóm màu

30

3.3
3.4
3.5
3.6
3.7

Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn
Sô lượng các chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập có khả năng đối kháng với
các chủng nấm và vi khuẩn kiểm tra
Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng sinh của 4 chủng xạ khuẩn lưa chọn được
32 nuôi cấy trên môi trường dịch thể ISP2 sau 5 ngày
Đặc điểm nuôi cấy của xạ khuẩn nội sinh C12 và R12-4 trên các môi trường
ISP
Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn sau 14

13

30
31

33
36

ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 30C
3.8
3.9
3.10

3.11
3.12
3.13

Ảnh hưởng của nồng độ NaCl trong môi trường ban đầu đến khả năng sinh
trưởng và phát triển của 4 chủng xạ khuẩn tuyển chọn
Ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đến khả năng sinh trưởng của 4
chủng xạ khuẩn tuyển chọn
Ảnh hưởng của nhiệt độ ban đầu đến khả năng sinh trưởng của 2 chủng xạ
khuẩn tuyển chọn
khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của các chủng xạ khuẩn
So sánh trình tư gen mã hóa 16S rRNA của chủng R12-4 với gen tương ứng
của các chủng xạ khuẩn được đăng ký trên GenBank
Môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm của hai chủng

37
37
37
38
39
40

xạ khuẩn C12 và R12-4
3.14 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi đến sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm
3.15 Nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm của hai chủng xạ
khuẩn lưa chọn
3.16 Lưa chọn dung môi để chiết hoạt chất kháng nấm tư dịch lên men và sinh

42

khố i
3.17 Ảnh hưởng của các pH chiết khác nhau đến khả năng chiết chất kháng nấm
3.18 Xác định độ bền nhiệt đến hoạt tính kháng nấm của chủng R12-4

43
44

DANH MỤC CÁC HÌNH

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN



41
41


Hình
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9

Tên hình
Hình ảnh minh họa kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh

trên một sô môi trường sau 6 tuần nuôi cấy
Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phân lập theo bộ phận của cây Cam Hàm Yên –
Tuyên Quang
Khả năng đố i kháng của một sô chủng xạ khuẩn phân lập với nấm
Xạ khuẩn C12 và R12-4 đố i kháng với nấm
Khuẩn lạc xạ khuẩn C12 trên các môi trường ISP
Khuẩn lạc xạ khuẩn R12-4 trên các môi trường ISP
Cuố ng sinh bà o tử, chuôi bào tử va hinh dang bao tư của xạ
khuẩn nội sinh C12
Cuố ng sinh bà o tử, chuôi bào tử va hinh dang bao tư của xạ khuẩn
nội sinh R12-4
Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của chủng xạ khuẩn R12-4 và C12

Trang
29
29
31
32
34
34
35
35
36

sau 14 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 28C
3.10
3.11
3.12
3.13
3.14

3.15
3.16
3.17
3.18

Điện di đồ DNA tổng sô của hai chủng xạ khuẩn C12 và R12-4 trên gel
agarose 1,0 %.
Điện di đồ sản phẩm PCR của chủng xạ khuẩn C12 và R12-4 với cặp
mồi sử dụng 27F và 1492R trên gel agarose 1,0%
Mức độ tương đồng di truyền giữa chủng Streptomyces angustmyceticus
C12 với các loài xạ khuẩn có họ hàng gần dưa vào 16S
rRNA Độ bền của chất kháng nấm với nhiệt
Độ bền của chất kháng nấm với pH
Khả năng bền với pH của chất kháng nấm
Hoạt chất kháng nấm của kháng sinh tinh sạch
Hình ảnh quang phổ hấp thu điện tử UV VIS của kháng sinh tinh sạch
Hình ảnh phổ hồng ngoại của kháng sinh tinh sạch

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN



38
38
39
44
45
45
46
46

47


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỞ ĐẦU.......................................................................................................................... 1
PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................. 3
1.1. Xạ khuẩn nội sinh trong thực vật ......................................................................... 3
1.1.1. Giới thiệu chung về xạ khuẩn .......................................................................... 3
1.1.2. Xạ khuẩn nội sinh trên thực vật .........................................................................
6
1.1.3. Mối quan hệ giữa thực vật và xạ khuẩn nội sinh .............................................. 8
1.1.4. Con đường xâm nhập của vi sinh vật vào cây chủ ........................................... 8
1.1.5. Các phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh ................................................. 9
1.1.6. Phân loại xạ khuẩn nội sinh .......................................................................... 10
1.2. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh và tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn
nội sinh
.................................................................................................................................... 12
1.2.1. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh ........................................................ 12
1.2.2. Tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh ................................................... 15
1.3. Cây có múi và khả năng thu nhận các thể nội sinh............................................ 17
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................ 20
2.1. Vật liệu ................................................................................................................ 20
2.1.1. Mẫu cây ........................................................................................................ 20
2.1.2. Vi sinh vật kiểm định:.................................................................................... 20
2.1.3. Hóa chất và thiết bị ....................................................................................... 20
2.1.4. Môi trường nghiên cứu.................................................................................. 21

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 22
2.2.1. Phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh từ các mô sống của các mẫu thực vật 22
2.2.2. Đánh giá khả năng đối kháng của xạ khuẩn .................................................. 22
2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn ................................................. 23
2.2.4. Phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA....................................................... 24
2.2.5.Phương pháp tách chiết và tinh sạch kháng sinh ............................................ 24
2.2.6. Phương pháp xác định một số tính chất của chất kháng nấm và kháng khuẩn 26


Phần III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................... 27
3.1. Phân lập và sàng lọc các chủng xạ khuẩn nội sinh có khả năng sinh tổng hợp
hoạt chất kháng nấm trên cây Cam Hàm Yên – Tuyên Quang. ..............................
27
3.1.1. Kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây cam Hàm Yên – Tuyên
Quang ..................................................................................................................... 27
3.1.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội sinh có khả năng sinh chất kháng nấm,
kháng khuẩn ........................................................................................................... 30
3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai chủng xạ khuẩn nội sinh lựa chọn ....... 32
3.2.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý và đặc điểm nuôi cấy của chủng xạ khuẩn lựa
chọn........................................................................................................................ 32
3.2.2. Đặc điểm sinh học của hai chủng xạ khuẩn lựa chọn .................................... 35
3.3. Nghiên cứu môi trƣờng và điều kiện sinh tổng hợp chất kháng nấm của hai
chủng xạ khuẩn nội sinh lựa chọn .............................................................................
40
3.3.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kháng
nấm ........................................................................................................................ 40
3.4. Nghiên cứu một số tính chất hoá lý của hoạt chất kháng nấm thu nhận từ
chủng R12-4. .............................................................................................................. 42
3.4.1. Tách chiết chất khang nấm............................................................................ 42
3.4.2. Khả năng bền nhiệt của chất kháng sinh ....................................................... 43

3.4.3. Khả năng bền với pH của chất kháng nấm .................................................... 45
3.4.4. Tinh sạch và thu nhận chất kháng sinh ......................................................... 46
PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................... 48
KẾT LUẬN.................................................................................................................... 48
KIẾN NGHỊ................................................................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 49
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 53


Luận văn tốt
nghiệp

Đào Ánh
Vân
MỞ ĐẦU

Cây có múi là tên gọi chung của nhóm cây cam, chanh, quýt, bưởi... cùng
họ Rutaceae. Cây ăn trái có múi được trồng ở hơn 100 quốc gia. Đây là loại quả có tầm
quan trọng hàng đầu thế giới, với sản lượng năm 2009 đạt hơn 120 triệu tấn, trong đó cam
chiếm
54% [15, 42, 46], bao gồm cả Việt Nam, tại vùng cam nổi tiếng Hàm Yên - Tuyên
Quang hiệu quả kinh tế thu về khá cao. Tuy nhiên, việc trồng cây có múi phải đố i mặt với
một sô vấn đề là cây tăng trưởng chậm, côn trùng, sâu bệnh... [41].Bên cạnh đó, sư
phát triể n nhanh chóng các vùng trồng và sử dụng lượng hóa chất nông nghiệp thiếu
kiểm soát trong nước dẫn đến những tác động tiêu cưc về sản xuất, môi trường, chất
lượng đất, sức khỏe con người, vật nuôi và ngày càng nhiều vi sinh vật gây bệnh có khả
năng kháng cá c loại thuốc bảo vệ thưc vật thông dụng. Vì vậy, việc tìm kiếm và ứng
dụng các vi sinh vật để kiểm soát sinh học, kích thích tăng trưởng thưc vật là một
phương pháp thay thế để giảm sử dụng hoá chất nông nghiệp. Trong sô các loài vi sinh
vật, xạ khuẩn có vị trí quan trọng do sư đa dạng cao, khả năng sinh tổng hợp nhiều chất

có hoạt tính sinh học như enzym, chất kích thích sinh trưởng thưc vật, thuốc kháng sinh
dùng trong nông nghiệp và y học... Đặc biệt là các loài xạ khuẩn nội sinh trong mô thưc
vật sống ( lá, cành, rễ). Các loài xạ khuẩn sống nội sinh trong thưc vật có khả năng tích
hợp với cây chủ và sinh tổng hợp một sô chất chuyển hóa thứ cấp có lợi cho cây chủ
của mình. Đó là một trong những hệ sinh thái đặc biệt và khó tiếp cận, nơi mà xạ khuẩn
nội sinh có vai trò quan trọng trong sư phát triển của cây chủ, chúng có thể ảnh hưởng
đến sinh trưởng của cây bằng con đường đồng hóa các chất dinh dưỡng, kích hoạt hệ
thống miễn dịch và sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp, giúp cây chủ hạn chế bệnh và
kích thích sinh trưởng cho cây[22, 23]. Trong mố i quan hệ tương hỗ với cây chủ, vi sinh
vật nội sinh cũng nhận được tư cây chủ các chất dinh dưỡng để sinh trưởng. Đến nay, đã
có nhiều nghiên cứu công bô về khả năng sản sinh các chất thứ cấp tiêu diệt nhiều loài
nấm bệnh và sinh tổng hợp các kháng sinh mới như munumbicin, kakadumycin và
coronamycin của các loài xạ khuẩn nội sinh. Như vậy, xạ khuẩn nội sinh thưc sư là những
ứng cử viên tiềm năng trong kiểm soát sinh học cho tương lai. Tuy nhiên, sô lượng các
nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh trên cây cam và cây có múi nói chung tại Việt Nam vẫn
còn rất hạn chế. Xuất phát tư những lí do trên, chúng tôi thưc hiện nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên cây Cam Hàm Yên- Tuyên Quang và tiềm năng sinh
tổng hợp chất kháng nấm của chúng”
Mục tiêu cơ bản của đề tài:
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh
vật

1


Luận văn tốt
nghiệp

Đào Ánh
Vân

Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây Cam tại Hàm Yên
Tuyên Quang có tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng nấm cao.
Nội dung nghiên cứu của đề tài:
1. Phân lậpcác chủng xạ khuẩn nội sinh trên rễ và cành trên các mẫu rễ và cành
của cây cam Hàm Yên- Tuyên Quang.
2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây cam Hàm Yên –Tuyên Quang
có khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn và kháng nấm cao.
3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại các chủng xạ khuẩn nội sinh lưa chọn.
4. Nghiên cứu môi trường và điều kiện sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm của
các chủng xạ khuẩn nội sinh lưa chọn
5. Nghiên cứu một sô tính chất hoá lý của hoạt chất kháng nấm thu nhận tư xạ khuẩn
R12-4.
Đề tài được thưc hiện tại phòng Vi sinh vật đất, Viện Công nghệ sinh học, Viện
Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh
vật

2


Luận văn tốt
nghiệp

Đào Ánh
Vân

PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Xạ khuẩn nội sinh trong thực vật

1.1.1. Giới thiệu chung về xạ khuẩn
Theo hệ thống phân loại hiện nay xạ khuẩn thuộc nhóm Prokaryote, thuộc giới
Monera trong 5 giới của Whittaken, còn theo hệ thống phân loại chia sinh giới thành 7
giới thì xạ khuẩn thuộc giới Prokaryote. Xạ khuẩn có mặt chủ yếu trong đất, trong nước
ao hồ, trong bùn và trong chất hữu cơ khác, thậm trí trong cả cơ chất mà các vi khuẩn
và nấm mốc không sinh trưởng được [9].
a. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
* Cấu tạo tế bào xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tư như vi khuẩn G(+), toàn bộ cơ thể chỉ là một
tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất,
chất nhân và các thể ẩn nhập. Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 ÷
20 nm có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3
lớp: Lớp ngoài cùng dày khoảng 60 ÷ 120Å, khi già có thể đạt tới 150 ÷ 200Å, lớp giữa
rắn chắc, dày khoảng 50Å, lớp trong dày khoảng 50Å. Các lớp này chủ yếu cấu tạo tư
các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N - axetyl glucozamin liên kết với N - axetyl
muramic bởi các liên kết 1,4 - β glucozit. Thành tế bào xạ khuẩn không chứa cellulose và
kitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận
chuyển vật chất qua màng tế bào[3, 9].
Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4 nhó
m chính, bao gồm:
Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6 diaminopimelic (L ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này.
Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic
(meso - ADP) và glyxin. Thuộc nhóm nà y gồm các chi : Micromonospora, Actinoplanes,
Ampullarriella…
Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 -diaminopimelic.
Thuộcnhóm nà y có các chi: Dermatophilus, Geodermatophilus, Frankia…

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh
vật

3


Luận văn tốt
nghiệp

Đào Ánh
Vân

Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 -diaminopimelic,
arabinose và galactose. Thuộc nhóm nà y gồm các chi: Mycobacterium, Nocardia,
Pseudonocardia…[8,11].
Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu tạo chủ yếu
bởi 2 thành phần là photpholipit và protein. Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong
quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn.
Tế bào chất của xạ khuẩn có chứa mezoxom, thể nhân, và các vật thể ẩn nhập
gồm các hạt poliphotphat và polixacarit. Nhân của tế bào xạ khuẩn không có cấu trúc
điển hình, chỉ là những nhiễm sắc thể không có màng. Khi còn non, toàn bộ tế bào chỉ có
1 nhiễm sắc thể sau đó hình thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ hệ khuẩn ty…[8, 11].
* Khuẩn lạc, khuẩn ty xạ khuẩn
Hình thái của khuẩn lạc xạ khuẩn rất khác nhau, kích thước và hình dạng của chúng
thay đổi phụ thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, độ ẩm…). Trên môi
trường đặc, xạ khuẩn sinh trưởng thành những khuẩn lạc khô, kích thước thay đổi. Mặt
khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng đá vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng
dẻo, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ và bám sâu [8]. Khuẩn lạc xạ khuẩn thường có
3 lớp: lớp vỏ ngoài có các sợi bện chặt, lớp trong đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong.
Khuẩn lạc xạ khuẩn thường có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, tím, nâu… tùy
thuộc vào tưng loại và điều kiện ngoại cảnh như: pH, nhiệt độ, thành phần môi trường
nuôi cấy.
Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn được phân biệt ở hướng sinh trưởng trong và ngoài

môi trường tạo thành khuẩn ty cơ chất (KTCC) và khuẩn ty khí sinh (KTKS). Các KTCC
cắm sâu vào môi trường để lấy chất dinh dưỡng, còn KTKS thì phát triển ra ngoài không
khí, phần cuố i của khuẩn ty này thường biến thành cuống sinh bào tử. Khuẩn ty xạ khuẩn
mảnh hơn khuẩn ty của nấm mốc và có đường kính thay đổi trong khoảng tư 0,2 ÷ 1,0
m đến 2
÷ 3 m. Đa sô xạ khuẩn có khuẩn ty không có vách ngăn và không tư đứt đoạn [3].
Xạ khuẩn giố ng nấm mốc ở chỗ có thể tạo thành hệ sợi, nhưng lại là cơ thể đơn
bào, Gram (+), không có nhân thưc và có kích thước giố ng vi khuẩn. Mặc dù thuộc nhóm
sinh vật nhân sơ nhưng xạ khuẩnthường sinh trưởng dưới dạng sợi và tạo nhiều bào tử.
Một bào tử xạ khuẩn khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ trương lên, sau 1÷ 2 giờ xuất hiện quá
trình tổng hợp ARN, nhân các gen cần thiết tư hệ gen và tiến hành tổng hợp protein
hình thành KTKS. Đầu KTKS kéo dài và phát triển hệ sợi theo phương pháp mọc chồi
phân nhánh (khoảng 30 m phân 1 nhánh). Độ dài khuẩn ty xạ khuẩn trong giai đoạn phát
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh
4
vật


Luận
văn tốt
Đào Ánh
triển khoảng
nghiệp
Vân
11 m/1 giờ và nhân của xạ khuẩn sắp xếp đều đặn theo chiều dài của khuẩn ty [9].

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh
vật

5

Luận văn tốt
nghiệp

Đào Ánh
Vân

b. Đặc điểm sinh trưởng của xạ khuẩn
Phần lớn xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, nhưng không phải là hiếu khí nghiêm
ngặt. Tùy theo xuất xứ mà chúng là vi sinh vật ưa ấm hoặc ưa nhiệt, thậm chí có loài
phát triển được ở những nhiệt độ bằng hoặc cao hơn 50°C. Hầu hết các chủng xạ khuẩn
sinh trưởng tôt ở dải nhiệt độ tư 25 ÷ 37°C, còn các chủng ưa nhiệt phát triển tôt ở 45
÷ 50°C. Xạ khuẩn phát triển tôt ở môi trường trung tính và hơi kiềm, phát triển chậm
hoặc không phát triển khi pH của môi trường quá axit hoặc kiềm. Xạ khuẩn thuộc loài dị
dưỡng, chúng sử dụng nguồn cacbon là tinh bột, các loại đường (glucose, maltose,
saccarose…) và các hợp chất polysacaride. Nguồn nitơ vô cơ thường là: nitrate, muố i
amon…, nitơ hữu cơ thường là: pepton, cao ngô, cao nấm men. Khả năng đồng hóa các
chất này ở các chủng xạ khuẩn khác nhau là không giố ng nhau. Phần lớn xạ khuẩn phát
triển tôt ở môi trường có pH trung tính và hơi kiềm; ở môi trường pH thấp hoặc hơi quá
kiềm xạ khuẩn không phát triển hoặc phát triển kém. Các chủng xạ khuẩn phát triển được
ở nồng độ muố i 3 ÷ 5% (w/v), còn ở nồng độ cao hơn có thể bị ức chế hoặc tiêu diệt [3].
c. Đặc điểm của bào tử xạ khuẩn
Cũng như các vi khuẩn sinh bào tử khác, xạ khuẩn thường sinh bào tử khi gặp điều
kiện bất lợi về dinh dưỡng hoặc điều kiện hóa lý của môi trường (nhiệt độ, độ ẩm, độ
pH). Bào tử của xạ khuẩn có dạng hình cầu hay hình bầu dục, hình que, hình trụ hay hình
quả dưa… Dưới kính hiển vi quang học, hình dạng của bào tử ổn định, nhưng khi
quan sát dưới kính hiển vi điện tử thì hình dạng của chúng không đồng nhất, thậm chí
trong một chuỗi bào tử hình thái của các bào tử cũng có thể khác nhau. Ngược lại, kết
cấu bề mặt ngoài của bào tử (trơn, thô, nhám, nhăn nheo, có mấu lồi hoặc có gai) thì lại

là đặc điểm tương đối ổn định. Dựa vào hình thái, kích thước cuống sinh bào tử và của
bào tử ở nhiều chi xạ khuẩn có thể phân loại được xạ khuẩn. Cuống sinh bào tử
thường có dạng thẳng hoặc hơi cong (RF), dạng xoắn thật hay xoắn lò xo (S) và chuỗi
bào tử không sinh trưởng hoặc xoắn đơn giản hình móc câu (RA). Cuống sinh bào tử
dạng xoắn có chiều dài và sô vòng khác nhau. Cuống sinh bào tử dạng thẳng có thể dài
hoặc ngắn hơn với các dạng lỏng cứng hoặc có thể thon lại, uốn cong hay kéo dài.
Những đặc điểm này rất quan trọng khi xác định tên xạ khuẩn [3]. Bào tử hình thành
đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc
và thường có hình trụ, ovan, hình cầu, hình que với mép nhẵn hoặc xù xì, ở một sô loài,
bào tử có hình thành ở các mấu lồi với các dạng khác nhau. Việc hình thành cuống bào
tử diễn ra mạnh mẽ hơn khi môi trường có chứa một sô nguyên tô vi lượng [9].

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh
vật

6


Luận văn tốt
nghiệp

Đào Ánh
Vân

Cuống sinh bào tử xạ khuẩn hình thành bào tử theo 3 phương thức
sau:
 Phương thức sinh trưởng toàn bộ: toàn bộ hay một bộ phận của khuẩn ty
hình thành nên thành của bào tử.
- Phương thức sinh trưởng trong thành: thành bào tử sinh ra tư tầng nằm giữa màng
nguyên sinh chất và thành khuẩn ty. Trường hợp này gặp ở xạ khuẩn thuộc chi

Planomonospora.
- Phương thức sinh trưởng thành bào tử nội sinh thật: thành khuẩn ty không tham
gia vào quá trình hình thành ra bào tử Thermoactynomyces[3].
1.1.2. Xạ khuẩn nội sinh trên thực
vật
Vi sinh vật nội sinh bắt đầu được nghiên cứu tư giữa thế kỷ XIX, nhưng
không chiếm được sư chú ý do hệ sinh thái của chúng rất đặc biệt[58]. De Bary (1866)
lần đầu tiên đề xuất định nghĩa về endophyte: đó là các VSV cư trú ở các mô bên trong
của thưc vật, phân biệt với thưc vật biểu sinh (epiphyte) sống ở trên bề mặt thưc vật, khái
niệm nà y đã gây ra nhiều tranh cãi[58]. Năm 1975, Smith và cộng sư đã đưa ra khái niệm
xạ khuẩn nội sinh khi phân lập thành công xạ khuẩn Microsmonospora sp. có khả năng
ức chế nấm gây bệnh Fusarium oxysporum trong mô cây cà chua không nhiễm bệnh
[45].Vào năm
1991, Pentrini đưa ra khái niệm về “endophyte”và đã được chấp nhận rộng rãi: Endophyte
là các vi sinh vật sống trong các tổ chức của thực vật trong một giai đoạn nhất định
của cuộc đời và không có khả năng gây bệnh [37]. Sau đó Sikora đã mở rộng định nghĩa
của endophyte: đó là một sinh vật xâm chiếm trong mô của một thưc vật trong suốt
vòng đời của chúng, mà không biểu hiện bất cứ triệu chứng bệnh rõ ràng nào cho cây
chủ[43]. Theo định nghĩa được thưa nhận rộng rãi nhất của Bacon và White (2000) thì
“các thể nội sinh (endophytes) là những vi sinh vật sinh trưởng ở các mô sống bên trong
thưc vật, mà không gây ra hiệu ứng xấu rõ ràng và trưc tiếp nào cho cây”. Theo Bacon
và While (2000) thì định nghĩa này hàm chứa một ý nghĩa rất quan trọng: vì bản chất
không gây triệu chứng bệnh cho cây nên việc các thể nội sinh chiếm cứ mô thưc vật đã
khiến chúng ta nghĩ đến mố i quan hệ hỗ sinh (mutualistic) giữa thể nội sinh và cây chủ
của chúng[16]. Vì vậy, các VSV nội sinh được mô tả là những VSV thiết lập được mố i
quan hệ cộng sinh với thưc vật hoặc được định nghĩa là bất cứ VSV nào không gây ra tác
động có hại với thưc vật, và có thể được phân lập tư bề mặt của các mô thưc vật đã được
khử trùng hoặc được chiết xuất tư phần bên trong của thưc vật. Mối liên kết giữa nội sinh
và thưc vật đã được tìm thấy trong rất nhiều cơ quan của thưc vật như rễ, cuống, lá, quả,
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh

7
vật


Luận
hoa vàvăn
hạttốt
[35].
nghiệp

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh
vật

Đào Ánh
Vân

8


Luận văn tốt
nghiệp

Đào Ánh
Vân

Theo Kandpal1 và cộng sư (2012), trong sô gần 300.000 loài thưc vật tồn tại trên
trái đất thì mỗi loại cây là cây chủ cho một hoặc nhiều loài VSV nội sinh[29].Các
VSV nội sinh tồn tại rộng rãi trong nhiều cơ quan thực vật mà chưa được biết đến, ước
tính lên đến một triệu loài [58]. Chúng không những không gây bệnh cho cây chủ mà còn
có khả năng thúc đẩy sư phát triển của cây bằng cách sản xuất các chất kích thích tăng

trưởng và bảo vệ thưc vật. Tiếp tục đi sâu nghiên cứu, các VSV nội sinh được xác định có
khả năng sản xuất ra nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học khác nhau có giá trị to lớn
trong sinh thái học, y học và bệnh lý học. Vi sinh vật nội sinh đem lại một triển vọng lớn
trong việc ứng dụng để phát triển các nguồn thuôc và ngăn chặn dịch bệnh, côn trùng
trong nông nghiệp và công nghiệp, có hiệu quả cao, độc tính thấp và thân thiện với môi
trường. Thêm nữa, vi sinh vật nội sinh cũng là nguồn tài nguyên quý giá của vi sinh vật
cũng như nguồn gen. Nhiều cây có ý nghĩa kinh tế quan trọng có chứa các thể nội sinh
giúp cây tăng trưởng, chông chịu các tác động bất lợi bên ngoài như khô hạn, đồng thời
cũng như giúp cây chông lại côn trùng và vi sinh vật gây bệnh [16].
Trong sô các VSV nội sinh, xạ khuẩn được chú ý bởi hơn 70 % các chủng xạ khuẩn
đã biết có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh có thể ức chế nhiều nhóm VSV
gây bệnh[31]. Với các tác dụng

nhận được tư xạ khuẩn nội sinh, một sô nhà sinh

học đã nghiên cứu sử dụng xạ khuẩn nội sinh như một yếu tô kiểm soát sinh học
(Biocontrol) trong suôt hai thập kỷ qua [47]. Khi sử dụng trong kiểm soát sinh học, vai
trò xạ khuẩn đã được chứng minh giúp tăng cường, thúc đẩy tăng trưởng của cây chủ,
giảm nguy cơ nhiễm mầm bệnh và tăng cường khả năng sống sót của cây chủ trong các
điều kiện khác nhau ... [58].Nói chung, sô chủng loại và sô lượng VSV nội sinh trong
thưc vật vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới nhiều hơn vùng lạnh và khô, trong cây tăng
trưởng nhanh và lâu năm nhiều hơn trong cây tăng trưởng chậm và ngắn ngày, trong cây
khỏe mạnh nhiều hơn trong cây phát triển ở môi trường ô nhiễm[58].
Xạ khuẩn đại diện cho một phần lớn cộng đồng vi sinh vật vùng rễ, đây là yếu tô
thuận lợi để chúng xâm nhiễm vào thưc vật và trở thành thể nội sinh. Cộng đồng xạ
khuẩn nội sinh bao gồm cả các loài Streptomyces và các loài khác không thuộc
Streptomyces, đều có thể có mặt trong mô thưc vật [45].
Theo một sô tác giả,tương tư các loài vi sinh vật khác, sư sinh ra hormone thưc vật
như IAA ở xạ khuẩn nội sinh là một trong những cơ chế để kích thích sư tăng trưởng của
cây chủ, tăng trọng lượng khô của lá, rễ và chiều dài rễ khiến cho cây phát triển khỏe

mạnh hơn. Mố i liên hệ giữa xạ khuẩn nội sinh với cây chủ và việc sản sinh ra các sản
phẩm tư
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh
vật

9


Luận văn tốt
nghiệp

Đào Ánh
Vân

nhiên có hoạt tính sinh học tạo ra cơ hội tìm ra các loại chế phẩm đặc hiệu có tiềm
năng ứng dụng trong bảo vệ thưc vật và kiểm soát nấm bệnh. Xạ khuẩn nội sinh có khả
năng hạn chế nấm gây bệnh trên cây chủ yếu dưa vào khả năng sinh tổng hợpcác chất có
hoạt tính sinh học như kháng sinh và các enzyme phá hủy thành tế bào. Xạ khuẩn nội
sinh cũng được công bô là có khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch thưc vật (ISR) [34,
43].
1.1.3. Mối quan hệ giữa thực vật và xạ khuẩn nội
sinh
Vi sinh vật nội sinh có lợi với thưc vật trong hầu hết các trường hợp. Thưc vật
che chở và cung cấp chất dinh dưỡng cho thể nội sinh, và thể nội sinh sẽ giúp tăng trưởng
thực vật. Ví dụ, xạ khuẩn nội sinh giúp tăng cường sư phát triển của rễ, hòa tan
phosphate làm tăng khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng của thực vật tư đất [58], cô định
nitơ và bảo vệ rễ chống nhiễm nấm [47, 53]Thông qua những hoạt động đó, endophyte có
thể thúc đẩy tăng trưởng cây chủ và giúp cây chủ chống chịu tôt hơn với điều kiện bất lợi
của môi trường. Mối quan hệ cộng sinh khá phổ biến giữa endophytes và thưc vật, nhưng
mố i quan hệ này có thể biến đổi tư hỗ sinh thành ký sinh, nếu một gen đơn (single gene)

bị biến đổi, có thể ảnh hưởng đến cơ chế hoạt động của VSV nội sinh với cây chủ[58].
1.1.4. Con đường xâm nhập của vi sinh vật vào cây
chủ
Có một sô cách thức để vi sinh vật xâm nhập vào bên trong cây và trở thành thể nội
sinh. Quá trình này thường bắt đầu tư sư tập trung của chúng ở vùng rễ. Khi đã sinh
trưởng được ở vùng rễ thì vi sinh vật bắt đầu bám lên bề mặt rễ. Đây là bước quan trọng
cho quá trình xâm nhập sau này. Một sô tác giả cho rằng vi sinh vật bám được lên bề
mặt rễ nhờ một sô thành phần trên bề mặt tế bào như lông tơ (pilli), liposaccharide hoặc
exopolysaccharide v.v. Những vị trí mà vi sinh vật lưa chọn để bám và xâm nhập thường
là vùng đầu rễ, nơi có lớp thành tế bào mỏng của đỉnh sinh trưởng, hoặc vùng lông rễ,
hoặc vùng gốc rễ nơi có những vết nứt nhỏ để rễ phụ trồi ra. Tại những vị trí đó vi sinh
vật sinh trưởng thành các khuẩn lạc siêu nhỏ gồm vài trăm tế bào. Để có thể xâm nhập dễ
dàng thì các vi sinh vật nội sinh phải có hệ enzyme phân hủy cellulose để phá lớp ngoài
của thành tế bào. Các enzyme phân hủy thành tế bào của vi khuẩn cũng được cho là kích
thích các cơ chế bảo vệ trong cây vì rất nhiều protein tham gia vào quá trình bảo vệ và
phục hồi đều nằm ở thành tế bào, được sinh tổng hợp nhằm ngăn chặn sư lan truyền của
mầm bệnh trong cây. Để trở thành thể nội sinh thì các vi sinh vật này phải có khả năng
tránh được đáp ứng miễn dịch của cây, hoặc làm giảm nó một cách đáng kể, một trong
những cách đó là xâm nhập vào cây tư các vết nứt nơi rễ phụ trồi ra, đây là trường
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh
10
vật


Luận
văn tốt
hợp được
giả thiết cho Azoacus và Burkholderia vietnamiensis[33].
nghiệp

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh
vật

11

Đào Ánh
Vân


Luận văn tốt
nghiệp

Đào Ánh
Vân

Sau khi tế bào vi sinh vật đã vượt qua được lớp biểu bì ngoài, chúng có thể nằm
ngay tại chỗ, hoặc di chuyển sâu hơn và xâm chiếm khoảng giữa các tế bào (apoplast)
trong vỏ cây. Vi sinh vật nội sinh khác vi khuẩn nôt sần ở cây họ đậu ở chỗ chúng không
xâm nhập vào bên trong tế bào thưc vật và tạo ra các tổ chức hình thái đặc biệt như trường
hợp của vi khuẩn nốt sần. Tuy vậy, cũng có trường hợp vi sinh vật nội sinh cũng tạo ra các
nôt sần.
Chỉ có một sô vi sinh vật có thể đi qua lớp bảo vệ bên trong và xâm nhập hệ
mạch dẫn (xylem) của thực vật. Tại đây vi sinh vật có thể sử dụng các chất dinh dưỡng
được vận chuyển trong hệ mạch như nước, ion và một sô chất hữu cơ có phân tử lượng
thấp như đường, axit amin và axit hữu cơ. Mặc dù nồng độ các chất dinh dưỡng trong hệ
mạch là rất thấp nhưng cũng đủ để duy trì sư sinh trưởng của thể nội sinh. Vi sinh vật nội
sinh có khả năng sử dụng các nguồn cac bon mà thông thường vi sinh vật vùng rễ không
sử dụng được, ví dụ D-sorbitol, D-galacturonic acid và L-arabinose là nguồn các bon
có sẵn trong hệ mạch dẫn của cây. Như vậy để trở thành thể nội sinh thì điều kiện tiên
quyết là vi sinh vật đó phải có khả năng sử dụng một sô hợp chất trao đổi chất của thưc

vật [33].
Thông thường thì nồng độ của chất dinh dưỡng trong hệ mao quản thực vật giảm
dần theo độ cao của cây. Điều này giải thích cho thưc tế là tính đa dạng và mật độ quần
thể vi sinh vật nội sinh giảm dần theo khoảng cách tư rễ trở lên, và chỉ một phần nhỏ vi
sinh vật đạt tới những phần trên của cây, lá và cơ quan sinh sản (hoa, quả và hạt). Một
sô vi sin h vật có thể xâm nhập vào cây qua các vị trí khác như khí khổng trên lá và trở
thành nội sinh. Chúng cũng có thể xâm nhập vào cây tư hoa quả và hạt, nhưng trường
hợp này thì thường là vi sinh vật gây bệnh [33].
1.1.5.Các phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh
Xạ khuẩn nội sinh cư trú trong mô thưc vật bị ảnh hưởng bởi các yếu tô môi
trường như: pH của đất, thành phần chất vô cơ và chất hữu cơ trong đất, lượng mưa,
cường độ ánh sáng mặt trời, không khí, nhiệt độ… Thêm vào đó, mật độ xạ khuẩn nội
cộng sinh nhìn chung thấp và phụ thuộc vào loại mô khác nhau trên thưc vật[39].
Theo các kết quả nghiên cứu đã công bố, quá trình phân lập xạ khuẩn nội sinh cần
xử lý bề mặt thưc vật nhằm loại bỏ vi khuẩn, vi nấm trên bề mặt. Vì vậy, phải khử
trùng bề mặt mẫu và cắt mẫu thành tưng mảnh bằng dụng cụ đã khử trùng trước khi phân
lập. Sodium hypochlorite (NaOCl) là một trong những tác nhân oxy hóa phổ biến được sử
dụng để khử trùng bề mặt, mẫu thưc vật có thể được ngâm trong ethanol nồng độ 70 ÷
90 % trong thời gian 1 ÷ 5 phút, sau đó được ngâm trong dung dịch NaOCl nồng độ 1 ÷ 5
%
trong
gian 3 ÷sinh
20 phút, tiếp12
theo rửa nhiều lần bằng nước vô trùng nhằm
Viện
Sinhkhoảng
thái vàthời
Tài nguyên
vật

Luận
loại văn tốt
nghiệp

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh
vật

Đào Ánh
Vân

13


Luận văn tốt
nghiệp

Đào Ánh
Vân

bỏ lượng NaOCl còn dư. Ngoài ra, hydroperoxide và clorua thủy ngân cũng được sử
dụng như chất khử trùng bề mặt hiệu quả [43]. Năm 1992, Sardi và cộng sư công bô sử
dụng hơi của propylene oxit để khử trùng bề mặt thay vì hóa chất khử trùng dạng
lỏng[41]. Hiệu quả khử trùng bề mặt được tăng cường bằng việc sử dụng các chất hoạt
hóa bề mặt như Tween
20 và Tween 80, làm tăng hiệu quả tác động của cơ chất khử trùng với bề mặt thưc
vật
[43].
Phần mẫu đã khử trùng được đặt vào trên môi trường thạch thích hợp, nuôi cấy ở
o

nhiệt độ thích hợp tư 25 ÷ 30 C. Trong quá trình phân lập, các nhà nghiên cứu thường gặp
phải VSV phát triển mạnh trong hai tuần đầu tiên vi khuẩn hoặc nấm tạp nhiễm trên phần
mẫu thưc vật. Để ngăn chặn sư sinh trưởng của vi khuẩn và nấm không mong muốn cũng
như tìm kiếm loại xạ khuẩn mới, một sô môi trường chọn lọc đã được sử dụng như: môi
trường humic acid - vitamin, môi trường thạch casein tinh bột, cao nấm men… bổ
sung
thêm các hợp chất kháng sinh như nystatin hoặc cycloheximide - ampicilin, acid
nalodixic và trimethoprim… Để ức chế vi khuẩn, nấm nội cộng sinh và nâng cao khả
năng phát triển chọn lọc của xạ khuẩn vì xạ khuẩn phát triển chậm hơn so với vi khuẩn và
nấm ... [43].
1.1.6. Phân loại xạ khuẩn nội
sinh
Các phương pháp phân loại xạ khuẩn thường dùng hiện nay là phương pháp
phân loại truyền thống (dưa trên đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy), phương
pháp phân loại bằng kỹ thuật phân tử (lai AND, ARN và phân tích rADN 16S) và phân
loại sô (dưa trên sư đánh giá về sô lượng mức độ giống nhau giữa các vi sinh vật theo
một độ lớn các đặc điểm, chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa. Để so sánh
các chủng với nhau tưng đôi một.
a. Phương pháp phân loại truyền
thống
Krainski (1914) lần đầu tiên đề ra các chỉ tiêu về đặc điểm sinh lý và coi đó là mấu
chốt trong nguyên tắc phân loại để sơ loại 17 chủng thuộc chi Actinomyces. Waksman và
Curtis (1916) đã đề cập đến những dạng trung gian trong mô tả phân loại của mình và coi
đặc điểm hình thái của bào tử là đặc tính quan trọng của các cá thể. Do vậy họ đã đưa
ra một sô loài mới ý nghĩa. Tiếp đó Millard và Burr (1926) tìm ra 17 loài, Jense n (19301931)
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh
vật

14

Luận
Đàoxạ
Ánh
– hai văn
loài,tốt
Dunche (1934) -13 loài. Baldacci và cộng sư đã bắt đầu nghiên cứu
khuẩn
nghiệp
Vân
tư năm 1936 và cho đến năm 1953 công bô một khóa phân loại chi Streptomyces dựa trên
cơ sở màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và một sô đặc điểm t rung gian khác
nhau. Năm 1943, Waksman và Henrici đã đưa ra một sô hệ thống phân loại và cho
đến năm
1961 có sửa đổi. Trong hệ thống này, xạ khuẩn được xếp thành nhóm gồm 3 họ, chia
thành

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh
vật

15


Luận văn tốt
nghiệp

Đào Ánh
Vân

10 chi và mô tả chi tiết hơn 250 loài thuộc chi Streptomyces. Krassilnikov là một trong
những chuyên gia nổi tiếng về nghiên cứu và phát triển khóa phân loại xạ khuẩn. Tư
năm
1941 đến năm 1949 ông đã phát hiện thêm 38 loài mới. Năm 1970, ông lại công bô
hệ thống phân loại mới dựa trên hệ thống đã công bô năm 1949 [56].Trong đó xạ khuẩn
được chia thành 6 họ, gồm 26 chi. Theo ông Actinomyces được dùng như một tên gọi
chung cho những loài thuộc chi Streptomyces mà Waksman và Henrici đã phác họa năm
1943.Một sô nhà nghiên cứu người Đức cho rằng chi Streptomyces là một nhóm lớn. Lần
đầu tiên họ sử dụng kính hiển vi điện tử để nghiên cứu đặc điểm bào tử của chi này.
Kutzner đã phát triển một sô khóa phân loại Streptomyces dưa trên cơ sở hình dáng cuống
sinh bào tử, cấu trúc hiển vi điện tử của bào tử, sư tạo sắc tô tan, hoạt phổ kháng khuẩn và
một sô đặc điểm sinh lí khác.Năm 1957, Gause và cộng sư đã công bô hệ thống phân loại
mới. Hệ thống này dưa vào màu sắc khuẩn ty khí sinh (KTKS), khuẩn ty cơ chất
(KTCC), hình dạng bào tử và cuống sinh bào tử. Hệ thống này cũng được chỉnh lý và tái
bản năm 1983. Sô lượng hệ thống phân loại xạ khuẩn ngày một tăng trong những năm
gần đây. Đó là hình thức phân loại truyền thống dưa trên đặc điểm hình thái và tính chất
nuôi cấy. Hình thức này hiện nay vẫn đang được sử dụng phổ biến.
b. Phương pháp phân loại sinh học phân
tử
Ngày nay nhờ sư phát triển cao của khoa học kĩ thuật, phương pháp phân loại
phân tử đã được sử dụng vào phân loại xạ khuẩn. Trong hệ thống phân loại xạ khuẩn hiện
nay người ta vẫn dùng ba phương pháp chính: lai AND, ARN và phân tích rADN 16S.
Kết quả được biểu hiện bằng sô phần trăm sư thống nhất (homology). Hiện nay, đại đa sô
các nhà khoa học đồng ý với quan niệm hai chủng được coi là hai loài riêng biệt nêu
chúng giố ng nhau dưới 70% khi tiến hành lai AND. Phân tích rADN 16S để liệt kê thứ tư
nucleotit đặc trưng của các cá thể và so sánh với bảng liệt kê của các cá thể khác để xác
định mức độ giống nhau của chúng. Keswani và cộng sư đã chứng minh rằng nếu sư
tương đồng giữa hai trình tư rADN 16S là 98,6% thì xác suất để mức độ giống nhau
trong phép lai AND thấp hơn 70% sẽ là 99%. Vì thế giá trị tương đồng 98,6% của trình
tư rADN 16S được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau. Tuy nhiên, cũng có

nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98% [30] .
c. Phân loại số
Phân loại sô đã được Williams và cộng sư (1983) sử dụng để phân loại chi
Streptomyces và các chi có quan hệ gần gũi [57]. Phương pháp này dưa trên sư đánh giá
về sô lượng mức độ giống nhau giữa các vi sinh vật theo một sô các đặc điểm, chủ yếu là
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh
16
vật


Luận
các văn tốt
nghiệp

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh
vật

Đào Ánh
Vân

17