luận án : Phân lập và xác định đặc tính sinh học của huyết thanh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN THÚ Y

ĐÀO THỊ HẢO

PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC
CỦA MYCOPLASMA GALLISEPTICUM VÀ CHẾ KHÁNG
NGUYÊN, KHÁNG HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI - 2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN THÚ Y

ĐÀO THỊ HẢO

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC
CỦA MYCOPLASMA GALLISEPTICUM VÀ CHẾ KHÁNG
NGUYÊN, KHÁNG HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN

CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC THÚ Y
MÃ SỐ: 62 42 50 10

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS-TS. CÙ HỮU PHÚ
TS. NGUYỄN NGỌC NHIÊN

HÀ NỘI - 2008


LỜI CẢM ƠN
Hoàn thành công trình nghiên cứu khoa học này, cùng với sự nỗ lực
cố gắng của bản thân, tôi xin được đặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai
thầy PGS-TS Cù Hữu Phú và TS Nguyễn Ngọc Nhiên, những người thầy đã
trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận Án.
Tôi xin cảm ơn Ban Giám đốc Viện Thú y, cùng các Phòng, Bộ môn, Cơ
sở Đào tạo sau đại học, đặc biệt là Bộ môn Vi trùng, đã tạo điều kiện cho tôi
thực hiện các đề tài khoa học và tiến hành các thí nghiệm liên quan đến Luận
Án.
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn tới PGS-TS Trương Văn Dung Giám
đốc dự án Jica, GS Kanameda, M., Mr. Kishima, M., Chuyên gia Dự án cũng
như Mrs. Imada,I., Viện Thú y Nhật Bản, đã tạo điều kiện cho tôi đến thực
tập và triển khai nghiên cứu, chẩn đoán về Mycoplasma là nội dung chính của
Luận Án.
Tôi xin được chân thành cảm ơn tới GS-TS Phan Thanh Phượng, người
thầy đã cho tôi những định hướng nghiên cứu đầu tiên của Luận Án.
Tôi luôn ghi nhớ công ơn của cố PGS-TS Lê Văn Tạo, người thầy luôn
quan tâm từng bước trong quá trình hoàn thành Luận Án.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo cùng cán bộ, nhân viên thuộc Trung
tâm Nghiên cứu gia cầm, Trung tâm Chẩn đoán Thú y Quốc gia, Trạm Nghiên

cứu và thử nghiệm thúc ăn gia súc Viện Chăn nuôi, đã tạo điều kiện cho tôi
thực hiện các nội dung của Luận Án.
Tôi xin cảm ơn tất cả các nhà khoa học, các bạn đồng nghiệp, gia đình
và bè bạn, đặc biệt là chồng và hai con tôi, đã luôn động viên giúp đỡ tôi
hoàn thành Luận Án.
Tác giả Luận Án


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án
này là hoàn toàn trung thực, do tôi khảo sát nghiên cứu có sự hợp tác và giúp
đỡ của tập thể trong và ngoài cơ quan, tôi chưa hề sử dụng để bảo vệ một học
vị nào.
Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm về số liệu trong bản luận án này
Hà Nội, ngày 04 tháng 06 năm 2008


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN
Bp
CFU
CRD
cs
GI
HA
HI
HT
IFA
IP
IS

KHT
KN
MA
MB
MG
MI
MIT
MM
MS
NDY
OIE
PBS
PCR
PPLO
RFLP
RA
RPA
RSA
WB

Axit deoxyribonucleic
Base pair
Colony Forming Unit
Chronic Respiratory Disease
Cộng sự
Growth Inhibition
Haemagglutination
Haemagglutination inhibition
Huyết thanh
Indirect Fluorescent Antibody

Immunoperoxydase
Infectious Sinusitis hay IS
Kháng huyết thanh
Kháng nguyên
Mycoplasma Agar
Mycoplasma Broth
Mycoplasma gallisepticum
Mycoplasma ioawe
Metabolism Inhibiton Test
Mycoplasma meleagridis
Mycoplasma synoviae
Nitten Dry Yeast
Office International des Epizooties
Photsphat Buffered Saline
Polymerase Chain Reaction
Pleuro - Pneumo Like - Organism
Restriction Flagment Length Polymorphism
Rapid Agglutination
Rapid Plate Agglutination
Rapid Slice Agglutination
Whole Blood Test


MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục ảnh
Danh mục bảng

Phần mở đầu

1

A. Tính cấp thiết của đề tài

1

B. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

2

Ý nghĩa khoa học

2

Ý nghĩa thực tiễn

3

C. Những đóng góp mới của luận án

3

Phần nội dung

4

Chương 1. Tổng quan tài liệu

4

1.1 Những nghiên cứu về mầm bệnh Mycoplasma gallisepticum(MG)

4

1.1.1 Một số điểm khái quát về Mycoplasma

4

1.1.2 Đặc điểm cấu trúc và huyết thanh học của MG

10

1.1.3 Đặc tính nuôi cấy của MG

11

1.1.4 Đặc tính gây bệnh của MG

11

1.1.5 Đặc tính sinh hoá của MG

12

1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do Mycoplasma ở gia cầm
1.2.1 Tình hình bệnh do Mycoplasma ở gia cầm trên thế giới

14

14


1.2.2 Tình hình bệnh do Mycoplasma ở Việt Nam
1.3 Bệnh do Mycoplasma ở gà

16
18

1.3.1 Nguyên nhân gây bệnh

18

1.3.2 Cách truyền lây và chất chứa mầm bệnh

22

1.3.3 Loài mắc bệnh và nhân tố ảnh hưởng tới dịch tễ

22

1.3.4 Triệu chứng của bệnh

23

1.3.5 Bệnh tích

26

1.3.6 Chẩn đoán

29

1.3.7 Điều trị

34

1.3.8 Biện pháp khống chế bệnh

35

1.4 Đặc tính miễn dịch của cơ thể gà trong bệnh do Mycoplasma

39

1.4.1 Đặc điểm về sự di truyền của các globulin miễn dịch từ mẹ
sang con

39

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự đáp ứng miễn dịch
Chương 2. Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

41
43

2.1 Nội dung nghiên cứu

43

2.1.1 Phân lập, xác định hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc tính
sinh vật hoá học của MG

43

2.1.2 Chế tạo và sử dụng kháng nguyên tự chế để xác định tỷ lệ
nhiễm bệnh Chronic Respiratory Disease (CRD) ở một số cơ sở
chăn nuôi gà công nghiệp
2.1.3 Chế kháng huyết thanh chẩn đoán và ứng dụng xác định vi
khuẩn Mycoplasma gallisepticum (MG), Mycoplasma synoviae
(MS) phân lập được
2.2 Nguyên liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

43

43

43
43


2.2.2 Nguyên liệu

44

2.2.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

45

2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp lấy và xử lý mẫu
2.3.2 Phương pháp phân lập, xác định hình thái, tính chất nuôi cấy,
đặc tính sinh vật hoá học của MG

45
45
45

2.3.3 Phương pháp phát hiện kháng thể

48

2.3.4 Phương pháp xác định kháng nguyên

49

2.3.5 Phương pháp phát hiện MG bằng phản ứng nhân gen
Polymerase Chain Reaction (PCR)

51

2.3.6 Phương pháp gây nhiễm thực nghiệm MG trên gà

54

2.3.7 Phương pháp chế kháng nguyên MG

57

2.3.8 Phương pháp chế kháng huyết thanh tối miễn dịch qua thỏ

59

2.3.9 Các phương pháp xử lý số liệu

61

Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

62

3.1 Kết quả phân lập, xác định hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc tính
sinh vật hoá học của vi khuẩn MG, MS

62

3.1.1 Xác định vi khuẩn MG, MS trên các mẫu bệnh phẩm

62

3.1.2 Giám định vi khuẩn MG, MS phân lập được

72

3.1.3 Gây nhiễm bằng MG trên gà để chọn chủng chế kháng nguyên

84

3.2 Chế kháng nguyên MG và đánh giá chất lượng kháng nguyên MG

89

3.2.1 Kết quả chế kháng nguyên

89

3.2.2 Xác định độ đặc hiệu của kháng nguyên

92

3.2.3 So sánh độ nhạy của kháng nguyên tự chế với kháng nguyên
của hãng Intervet- Hà Lan

93


3.2.4 Đánh giá chất lượng của kháng nguyên MG tự chế, so sánh
với kháng nguyên của hãng Intervet- Hà Lan

94

3.2.5 Xác định tỷ lệ nhiễm MG ở một số giống gà bằng kháng
nguyên tự chế

101

3.3 Chế kháng huyết thanh chẩn đoán và ứng dụng xác định vi khuẩn
MG, MS phân lập được

106

3.3.1 Chế kháng huyết thanh chẩn đoán

106

3.3.2 Ứng dụng kháng huyết thanh tự chế để xác định vi khuẩn
MG, MS phân lập được

110

Kết luận và đề nghị

112

I. Kết luận

112

II. Đề nghị

112

Các công trình liên quan

113

Tài liệu tham khảo

114

Phụ lục

133


DANH MỤC CÁC BẢNG
BẢNG SỐ

TÊN BẢNG

TRANG

1.1

Các đặc điểm phân biệt của giống Mycoplasma

7

1.2

Các đại diện Mycoplasma gây bệnh ở một số động vật

8

1.3

Các loài Mycoplasma phân lập từ gia cầm

9

1.4

Đặc điểm và tính chất của các serotype Mycoplasma
ở gia cầm

15

1.5

Tính chất sinh hoá của Mycoplasma ở gia cầm

16

2.1

Thành phần các chất trong phản ứng PCR xác định
MG, MS

53

2.2

Điều kiện trong phản ứng PCR xác định MG, MS

53

2.3

Gây nhiễm thực nghiệm MG trên gà

55

2.4

Quy trình gây miễn dịch trên thỏ

60

3.1

Xác định vi khuẩn MG, MS từ máu và dịch họng theo
lứa tuổi

63

3.2

Xác định vi khuẩn MG, MS từ máu và dịch họng ở
các cơ sở chăn nuôi

67

3.3

Phân lập vi khuẩn MG, MS từ mẫu phổi

70

3.4

Kiểm tra một số đặc tính sinh hoá và khả năng lên
men đường của các chủng MG, MS phân lập được

76

3.5

Giám định các chủng MG, MS phân lập bằng phương
pháp phát hiện kháng thể

77

3.6

Giám định các chủng MG, MS phân lập bằng phương
pháp xác định kháng nguyên

78

3.7

Giám định vi khuẩn phân lập được bằng phản ứng PCR

81

3.8

Kết quả giám định serotype của các chủng MG phân lập

83


3.9

Ứng dụng các phương pháp chẩn đoán khác nhau sau
gây nhiễm MG

85

3.10

Đánh giá kết quả của các phương pháp sau 35 ngày
gây nhiễm

86

3.11

Kết quả giám định vi khuẩn

88

3.12

Xác định độ thuần khiết, vô trùng của canh khuẩn chế
kháng nguyên

91

3.13

Kết quả xác định khả năng ngưng kết ở các lô KN
trước và sau khi bảo quản trong tủ lạnh

92

3.14

Xác định độ đặc hiệu của kháng nguyên

93

3.15

So sánh độ nhạy của kháng nguyên tự chế với kháng
nguyên Intervet

94

3.16

So sánh sự ngưng kết giữa các lô KN tự chế và KN
Intervet bằng phản ứng ngưng kết toàn huyết

95

3.17

So sánh sự ngưng kết giữa KN tự chế và KN Intervet

bằng phản ứng ngưng kết huyết thanh nhanh

96

3.18

Xác định nồng độ tối ưu của KN tự chế với huyết
thanh dương tính

98

3.19

Xác định hiệu giá ngưng kết của huyết thanh dương
tính bằng KN tự chế và KN Intervet- Hà Lan

100

3.20

Tỷ lệ nhiễm MG ở một số giống gà

101

3.21

Kết quả kiểm tra tỷ lệ nhiễm CRD bằng KN tự chế và
xác định vi khuẩn MG từ dịch họng bằng phương
pháp PCR

102

3.22

Kết quả xác định kháng thể trong máu của gà được
tiêm vacxin Nobilis® MGINAC

103

3.23

Thu hoạch kháng huyết thanh

107

3.24

Kiểm tra chất lượng kháng huyết thanh bằng phản
ứng ngưng kết nhanh

107


3.25

Xác định hiệu giá ngưng kết của kháng huyết thanh

108

3.26

Xác định kháng huyết thanh bằng phản ứng kết tủa
khuếch tán trên thạch

109

3.27

Ứng dụng KHT MG, KHT MS tự chế để xác định
các chủng Mycoplasma phân lập được

110


DANH MỤC ẢNH
SỐ

TÊN ẢNH

TRANG

3.1

Phản ứng Multiplex PCR xác định MG, MS trong bệnh
phẩm

64

3.2

Khuẩn lạc MS

75

3.3

Khuẩn lạc MG

75

3.4

Giám định MG, MS phân lập bằng phương pháp PCR

82

3.5

Khuẩn lạc MG, MS nhuộm Immunoperoxidaza

133

3.6

Phản ứng lên men đường

134

3.7

Phản ứng khuếch tán trên thạch

134

3.8

Lấy mẫu máu

135

3.9

Huyết thanh làm phản ứng ngưng kết nhanh

135

3.10

Phản ứng ngưng kết và ức chế ngưng kết hồng cầu

135

3.11

Nhân truyền giống qua trứng

136

3.12

Giết thỏ thu hoạch kháng huyết thanh

136

3.13

Chuẩn bị cấy chuyển giống chế kháng nguyên

136

3.14

Kiểm tra giống trên môi trường MA

137

3.15

Kết quả phản ứng ngưng kết khi pha loãng kháng nguyên

137

3.16

Sản phẩm kháng nguyên MG tự chế

137


1

PHẦN MỞ ĐẦU
A. Tính cấp thiết của đề tài
Trong sự phát triển kinh tế xã hội và tiêu dùng, với khoảng trên dưới
250 triệu gia cầm hàng năm, ngành chăn nuôi gia cầm đóng vai trò quan trọng
trong việc cung cấp thực phẩm ở nước ta.
Chính sách kinh tế thị trường mở cửa đã góp phần thúc đẩy sự phát
triển nhanh chóng, cũng như sự cạnh tranh mãnh liệt về mọi mặt trong ngành
chăn nuôi gia cầm, nhưng sự thiếu kiểm soát chặt chẽ việc vận chuyển động
vật và sản phẩm động vật xuyên biên giới hay từ vùng này sang vùng khác, đã
dẫn đến việc du nhập và xuất hiện nhiều loại bệnh mới ở nước ta. Bệnh dịch
đã làm ảnh hưởng rất lớn và nhiều mặt đối với sự phát triển kinh tế xã hội,
hoạt động thương mại và sức khỏe con người.
Chính vì thế, công tác kiểm dịch và phòng chống bệnh ngày càng được
quan tâm. Bên cạnh việc tập trung kiểm soát và khống chế các bệnh mới xuất
hiện như dịch cúm gia cầm, nổ ra từ cuối năm 2003, các bệnh truyền nhiễm
như hội chứng giảm đẻ ở gà (Egg Drop Syndrome), bệnh viêm khí quản
truyền nhiễm (Infectious Bronchitis), bệnh viêm sổ mũi truyền nhiễm
(Infectious Coryza) … cũng dần được khống chế. Song, vì nhiều lí do khác
nhau, việc nghiên cứu chuyên sâu một số bệnh vẫn còn hạn chế, trong đó có
bệnh do Mycoplasma ở gia cầm, nguyên nhân chính là Mycoplasma
gallisepticum (MG) gây ra.
Bệnh làm giảm sức đề kháng của gà, giảm chất lượng và tỷ lệ thịt xẻ
của đàn gà thịt. Trong đàn mái đẻ, bệnh ở dạng ẩn tính làm giảm tỷ lệ trứng,
tăng tỷ lệ chết phôi trong quá trình ấp nở hoặc gà con nở ra không khoẻ mạnh.
Đối với gà con, bệnh gây chết tỷ lệ không cao, chủ yếu là giảm khả năng sinh
trưởng làm cho gà kém phát triển và tiêu tốn nhiều thức ăn trong chăn nuôi,


2

tạo cơ hội cho các bệnh khác phát triển.
Với các trại gà lớn, việc chẩn đoán chủ yếu dựa vào triệu chứng và
bệnh tích mà triệu chứng của bệnh chủ yếu ở dạng ẩn tính, biểu hiện không rõ
ràng nên gây nhiều khó khăn cho người làm công tác thú y.
Ở một số trại gà giống, việc chẩn đoán bằng phản ứng ngưng kết nhanh
đã được thực hiện, nhưng kháng nguyên Mycoplasma dùng để chẩn đoán vẫn
phải nhập từ nước ngoài với giá thành cao nên ảnh hưởng đến lợi ích kinh tế
cho người chăn nuôi.
Bên cạnh đó, các loại kháng huyết thanh dùng để định týp vi khuẩn
trong phòng thí nghiệm cũng phải nhập ngoại nên không được sử dụng rộng
rãi trong các phòng thí nghiệm.
Trong công tác chẩn đoán, việc phân lập ra vi khuẩn, xác định các đặc
tính gây bệnh của mầm bệnh, nhằm mục đích phát hiện sớm và tìm ra hướng
phòng và trị bệnh có hiệu quả luôn là những việc làm cấp thiết. Xuất phát từ
thực tiễn nghiên cứu và yêu cầu của sản xuất, chúng tôi tiến hành nghiên cứu
đề tài:

"Phân lập, xác định một số đặc tính sinh học của Mycoplasma
gallisepticum và chế kháng nguyên, kháng huyết thanh chẩn đoán”
B. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1. Kết quả nghiên cứu của đề tài có những ý nghĩa khoa học sau đây:
- Bổ sung những tư liệu về bệnh do Mycoplasma ở gà trong điều kiện
chăn nuôi hiÖn nay ở Việt Nam.
- Xác định được các chủng Mycoplasma phổ biến gây bệnh trên đàn gà
chăn nuôi cụ thể ở Việt Nam và vai trò của chúng trong hội chứng bệnh
đường hô hấp của gà.
- Nghiên cứu được quy trình chế tạo kháng nguyên, kháng huyết thanh
cho chẩn đoán bệnh.

3
2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:
- Đưa ra các phương pháp chẩn đoán và giám định Mycoplasma, có thể
xây dựng thành quy trình thường quy.
- Chế tạo thành công chế phẩm kháng nguyên và kháng huyết thanh
giúp cho việc chẩn đoán Mycoplasmosis nhanh và chi phÝ giảm so với việc sử
dụng các chế phẩm tương tự ngoại nhập.
C. Những đóng góp mới của luận án:
Luận án đã có một số đóng góp mới sau:
- Phân lập và xác định được các chủng Mycoplasma phổ biến gây bệnh
trên đàn gà nuôi tại Việt Nam.
- Kết quả nghiên cứu là cơ sở để xây dựng phương pháp thường quy
chẩn đoán bệnh do Mycoplasma.
- Lần đầu tiên nghiên cứu chế tạo được kháng nguyên và kháng huyết
thanh phục vụ chẩn đoán bệnh do Mycoplasma ở gà tại nước ta.


4

PHẦN NỘI DUNG
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Những nghiên cứu về mầm bệnh Mycoplasma gallisepticum (MG)
1.1.1 Một số điểm khái quát về Mycoplasma
Trong phân loại học, Mycoplasma thuộc lớp Mollicutes (Mollis có
nghĩa là mềm, cutes có nghĩa là vỏ bọc, da). Lớp vi khuẩn này có khoảng 176
loài, chúng phân bố rộng trong tự nhiên gây bệnh ở động vật có vú, chim, bò
sát, chân đốt, thực vật và cá (Dybvig và Voelker, 1996)[48].
Hệ thống phân loại của Mycoplasma trong lớp Mollicutes được xác
định như sau ( Razin và cs, 1998)[123] (xem sơ đồ trang bên).
Theo phân loại, Mycoplasma là vi sinh vật có vị trí xếp giữa vi khuẩn

và virus. Mycoplasma là vi thể sống có thành tế bào không ổn định, chúng
được bao bọc bởi màng Plasma gồm các thành phần protein, glycoprotein,
glycolipit và phospholipit, hình dạng lúc là hình cầu, hình xoắn, lúc là hình
sợi hoặc vòng, kích thước tối thiểu có đường kính 0,3 μm nhưng do hình
dạng luôn thay đổi nên có thể qua lọc màng lọc 0,22 μm, Mycoplasma là vi
trùng có khả năng tự nhân đôi với kích thước nhỏ nhất (Yoder và Hofstad,
1964)[154], (Razin, 1992)[122].
Mycoplasma không giống với virus ở chỗ chúng có thể sinh trưởng và
phát triển trên môi trường nhân tạo không có tế bào. Trước kia, Mycoplasma
thường bị nhầm với vi khuẩn dạng L (L-form bacteria), dạng vi khuẩn không
có thành tế bào, nhưng vi khuẩn dạng L không có sterols ở trong màng
nguyên sinh và chúng có thể chuyển thành dạng có thành tế bào khi thay đổi
môi trường sống.
Để phân biệt giữa vi khuẩn dạng L-form với Mycoplasma có thể làm
như sau:


Mycoplasma taceae

Mycoplasma tales

Entomoplasma tacea

Anaeroplasma tales

Anaeroplasm aceae

Acholeplasma tales

Acholeplasma taceae

Acholeplasma
(13 loài)

Spiroplasmataceae acea

Entomoplasm tales

Mollicutes

Hệ thống phân loại Mycoplasma (Razin và cs 1998) [123]

5

Spiroplasma
(33 loài)

Asteroleplasma
(1 loài)

Anaeroplasma
(4 loài)

Mesoplasma
(12 loài)

Entomoplasma
(5 loài)

Ureaplasma

(6 loài)

Mycoplasma
(102 loài)


6
- Cấy chuyển vi khuẩn nghi dạng L-form sang môi trường không có
kháng sinh, vi khuẩn L-form sẽ trở lại khuẩn lạc bình thường có thể qua 5 lần
cấy chuyển.
- Nhuộm khuẩn lạc với thuốc nhuộm để nhận biết vi khuẩn và phân
biệt Mycoplasma với vi khuẩn dạng L-form, khuẩn lạc Mycoplasma giữ màu
thuốc nhuộm, khuẩn lạc vi khuẩn dạng L-form làm mất màu thuốc nhuộm.
Mycoplasma có khả năng kháng lại những kháng sinh ức chế tổng hợp
thành tế bào, nhạy cảm với các chất tẩy, cồn, kháng thể, bổ thể (Maniloff và
cs, 1992)[98]. Mycoplasma đòi hỏi thành phần dinh dưỡng khá nghiêm ngặt
trong quá trình nuôi cấy, có xu hướng thâm nhập và phát triển sâu vào trong
môi trường thạch.

Vùng trung tâm
Vùng ngoại vi

Bề mặt thạch
Khuẩn lạc phát triển trong
thạch
Ảnh minh hoạ: Khuẩn lạc Mycoplasma
Không có bất cứ một loại môi trường nào có thể phù hợp với tất cả các
Mycoplasma, nhưng hầu hết các môi trường nuôi cấy Mycoplasma đều được
chuẩn bị từ các thành phần chính là nước chiết tim bê, péptôn, chất chiết nấm
men, huyết thanh và các thành phần khác. Nhu cầu cholesterol trong thành

phần môi trường nuôi cấy là một đặc điểm để phân loại Mycoplasma. (Bảng
1.1)


7
Bảng 1.1: Các đặc điểm phân biệt của giống Mycoplasma (Mollicutes)
(Razin và cs, 1998)[123]
Giống

Cần Cholesterol

Nơi cư trú

+

Động vật

+

Động vật

Acholeplasma

-

ĐV, đất và nước
thải

Spiroplasma

+

Anaeroplasma

v

Mycoplasma

Ureaplasma

Các đặc điểm khác
Nhiều loài là tác
nhân gây bệnh ở ĐV.
pH 7.5
Một số gắn với
bệnh tật pH 6.0
Sản sinh Urea
Sống hoại sinh.

Dạng xoắn ốc và di
động.
Dạ cỏ cừu và trâu bò Sống hội sinh, kỵ khí.
TV, côn trùng

(+): Cần Cholesterol; (-): Không cần Cholesterol;
v= Thay đổi về nhu cầu Cholesterol. ĐV: Động vật . TV: Thực vật

Các loài Mycoplasma gây bệnh chủ yếu ở đường hô hấp của người và
động vật, chúng tập trung ở niêm mạc, màng nhầy của vật chủ, trong khi đó
các giống Ureaplasma gây bệnh cho người và động vật chủ yếu ở đường tiết

niệu và trong quá trình trao đổi chất, chúng cần urea, các giống Spiroplasma
gây bệnh trên thực vật và côn trùng, còn các giống Acholeplasma gây bệnh
chủ yếu cho động vật, một số ít gây bệnh cho thực vật và côn trùng, ngoài ra
chúng còn được tìm thấy ở ngoài tự nhiên như trong phân, nước cống.
Cùng với khả năng gây bệnh trên người và động vật, Mycoplasma còn
có trong các chế phẩm sinh học như vacxin, môi trường nuôi cấy tế bào và
gây ra những khó khăn rất lớn trong nghiên cứu cũng như trong công nghệ
sinh học sử dụng tế bào nuôi.
Các đại diện Mycoplasma gây bệnh ở một số động vật được trình bày ở
bảng 1.2


8
Bảng 1.2 : Các đại diện Mycoplasma gây bệnh ở một số động vật có vú
(Theo Razin và cs, 1998) [123]
Vật chủ

Bệnh
Viêm phổi
Viêm khớp
Viêm vú
Sảy thai
Viêm âm đạo
Chưa xác định rõ

Căn nguyên
M.mycoides,M.bovis, M.dispa. Ureaplasmas
M.bovis, M.bovigenitalium
Trâu, bò
M.bovis, M.canifornicum

M.bovis
Ureaplasmas, M.bovigenitalium
M.bovirhinis M.alkalescens, M.arginini,
M.modicum,
M.ladlawii,
M.bovoculi,
M.verecundum, M.canadense, Malvi
Viêm phổi
M.hyopneumoniae
Lợn
Viêm khớp
M.hyorhinis, M.hyosynoviae
Chưa xác định
M.flocculare,
M.suali,
A.axanthum,
Agranulaeum, M.hyopharyngis,
Viêm phổi
M.ovipneumoniae
Dê và cừu Viêm phổi, viêm M.mycoides, Loài phụ, Capi, M.mycoides, Loài
khớp, viêm vú
phụ mycoide, Magalactiae, M.putrefaciens
Viêm màng kết M.conjunctivae, M.capricolum
viêm phổi, viêm
khớp, viêm vú
Chưa rõ
M.arginini, M.oculi
Chưa rõ
M.equigentalum, M.equirhinis, M.subdolum.
Ngựa

M.felis,
M.arginini,
M,salivrum,
A.equifetable, Ahippikon, A.laidlawii
Viêm phổi
M.pulmonis
Chuột
Viêm khớp
M.arthitidis
Rối loạn thần kinh M.neurolyticum
Chưa rõ
M.caviae
Chuột
lang
Viêm phổi
M.cynos
Chó
Chưa rõ
M.spumans, M.maculosum, M.edwardii,
M.molare, M.canis, M.opalescens.
Viêm
phổi
M.felis, M.feliminutum, M.gateae.
Mèo
Các Mycoplasma có xu hướng khá đặc trưng cho từng loài vật chủ, phân
bố của bệnh trên toàn thế giới, có nhiều loài phân lập được từ chim và động


9
vật mà tình trạng bệnh hiện tại chưa xác định được. Mycoplasma thường bám

chắc vào các màng nhầy của vật chủ và một số khác cố định vào các tế bào
bằng cấu trúc đặc hiệu. Vi khuẩn sống ngoài tế bào, sản sinh ra hemolysine,
và một số yếu tố độc tố dẫn tới gây chết tế bào vật chủ hay gây nên bệnh mãn
tính. Đường hô hấp và phổi thường là nơi bị nhiễm trùng, Mycoplasma có khả
năng phá huỷ các lông nhung ở đường hô hấp tạo điều kiện cho vi khuẩn kế
phát xâm nhập. Sự lây truyền bệnh thường qua giao phối, mẹ sang con hoặc
qua không khí và rất quan trọng đối với gia cầm là truyền lây qua trứng. Việc
xác định tương quan giữa vật chủ và Mycoplasma là mối quan tâm của nhiều
nhà nghiên cứu nhằm tạo ra hướng phòng trị bệnh có hiệu quả (Rosengarten,
2001)[131].
Giống Mycoplasma có nhiều loài, trên gia cầm 16 loài Mycoplasma
được phân lập từ gà và gà tây, 7 loài được phân lập từ ngỗng và vịt, một vài
loài được phân lập từ bồ câu (Stipkovits và Kempf, 1996)[139]. (Bảng 1.3)
Bảng 1.3: Các loài Mycoplasma phân lập từ gia cầm
(Stipkovits và Kempf, 1996)[139]
Loài
M. gallisepticum
M. synoviae
M. meleagridis
M. iowae
M. iners
M. gallinarum
M. gallopavonis
M. gallinaceum
M. pullorum
A. equifetale.
A. axanthum

Vật chủ
Gà, gà tây, vịt

Gà, gà tây, chim
Gà, gà tây
Gà tây, gà
Ngỗng
Lớp chim
Gà tây
Gà
Gà, gà tây
Gia cầm
Vịt, ngỗng

Loài
A. laidlawii
M. cloacale
U. gallorale
M. anseris
M. imitans
M. anatis
M. glycophilum
M. lipofaciens
M. columbinum
M. columbinasale
M. columborale

Vật chủ
Gia cầm, tự nhiên
Nhiều vật chủ
Gà, gà tây
Nhiều vật chủ
Vịt, ngỗng

Vịt, ngỗng
Vịt, ngỗng
Vịt, ngỗng
Bồ câu
Bồ câu
Bồ câu


10
Trong các loài Mycoplasma đã được phân lập, MG là loài gây bệnh chủ
yếu cho gà và bệnh do MG ở gia cầm được xếp vào danh sách B của các bệnh
truyền nhiễm nguy hiểm ở gia cầm do Tổ chức Dịch tễ Thế giới OIE (2000)
[112] đánh giá. Theo Yoder năm 1990[157], MG thuộc týp huyết thanh A.
1.1.2 Đặc điểm cấu trúc và huyết thanh học của MG
- Hình thái:
Mycoplasma là loại vi sinh vật đa hình thái, có hình sợi, hình nhẫn, kích
thước xấp xỉ 0,1 µm ÷ 0,8 µm. Vi khuẩn MG có kích thước nhỏ 0,25 µm ÷
0,5 µm, thành tế bào không ổn định, bắt mầu tốt với thuốc nhuộm Giemsa.
Hai hình dạng thường thấy nhất là hình quả lê và hình chai với cấu trúc đầu
chóp trên có các cơ quan bám dính giúp MG có khả năng bám vào thành tế
bào vật chủ (Razin, 1992)[122], (Razin và cs, 1998)[123].
- Cấu tạo:
Trong cấu tạo của MG người ta thấy các chất đặc trưng đối với các tế
bào vi khuẩn (các mucotit). Lớp vỏ ngoài cùng của MG chỉ là màng nguyên
sinh chất dài 75A0 ÷ 100A0. Trong tế bào MG có thể tìm thấy hạt Riboxom có
đường kính 0,2 µm và các sợi nhân. Đây là vi sinh vật có khả năng tự nhân
đôi có kích thước nhỏ nhất.
Hai đặc điểm của MG khác biệt với các vi khuẩn khác là kích thước
genome và thành phần các bazơ nitơ của ADN, MG có cả ADN và ARN, nó
mang bộ gen nhỏ nhất trong tất cả các cơ thể sống tự do. Chủng R(low) của

MG có kích thước toàn bộ là 996422 bp (Papazisi và cs, 2003)[117]. Các cơ
thể sống của lớp này có ít hơn 300 gen, tổng thành phần Guanine (G) và
Cystosine trong ADN thấp và tỉ lệ đó phân bố không đều trên bộ gen (Marois
và cs, 2001)[104], có vùng rất cao lại có vùng rất thấp. Một cơ thể sống có
kích thước và số lượng nhỏ như vậy nhưng nó cũng thể hiện là một mầm bệnh
tương đối hoàn chỉnh và thực hiện rất nhiều chức năng của một cơ thể sống


11
chứng tỏ tính tổ chức và sự điều hành của bộ gen của MG khá hoàn chỉnh.
Hầu hết các nhà nghiên cứu đều cho rằng các loài Mycoplasma gây
bệnh đường hô hấp mãn tính ở gà đều thuộc týp huyết thanh A, đặc trưng là
chủng S6 (Zander, 1961)[160]. Nhưng theo Adler và cs (1958)[24] cho rằng
có ít nhất hai týp huyết thanh ở gà và gà tây. Cho đến năm 1964 đã phát hiện
ra 12 týp huyết thanh khác nhau của các mầm bệnh và được đặt theo thứ tự
ABC tới L. Theo Yoder, (1990)[157], đặc điểm và tính chất týp huyết thanh
của MG được thể hiện như sau:
Týp huyết thanh: A

Lên men Glucoza:

+

Giống, loài:

MG

Đòi hỏi huyết thanh:

+

HA:

+

Chuyển hoá Arginine: -

Gây bệnh:

Gà và gà tây.

1.1.3 Đặc tính nuôi cấy của MG
MG có thể mọc tốt trên môi trường thạch giàu huyết thanh có từ 10% ÷
20% huyết thanh ngựa hoặc lợn, hình thái các khuẩn lạc nhỏ có dạng trứng ốp
lếp đặc trưng. Trong môi trường lỏng, MG làm môi trường vẩn đục nhẹ.
Để có thể phân lập và tạo thành dòng phân lập thuần khiết, trước hết
phải nuôi cấy lặp lại nhiều lần trên môi trường thạch, chọn ra một khuẩn lạc
thuần, đặc trưng, sau đó nuôi cấy trong môi trường nước thịt để làm các phản
ứng tiếp theo.
Môi trường nước thịt thường được sử dụng nuôi cấy MG để sản xuất
kháng nguyên (Capenter và cs, 1981)[38].
MG làm tan hồng cầu ngựa hoàn toàn trong môi trường đặc và gây
ngưng kết hồng cầu gà, gà tây. MG cũng có thể nuôi cấy trên phôi gà (Zain và
Bradbury, 1996)[159].
1.1.4 Đặc tính gây bệnh của MG
Mầm bệnh MG có thành tế bào không ổn định nên hình dạng của nó rất


12
dễ bị biến đổi, nó có thể có dạng hình cầu đến hình sợi mảnh, có cơ quan bám

dính ở một đầu, cơ quan này có hình cầu, nhô ra và được gọi là “bleds”. Khi
mầm bệnh xâm nhập vào vật chủ, nó chui vào giữa các nhung mao niêm mạc
đường hô hấp hoặc đường sinh dục. Phần bleds của vi khuẩn bám vào phần
đuôi sialic của thụ quan sialoglycoprotein hoặc sialoglycolipit của tế bào vật
chủ. Sự bám dính này đủ chắc để nó không bị đào thải ra ngoài bởi nhu động
và quá trình tiết dịch của niêm mạc. MG có thành tế bào không ổn định nên
cũng có hiện tượng hoà nhập giữa màng tế bào vật chủ và màng nguyên sinh
của vi khuẩn, các enzym thuỷ phân, neuraminidase, peroxidaza heamolysin và
các loại độc tố khác được đưa vào tế bào vật chủ. Những tác động đó có thể
dẫn tới tế bào bị tổn thương, thoái hoá và cơ thể có thể có những đáp ứng
miễn dịch và sốt. Hơn nữa, do có sự xâm nhập của tế bào đơn nhân tới phần
mô bào của lớp dưới niêm mạc, do một số lượng lớn tế bào lympho và đại
thực bào thẩm xuất dẫn tới sự dày lên của phần tổ chức bị tấn công. Mầm
bệnh gây tổn thương các cơ quan hô hấp, tuần hoàn ở phổi làm rối loạn toàn
bộ cơ thể gà bệnh. Mầm bệnh có thể kết hợp với một số vi khuẩn, virus khác
làm tổn thương niêm mạc đường hô hấp, con vật gầy sút nhanh rồi chết
(Archibald, 1944)[28].
1.1.5 Đặc tính sinh hoá của MG
1.1.5.1 Phản ứng lên men đường glucoza
Các vi khuẩn thuộc lớp Mollicutes được phân làm hai nhóm lớn là
Mycoplasma lên men glucoza và không lên men glucoza. Vì vậy, phản ứng
chuyển hoá glucoza là một trong những phản ứng bắt buộc trong quá trình xác
định Mycoplasma.
Những kỹ thuật để xác định khả năng lên men đường glucoza dựa trên
sự giảm pH của môi trường nuôi cấy trong quá trình phát triển của vi khuẩn
với điều kiện có glucoza hoặc dựa trên các biện pháp kiểm tra trực tiếp như: