nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của dịch chiết bọ mắm (pouzolzia sp ) thu hái tại thái nguyên

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA
DỊCH CHIẾT BỌ MẮM (POUZOLZIA SP.)
THU HÁI TẠI THÁI NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2018


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ NHUNG
MSV: 1301301

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA
DỊCH CHIẾT BỌ MẮM (POUZOLZIA SP.)
THU HÁI TẠI THÁI NGUYÊN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1.
2.

TS. Bùi Thị Thúy Luyện

DS. NCS. Nguyễn Thanh Tùng

Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dược

HÀ NỘI - 2018


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn trân trọng và sâu sắc tới TS. Bùi Thị
Thúy Luyện, tổ Chiết xuất- bộ môn Công nghiệp Dược- Trường Đại học Dược
Hà Nội và DS.NCS. Nguyễn Thanh Tùng, bộ môn Dược liệu – Trường Đại học
Dược Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt thời gian
thực hiện đề tài.
Em cũng được gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS. Nguyễn Văn Hân và
PGS.TS. Nguyễn Thu Hằng và tập thể cán bộ, giảng viên của bộ môn Công
nghiệp Dược và bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình
giúp đỡ và tạo điều kiện giúp em hoàn thành đề tài này.
Trong quá trình học tập, triển khai làm đề tài và những gì đạt được hôm nay,
em xin cảm ơn công lao giảng dạy và hướng dẫn của thầy cô giáo Trường Đại
học Dược Hà Nội.
Và em cũng xin cảm ơn gia đình, bạn bè, anh chị những người luôn bên em,
giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập, nghiên cứu, hoàn thành đề tài
tại Trường đại học Dược Hà Nội này.
Dù đã có nhiều cố gắng, song đề tài còn có những thiếu sót. Kính mong
nhận được sự chia sẻ và nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của các thầy
cô giáo.
Em xin trân trọng cảm ơn.
Hà Nội, tháng 05 năm 2018
Sinh viên

Đỗ Thị Nhung


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .........................................................................................................
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT...........................................
DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH .......................................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................. 2
1.1. Tổng quan về chi Pouzolzia L. ................................................................. 2
1.1.1. Vị trí phân loại ................................................................................... 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật............................................................................... 2
1.1.3. Một số loài thuộc chi Pouzolzia ở Việt Nam ...................................... 2
1.2. Tổng quan về cây Bọ mắm (Pouzolzia zeylanica (L.) Benn.).................. 4
1.2.1. Đặc điểm thực vật............................................................................... 4
1.2.2. Phân bố............................................................................................... 4
1.2.3. Bộ phận dùng...................................................................................... 4
1.2.4. Các nghiên cứu về thành phần hóa học ............................................. 4
1.2.5. Các nghiên cứu về tác dụng sinh học................................................. 9
1.2.6. Công dụng ........................................................................................ 10
1.2.7. Một số bài thuốc có Bọ mắm ............................................................ 11
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 12
2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................. 12
2.2. Nguyên liệu............................................................................................. 13
2.2.1. Hóa chất .............................................................................................. 13
2.2.2. Dụng cụ ............................................................................................... 13
2.2.3. Thiết bị ................................................................................................ 13
2.3. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 14
2.4. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 14

2.4.1. Phương pháp chiết xuất ................................................................... 14
2.4.2. Phương pháp sàng lọc hoạt tính sinh học ........................................ 14
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học ................................ 17
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................... 19


3.1. Chiết xuất dịch chiết ethanol toàn phần và các dịch chiết phân đoạn ...... 19
3.2. Kết quả sàng lọc hoạt tính sinh học của dịch chiết và phân đoạn của Bọ
mắm .................................................................................................................. 20
3.2.1. Tác dụng gây độc tế bào ung thư ........................................................ 20
3.2.2. Tác dụng bắt giữ gốc tự do DPPH ..................................................... 20
3.2.3. Tác dụng chống dị ứng ....................................................................... 21
3.3. Nghiên cứu thành phần hóa học................................................................ 22
3.3.1. Định tính sơ bộ một số nhóm chất hữu cơ trong các phân đoạn bằng
phản ứng hóa học.......................................................................................... 22
3.3.2. Phân lập hợp chất từ các phân đoạn có hoạt tính tốt .......................... 27
3.4. Bàn luận .................................................................................................... 32
3.4.1. Về tác dụng sinh học ........................................................................... 32
3.4.2. Về thành phần hóa học ....................................................................... 33
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................
PHỤ LỤC ................................................................................................................


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABTS

2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)

Amẫu chứng

Độ hấp thu tại giếng không chứa chất thử

Amẫu thử

Độ hấp thu tại giếng chứa chất thử

CH2Cl2

Dicloromethan

DĐVN IV

Dược điển Việt Nam IV

DMSO

Dimethyl sulfoxid

DPPH

2, 2-diphenyl-1-picryhydrazyl

EC50

Nồng độ hiệu quả trung bình

EtOAc

Ethyl acetat

EtOH

Ethanol

IC50

Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử

LC50

Liều lượng của hoá chất phơi nhiễm trong cùng một thời điểm,
gây ra cái chết cho 50% (một nửa) của một nhóm động vật dùng
thử nghiệm

LC90

Là liều lượng của hoá chất phơi nhiễm trong cùng một thời điểm,
gây ra cái chết cho 90% của một nhóm động vật dùng thử nghiệm

NO

Nitric oxid

P.

Pouzolzia

TT

Thuốc thử

v/v

Thể tích/thể tích


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Nội dung

Trang

Bảng 2.1

Tên hóa chất, nguồn gốc

13

Bảng 3.1

Tác dụng trên các dòng tế bào ung thư của các dịch chiết

20

Bảng 3.2

Tác dụng chống oxi hóa của các dịch chiết

21

Bảng 3.3

Tác dụng chống dị ứng của các dịch chiết

21

Bảng 3.4

Kết quả các thí nghiệm định tính

26

Bảng 3.5

Kết luận định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ

27

Bảng 3.6

Số liệu phổ NMR của hợp chất PZ1

29

Bảng 3.7

Số liệu phổ NMR của hợp chất PZ3

31


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình

Tên hình

Trang

Hình 1.1

Thành phần flavonoid từ Bọ mắm (P. zeylanica)

5

Hình 1.2

Thành phần lignan từ Bọ mắm (P. zeylanica)

6

Hình 1.3

Thành phần triterpenoid từ Bọ mắm (P. zeylanica)

7

Hình 1.4

Các thành phần hóa học khác có trong Bọ mắm (P.

8

zeylanica)
Hình 2.1.

Hình ảnh dược liệu Bọ mắm thu hái ở Thái Nguyên

12

Hình 3.1

Sơ đồ quy trình chiết xuất Bọ mắm

19

Hình 3.2

Sơ đồ phân lập hợp chất

27

Hình 3.3

Cấu trúc hóa học của hợp chất PZ1

30

Hình 3.4

Cấu trúc hóa học của hợp chất PZ3

30


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây Bọ mắm thuộc chi Pouzolzia, hay còn gọi là cây thuốc giòi, là một cây
thuốc quen thuộc trong các bài thuốc cổ truyền của Việt Nam. Ở nước ta, Bọ
mắm phân bố rải rác khắp nơi ở các tỉnh vùng núi thấp và trung du [6]. Trong y
học cổ truyền Việt Nam, cây Bọ mắm được sắc hoặc nấu thành cao chữa bệnh
ho lâu năm, ho lao, viêm họng, dùng làm thuốc mát và thông tiểu, thông sữa, có
nơi dùng lá giã nát nhét vào răng sâu chữa sâu răng [6]. Hiện nay, các nghiên
cứu cho thấy các thành phần hóa học chính của Bọ mắm có thể kể tới như
flavonoid, triterpenoid và lignan; các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cây
Bọ mắm mới chỉ tập trung nhiều ở phân đoạn dịch chiết bao gồm: tác dụng
kháng khuẩn và kháng nấm của dịch chiết cồn [23], [24]; tác dụng kháng viêm
của dịch chiết methanol [11], tác dụng chống oxi hóa của dịch chiết phân đoạn
ethyl acetat [17], hoạt tính hạ đường huyết của dịch thuốc sắc Bọ mắm [15] và
tác dụng gây độc tế bào ung thư của cắn chiết phân đoạn ethyl acetat, n-butanol
trên tôm nước mặn [25]. Mặc dù là một cây thuốc có tính ứng dụng cao và
nguồn nguyên liệu rất dồi dào, tuy nhiên, cho đến hiện nay, các nghiên cứu về
thành phần hóa học và tác dụng sinh học của Bọ mắm mới chỉ tập trung ở nước
ngoài, ở Việt Nam vẫn có rất ít nghiên cứu về cây thuốc này.
Vì vậy, với mong muốn cung cấp các cơ sở dữ liệu về thành phần hóa học
và tác dụng sinh học của dược liệu Bọ mắm ở Việt Nam, chúng tôi đã thực hiện
đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Bọ mắm
(Pouzolzia sp.) thu hái tại Thái Nguyên” với các mục tiêu sau:

- Chiết xuất dịch chiết toàn phần và các dịch chiết phân đoạn của cây Bọ
mắm.
- Sàng lọc hoạt tính sinh học dịch chiết toàn phần và các phân đoạn chiết.
- Định tính một số nhóm chất hữu cơ từ các phân đoạn có hoạt tính cao.
- Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ phân đoạn có hoạt tính
sinh học cao.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về chi Pouzolzia L.

1.1.1. Vị trí phân loại
Theo hệ thống phân loại của tác giả Takhtajan (2009) [27], chi Pouzolzia L.
được phân loại như sau:
Giới: Thực vật bậc cao (Plantae)
Ngành: Ngọc lan (Maganoliophyta)
Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp: Sổ (Dilleniidae)
Liên bộ: Bông (Malvanae)
Bộ: Gai (Urticales)
Họ: Gai (Urticaceae)
Chi: Pouzolzia L.
1.1.2. Đặc điểm thực vật
Cây bụi, nửa bụi hoặc cây thảo, không có lông ngứa. Lá mọc so le, ít khi
mọc đối, lá kèm thường bền, mọc bên hay rời; lá có ba gân, viền có răng cưa
hoặc nguyên. Cụm hoa ở nách lá hoặc hiếm khi ở các đốt dọc theo cuống nhánh,

thường lưỡng tính, ít khi đơn tính (thực vật lương tính hoặc khác giống), lá bắc
và lá bắc con nhỏ. Hoa đực: bao hoa 3, 4 hoặc 5 thùy; nhị 3, 4 hoặc 5 (tương
ứng với số lượng thùy bao hoa); hợp sinh 1/2 chiều dài, có nắp, đỉnh lõm; chỉ
nhị dính gốc, có bầu thô sơ. Hoa cái: bao hoa hình ống, hoặc hình trứng, bẻ cong
hoặc thắt, đỉnh có 2-4 răng. Bầu nhụy gồm có: vòi nhụy; núm nhụy hình sợi, có
lông tơ cùng 1 bên, rụng sớm cùng vòi nhụy; noãn mọc thẳng trong bầu hoa.
Quả bế, vỏ dạng vảy, láng bóng, và thường có gờ, hiếm khi có cánh, có bao
hoa. [30]
1.1.3. Một số loài thuộc chi Pouzolzia ở Việt Nam
1.1.3.1. Pouzolzia zeylanica (L.) Benn
-

Tên khoa học: Pouzolzia zeylanica (L.) Benn

-

Tên khác: P. indica Guad.

-

Tên thường gọi: Bọ mắm hay Thuốc giòi
2


-

Họ: Gai (Urticaceae)
Cây Bọ mắm thuộc loại cỏ có cành mềm, thân có lông [1], [6]; phân bố ở

ruộng, ven rừng, nơi ẩm [3].

1.1.3.2. Pouzolzia sanguinea (Blume) Merr
- Tên khoa học: Pouzolzia sanguinea (Blume) Merr
- Tên khác: P. viminea (Wall.) Wedd.)
- Họ: Gai (Urticaceae)
- Tên thường gọi: Bọ mắm rừng, Nhớt nháo, Thuốc giòi cây
Cây nhỡ mọc cao 2-3m hay hơn, thân và cành mảnh; mọc ven rừng, nơi
sáng, ven các suối, ở độ cao đến 1500m [1].
1.1.3.3. Pouzolzia elegans Wedd.
- Tên khoa học: Pouzolzia elegans Wedd.
- Họ: Gai (Urticaceae)
- Tên thường gọi: Bọ mắm thanh lịch, Thuốc vòi thanh
Cây bụi nhỡ cao tới 1,5m phân cành nhiều, cành non có lông mịn dày; mọc
trong rừng ẩm, ở độ cao 1500m [1].
1.1.3.4. Pouzolzia auriculate Wight.
- Tên khoa học: Pouzolzia auriculata Wight.
- Họ: Gai (Urticaceae)
- Tên thường gọi: Thuốc vòi tai
Cây cỏ cao 30-50 cm, thân có 4 cạnh; phân bố ở Miền Nam, Việt Nam [3].
1.1.3.5. Pouzolzia hirta Hassk.
- Tên khoa học: Pouzolzia hirta Hassk.
- Họ: Gai (Urticaceae)
- Tên thường gọi: Thuốc vòi lông
Cây cỏ nhám, thân tròn, gần như không lông; mọc ở nơi ẩm, gần ruộng,
rạch [3].
1.1.3.6. Pouzolzia pentadra Benn.
- Tên khoa học: Pouzolzia penadra Benn.
- Họ: Gai (Urticaceae)
3

- Tên thường gọi: Thuốc vòi ngũ hùng
Cây cỏ cao 60-80cm, thân có 5 cạnh, to 1-5mm, không lông; cây mọc ở nơi
ẩm, ở độ cao 900-1200m [3].
1.2.

Tổng quan về cây Bọ mắm (Pouzolzia zeylanica (L.) Benn.)

1.2.1. Đặc điểm thực vật
Cây Bọ mắm thuộc loại cỏ sống nhiều năm có cành mềm mọc trải ra, thân
có lông, cao 40-90cm, nham nhám. Lá mọc so le, đôi khi mọc đối, có lá kèm,
phiến lá nhỏ hình mác hẹp, trên gân và 2 mặt lá đều có lông đặc biệt là mặt dưới,
lá dài 4-9 cm, rộng 1,5-2,5cm. Có 3 gân xuất phát từ cuống. Cuống dài 5mm có
lông trắng. Hoa nhỏ màu trắng. Cụm hoa đơn tính mọc thành xim co, ở kẽ lá có
các hoa không cuống. Hoa đực có 4 nhị có chỉ nhị trong nụ hoa, hoa cái có vòi
nhụy dài, trắng. Quả hình trứng, nhọn, có bao hoa có lông, màu hồng tím [1],
[6].
1.2.2. Phân bố
Cây ưa sáng, mọc trong rừng hoặc ven rừng ẩm, ở độ cao đến 1500m.
Thường được trồng ở những nơi ẩm ở bờ các giếng nước và quanh vườn [1].
Ở Việt Nam, cây phân bố ở các tỉnh Lào Cai, Yên Bái, Hà Giang, Tuyên
Quang, Cao Bằng, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Bắc Giang, Hà Nội, Hòa Bình, Hải
Phòng, Ninh Bình, Nghệ An, Quảng Bình, Hải Phòng, Ninh Bình, Nghệ An,
Quảng Bình, Thừa Thiên-Huế, Đà Nẵng, Đăk Lăk, Lâm Đồng, Khánh Hòa,
Ninh Thuận [1], [6].
Trên thế giới, cây có ở Ấn Độ, Trung Quốc, Lào, Campuchia [1].
1.2.3. Bộ phận dùng
Toàn cây đều có thể dùng [1], [6]. Cây có thể được thu hái quanh năm,
nhưng tốt nhất là vào cuối mùa khô (tháng 4 - tháng 6), đem về, rửa sạch, dùng
tươi hoặc thái nhỏ, phơi khô dùng dần [1], [6].
1.2.4. Các nghiên cứu về thành phần hóa học

Qua những công trình nghiên cứu, nhiều hợp chất từ cây Bọ mắm đã được
phân lập, thành phần hóa học của cây bao gồm các hợp chất như steroid và
4


triterpen. Ngoài ra còn có các flavonoid và lignan. Trong đó lớp chất flavonoid
đóng vai trò sinh hoạt tính chủ yếu của cây Bọ mắm.
a. Thành phần flavonoid

Hình 1.1. Thành phần flavonoid từ Bọ mắm (P. zeylanica)
Thành phần hóa học của Bọ mắm lần đầu tiên được công bố vào năm 2003
bởi nhóm nghiên cứu của trường Đại học Băng la đét [26]. Một hợp chất
isoflavon đã được phân lập và xác định cấu trúc là 5-metoxy-4ʹ-hydroxy-2ʹʹdimetylpyrano (3ʹʹ, 4ʹʹ, 7, 8) isoflavon (1).
Năm 2007, nhóm tác giả Lê Thanh Thủy đã phân lập được sáu hợp chất
trong đó có 3 flavonoid bao gồm isovitexin (2), vitexin (3) và quercetin (4) từ lá
cây tươi của loài này [8].
Tiếp sau các nghiên cứu của Fu và các cộng sự năm 2012 đã xác định được
14 hợp chất tồn tại trong cây Bọ mắm, trong số đó có các hợp chất cũng thuộc
nhóm flavonoid là quercetin (4), scutellarin-7-O-α-L-rhamnoside (5), quercetin3-O-β-D-glucopyranoside (6), apigenin (7) và epicatechin (8) [13].
Năm 2015, Lujun Wang và các cộng sự cũng đã phân lập được một hợp
chất flavonoid khác từ Bọ mắm là kaempferol (9) [29] (hình 1.1).
5


b. Thành phần lignan
Từ Bọ mắm tươi, nhóm tác giả Lê Thanh Thủy đã phân lập ra được một
hợp chất lignan có tên là phylanthin (10) [8].

Hình 1.2. Thành phần lignan từ Bọ mắm (P. zeylanica)
Năm 2013, hai lignan, pouzolignan A (11) và pouzolignan B (12), đã được

phân lập từ cây Bọ mắm do nhóm nghiên cứu tại Trung Quốc thực hiện [9].
Nhóm nghiên cứu của Zhuo Han Chen đã chiết tách và xác định cấu trúc được 5
hợp chất dạng khung norlignan mới từ dịch chiết 95% ethanol là pouzolignan F,
G, H, I và J (13-17) [10].
Như là thành phần chính có trong Bọ mắm, nhóm nghiên cứu của ChuQian Zhong cũng đã tinh chế được hai norlignan mới là pouzolignan L (18) và
6


M (19), bên cạnh đó còn công bố hai stibene mới pouzolignan D (20) và K (21)
[13].
Ngoài ra, một lignan đã biết cũng được tìm thấy trong Bọ mắm là
syringaresinol (22), đã được công bố bởi Wang Lujun [29] (hình 1.2).
c. Thành phần triterpenoid
Một số hợp chất friedelan triterpen ester đã được xác định có trong cây Bọ
mắm. Theo nghiên cứu của Fu và các cộng sự, acid oleanolic (23), α-amyrin
(24), 2α, 3α, 19α-trihydroxyurs-12-en-28-oic (25), 2α-hydroxyursolic acid (26)
đã được tìm thấy trong cây Bọ mắm [13].
Friedelin (27) cũng đã được thu nhận từ dịch chiết Bọ mắm qua nhóm
nghiên cứu của Brazendranath Sarkar và các cộng sự [25] (hình 1.3).

Hình 1.3. Thành phần triterpenoid từ Bọ mắm (P. zeylanica)
d. Một số thành phần khác
Bên cạnh các hợp chất chính là flavonoid, lignan và triterpenoid thì Bọ
mắm còn có các thành phần khác như steroid, coumarin, lipid, các hợp chất có
nitơ hay các dẫn xuất của phenol.
Wang Lujun và các cộng sự đã phân lập được một số hoạt chất từ cây Bọ
mắm và cấu trúc hóa học đã được xác định như: N-[2-(3-hydroxy-47


methoxyphenyl)-2

hydroxyethyl]-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide

(28),

14,16-hentriacontanedione (29), sinapaldehyde (30), dipentylphthalate (31),
undecyl ferulate (32), 3,4-dihydro-5,7-dihydroxy-4-(4-hydroxyphenyl)coumarin
(33), stigmast-4-en-3-on (34) [29].

Hình 1.4. Các thành phần hóa học khác có trong Bọ mắm (P. zeylanica)
Lê Thanh Thủy phân lập được metyl stearat (35), daucosterol (36) [8] và βsitosterol (37), scopolin (38), scopoletin (39), eugenyl-β-rutinoside (40) được
tìm thấy bởi Fu [13] (hình 1.4).
Cho đến hiện nay, các nghiên cứu về thành phần hóa học của Bọ mắm mới
chỉ tập trung ở nước ngoài. Ở Việt Nam nghiên cứu về loài này vẫn còn hạn chế
tuy nguyên liệu rất dồi dào.
8


1.2.5. Các nghiên cứu về tác dụng sinh học
Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học gần đây của cây Bọ mắm mới chỉ tập
trung nhiều ở phân đoạn dịch chiết mà chưa có nhiều nghiên cứu về hoạt tính
sinh học của thành phần cụ thể.
a. Hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn
Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết
cồn Bọ mắm cho kết quả tốt. Ở nồng độ 1 mg/mL, dịch chiết Bọ mắm cho hoạt
tính kháng khuẩn trên cả vi khuẩn gram dương và gram âm như: Bacillus
subtilis, Bacillus megaterium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus, Shigella và Salmonella typhi dysentariae, đặc biệt là
trên hai loài Staphylococcus aureus và Escherichia coli [23]. Năm 2012, Saha
và cộng sự đã thử hoạt tính kháng nấm của dịch chiết cồn trên các dòng nấm

Blastomyces dermatitides, Aspergillus niger, Microsporum spp., Candida
albicans, Pityrosporum ovale và Trichophyton spp. Kết quả cho thấy khả năng
ức chế tốt các dòng nấm trên, đặc biệt là Aspergillus niger [24].
b. Hoạt tính kháng viêm
Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy Bọ mắm có tác dụng kháng viêm tốt.
Tiến hành thí nghiệm trên chuột bị gây viêm bởi Staphylococcus aureus cho
thấy khả năng giảm khối áp xe tốt. Cặn chiết methanol của cây Bọ mắm còn cho
thấy khả năng làm giảm sưng, lành vết loét nhờ tác dụng ức chế cytokin IL-1
[11]. Các dịch chiết khác như cloroform, n-butanol và nước của Bọ mắm cho tác
dụng chống viêm và giảm đau tốt nhất. Nghiên cứu tác dụng ức chế sự sản sinh
NO của các hợp chất norlignan phân lập từ Bọ mắm cho thấy pouzolignan H
(15) và pouzolignan I (16) cho tác dụng ngăn ngừa sự sản sinh NO ở mức độ
tương đối tốt với giá trị IC50 lần lượt là 43,8 ± 2,9 và 60,3 ± 3,3 µM, so sánh với
chất đối chứng dương có giá trị IC50 là 38,2 ±2,2 µM [10].
c. Hoạt tính chống oxi hóa
Hoạt tính chống oxi hóa được thể hiện mạnh trên dịch chiết ethyl acetat của
Bọ mắm. Đánh giá khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH của dịch chiết ethyl acetat
thu nhận kết quả là 64,9%. Đối với gốc tự do ABTS, dịch chiết này cũng thể
9


hiện hoạt tính tốt với khả năng bắt giữ trên 50% ở nồng độ 1,2 mg/mL. Dịch
chiết ethyl acetat thể hiện khẳ năng bắt giữ các gốc hydroxyl rất mạnh. Ở nồng
độ thấp hơn 0,2 mg/mL, hiệu quả ức chế mới chỉ 10,9% nhưng khi tăng dần
nồng độ lên đến 1,2 mg/mL thì hiệu quả đã tăng lên đến 90,5%. Hoạt tính mạnh
của dịch chiết ethyl acetat có thể được lý giải bởi thành phần phenolic đã được
làm giàu ở phân đoạn chiết này [17].
d. Hoạt tính hạ đường huyết
Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của dịch thuốc sắc Bọ mắm trên
chuột thử nghiệm gây mô hình tiểu đường được tiêm streptozotocin và chế độ ăn

giàu năng lượng. Mức đường huyết sau hai tuần điều trị của nhóm chuột dùng
liều thấp và trung bình giảm đáng kể, đường huyết trở về mức không khác biệt
so với nhóm chuột bình thường. Kết quả cho thấy, dịch chiết Bọ mắm và thành
phần hóa học trong đó có tiềm năng trong việc giảm mức đường huyết và nên
được nghiên cứu sâu hơn nữa [15].
e. Hoạt tính kháng ung thư
Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết toàn phần từ Bọ mắm
trên tôm nước mặn cho thấy kết quả tốt với giá trị LC50 là 6,1 µg/mL và LC90 là
12,2 µg/mL [20]. Khả năng chống lại tế bào ung thư cũng được quan tâm khi
phối hợp Bọ mắm với Cananga latifolia. Một nghiên cứu khác về tác dụng gây
độc tế bào của các cắn chiết và hợp chất tinh khiết cũng được Brazendranath
Sarkar và các cộng sự thực hiện năm 2014 trên tôm nước mặn. Nghiên cứu đã
thu được kết quả là dịch chiết ethyl acetat, n-butanol và hợp chất friedelin cho
hoạt tính tốt với giá trị LC50 lần lượt là 3,32; 3,44 và 2,80 µg/mL [25]. Kết quả
này đã bước đầu gợi ý đến tiềm năng phát triển nguồn nguyên liệu cũng như
hoạt chất có tác dụng kháng ung thư mới sử dụng trong công nghệ dược phẩm.
1.2.6. Công dụng
Cây có vị ngọt, đắng nhạt, tính mát; có tác dụng trị khát, tiêu đờm, lợi tiểu,
tiêu viêm, rút mủ [1].
Cây có thể lấy lá làm rau ăn sống như các loại rau khác hoặc xay với rau
má, trái cây làm nước sinh tố [1].
10


Toàn cây được dùng làm thuốc. Thường dùng để trị: [1], [6]
- Cảm ho, hoặc ho lâu ngày, viêm họng, bệnh về phổi
- Lỵ, viêm ruột
- Nhiễm trùng đường tiết niệu, bí tiểu tiện
- Đau răng
- Nấm da cứng.

Liều dùng 10-20g, dạng thuốc sắc. [1], [6]
Dùng ngoài trị đinh nhọt, sâu quảng, viêm mủ da, viêm vú, đụng giập;
thường giã cây tươi hoặc nấu nước rửa [1].
Ở Ấn Độ, cây dùng trị giang mai, bệnh lậu và nọc độc rắn [1].
Ở Malaixia, dịch lá tươi và nước sắc lá dùng uống như là lợi sữa khi có
hiện tượng ngưng tiết sữa [1].
1.2.7. Một số bài thuốc có Bọ mắm
- Chữa ho, ho lâu ngày: 8-16g Bọ mắm sắc uống. Có thể nấu cao
- Đinh nhọt và viêm mủ da: Bọ mắm tươi, rau má, lá ra muống giã tươi đắp
- Viêm vú: Bọ mắm, Tử hoa địa dinh, Phù dung, Bồ công anh giã tươi đắp
- Đụng giập: Sau khi cố định, dùng cây tươi giã đắp hoặc bột cây khô thêm
rượu mà đắp, bó.
- Sâu răng: Dùng cây Bọ mắm tươi nấu nước súc miệng hoặc giã nát đắp vào
chỗ răng đau [1].

11


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Cây Bọ mắm được thu tại xã An Khánh, huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên,
Việt Nam vào tháng 7 năm 2017 (hình 2.1). Dược liệu được rửa sạch, để ráo
nước, sấy khô được bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo.
Mẫu dược liệu tươi gồm toàn cây có hoa được TS. Bùi Văn Thanh, Viện
Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viên Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam giám định tên khoa học là Pouzolzia zeylanica (L.) Benn., thuộc họ Gai
(Urticaceae). Mẫu tiêu bản được lưu tại Phòng Thực vật Dân tộc học, mã số tiêu
bản CND-01.

Hình 2.1. Hình ảnh dược liệu Bọ mắm thu hái ở Thái Nguyên

12


2.2. Nguyên liệu
2.2.1. Hóa chất
Hóa chất và thuốc thử được sử dụng đạt tiêu chuẩn phân tích theo DĐVN
IV, được trình bày cụ thể trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Tên hóa chất và nguồn gốc
STT

Tên hóa chất

Nguồn gốc

Tiêu chuẩn

1

Ethanol

Việt Nam

DĐVN IV

2

n-hexan

Trung Quốc

DĐVN IV

3

Dicloromethan

Trung Quốc

DĐVN IV

4

Ethyl acetat

Trung Quốc

DĐVN IV

5

Aceton

Trung Quốc

DĐVN IV

6

Methanol

Trung Quốc

DĐVN IV

7

Acid sulfuric

Trung Quốc

DĐVN IV

8

Nước

Việt Nam

DĐVN IV

2.2.2. Dụng cụ
- Cột sắc ký với đường kính trong 2,5cm; 2 cm; 1,5cm
- Dụng cụ thủy tinh trong phòng thí nghiệm (pipet, phễu thủy tinh, cốc thủy
tinh, ống đong, ống nghiệm).
- Giấy lọc.
2.2.3. Thiết bị
- Bộ thiết bị chiết hồi lưu
- Bản mỏng TLC Silica gel 60 F254 (Merck).
- Bột silica gel 60 Merck cỡ hạt 0,063-0,200mm.
- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Cân phân tích Mettler Toledo AB204S (Thụy Sĩ)
- Máy cất quay BUCHI Rotavador R210 (Thụy Sĩ)
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR
của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Khoa
Hóa, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
13


2.3. Nội dung nghiên cứu
- Chiết xuất dịch chiết ethanol toàn phần và các dịch chiết phân đoạn của
cây Bọ mắm.
- Sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào, chống oxi hóa, chống dị ứng của dịch
chiết ethanol toàn phần và các phân đoạn chiết.
- Nghiên cứu thành phần hóa học :
•

Định tính sơ bộ các nhóm chất trong phân đoạn có hoạt tính tốt

•

Phân lập 1-2 hợp chất từ các phân đoạn có hoạt tính tốt.

•

Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được.

2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1.

Phương pháp chiết xuất

- Sử dụng phương pháp chiết hồi lưu với dung môi là ethanol 96 và cất thu
hồi dung môi dưới áp suất giảm.
- Sau đó, phân tán cắn chiết ethanol trong nước và chiết với các dung môi
có độ phân cực tăng dần: n-hexan, dicloromethan và ethyl acetat, cô thu hồi
dung môi các dịch chiết phân đoạn đến cắn.
2.4.2.

Phương pháp sàng lọc hoạt tính sinh học

Các thí nghiệm sàng lọc hoạt tính sinh học của dịch chiết và các phân đoạn
của cây Bọ mắm được tiến hành tại Khoa Dược, Trường Đại học Quốc gia
Chungnam, Hàn Quốc.
2.4.2.1.
•

Tác dụng gây độc tế bào ung thư

Dòng tế bào và nuôi cấy tế bào
Tất cả các dòng tế bào ung thư bao gồm MCF7 (dòng tế bào ung thư vú),

MDA-MD 231 (dòng tế bào u vú người), HCT116 (dòng tế bào u đại trực tràng
người) và B16F10 (dòng tế bào u ác tính), A549 (dòng tế bào ung thư phổi)
được nuôi cấy trong môi trường DMEM với sự có mặt của glutamine được bổ
sung 10% huyết thanh của bào thai bò (FBS), 10 IU/ml penicillin và 10ug/ml
streptomycin. Tất cả các tế bào được nuôi cấy ở 37oC trong máy ủ 5% CO2.
•

Thử nghiệm độc tính MTT
14

Các tế bào đã được cấy vào một phiến 96 giếng với mật độ 5x103 tế bào /
giếng trong 100µl. Sau 24 giờ, được xử lý với các mẫu thử ở 5 nồng độ khác
nhau (100; 50; 25; 12,5; 6,25 và 3,63 mmol). DMSO được xử lý bằng làm giếng
chứng. Giếng chứng chứa các thành phần phản ứng tương tự, ngoại trừ cùng một
thể tích môi trường nuôi được thêm vào thay vì mẫu thử. Mitomycin C (SigmaAldrich) được sử dụng như là tiêu chuẩn. Vào ngày thứ ba, thêm 10 μL MTT
((3-4-5-dimetylthiazol-2, 5-diphenyltetrazolium bromid) từ EZ-CYTOX được
thêm vào mỗi giếng và ủ ở 37oC trong 1,5 giờ. Độ hấp thụ được phát hiện ở 405
nm với đầu đọc vi mô.
Xét nghiệm MTT được định lượng với EZ-CYTOX- tính khả thi tế bào, sự
tăng sinh và thử độc tính của bộ kit (Cat. No EZ-3000) theo hướng dẫn của nhà
sản xuất.
Tỷ lệ ức chế (%) được tính như sau:
% ức chế = 1 −
2.4.2.2.
•

𝐴𝑚ẫ𝑢 𝑡ℎử
𝐴𝑚ẫ𝑢 𝑐ℎứ𝑛𝑔

× 100%

Tác dụng chống oxi hóa

Thử nghiệm DPPH
Hoạt tính chống oxy hóa của mỗi mẫu chiết xuất được đánh giá bởi khả

năng của mẫu đó với các gốc tự do 2,2-diphenyl-1-picryhydrazyl (DPPH)
(Brand-Williams và cộng sự, 1995). Cụ thể, mỗi giếng chứa 100μl mẫu, được

pha chính xác trong DMSO với các nồng độ là 100; 50; 25; 12,5; 6,25 và 3,6
μM. DPPH đã được pha loãng thành 100 μM trong ethanol. Hỗn hợp phản ứng
gồm 100 μl mẫu và 100 μl DPPH. Giếng chứng có chứa các thành phần phản
ứng tương tự, ngoại trừ lượng nước tương tự được thêm vào thay vì thêm mẫu.
Acid ascorbic được sử dụng như một chất chuẩn. Giếng được trộn kỹ và ủ ở
nhiệt độ phòng trong 30 phút. Khi DPPH phản ứng với một hợp chất chống oxy
hoá, sự thay đổi màu sắc từ tím đậm sang vàng nhạt được đọc ở 517nm với một
đầu đọc vi mô. Các kết quả được đo bằng mật độ hấp thụ và được tính bằng tỷ lệ
phần trăm mất DPPH:
%EC=

𝐴𝑚ẫ𝑢 𝑐ℎứ𝑛𝑔 −𝐴𝑚ẫ𝑢 𝑡ℎử
𝐴𝑚ẫ𝑢 𝑐ℎứ𝑛𝑔

15

x100


Kết quả được thể hiện bằng EC50, tương ứng với các hợp chất (μM) cần
thiết để làm mất 50% các gốc DPPH ban đầu trong các điều kiện thí nghiệm
nhất định.
2.4.2.3.

Tác dụng chống dị ứng

Hoạt tính chống dị ứng được thực hiện trên dòng tế bào RBL-2H3 (Rat
Basophilic Leukemia) thông qua việc đánh giá nồng độ β-hexosaminidase. Tế
bào RBL-2H3 đã được nuôi cấy trong môi trường DMEM với sự có mặt của
15% FBS, penicillin 10 IU/mL và 10 μg/mL streptomycin. Tế bào được cấy vào

một phiến 96 giếng với mật độ khoảng 2 × 105 tế bào/giếng và ủ ở nhiệt độ
37oC, 5% CO2 trong 8h, sau đó được xử lý với các mẫu thử có nồng độ khác
nhau và tiếp tục ủ qua đêm. Các tế bào này sau đó được bổ sung chất kháng
DNP IgE (antidinitrophenyl- immunoglobulin E) (0.2 µg/mL) để làm tăng độ
nhạy, và tiếp tục được ủ ở 37oC, 5% CO2 trong 2 giờ. Rửa tế bào với 200 µL
DPBS, 200 µL Siraganian chất đệm (chất đệm A) [119mM NaCl, 5 mM KCl,
5,6 mM glucose, 0,4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 25 mM piperaizin-N, N’- bis (2ethanesulfonic acid) (PIPES), 0,1% BSA, 40 mM NaOH, pH 7,2]. Lấy 65 µL
chất đệm A chứa kháng nguyên (DNP-BSA, nồng độ cuối 100 ng/mL) được
thêm vào mỗi giếng và ử trong 15 phút ở 37oC để kích thích. 50 µl chất bề mặt
đã được thêm vào 96 giếng và ủ với 50µL chất nền

PNAG (1 mM p-

nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminde) trong 0,1 M chất đệm (pH 4,5) ở 37oC
trong 1 giờ. Phản ứng được dừng lại khi thêm vào 200 µL hỗn hợp dung dịch
(0,1M Na2CO3. NaHCO3, pH 10). Sự hấp thụ được đo ở bước sóng 405 nm.
% ức chế = [1 −

(𝑇−𝐵−𝑁)
(𝐶−𝑁)

] x 100

Chú thích:
- Chứng C: DNP-BSA (+), chất thử (-);
- Mẫu thử (T): DNP-BSA (+), chất thử (+),
- Mẫu trắng (B): DNP-BSA (-), chất thử (+),
- Mẫu giả (N): DNP-BSA (-), chất thử (-)
- T, B, N, C: độ hấp thụ của các mẫu thử, mẫu trắng, mẫu giả, mẫu chứng.
16

2.4.3.

Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học

2.4.3.1.

Định tính các thành phần hóa học các phân đoạn có hoạt tính sinh

học cao
Định tính một số nhóm chất hữu cơ trong các phân đoạn n-hexan,
dicloromethan và ethyl acetat bằng các phản ứng hóa học thường quy [4], [7],
[5].
2.4.3.2.

Phân lập và xác định cấu trúc phân tử hợp chất hóa học

+ Sử dụng phương pháp sắc ký cột silica gel để phân lập các chất
Tiến hành:
- Chất nhồi cột: silica gel cỡ hạt 0.063-0.200mm (Merck)
- Dung môi rửa giải: Hỗn hợp được pha từ các dung môi thường dùng: nhexan, dicloromethan, aceton, ethyl acetat, methanol theo tỷ lệ thích hợp đã
được khảo sát qua sắc ký lớp mỏng.
- Chuẩn bị cột: Cột thủy tinh có khóa, đường kính và chiều dài phù hợp với
lượng chất đưa lên cột, rửa sạch, tráng cột bằng aceton, để khô, cố định trên giá
theo phương thẳng đứng. Cho một lớp bông vào đáy cột.
- Nhồi cột: Cân lượng silica gel phù hợp cho vào cốc có mỏ, thêm dung môi
rửa giải, ngâm trương nở trong khoảng 30 phút rồi khuấy đều cho đến khi hết
bọt. Cho hỗn dịch trên vào cột đã chuẩn bị. Mở khóa cột, rót tiếp dung môi và
gõ quanh thành cột, nén cột bằng áp suất để cột hết bọt khí và cột ổn định

khoảng 1 tiếng. Sau đó cho hệ dung môi tiếp tục chảy cho đến khi mực dung
môi còn cách lớp silica gel khoảng 2-4mm thì khóa cột và chuẩn bị đưa mẫu lên
cột.
- Nạp mẫu: Mẫu được hòa tan trong một lượng dung môi tối thiểu đến tan
hoàn toàn, sau đó trộn đều với một lượng silica gel tối thiểu, đem bốc hơi đến
khi thu được bột khô tơi rồi đưa lên cột thành một lớp đều đặn trên bề mặt silica
gel trong cột.
- Rửa giải: Cho hệ dung môi rửa giải thích hợp vào cột đã được nạp mẫu,
thêm một lớp bông để khi cho dung môi không làm xáo trộn lớp bề mặt. Trong
17