thực hành hóa sinh thực phẩm về carbohydrate, protein, lipid, vitamin

Chương 2: CARBOHYDRATE
2.1.




Mục đích:
Phân biệt giữa monosaccharide và disaccharide bằng thuốc thử Barfoed
Nắm được phương pháp định lượng amylose và amylopectin
Định lượng đường khử bằng phương pháp so màu với thuốc thử dinitrosalicylic acid

2.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, nguyên vật liệu:
 Thiết bị:
- Bếp điện
- Bếp cách thủy
- Máy li tâm
- Máy quang phổ
 Dụng cụ:
- Bình định mức 100 ml
- Ống nghiệm
- Ống nghiệm có nắp
- Bình tam giác
- Giấy lọc
- Phễu thủy tinh
- Micropipet
- Cốc thủy tinh 100 ml
- Phễu thủy tinh
- Đũa thủy tinh
 Hóa chất
- Thuốc thử Barfoed
- Thuốc thử Fehling

- Glucose 1%
- Mantose 1%


- Sucrose 1%
- Dung dịch trichloro aceticacid (TCA) 0,6%
- Iod 0,01N
- NaOH 1N
- Cồn 800, 900
- Thuốc thử dinitrosalicylic (DNS)
- Chì acetate 30%
 Nguyên vật liệu:
- Bột gạo
- Chôm chôm
2.3. Nội dung
2.3.1. Phân biệt giữa monosaccharide và disaccharide (phản ứng Baroed)
 Tiến hành: chuẩn bị 6 ống nghiệm và đánh số (1A, 2A, 3A, 1B, 2B, 3B)
- Cho vào ống A (1A, 2A, 3A) mỗi ống 2 ml thuốc thử Barfoed; ống B (1B,
2B, 3B) mỗi ống 2 ml thuốc thử Fehling.
- Ống 1 (1A; 1B) cho vào mỗi ống 2 ml dung dịch glucose 1%
- Ống 2 (2A; 2B) cho vào mỗi ống 2 ml dung dịch Maltose 1%
- Ống 3 (3A; 3B) cho vào mỗi ống 2 ml dung dịch Sucrose 1%
- Đun cách thủy các ống nghiệm trong 5 phút ( 75oC- 80oC ), làm lạnh, quan
sát ống có trầm hiện tượng đỏ. Sau đó lấy 3 ống A đun tiếp 8 phút ở 95oC.
Quan sát ống có hiện trầm đỏ.


Hình 1. Bố trí dung dịch vào các ống nghiệm
 Kết quả, hiện tượng:
Ống

nghiệm

Hiện tượng
Đun lần 1

Đun lần 2

1A

Dung dịch màu xanh, có trầm đỏ

Dung dịch màu xanh, trầm đỏ
nhiều hơn

2A

Dung dịch xanh dương

Dung dịch màu xanh, trầm đỏ ít

3A

Dung dịch xanh dương

Dung dịch màu xanh

1B

Dung dịch vàng cam, có trầm đỏ

2B

Dung dịch xanh nhạt, có trầm đỏ

3B

Dung dịch xanh đậm


Hình 2a. Đun lần 1

Hình 2b. Đun lần 2

 Giải thích
 Ống nghiệm A ( thuốc thử Barfoed: (Cu(CH3COO)2.H2O) )
- Khả năng khử của những monosaccharide có thể lớn hơn nhiều khả năng khử
của disaccharide nên thay đổi môi trường base bằng môi trường acid yếu để
phân biệt monosaccharide và disaccharide
- Khi đun ở nhiệt độ 75- 800C trong 5 phút: ống nghiệm 1A xuất hiện trầm đỏ
vì glucose ( monosaccharide) có tính khử mạnh hơn maltose ( disaccharide )
ống nghiệm 2A
- Sau khi đun tiếp ở nhiệt độ 950C:
+ Ống nghiệm 2A: Do maltose là disaccharide chứa 2 gốc α-glucopiranose liên
kết với nhau bởi các nhóm OH ở vị trí C1 và C4 nên trong phân tử còn một
nhóm OH glycoside và do vậy phân tử maltose có tính khử. Tuy nhiên tính khử
của maltose yếu hơn của glucose nên phản ứng giữa maltose với thuốc thử
bafoed xảy ra chậm hơn.
+ Ống nghiệm 3A: Do phân tử sucrose được hình thành bởi liên kết bởi hai
nhóm glycoside trong vòng sáu C của glucose và vòng năm của fructose với
nên nhau nên phân tử sucrose không có tính khử nên không cho phản ứng với

thuốc thử barfoed.
 Ống nghiệm B ( thuốc thử Fehling )


- Thuốc thử Fehling là hỗn hợp 2 dung dịch: dung dịch CuSO4 và muối Seignet với NaOH.
Khi trộn 2 dung dịch trên với nhau thì xảy ra phản ứng:
-

-

2NaOH + CuSO4→Cu(OH)2 + Na2SO4
Sau đó dung dịch Cu(OH)2 tác dụng với muối Seignet tạo muối phức hòa tan, dung dịch có
màu xanh thẫm.
Muối phức trên là muối phức không bền.
Trong môi trường kiềm nung nóng, monosaccharide ở dạng enol-diol không bền, dễ dàng khử
kim loại nặng như Cu2+. Mononosaccharide sẽ khử đồng II trong dung dịch Fehling thành đồng
I có kết tủa màu đỏ gạch.
Ống nghiệm 1B ,2B : glucose và maltose có tính khử, khử đồng (II) thành đồng (I) xuất hiện
trầm đỏ
Ống nghiệm 3B: đường sucrose không có tính khử, nên dung dịch màu xanh , không trầm đỏ.
Phương trình phản ứng :

2.3.2. Định lượng amylose và amylosepectin
 Nguyên tắc:
Dựa trên sự tạo phức màu xanh của amylose với iod trong môi trường acid. Sau
đó, đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 620 nm. Do trong thành phần tinh bột chủ yếu
là amylose và amylosepectin (chiếm từ 96,1 – 97%) nên có thể tính hàm lượng
amylosepectin từ hàm lượng tinh bột và hàm lượng amylose trong mẫu.
 Tiến hành: Xây dựng đường chuẩn với các nồng độ khác nhau của amylose.
- Pha dung dịch amylose gốc với nồng độ 2 mg/ml trong dung dịch NaOH 1N.

Từ dung dịch gốc, pha dãy dung dịch có nồng độ từ 0 – 2 mg/ml. Bố trí thí
nghiệm như sau:


Ống nghiệm

1

2

3

4

5

6

7

Nồng độ dung dịch
amylose (mg/ml)

0

0,4

0,8

1

1,4

1,8

2

Thể tích dung dịch
amylose gốc (µl)

0

20

40

50

70

90

100

Thể tích nước cất (µl)

100

80

60

50

30

10

0

Thể tích dung dịch
TCA 0,6% (ml)

5

5

5

5

5

5

5

Thể tích dung dịch Iod
0,01N (µl)

50

50

50

50

50

50

50

Bảng 1. Xây dựng đường chuẩn các nồng độ khác nhau của amylose
- Lắc đều các ống nghiệm, để yên trong 20 phút rồi đo ở bước sóng 620 nm. Vẽ
đồ thị tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ amylose.
- Xác định độ ẩm của mẫu (bột gạo)
- Chuẩn bị mẫu: Cân chính xác 20 mg mẫu bột gạo. Thêm 10 ml dung môi
ethanol (lắc mạnh) để ly trích béo. Đun cách thủy 60 oC trong 30 phút. Ly tâm
ở 6000 vòng trong 15 phút, lấy phần cặn lắng. Lặp lại bước trích ly béo một
lần nữa. Phần cặn lắng thêm 4 ml NaOH 1N và 8 ml nước. Đun cách thủy ở
95oC trong 30 phút.
- Tiến hành đo:Dùng micropipette hút 100 µl dung dịch mẫu đã chuẩn bị ở trên
cho vào ống nghiệm, thêm 5 ml dung dịch TCA 0,6% và 50 µl dung dịch Iod
0,01 N, lắc đều các ống nghiệm và để yên 20 phút. Đo ở bước sóng 620 nm.


 Kết quả:

Hình 3: Đồ thị tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ amylose
 Hàm lượng amylose (%) =

𝑋 × 12 × 100
𝑚

Với:
X : nồng độ amylose được suy ra từ đồ thị chuẩn (mg/ml)
m : khối lượng của gạo ( theo căn bản khô )
Tính kết quả:
Hàm lượng amylose (%) =

0,2836 × 12 × 100
20

= 17,02%

Hàm lượng amylopectin: 100% - 17,02% - 7% = 75,98%
2.3.3. Định lượng đường khử bằng phương pháp so màu với thuốc thử
Dinitrosalicylic acid
 Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử
acid dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hộp phản ứng tỉ lệ thuận với
nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. So màu tiến hành ở bước sóng
540 nm. Dựa theo đồ thị dường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS


sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.
 Tiến hành:
-

Chuẩn bị dịch đường phân tích.

+ Chiết đường: Lấy thịt quả chôm chôm thái nhỏ, cân 0,99g, giã nhuyễn và cho
vào cốc 100 ml,thêm vào cốc 10 ml cồn 900 , đun sôi (3 lần), gạn lấy phần nước
trong vào cốc mới. Tiếp tục cho vào cốc với phần bã 10 ml cồn 80 0, đun sôi và
gạn lấy phần nước trong cho vào cốc cùng với nước trong lần 1. Sau đó lọc dịch
chiết và rửa bã bằng cồn 800 nóng.
+ Chuẩn bị dịch đường: cho bay hơi cồn từ dung dịch vừa chiết đường bằng cách
thủy nhẹ hoặc để ngoài môi trường đến khi dich cạn khô. Cho 100 ml nước cất
vào phận cạn để được dịch đường phân tích.
+ Có thể chiết đường bằng nước cất trong trường hợp mẫu không chứa inulin và
tinh bột. Nếu chiết đường bằng nước cất thì cần dùng chì acetate 30% để khử tạp
chất vì có lẫn protein. Cần trung hòa mẫu bằng Na2CO3 đối với các mẫu quả có
nhiều acid nhằm tránh quá trình thủy phân các oligosaccharide.
-

Xây dựng đường chuẩn

Chuẩn bị dung dịch glucose gốc 5 mg/ml
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn như bảng sau:
Bước 1
ống
nghiệm

Dung
dịch
glucose

Nước

cất
(ml)

Bước 2
Thuốc
thử
Dinitrosalicyl
ic

Nước
cất

Nồng độ
glucose
(mg/ml)

(ml)

(ml)
1

0.0

1.0

1.0

3.0

0

2

0.2

0.8

1.0

3.0

1

3

0.4

0.6

1.0

3.0

2

4

0.6

0.4

1.0

3.0

3

5

0.8

0.2

1.0

3.0

4

6

1.0

0.0

1.0

3.0

5

Bảng 2. Xây dựng đường chuẩn với các nồng độ khác nhau của glucose
Sau khi hoàn thành cho các chất ở bước 1 thì đun dung dịch sôi trong 5 phút và
làm nguội.
Khi dung dịch trong ống nghiệm nguội thì cho tiếp 7 ml nước như bước 2 và đo
độ hấp thu của dãy dung dịch chuẩn ở bước sóng 540 nm để được đường chuẩn.
 Đo mẫu
Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch đường phân tích (đã chuẩn bị ở trên) và 1 ml
thuốc thử DNS. Đun hỗn hợp sôi trong 5 phút, để nguội. Thêm 3 ml nước cất, đo
độ hấp thu ở bước sóng 540 nm và so sánh với đường chuẩn để được nồng độ dịch
đường phân tích.
 Kết quả

Hình 4. Đồ thị tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ glucose
 Hàm lượng đường khử (mg%) =

𝑋 𝑥 100 𝑥 100
𝑚

Với:
X: Hàm lượng đường khử từ kết quả đo (mg/ml)
m: khối lượng mẫu (mg)
Tính kết quả
Hàm lượng đường khử (mg%) =

0,6723 𝑥 100 𝑥 100
0.99

= 6,79 mg%

Chương 3: PROTEIN
3.1. Mục đích:


 Nắm được phương pháp định tính protein bằng phương pháp kết tủa.
 Nắm được phương pháp định lượng protein bằng phương pháp quang phổ.
3.2.Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, nguyên vật liệu:
 Thiết bị:
- Bếp cách thủy
- Máy li tâm
- Máy quang phổ
 Dụng cụ:
- Bình định mức 50 ml
- Ống nghiệm
- Bình tam giác
- Giấy lọc
- Phễu thủy tinh
- Micropipet
- Cốc thủy tinh 50 ml
- Đũa thủy tinh
 Hóa chất
- (NH4)2SO4 tinh thể
- Dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa
- HCl 0,5N
- NaOH 10% và bão hòa
- Dung dịch acid sulfosalicylic 10%
- Dung dịch NaCl 10% và NaCl bão hòa
- AgNO3
- Thuốc thử Biuret

- Dung dịch NaCl 0,9%
 Nguyên vật liệu:
- Lòng trắng trứng
3.3. Nội dung
3.3.1. Định tính protein bằng phương pháp kết tủa protein


a. Kết tủa thuận nghịch:
 Nguyên tắc:
Sự hòa tan của protein phụ thuộc vào pH, lực ion, dung môi và nhiệt độ. Khi thay
đổi các điều kiện này, độ hòa tan của protein sẽ bị thay đổi, kết tủa thuận nghịch
hoặc bất thuận nghịch.
Kết tủa thuận nghịch: Một số tác nhân khi thêm vào dung dịch keo protein có khả
năng kết tủa protein mà không mất đi các hoạt tính và khi loại bỏ các tác nhân
này, protein lại có khả năng hòa tan và tạo dung dịch keo. Hiện tượng này được
gọi là kết tủa thuận nghịch và được ứng dụng để chiết tách thu nhận enzyme và
protein.
 Tiến hành: Tách 2 loại protein trứng albumin và globulin bằng cách sử dụng
lực ly tâm 20 phút 5000 vòng, sau đó chuẩn bị 4 ống nghiệm và đánh số (1, 2,
3, 4)
- Ống 1: Cho vào ống một ít globulin và 4 ml NaCl 10%
- Ống 2: Cho vào ống 2 ml albumin và 2 ml (NH4)2SO4 bão hòa
- Ống 3: Cho vào ống 2 ml albumin, 1 ml NaCl bão hòa và 1 ml (NH4)2SO4
bão hòa
- Ống 4: Cho vào ống 2 ml albumin, sử dụng HCl 0,5N cho vào từng giọt và
lắc đều đến khi kết tủa xuất hiện cho một giọt NaOH 10% lắc đến khi tan
về trạng thái ban đầu sau đó cho Cu2+ vào và quan sát hiện tượng.


Hình 1. Bố trí dung dịch vào các ống nghiệm

Ống
nghiệm

Hiện tượng

1

Dung dịch trong suốt

2

Kết tủa trắng đục nhiều

3

Kết tủa trắng đục ít

4

Dung dịch có màu tím

 Giải thích
- Ống nghiệm 1: Dung dịch trong suốt không tủa vì các tiểu phân tử
protein bị mất lớp áo bao bên ngoài nhưng vẫn còn tích điện, không tạo
tủa.
- Ống nghiệm 2: Protein trong lòng trắng trứng có cả albumin và globulin.
Đây là những protein mang acid yếu, ở điều kiện bình thường, trong
trạng thái dung dịch, phân tử Protein tích điện (-), bên ngoài được bao
bởi một lớp áo nước với đầu (+) quay vào và đầu (–) quay ra, nên lơ
lửng trong môi trường.

Khi cho các muối (NH4)2SO4 có nồng độ cao vào, thì muối sẽ tạo các ion
NH4+ và SO42- . Các ion này sẽ trung hòa các tiểu phân tử protein trứng
đồng thời lấy lớp áo nước bên ngoài tạo ra hiện tượng tủa.
- Ống 3: Có kết tủa trắng đục vì NaCl và (NH4)2SO4 là những chất điện
giải mạnh tạo các ion trung hòa điện tử của các phân tử protein, đồng
thời lấy lớp áo nước bên ngoài nên gây ra hiện tượng tủa
- Ống 4: Khi cho các axit vô cơ mạnh vào, các axit này có tính háo nước, sẽ
lấy nước của dung dịch protein trứng làm cho protein bị biến tính, protein
bị khử nước và trung hòa điện tích gây tủa. Khi cho NaOH 10% vào tạo
môi trường kiềm mạnh, protein còn tích điện nên không tạo tủa làm tủa tan.
Khi cho tác dụng với Cu2+ sẽ cho màu tím.
b. Kết tủa bất thuận nghịch
 Nguyên tắc: Kết tủa bất thuận nghịch của protein thường liên quan đến sự biến
tính. Khi cấu trúc bậc 2,3,4 bị phá vỡ vĩnh viễn, protein sẽ mất các tính chất lý
hóa và các chất năng sinh học. Các yếu tố gây kết tủa bất thuận nghịch protein


bao gồm: acid hữu cơ, acid vô cơ đậm đặc (H2SO4, HCl, HNO3,…), muối kim
loại nặng, nhiệt độ,…
 Tiến hành: Chuẩn bị 3 ống nghiệm và đánh số 1, 2 ,3, cho vào mỗi ống 1ml
dung dịch albumin.
- Ống 1: cho từng giọt acid sulfosalicylic 10%, lắc đều và quan sát
- Ống 2: 1ml AgNO3 lắc, quan sát
- Ống 3: đun cách thủy 3-5 phút lấy ra quan sát.
Sau đó cho vào 3 ống 4 ml NaCl 10%, khảo sát độ tan của trứng.

Hình 2a: Trước khi cho NaCl 10%

Hình 2b: Sau khi cho NaCl 10%

 Hiện tượng và giải thích:
 Trước khi cho NaCl 10% :
- Ống 1: có kết tủa trắng, dung dịch có màu trong suốt lớp trên. Khi
cho các acid hữu cơ vào dung dịch protein trứng sẽ tạo nên môi
trường axit yếu, có khả năng gây tủa.
- Ống 2: dung dịch chia làm 2 lớp, lớp trên vẫn đục,lớp dưới trong
suốt. AgNO3 là muối kim loại nặng có khả năng tạo tủa và làm biến
tính protein do sự phá hủy sâu sắc cấu trúc bậc 2,3 của phân tử
protein.
- Ống 3: kết tủa trắng. Khi đun nóng cấu trúc bậc 2,3,4 của protein bị
phá vỡ, protein bị biến tính.
 Khi cho NaCl 10% vào:


- Ống 1: Kết tủa trắng không tan
- Ống 2: Kết tủa màu nâu tím
- Ống 3:Lớp trên trong suốt, lớp dưới kết tủa trắng
2.3.2. Định lượng protein bằng phương pháp biuret.
 Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm, các hợp chất có chứa nhóm –CONH-, -CS-NH-, -C(NH)2 sẽ có phản ứng với Cu2+ tạo phức màu tím. Cường
độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch.
 Tiến hành: Chuẩn bị dãy dung dịch protein có nồng độ tăng dần từ 0-20
mg/ml từ dung dịch protein gốc (BSA 20 mg/ml) với 6 ống nghiệm như
sau:
Ống nghiệm

1

2

3

4

5

6

Nồng độ dung dịch
(mg/ml)

0

4

8

12

16

20

Thể tích dung dịch
protein chuẩn (µl)

0

100

200

300

400

500

Thể tích dung dịch
NaCl 0,9% (µl)

500

400

300

200

100

0

Thể tích nước cất (ml)

1

1

1

1

1

1

Thuốc thử biuret (ml)

3,5

3,5

3,5

3,5

3,5

3,5

Chuẩn bị ống nghiêm mẫu:
500 µl dung dịch protein trứng
1 ml nước cất
3,5 ml thuốc thử biuret
Lắc đều các ống nghiệm, để yên 20 phút. Quan sát màu dung dịch trong các
ống nghiệm.
Đo độ hấp thu các ống nghiệm dung dịch chuẩn ở bước song 550 nm và vẽ
đường chuẩn. Sau đó đo độ hấp thu dung dịch trong ống nghiệm mẫu và
dựa vào đường chuẩn để suy ra nồng độ protein trong mẫu.

Hình 3. Đường chuẩn BSA
 Kết quả:
X

50  C 100
m

Với:
X : Hàm lượng protein trong lòng trắng trứng (mg/100g)
C: Nồng độ protein hiển thị trên máy (mg/ml)
m : khối lượng lòng trắng trứng đem phân tích (g) - 500 µl
 Tính kết quả:

X=

50×16,04×100
5,16×1000

= 9,83 (%)

Chương 4: LIPID
4.1. Mục đích:
 Nắm được cách xác định chỉ số peroxide và chỉ số axit
 Nắm được phương pháp khảo sát đặc tính của lecithin
4.2.Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, nguyên vật liệu:
 Thiết bị:
- Bếp cách thủy
- Máy li tâm

- Tủ hút
- Cân phân tích
 Dụng cụ:
- Bình tam giác
- Bình cầu
- Giấy lọc
- Phễu thủy tinh
- Micropipet
- Ống nghiệm
- Buret
- Pipet
 Hóa chất
- Acid acetic đậm đặc
- Cloroform
- Dung dịch KI bão hòa
- Dung dịch Na2S2O3 0,01N
- Dung dịch hồ tinh bột 1%
- Dung dịch KOH 0.01N
- Dung dịch phenolphthalein 1%
- Alcol tuyệt đối
- Ether ethylic
- Acetone
 Nguyên vật liệu:
- Lòng đỏ trứng
- Dầu ăn
4.3. Nội dung
4.3.1. Xác định chỉ số peroxide
 Khái niệm: chỉ số peroxide đặc trưng cho sự ôi hóa của chất béo. Chỉ số
peroxide là số gam iod được giải phóng ra khi cho dung dịch KI tác dụng với

100 gam chất béo dưới tác dụng của các peroxide có trong chất béo.
 Nguyên tắc:
Trong không khí hoặc trong điệu kiện có oxi, các axit béo đặc biệt là các axit béo
không no dễ dàng bị oxy hóa tạo thành các peroxide, gây ra hiện tượng ôi hóa chất


béo. Để khảo sát mức độ ôi hóa chất béo, khi cho KI tác dụng với peroxide, giải
phóng ra iod, sau đó chuẩn lượng iod bằng dung dịch thiosulfat natri.
 Tiến hành
Chuẩn bị 2 bình cầu
- Bình 1 : Cân 3g dầu ăn vào bình cầu, thêm vào bình 20ml acetic và 10ml chloroform
(theo tỉ lệ 3:2 theo khối lượng), lắc đều cho dầu hòa tan hoàn toàn. Sau đó cho thêm
5ml dung dịch KI bão hòa rồi để yên 30 phút trong tủ tối, lấy ra tiếp tục cho 30 ml
nước cất và đem chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,01N đến khi dung dịch có màu vàng, sau
đó thêm 1ml dung dịch hồ tinh bột 1% và chuẩn tiếp đến khi hết màu xanh.
- Bình 2: (mẫu trắng) Cho 3ml nước cất vào bình cầu, thêm vào bình 20ml acetic và
10ml chloroform (theo tỉ lệ 3:2 theo khối lượng), lắc đều. Sau đó thêm 5ml dung
dịch KI bão hòa, thêm vào 1ml dung dịch hồ tinh bột 1% và chuẩn đến hết màu xanh.
 Kết quả chuẩn độ:
+ 15ml Na2S2O3 0,01N được dùng để chuẩn độ chất béo (bình 1 )
+ 3,6ml Na2S2O3 0,01N được dùng để chuẩn độ mẫu trắng (bình 2 )
 Tính toán kết quả: Chỉ số peroxide (Px) biểu thị bằng số gam iod thoát ra từ
100g chất béo.
PX =

=

= 0,48

Trong đó:

V1 : dung dịch Na2S2O3 0,01N dùng để chuẩn độ mẫu chất béo (ml)
V2: Dung dịch Na2S2O3 0,01N dùng để chuẩn độ mẫu trắng (ml)
N: Nồng độ đương lượng của dung dịch Na2S2O3
G: Trọng lượng mẫu phân tích (g)
4.3.2. Xác định chỉ số acid
 Khái niệm:Chỉ số acid là số mg KOH cần thiết dùng để trung hòa acid béo tự
do có trong 1g chất béo
 Nguyên tắc: Cho KOH 0,01N trung hòa các acid béo tự do trong chất béo với
chỉ thị màu phenolphthalein
 Tiến hành:
- Cho vào mỗi bình 5ml acol tuyệt đối và 5ml ether ethylic,cho thêm vài giọt
phenolphthalein, dùng KOH trung hòa hỗn hợp đến khi xuất hiện màu hồng nhạt.


- Cho thêm vào hỗn hợp 1g dầu ăn và tiếp tục dùng KOH 0,01N chuẩn độ đến khi
màu hồng bền trong 30 giây. Đọc thể tích KOH.
- Đối với mẫu trắng : cho 1ml nước cất vào bình, dùng KOH 0,01N chuẩn độ đến
khi màu hồng bền trong 30 giây. Đọc thể tích KOH.
 Kết quả: Thể tích KOH dùng để chuẩn độ
- Dầu ăn là 0,5ml
- Mẫu trắng (nước cất) là 0,35ml
 Tính kết quả: chỉ số axit được tính theo công thức:
Ca =

=

= 0,083

Trong đó:
Ca: chỉ số acid

v: số ml KOH 0,01N chuẩn độ (ml)
0,56mg acid béo tương ứng với 1ml KOH 0,01N
k: hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch KOH 0,01N (nếu có)
m: khối lượng mẫu phân tích (gam)
4.3.3. Khảo sát đặc tính của lecithin
 Nguyên tắc: Lecithin là lipid có chứa gốc phosphate (phospholipid), trong thành
phần có nhóm phân cực alcol amincholin, là nhóm có tính bazo mạnh. Chiết tách
lecithin trong long đỏ trứng bằng alcol và khảo sát đặc tính của lecithin cũng như
nhóm alcol amincholin.
 Tiến hành:
Cho ½ lòng đỏ trứng đã đánh nhuyễn vào bình tam giác 100ml, thêm 10ml alcol
tuyệt đối,khuấy đều, đun cách thủy ở 75-80 , tiếp tục khuấy đều trong thời gian 10
phút (là thời gian để rút tách lecithin). Trong trường hợp lượng alcol bị bốc hơi hết
thì thêm đúng lượng ancol ban đầu. Sau đó lọc hỗn hợp và thu dịch lọc. Sau đó dùng
dịch chiết bố trí thí nghiệm sau:
Ống nghiệm
Dịch chiết
Acetone
Nước cất

1
1ml
2ml
0ml

2
1ml
0ml
2ml

Hình 1. Bố trí dung dịch vào hai ống nghiệm
 Hiện tượng và giải thích:
- Ống nghiệm 1: dung dịch không đổi màu vì lecithin (có mhóm phân cực alcol
amincholin) nên không tan trong acetone (không phân cực)
- Ống nghiệm 2: dung dịch có màu trắng xám do lecithin tan trong nước (dung môi
phân cực) dẫn đến sự chuyển màu của dung dịch.
 Kết luận: Nhờ đặc tính vừa ưa nước, vừa kỵ nước nên phospholipid tham gia
trong việc đảm bảo tính thấm một chiều của các màng cấu trúc dưới tế bào.

Chương 5: VITAMIN
I. Mục đích:
 Nắm được phương pháp định tính vitamin B1 bằng phản ứng với thuốc thử diazo
 Nắm được phương pháp định lượng vitamin C
II. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, nguyên vật liệu:
 Dụng cụ:
- Ống nghiệm
- Bình định mức 100 ml
- Bình tam giác


- Pipet
- Micropipet
- Cối sứ
- Chày sứ
- Cốc thủy tinh
- Phễu thủy tinh
- Giấy lọc
 Hóa chất
- Natri nitric 5%

- Acid sulfanilic 1%
- Natri carbonate 10%
- Acid chlohydric 1%
- Acid oxalic 1%
- Chì acetate 30%
- 2,6 dichlorophenol indophenol
 Nguyên vật liệu:
- Vitamin B1
- Nước cam, quýt
- Vỏ cam

III. Nội dung
1. Định tính vitamin B1 bằng phản ứng với thuốc thử diazo
 Tiến hành: Cho vào ống nghiệm lần lượt 0,5 ml dung dịch vitamin B1 +
0,5 ml dung dịch acid sulfanilic 1% + 0,5 ml dung dịch natri nitric 5% + 10
giọt dung dịch natri carbonate 10%, lắc đều
 Kết quả: dung dịch trong ống nghiệm có màu đỏ cam
 Giải thích: Trong môi trường kiềm thiamin (vitamin B1) phản ứng với
thuốc thử diazo sẽ cho phức màu cam hoặc đỏ.
2. Định lượng vitamin C


 Tiến hành:
 Với sản phẩm dạng lỏng: Lấy 5 ml nước cam (nước quýt) cho vào bình
định mức 100 ml, thêm vào bình 20 ml HCl 1% và định mức bằng acid
oxalic 1% đến vạch định mức, lắc đều. Nếu thấy có cặn thì lọc trong
dung dịch. Hút 10 ml dịch chiết và chuẩn độ bằng dung dịch thuốc thử
2,6 dichlophenolindophenol cho tới khi xuất hiện màu hồng nhạt.
 Với sản phẩm dạng rắn: Cân khoảng 2g vỏ cam, thái nhuyễn, ngâm
trong 20 ml HCl 1%, sau đó giã nhuyễn và cho vào bình định mức, thêm

3 ml chì acetate 30% và định mức bằng acid oxalic 1% đến vạch, để yên
10 phút và lọc. Hút 10 ml dịch chiết và chuẩn độ bằng thuốc thử 2,6
dichlophenolindophenol cho tới khi xuất hiện màu hồng nhạt.
 Kết quả:
Tính kết quả: Hàm lượng vitamin C (mg %)
X=

(𝑎−𝑏)×𝑓×𝑉×100
𝑣×𝑚

Trong đó:
a: số ml natri 2,6 dichlorophenol indophenols dùng định phân dịch chiết
vitamin C
b: : số ml natri 2,6 dichlorophenol indophenols dùng định phân mẫu kiểm
chứng (b= 0.2)
f: số mg acid ascorbic ứng với 1 ml dung dịch natri 2,6 dichlorophenol
indophenol (f= 0.088)
V: tổng thể tích dịch chiết (ml)
v: thể tích mẫu đem chuẩn độ (ml)
m: lượng mẫu cân (g)
 Nước cam:
Lần 1

Lần 2

Lần 3

Trung bình

1

0,95

0,95

0,97

Bảng 1: số ml natri 2,6 dichlorophenol indophenol dùng định phân dịch chiết
vitamin C từ nước cam


X=

(0,97−0,2)×0,088×100×100
10 ×5

= 13,55 (mg%)

 Nước quýt:
Lần 1

Lần 2

Lần 3

Trung bình

1,65

1,7

1,6

1,65

Bảng 2: số ml natri 2,6 dichlorophenol indophenol dùng định phân dịch chiết
vitamin C từ nước quýt
X=

(1,65−0,2)×0,088×100×100
10 ×5

= 25,52 (mg%)

 Vỏ cam:
Lần 1

Lần 2

Lần 3

Trung bình

0,4

0,35

0,35

0,37

Bảng 3: số ml natri 2,6 dichlorophenol indophenol dùng định phân dịch chiết
vitamin C từ vỏ cam
X=

(0,37−0,2)×0,088×100×100
10 ×2

= 7,48 (mg%)

Chương 6: ENZYME
6.1. Mục đích:
 Xác định hoạt tính của enzyme amylase
 Khảo sát enzyme urease trong bột đậu nành
6.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, nguyên vật liệu:
 Thiết bị:
- Bếp điện
- Bếp cách thủy
 Dụng cụ:
- Bình cầu


- Ống nghiệm
- Bình tam giác
- Giấy lọc
- Micropipet
- Cốc thủy tinh
- Phễu thủy tinh
- Đũa thủy tinh
- Buret

- Pipet
- Đĩa kính đồng hồ
 Hóa chất
- Hồ tinh bột 1%
- Thuốc thử phenolphthalein 1%
- Dung dịch đệm pH = 5
- Dung dịch iod 1%
- Dung dịch CuSO4 2%
- Dung dịch CaCl2 1%
- Dung dịch NaOH 0,05N
- Formol trung tính
- Urea 2%
 Nguyên vật liệu:
- Bột đậu nành
- Lúa nẩy mầm
6.3. Nội dung
6.3.1. Xác định hoạt tính của enzyme amylase
6.3.1.1. Đo hoạt tính enzyme amylase
 Nguyên tắc:
- Dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột của enzyme amylase thành các sản phẩm
và khả năng kết hợp cũng như tạo màu của các sản phẩm với iod.


- Phức hệ amylase của mầm lúa có khả năng thủy phân tinh bột thành các
sản phẩm lần lượt là: Tinh bột (màu xanh với iod) → amylodetrix (màu tím
với iod), Erythrodetrix (màu đỏ với iod) → achrodetix (không kết hợp iod,
khong có màu) → maltodetrix (không kết hợp với iod) → Maltose và
glucose (không kết hợp với iod)
- Khi cho sản phẩm thủy phân kết hợp với iod, ta có thể nhận biết thời gian
kết thúc phản ứng.

 Tiến hành
- Ly trích amylase
Trích ly từ lúa: Cân 10 g lúa nẩy mầm đã nghiền nhỏ, cho vào bình tam
giác dung tích 250 ml, cho vào 50 ml nước cất và 10 ml dung dịch đệm
phosphate pH = 4,9. Giữ hỗn hợp ở nhiệt độ 300C trong thời gian 1 giờ có
khuấy định kỳ. Lọc, rửa thu hồi dịch trích enzyme sao cho V = 100 ml. Bảo
quản dung dịch gốc ở 2-40C trong thời gian 1 ngày.
Pha loãng enzyme gốc bằng dung dịch đệm sao cho trong 1 ml dung dịch
enzyme phân tích chứa một lượng enzyme đủ để thủy phân 20-30% tinh
bột trong dung dịch ở điều kiện xác định
- Xác định hoạt tính
Chuẩn bị dung dịch thí nghiệm theo bảng sau:

Bảng 1. Bố trí thí nghiệm đo hoạt tính amylase
Ống nghiệm

1

2

3

4

5

6

7

8

Hồ tinh bột 1% (ml)

1

1

1

1

1

1

1

1

Nước cất (ml)

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

Dung dịch đệm pH =
4.9 (ml)

2

2

2

2

2

2

2

2

Dung dịch cho vào

Để ổn định ở 500C ( trong 5 phút)

Thể tích dung dịch
enzyme (ml)

2,0

1,8

1,6

1,4

1,2

1,0

0,8

0,6

Thời gian kết thúc
thủy phân (giây)

42

52

62

70

83

100

119

144

Cho dung dịch enzyme vào ống nghiệm, dùng pipet khuấy nhẹ dung dịch và lấy ra
1 giọt để thử màu với iod. Khi màu của dung dịch iod không thay đổi thì sự thủy
phân tinh bột kết thúc.
2.5

2
y = 3.288e-0.012x
R² = 0.9987

1.5

1

0.5

0
0

20

40

60

80

100

120

140

160

Đồ thị tương quan giữa thể tích dung dịch enzyme và thời gian kết thúc thủy
phân
 Nhận xét: khi thể tích dung dịch enzyme càng giảm thì quá trình thủy phân
tinh bột càng chậm, nên thời gian tinh bột kết thúc phản ứng màu với iod càng
lâu
6.3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên tốc độ thủy phân của
enzyme.
 Tiến hành Chuẩn bị dung dịch thí nghiệm theo bảng sau:
Bảng 2. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất lên tốc độ
thủy phân enzyme
Ống nghiệm

1

2

3

4

5

6

7