Nghiên cứu nuôi cấy cảm ứng biệt hóa in vitro tế bào gốc từ mô mỡ thành tế bào sụn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------------------------------

NGUYỄN THỊ NAM

NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY CẢM ỨNG
BIỆT HÓA IN VITRO TẾ BÀO GỐC
TỪ MÔ MỠ THÀNH TẾ BÀO SỤN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Hà Nội – Năm 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------------------------------

NGUYỄN THỊ NAM

NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY CẢM ỨNG
BIỆT HÓA IN VITRO TẾ BÀO GỐC
TỪ MÔ MỠ THÀNH TẾ BÀO SỤN
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
NGƯỜI HƯỚNG DẪN:
1. TS. Đỗ Minh Trung

2. PGS.TS. Nguyễn Thị Xuân Sâm

Hà Nội – Năm 2017


LỜI CAM ĐOAN
Luận văn này là sản phẩm khoa học thuộc đề tài cấp Nhà Nước ―Nghiên
cứu ứng dụng tế bào gốc tự thân trong điều trị bệnh thoái hóa khớp‖ mang Mã số:
ĐTĐL. 2012-G/21 do Học viện Quân y chủ trì.
Là người tham gia trực tiếp thực hiện các nội dung thuộc đề tài được trình
bày trong luận văn này, tôi xin cam đoan những số liệu và kết quả nghiên cứu
trong luận văn là trung thực và chưa từng được các tác giả khác công bố trong
các luận văn, luận án nào và đã được chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng vào luận
văn này.
Hà Nội, ngày

tháng

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Nam

i

năm 2017


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơntới PGS. TS Nguyễn Thị Xuân Sâm, Trưởng bộ
môn Hóa sinh – Vi sinh – Sinh học Phân tử cùng các thầy cô giáo, các cán bộ

phòng Hóa sinh – Vi sinh – Sinh học Phân tử, Trung tâm nghiên cứu và Phát triển
Công nghệ Sinh học – Viện Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm và Viện
Đào tạo Sau đại học – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình giúp đỡ, dạy
bảo và động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đỗ Minh Trung tại Học viện Quân y cùng các
cán bộ, nhân viên Phòng Protein-Độc chất-Tế bào, Trung tâm Nghiên cứu Y dược
học Quân sự, Học viện Quân y đã tạo điều kiện thuận lợi để đề tài được triển khai
bảo đảm tiến độ và chất lượng.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên,
khích lệ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu.

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii
MỤC LỤC ................................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................... v
DANH MỤC CÁC BẢNG....................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ............................................................... vii
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................ 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN .................................................................................... 3
1.1. Tế bào gốcvà phân loại tế bào gốc ................................................................ 3
1.1.1. Tế bào gốc ................................................................................................ 3
1.1.2. Phân loại tế bào gốc .................................................................................. 5
1.2. Tế bào gốc trung mô ...................................................................................... 9
1.2.1. Nguồn gốc và đặc điểm của tế bào gốc trung mô .................................... 9
1.2.2. Tiềm năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô [24]. ................................. 10
1.3. Tế bào gốc mô mỡ ........................................................................................ 14

1.3.1. Nguồn gốc và đặc điểm của tế bào gốc từ mô mỡ ................................. 14
1.3.3. Ứng dụng tế bào gốc trung mô từ mô mỡ để điều trị bệnh ở người....... 16
1.3.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc ở Việt Nam ................... 18
1.4. Bệnh thoái hóa khớp ................................................................................... 22
1.4.1. Tình hình mắc bệnh ................................................................................ 22
1.4.2. Cơ chế bệnh sinh thoái hoá khớp ........................................................... 23
1.4.3. Một số biến đổi trong bệnh thoái hóa khớp ............................................ 24
1.5. Các phƣơng pháp điều trị thoái hóa khớp ................................................ 26
1.5.1. Điều trị không dùng thuốc ...................................................................... 26
1.5.2. Điều trị bằng thuốc ................................................................................. 26
1.5.3. Điều trị bằng phẫu thuật ......................................................................... 26
iii


1.5.4. Điều trị thoái hóa khớp bằng huyết tương giàu tiểu cầu ........................ 27
1.5.5. Điều trị thoái hóa khớp bằng tế bào gốc................................................. 27
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 29
2.1. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 29
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 30
2.2.1. Xác định số lượng và tỷ lệ tế bào sống .................................................. 30
2.2.2. Xác định độ vô khuẩn của tế bào ........................................................... 30
2.2.3. Nuôi cấy tăng sinh tế bào ....................................................................... 30
2.2.4. Xác định các dấu ấn của tế bào bằng flowcytometry ............................. 31
2.2.5. Thu hoạch và bảo quản tế bào ................................................................ 31
2.2.6. Phục hồi tế bào sau bảo quản lạnh sâu ................................................... 31
2.2.7. Biệt hóa tế bào gốc từ mô mỡ theo hướng tạo thành tế bào sụn: ........... 32
2.2.8. Địa điểm nghiên cứu .............................................................................. 34
2.2.9. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu........................................................... 34
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 35
3.1. Nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc mô mỡ ........................................................ 35

3.2. Định danh tế bào bằng dấu ấn bề mặt ....................................................... 38
3.3. Nuôi cấy cảm ứng biệt hóa tế bào gốc mô mỡ thành tế bào sụn ............. 42
3.3.1. Khảo sát môi trường cơ bản để biệt hóa tế bào gốc từ mô mỡ thành tế bào
sụn ..................................................................................................................... 42
3.4. Biệt hóa tế bào .............................................................................................. 45
3.5. Một số biến đổi phân tử của tế bào gốc từ mô mỡ trong quá trình biệt
hóa theo hƣớng thành giống tế bào sụn ............................................................ 46
KẾT LUẬN ............................................................................................................. 51
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................ 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 53

iv


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACD

Acid citric, Citrat natri, Dextrose

ADSCs

Adipose derived stem cells (tế bào gốc mô mỡ)

DMEM

Dullbecco’s Modifide Eale Medium

DMSO

Dimethyl sunfoxide

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

FBS

Fetal Bovine Serum (huyết thanh bào thai bê)

HLA

Human Leukocyte Antigens: Kháng nguyên bạch cầu người

HTGTC

Huyết tương giàu tiểu cầu

MSCs

Mesenchymal stem cells (Tế bào gốc trung mô)

SVF

Stromal vascular fraction (phân đoạn nền mạch máu)

SLTB

Số lượng tế bào

PBS

Phosphate-buffered saline (Đệm muối phốt phát

PRP

Platelet Rich Plasma (huyết tương giàu tiểu cầu)

TB

Tế bào

TBG

Tế bào gốc

v


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Khảo sát các thành phần môi trường cảm ứng biệt hóa thành tế bào sụn ..... 33
Bảng 2.2: Trình tự các cặp mồi sử dụng để nhận biết tế bào sụn bằng kỹ thuật
RT-PCR ............................................................................................................ 34

vi


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Khả năng tự tái tạo và biệt hóa tế bào gốc ................................................ 3

Hình 1.2: Các hình thức phân bào .............................................................................. 4
Hình 1.3: Ứng dụng của công nghệ TBG ................................................................... 5
Hình 1.4Phân loại tế bào gốc. ..................................................................................... 7
Hình 1.5. Biệt hóa tế bào gốc phôi. ............................................................................ 7
Hình 1.7. Sự biệt hóa của tế bào gốc mô mỡ ........................................................... 15
Hình 1.8. Cách thức sử dụng tế bào gốc điều trị thoái hóa khớp gối ..................... 17
Hình 1.9. Hình ảnh minh họa các mức độ tổn thương sụn khớp .............................. 23
Hình 3.1: Nuôi cấy tăng sinh TBG từ Mô mỡ .......................................................... 36
Hình 3.2: Hình ảnh tế bào gốc mô mỡ ..................................................................... 36
Hình 3.3: Nhuộm Giemsa tế bào .............................................................................. 37
Hình 3.4: Đường cong tăng trưởng của TBG từ mô mỡ. ......................................... 37
Hình 3.5: Kết quả phân tích biểu hiện một số dấu ấn bề mặt của tế bào sau khi cấy
chuyền lần 3 (P3) ...................................................................................... 39
Biểu đồ 3.6: Nồng độ collagen type II ở các mẫu tế bào được khảo sát ở các môi
trường cảm ứng biệt hóa khác nhau. ......................................................... 44
Biểu đồ 3.7: Đường chuẩn của collagen type II. ...................................................... 44
Hình 3.8: Hình ảnh nhuộm tế bào bằng Alcian Blue ............................................... 46
Hình 3.9: Xác định dấu ấn -actin............................................................................ 48
Hình 3.10: Xác định dấu ân Aggrecan của tế bào biệt hóa. ..................................... 49
Hình 3.11: Xác định dấu ân collagen type II của tế bào biệt hóa. ............................ 49

vii


ĐẶT VẤN ĐỀ
Các bệnh về xương khớp là một nhóm bệnh thường gặp nhất (chiếm tỷ lệ cao
nhất ở các nước phát triển và đang phát triển), gây đau đớn kéo dài cho hàng trăm
triệu người, gây tàn phế cho nhiều người. Ngoài tác động rất lớn về kinh tế, xã hội,
các bệnh xương khớp còn ảnh hưởng nặng nề đến tâm lý, tình cảm của con người.
Trong các bệnh về xương khớp, bệnh thoái hoá khớp là một trong những bệnh hay

gặp. Bệnh gây đau đớn kéo dài cuối cùng dẫn đến mất chức năng vận động và tàn
phế. Bệnh thường xuất hiện ở lứa tuổi trung niên trở đi. Biểu hiện bệnh lý sớm nhất
ở sụn khớp bởi các thay đổi về hình thái, sinh hóa, phân tử và sinh học của tế bào và
chất cơ bản của sụn dẫn đến nhuyễn hóa, nứt loét và mất sụn khớp. Hiện nay, có
nhiều phương pháp điều trị nhưng phần lớn các biện pháp điều trị, như dùng thuốc
giảm đau, chống viêm và bổ xung dịch khớp đều chỉ mang lại tác dụng giảm đau
cho người bệnh mà chưa giải quyết được quá trình tiến triển của bệnh thoái hóa
khớp. Bên cạnh đó, đa số các thuốc điều trị thoái hóa khớp đều có nhiều tác dụng
không mong muốn liên quan tới việc sử dụng dài ngày các thuốc điều trị.
Những nghiên cứu gần đây đã cho thấy việc sử dụng tế bào gốc (TBG)
trưởng thành có nhiều tiềm năng điều trị rất lớn. Hiện nay TBG trưởng thành có thể
được lấy từ nhiều nguồn khác nhau, trong đó phổ biến nhất là lấy từ tủy xương và
mô mỡ. Kỹ thuật lấy TBG từ mô mỡ có thể cho số lượng tế bào gốc tương đương
hoặc lớn hơn so với kỹ thuật lấy từ tủy xương, đây cũng là kỹ thuật ít xâm nhập và
ít gây đau cho bệnh nhân. Chính vì vậy mô mỡ được coi là một nguồn rất tiềm năng
và dễ thực hiện việc phân lập TBG để dùng trong điều trị. Trong số các tế bào của
mô mỡ, phân đoạn tế bào nền mạch máu (stromal-vascular fraction: SVF) được
quan tâm nhiều trong nghiên cứu TBG, vì đây là nguồn cung cấp các TBG đa tiềm
năng. TBG từ mô mỡ có thể biệt hóa thành sụn và xương… điều này thể hiện tiềm
năng của chúng trong chữa trị bệnh thoái hóa khớp. Đã có một số nghiên cứu sử
dụng TBG tự thân từ mô mỡ để điều trị thoái hóa khớp gối và khớp háng cho thấy
biện pháp điều trị này an toàn và bước đầu có hiệu quả tốt cho người bệnh.

1


Để kiểm soát chất lượng sản phẩm mẫu TBG được cấy ghép vào cơ thể bệnh
nhân, việc đánh giá chất lượng tế bào gốc mô mỡ ở các giai đoạn sau phân lập, bảo
quản và hoạt hóa là yêu cầu thiết yếu. Bên cạnh đó chứng minh đượckhả năng biệt
hóa thành tế bào sụn trên in vitro của chính các mẫu TBG mô mỡ đã được cấy ghép

vào ổ khớp của bệnh nhân để điều trị thoái hóa khớp sẽ là minh chứng gián tiếp
khẳng định cơ chế các TBG được cấy ghép tham gia vào tái tạo mô sụn khớp tổn
thương. Xa hơn nữa việc cảm ứng biệt hóa TBG mô mỡ thành tế bào sụn trước khi
cấy ghép vào ổ khớp cũng là một hướng nghiên cứu nhằm tăng khả năng thành
công cũng như rút ngắn thời gian điều trị sau cấy ghép nhờ rút ngắn được thời gian
biệt hóa in vivocủa các TBG sau khi đã được cấy ghép vào ổ khớp.Từ những cơ sở
lý luận và thực tiễn trên chúng tôi tiến hành Đềtài “Nghiên cứu nuôi cấy cảm ứng
biệt hóa in vitro tế bào gốc từ mô mỡ thành tế bào sụn” vớicác mục tiêuchính
của đề tài là:
Mục tiêu nghiên cứu:
1. Nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc từ mô mỡ
2. Biệt hóa tế bào gốc từ mô mỡ theo hướng tạo thành tế bào sụn

2


CHƢƠNGI:TỔNG QUAN

1.1. Tế bào gốcvà phân loại tế bào gốc
1.1.1. Tế bào gốc
Tế bào gốc (TBG) là các tế bào chưa có chức năng chuyên biệt, có tiềm
năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau và có khả năng tự thay mới
(Self-Renewal) [47]. Các tế bào này là các tế bào chưa biệt hóa (Unspecialized
Cell) hoặc đang ở những giai đoạn khác nhau nhưng chưa kết thúc quá trình biệt
hóa (tế bào vạn tiềm năng, tế bào đa tiềm năng, tế bào ít tiềm năng, tế bào đơn
tiềm năng), do vậy chúng có thể đi theo nhiều hướng khác nhau để tạo thành nhiều
loại tế bào khác nhau.

Hình 1.1: Khả năng tự tái tạo và biệt hóa tế bào gốc [25].
Tự thay mới là khả năng của các TBG tạo ra các tế bào giống hệt chúng về

mức độ biệt hóa. Thông thường các tế bào phân chia theo kiểu đối xứng như từ một
tế bào tạo ra 2 tế bào giống hệt nhau; các TBG là các tế bào có khả năng phân chia
không đối xứng, nghĩa là từ một tế bào tạo ra 2 tế bào không đối xứng nhau, 1 tế
bào giống hệt tế bào ban đầu về mức độ biệt hóa, tế bào còn lại đã biệt hóa hơn sẽ
tiếp tục phân chia như vậy để tạo thành các tế bào, cơ quan chuyên biệt. Khả năng
tự thay mới có đặc tính chưa có chức năng chuyên biệt chính là cơ sở cho những
tiềm năng ứng dụng to lớn của công nghệ TBG [24].

3


Hình 1.2: Các hình thức phân bào[24].

Nghiên cứu về TBG có thể cho ta thêm những hiểu biết về quá trình biệt hóa
tế bào và sự phát triển của cơ thể người. Bản chất của quá trình biệt hóa là việc tắt
các gen trong vốn gen chung. Hiểu rõ về quá trình này ta có thể chủ động và kiểm
soát để tạo ra các tế bào như mong muốn hoặc điều trị các bệnh di truyền.
Trên cơ sở các TBG chưa hoàn tất quá trình biệt hóa và khả năng tăng sinh
mạnh mẽ của chúng, các nhà khoa học có thể chủ động tạo ra các tế bào giống hệt
nhau và ở các giai đoạn sinh lý, bệnh lý khác nhau rất gần với thực tế lâm sàng, điều
này rất có ý nghĩa trong việc nghiên cứu cơ chế tác dụng cũng như độc tính của các
loại thuốc hay các chế phẩm sinh học [24].
Và có thể nói ứng dụng quan trọng và rộng lớn nhất của công nghệ TBG là
trong điều trị. Trên cơ sở các TBG có thể biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác
nhau, chúng ta có thể chủ động nuôi cấy TBG trong ống nghiệm sau đó biệt hóa
chúng thành các tế bào như tế bào cơ, tế bào xương, tế bào thần kinh, tế bào sụn, tế
bào tuyến tụy, tế bào cơ tim… rồi ghép vào cơ thể người bệnh để điều trị một số
bệnh như các bệnh lý tim mạch, điều trị Parkinson, tiểu đường, trong lĩnh vực thẩm
mỹ hay thúc đẩy quá trình liền xương… [47].

4


Hình 1.3: Ứng dụng của công nghệ TBG
(Nguồn: )
1.1.2. Phân loại tế bào gốc
Có nhiều cách để phân loại tế bào gốc như: phân loại dựa vào tiềm năng
biệt hóa, phân loại dựa theo nguồn gốc phân lập và phân loại dựa vào kiểu tế bào
mà chúng biệt hóa.
1.1.2.1. Phân loại theo đặc tính hay tiềm năng biệt hóa
Theo tiềm năng biệt hóa có thể xếp tế bào gốc thành 4 loại: Tế bào gốc toàn
năng (các tế bào phôi dâu), TBG vạn tiềm năng (các tế bào tách từ khối tế bào bên
trong của phôi nang), TBG đa tiềm năng (các tế bào tách từ ba lá phôi), TBG đơn
năng (tế bào tạo máu…) [24].
 Tế bào gốc toàn năng (Totipotent stem cell):
Là những tế bào có khả năng biệt hóa thành tất cả các loại tế bào cơ thể từ
một tế bào ban đầu. Tế bào toàn năng có khả năng phát triển thành thai nhi, tạo ra 1
cơ thể sinh vật hoàn chỉnh. Trứng đã thụ tinh (hợp tử) và các tế bào được sinh ra từ
các lần phân chia đầu tiên của tế bào trứng đã thụ tinh (giai đoạn 2-4 tế bào – các
blastosomer) là các tế bào gốc toàn năng, có khả năng phân chia và biệt hóa ra tất cả
các dòng tế bào để tạo ra cơ thể sinh vật hoàn chỉnh [3].

5


 Tế bào gốc vạn tiềm năng (Pluripotent stem cell):
Là khối tế bào bên trong của Blastocyst. Là tế bào có khả năng biệt hoá
thành tất cả các tế bào ngoại trừ tế bào phôi.
 Tế bào gốc đa tiềm năng (Multipotent stem cells):
Là những tế bào có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào của cơ thể từ

một tế bào ban đầu. Trong cơ thể người, các tế bào gốc đa năng có mặt ở nhiều mô
khác nhau như màng xương, máu, tủy xương, cuống rốn, mô mỡ… . Các tế bào
được tạo thành nằm trong một hệ tế bào có liên quan mật thiết, ví dụ chỉ tạo nên các
tế bào máu (bao gồm hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, lympho…) hoặc chỉ tạo nên các
tế bào của hệ thống các cơ quan có nguồn gốc từ trung mô thời kì phôi thai như
xương, sụn, cơ, khớp, thần kinh, mỡ..
 Tế bào gốc đơn năng (Mono/unipotential stem cells):
Tế bào gốc đơn năng còn gọi là tế bào định hướng đơn dòng hay tế bào đầu
dòng (progenitor cells), là những tế bào gốc chỉ có khả năng biệt hóa theo một
dòng. Ví dụ mẫu tiểu cầu, tế bào định hướng dòng lympho, tế bào định hướng dòng
hồng cầu, dòng bạch cầu. Trong điều kiện bình thường, các tế bào gốc trưởng thành
trong nhiều mô đã biệt hóa tính đơn năng và có thể biệt hóa thành chỉ một dòng tế
bào. Khả năng biệt hóa theo dòng này cho phép duy trì trạng thái sẵn sàng tự tái tạo
mô, thay thế các tế bào mô chết vì già cỗi bằng các tế bào mô mới [35].
1.1.2.2. Phân loại theo dựa theo nguồn gốc phân lập
Theo nguồn gốc phân lập có thể phân tế bào gốc thành: Tế bào gốc phôi, tế
bào mầm phôi, tế bào gốc thai, tế bào gốc trưởng thành.

6


Hình 1.4Phân loại tế bào gốc[22].
 Tế bào gốc phôi (Embryonic stem cells):
Tế bào gốc phôi là tế bào gốc vạn năng được lấy từ phôi giai đoạn sớm (4-7
ngày tuổi). Ở giai đoạn này phôi có hình cầu và được gọi là phôi túi (blastocyst).
Blastocyst có cấu trúc gồm 3 thành phần: Một lớp tế bào bên ngoài (trophoblast),
một khoang chứa đầy dịch và một nhóm có khoảng 30 tế bào vạn năng nằm lệch về
một cực gọi là khối tế bào bên trong (inner cell mass). Dùng một loại enzyme đặc
biệt để phân tách các tế bào của khối này sẽ thu được cáctế bào gốc phôi.

Hình 1.5. Biệt hóa tế bào gốc phôi[25].

7


Trong những điều kiện nhất định, các tế bào này có thể biệt hóa thành bất kì
loại tế bào nào trong cơ thể, về tiềm năng biệt hóa thì đây chính là các tế bào vạn
tiềm năng. Hơn nữa các tế bào này còn rất non nên có khả năng tăng sinh rất mạnh
mẽ, chúng có thể nhanh chóng tạo ra một số lượng lớn các tế bào nếu được cung
cấp đầy đủ các yếu tố cần thiết, do vậy các tế bào này có tiềm năng rất lớn trong
điều trị. Đây cũng là loại tế bào được quan tâm nhiều nhất không chỉ vì tiềm năng
ứng dụng to lớn của chúng mà còn vì vấn đề đạo đức xung quanh việc sử dụng các
tế bào này bởi lẽ để thu được các yếu tố này cần phải phá hủy phôi đồng nghĩa với
việc ―giết người‖ và điều này bị nhiều tổ chức và quốc gia lên án [24].
Nguồn phôi cho thu nhận tế bào gốc hiện tại chủ yếu có từ công nghệ IVF
hay ICSI. Bằng một trong hai kĩ thuật này, từ các tinh trùng và trứng, nhiều phòng
thí nghiệm có thể tạo ra phôi một cách chủ động. Phôi được nuôi, ủ và thu nhận tế
bào gốc ở giai đoạn cần thiết. Ngoài nguồn trên, một số trung tâm, phòng thí
nghiệm trên thế giới phát triển các nguồn tế bào gốc từ phôi chuyển nhân, chuyển
gen, hay phôi tạo dòng hoặc nhân bản. Đây là hướng đi mới để tạo nguồn tế bào gốc
phôi sử dụng trong điều trị bệnh.
 Tế bào mầm phôi (Embryonic germ cells):
Tế bào mầm phôi là các tế bào mầm nguyên thủy có tính vạn năng. Đó là
những tế bào sẽ hình thành nên giao tử (trứng và tinh trùng) ở người trưởng thành.
Các tế bào mầm nguyên thủy này được phân lập từ phôi 5-9 tuần tuổi hoặc từ thai
nhi. So với tế bào phôi, các tế bào mầm phôi khó duy trì dài hạn hơn trong nuôi cấy
nhân tạo do chúng ở giai đoạn biệt hóa cao hơn [46].
 Tế bào gốc thai (Foetal stem cells):
Tế bào gốc thai (tế bào gốc vạn năng hoặc đa năng) thường được thu nhận từ
các mô của thai bỏ, hay các phần phụ của thai nhi sau khi sinh. Tuy nhiên, vấn đề

đạo lí luôn là cản trở lớn nhất.
 Tế bào gốc trưởng thành (Adult stem cells/Somatic stem cells):
Còn gọi là tế bào gốc thân. Là các tế bào chưa biệt hóa được tìm thấy với
một lượng ít các mô người trưởng thành (máu ngoại vi, mô da, mô cơ, mô mỡ…).
Đặc biệt trong cơ thể, vai trò chủ yếu của các tế bào gốc trưởng thành là duy trì và
sửa chữa mô mà ở đó chúng được tìm ra. Tế bào gốc trưởng thành được cho là có
8


tính đa năng, chúng có thể phát triển thành nhóm các tế bào có quan hệ mật thiết với
nhau trong cùng mô. Một số loại tế bào gốc trưởng thành có thể có tính vạn năng,
hoặc ít nhất có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau [62].
Ngày nay, các nhà khoa học càng ngày càng phát hiện ra nhiều ổ tế bào gốc
trưởng thành. Các kiến thức về vị trí của các ổ tế bào gốc ở các cơ quan, mô đã giúp
chỉ ra cách thu nhận và sử dụng chúng trong điều trị bệnh. Trong các ổ tế bào gốc
trưởng thành, ổ tế bào gốc tủy xương được quan tâm và biết rõ hơn cả. Đã từ lâu,
tủy xương được xác định là nơi cư ngụ của nhiều tế bào gốc tạo máu. Đó là nguồn
tế bào gốc quan trọng trong cơ chế điều hòa số lượng tế bào máu, chúng được đảm
bảo cân bằng trong suốt quá trình sống của cơ thể. Ngoài tế bào gốc tạo máu, tủy
xương còn được biết như là một trong các mô có chứa nguồn tế bào gốc trung mô.
Nguồn tế bào này có tính mềm dẻo cao, chúng có thể biệt hóa, hay chuyển biệt hóa
thành nhiều kiểu tế bào chức năng khác nhau.
 Tế bào gốc ung thư (Cancer Stem cells):
Là những tế bào được lấy ra trực tiếp từ khối u. Chúng có những đặc điểm
tương đối giống với tế bào gốc phôi và có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào.
Các tế bào gốc ung thư được tạo ra bởi các đột biến từ các tế bào gốc bình
thường. Tuy nhiên, một vài dòng cho thấy rằng tế bào gốc ung thư cũng tạo ra từ
các tế bào tiền thân bị đột biến. Các tế bào tiền thân này (cũng còn gọi là các tế bào
khuyếch đại chuyển – TAC) có thể có khả năng khuyếch đại, nhưng chúng thường
không có khả năng tự làm mới như một tế bào gốc. Để trở thành tế bào gốc ung thư,

một tế bào tiền thân phải có sự tích tụ các đột biến gây nên sự lặp lại, tạo đặc tính tự
làm mới.
1.2. Tế bào gốc trung mô
1.2.1. Nguồn gốc và đặc điểm của tế bào gốc trung mô
Tế bào gốc trung mô là tế bào gốc trưởng thành, đa tiềm năng được thu nhận
từ những mô có nguồn gốc từ trung bì như: xương, sụn, chất nền tủy xương, mô xơ
cơ ở khoảng giữa hai tổ chức, cơ vân, mô mỡ [24].
Các tế bào gốc trung mô có hình dáng đặc trưng và giống với các nguyên bào
sợi: Đó là các tế bào hình thoi, kích thước 20μm, có nhiều nhánh bào tương, nhân
lớn, trong tế bào, lưới nội bào hạt rất phát triển.
9


1.2.2. Tiềm năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô [24].
Mỗi loại tế bào được biệt hóa biểu hiện một số lượng gen nhất định của
genome và mỗi một loại tế bào được hình thành qua một kiểu biểu hiện riêng của
gen được điều hòa. Vì vậy sự biệt hóa tế bào là sự chuyển đổi từ một loại tế bào này
thành một loại khác và nó liên quan đến một ―công tắc‖ đóng một số gen đang hoạt
động và mở một số gen chưa hoạt động. Những thay đổi này dẫn đến tế bào biến
đổi theo chiều hướng phù hợp với các yếu tố kích thích và sẽ tạo thành một kiểu tế
bào chuyên biệt nào đó.
Tế bào gốc trung mô là các tế bào có khả năng tăng sinh mạnh mẽ và có thể
biệt hóa tạo thành nhiều loại tế bào khác nhau như các tế bào mỡ, tế bào xương, tế
bào sụn, tế bào cơ, tế bào thần kinh… nói cách khác đây chính là các tế bào tiền
thân trưởng thành đa tiềm năng, chúng là nguồn cung cấp tế bào để bù đắp lại sự
thiếu hụt mô. Trong cơ thể dưới tác dụng của các tín hiệu từ các vết thương, ổ gẫy
xương, ổ viêm, hay chỉ là các điều kiện vi môi trường từ một vị trí đặc biệt nào đó
các tế bào này sẽ được huy động và biệt hóa thành các tế bào chuyên biệt.
TBG trung mô có khả năng biệt hóa trong điều kiện in vitro, biệt hóa có thể
được thực hiện theo những phương pháp như:

- Sử dụng hóa chất cảm ứng biệt hóa: Một số hormone, cytokine, vitamin,
các ion Ca2+… một số hóa chất hay sử dụng trong cảm ứng biệt hóa tế bào như
Dexamethason, Indomethacin, Hydrocortison, TGF-β... với một hàm lượng và tỷ lệ
nhất định tùy thuộc vào mỗi loại tế bào. Các hóa chất tác động lên tế bào làm tế bào
thay đổi sự biểu hiện của gen, hoặc đóng một số gen đang hoạt động và mở một số
gen chưa hoạt động. Những thay đổi này dẫn đến tế bào biến đổi theo chiều hướng
phù hợp với kích thích, và sẽ tạo thành một kiểu tế bào chuyên biệt nào đó. Ngoài
ra, các nhân tố tăng trưởng thu nhận từ các dịch mô cũng được xem là chất biệt hóa
định hướng.
- Biệt hóa bằng các chất nền: biệt hóa bằng các chất nền dựa vào sự tương
tác giữa tế bào và chất nền trong nuôi cấy tế bào in vitro. Tế bào hoạt động nằm
trong chất nền ngoại bào ECM (Extra cellular matrix). ECM có chứa các hợp chất
cao phân tử như collagen, laminin, fibronectin… Ngoài vai trò làm cấu trúc như
một giá thể cho các tế bào, ECM còn có vai trò sinh lý như một vi môi trường của
10


các tế bào. Mỗi mô khác nhau có thành phần ECM của riêng nó. Do đó, việc bổ
sung ECM thích hợp vào nuôi cấy in vitro giúp các tế bào gốc có thể biệt hóa thành
các tế bào mong muốn.
- Đồng nuôi cấy với các tế bào đã biệt hóa: Khi thực hiện đồng nuôi cấy, tế
bào gốc và tế bào đã biệt hóa tương tác mật thiết với nhau, dẫn đến sự truyền các tín
hiệu phân tử một cách hiệu quả gây ra sự biệt hóa ở tế bào gốc.
- Kích thích vật lý: xung điện, các lực cơ học và xử lý nhiệt có thể làm tế bào
gốc biệt hóa. Nếu làm giảm nhiệt độ các tế bào cơ tim phôi chuột sẽ làm tăng sự
biểu hiện của beta-TGF, tác nhân gây biệt hóa ở một số tế bào.
- Các gốc tự do và dạng oxygen hoạt động: các gốc tự do và dạng oxygen
hoạt động là những chất truyền tin nội bào quan trọng trong quá trình biệt hóa của
tế bào.
- Chuyển gen: phương pháp này thường được sử dụng để điều hòa sự biệt

hóa tế bào gốc phôi. Đưa gen cần chuyển vào tế bào nhằm bổ sung một số gen hoạt
động vào hệ gen của tế bào gốc phôi, khởi động sự biệt hóa tế bào gốc theo con
đường tạo thành tế bào chuyên hóa mong muốn.
 Biệt hóa thành sụn:
Sự biệt hóa MSC thành sụn là một dấu hiệu quan trọng trong sự tái sinh sụn.
Sụn có khả năng tái sinh thấp bởi sự khan hiếm các tế bào tiền thân tạo sụn trong cơ
thể người trưởng thành. Hầu hết tế bào trong khớp xương trong người lớn là những
tế bào sụn đã trưởng thành, thay vì những tế bào tiền thân sụn có khả năng tăng
nhanh và biệt hóa thành tế bào sụn [22].
- Các nhân tố phát triển chuyển dạng TGF-β1, TGF-β2 hay TGF-β3 cũng
được mô tả kích thích sự tạo thành sụn của MSC. Sự kết hợp của TGF-β3 và
protein-6 tạo hình thể xương (BMP-6), gia tăng sự tích tụ của chất nền sụn.
- Quy trình biệt hóa thành sụn [22]:
+ Môi trường biệt hóa thành sụn: 95% DMEM high glucose, 1% 1X ITS +
1 Solution, 1% kháng sinh, 100 µg/ml sodium pyruvate, 50 µg/ml L-ascorbic axit
2-phosphate (AsAP), 40 µg/ml L-proline, 0,1 µM dexamethasone và 10 ng/ml
TGF-β3.
11


Sử dụng thuốc nhuộm mô là cách tiện lợi để quan sát sự biệt hóa thành sụn
của các tế bào MSC. Thuốc nhuộm là tác nhân nhạy cảm với proteoglycan và
glycosaminoglycan sulfate. Thuốc cảm ứng với các glycosaminoglycan và
proteoglycan, bao gồm satranin-O/fast green và Alcian Blue. Các thuốc nhuộm mô
này đã được sử dụng để đánh dấu các sụn khớp và sự phát triển của đĩa sụn, do đó,
chúng là dấu ấn đáng tin cậy cho sự biệt hóa sụn.
Sự biệt hóa tạo sụn được điều khiển bởi các nhân tố phiên mã như họ SOX,
SOX9 được biểu hiện trong các tế bào sụn đan biệt hóa, sự mất của SOX9 gợi ra sự
hình thành xương sụn, giảm sự dị thường của phát triển xương. SOX5 và SOX6
được biểu hiện trong suốt quá trình biệt hóa tạo sụn. Sự tổng hợp sinh học của

collagen type II và aggrecan được điều hòa bởi sự biểu hiện của SOX9 và SOX5,
thông qua sự hoạt hóa gen COL2A1 và aggrecan. Hơn nữa, các gen collagen như
COL9A1, COL9A2, COL9A3 và COL11A2 được biểu hiện đáp ứng lại sự biểu
hiện của SOX9.
Các kỹ thuật RT-PCR, Western blot và hóa mô miễn dịch rất hiệu quả để xác
định sự hiện diện của collagen type II, collagen type X, những proteoglycan khác
như aggrecan, decorin và biglycan trong mô sụn. Collagen và GAG sulfate có thể
được đo một cách định lượng bằng việc sử dụng các tác nhân thương mại hóa sẵn
có, và các kít ELISA, hay các xét nghiệm hóa sinh [22].
1.2.3. Tiềm năng ứng dụng tế bào gốc trung mô [22].
Liệu pháp dựa vào tế bào gốc trung mô đang được tiến hành cho phục hồi
các khiếm khuyết do chấn thương, bệnh mãn tính, những dị thường bẩm sinh và
việc cắt bỏ khối u...
 Cấy ghép:

Khả năng tăng sinh trong nuôi cấy, kết hợp với tiềm năng biệt hóa thành
nhiểu kiểu hình, khiến MSC trở thành nguồn tế bào ứng viên cho chiến lược sửa
chữa mô. Một thuận lợi của việc sử dụng MSC là các tế bào này dễ dàng thu nhận
bởi các quy trình tiêu chuẩn từ tủy xương, hay các mô khác. Sau đó, tế bào có thể
tăng sinh và sử dụng cho cấy ghép.
 Sửa chữa xương:

Tiện ích của việc sử dụng MSC trong hàn gắn xương được mô tả tron khuyết
tật xương nghiêm trọng của chuột. MSC cũng được kiểm tra khả năng phục hồi

12


xương trong một mô hình lỗ hổng khuyết tật ở đùi chó. Việc phân tích sự phát sinh
hình thái mô và kĩ thuật X quang cho thấy, xương được lấp đầy các MSC hơn so với

đối chứng.
 Sửa chữa gân:

Các thử nghiệm về mô hình sửa chữa gân cho thấy, MSC đồng cấy ghép vào
vật mang chất nền collagen có thể sẽ sát nhập vào mô mới. MSC đã liên kết vào các
sợi và các tế bào tại chỗ. Để sửa chữa gân Achillies, người ta thấy MSC kết hợp với
collagen type I đã lấy lại gần 65% trương lực tối đa của gân bình thường, so với
31% của trương lực tối đa trong đối chứng collagen type I không có tế bào.
MSC đã có sự kết hợp với gel collagen type I, và chúng cũng cho thấy đã cải
thiện được các đặc tính sinh hóa vào tuần thứ 4, hơn hẳn so với đối chứng không có
tế bào.
 Sửa chữa sụn:

Mô sụn khó có khả năng để lành, đặc biệt trong những động vật trưởng
thành. MSC được quan tâm nhiều trong ứng dụng cho công nghệ tạo mô sụn, sửa
chữa sụn.
Một số nghiên cứu đã được chỉ đạo sửa chữa những khuyết tật sụn khớp, qua
việc cấy MSC vào bên trong những cấu trúc polymere khác nhau, chẳng hạn những
vật liệu polymere dựa trên axit hyluronic, axit polylactic.
 Hệ thần kinh:

MSC được kiểm tra như là các tác nhân liệu pháp cho sự sửa chữa tổn
Uthương não. Chuột được tiêm với MSC với gắn với bromodeoxyuridine biểu hiện
NruN, một protein chuyên biệt thần kinh, có tính axit, dạng sợi của thần kinh đệm.
Kiểm tra chức năng cho thấy có kết quả hồi phục quan trọng là đã hàn gắn kín động
mạch não (so với đối chứng).
 Phân phối hệ thống:

Ứng dụng tiềm năng khác của MSC là phân phối có hệ thống những tế bào tạo
xương, chống lại loãng xương do tuổi, hay tiềm năng điều trị cho sự bất toàn tạo xương.

 Liệu pháp gen:

Sự hấp dẫn của MSC như là mục tiêu tiện lợi của liệu pháp gen nằm trong 3
vấn đề chính: (1) MSC dễ dàng được thu nhận và không gây bệnh cho bệnh nhân.

13


(2) MSC là quần thể tế bào đồng nhất có thể dễ dàng tăng sinh, và (3) MSC có tiềm
năng biệt hóa thành nhiều kiểu hình tế bào hữu ích cho mục tiêu chuyên biệt mô.
Nhờ các thuận lợi trên đã gợi ra tiềm năng ứng dụng MSC vào công nghệ mô.
 Điều trị bỏng và tái tạo da:

Tế bào gốc trung mô cũng được sử dụng trong điều trị các khuyết hổng da,
cũng như tái tạo da trong những năm gần đây. Nhiều báo cáo đã điều trị thành công
các khuyết hổng da như bỏng, các vết loét khó lành trong các bệnh tiểu đường...
bằng tế bào gốc trung mô thu nhận từ tủy xương.
1.3. Tế bào gốc mô mỡ
1.3.1. Nguồn gốc và đặc điểm của tế bào gốc từ mô mỡ

Ngoài ra mô mỡ còn thực hiện chức năng như một cơ quan nội tiết thông qua việc
sản xuất ra một số hormone như adiponectin, resistin, angiotensin... Thành phần tế
bào của mô mỡ bao gồm các tế bào mỡ trưởng thành, tế bào tiền tạo mỡ, nguyên
bào sợi, tế bào cơ trơn mạch máu, tế bào nội mô mạch máu, tế bào quanh mạch,
các đại thực bào và tế bào lympho. Trong số các tế bào của mô mỡ, phân đoạn tế
bào nền mạch máu (stromal-vascular fraction: SVF) được quan tâm nhiều trong
nghiên cứu tế bào gốc, vì đây là nguồn cung cấp các tế bào gốc đa tiềm năng
[9],[22],[29],[46],[56],[57],[63].
Tùy theo cách thu hoạch mô mỡ, phân lập tế bào, có những thuật ngữ khác nhau
về các tế bào tiền thân đa tiềm năng từ mô mỡ. Ví dụ: tế bào thu được từ chọc hút mỡ,

tế bào nền thu được từ mô mỡ (adipose tissue-derived stromal cells: ADSC), tế bào tiền
thân tạo mỡ (pre-adipocyte), phân đoạn tế bào nền mạch máu, và một số tên gọi khác.
Do các tế bào gốc thu được từ mô mỡ chủ yếu là các tế bào gốc trung mô, phân đoạn tế
bào này đôi khi còn được gọi là tế bào gốc trung mô thu được từ mô mỡ (adipose
tissue-derived mesenchymal stem cells: ATMSC). Đây là các tế bào có hình dạng
giống như nguyên bào sợi là hình thái của đặc trưng của tế bào gốc trung mô, giống với
các tế bào gốc trung mô thu được từ các mô khác [22],[47],[63].
14


Năm 2001, Patricia Zuk, và nhóm nghiên cứu của Đại học California phát
hiện thấy sản phẩm chọc hút mỡ sau khi rửa với dung dịch PBS và phân hủy với
0,075% collagenase thu được dung dịch giàu tế bào giống nguyên bào sợi cùng với
lượng lớn các tế bào quanh mạch, tế bào nội mô và các tế bào cơ trơn. Quần thể tế
bào này có thể được duy trì in vitro trong thời gian dài và có thể biệt hoá in vitro
thành các tế bào mỡ, tế bào sụn, tế bào cơ và tế bào xương khi được cảm ứng bằng
các chất chuyên biệt [69]. Tiếp sau đó, những công bố khác đã góp phần khẳng định
tiềm năng của các tế bào gốc từ mô mỡ người có khả năng biệt hoá thành dòng cơ,
sụn, thần kinh dưới các điều kiện thích hợp [29],[56],[58],[60].

Hình 1.7. Sự biệt hóa của tế bào gốc mô mỡ[22]
Các nghiên cứu về dấu ấn của tế bào gốc từ mô mỡ cho thấy chúng có các kiểu
hình: Dương tính với những marker và gen: CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49,
CD49, CD54, CD55, CD59, CD73, CD90, CD105, CD106, CD146, CD166, HLA I,
Fibronectin, Endomucin, ASMA, Vimentin, Collagen-1; Âm tính với những marker
và gen: CD11b, CD14, CD19, CD31, CD34, CD45, CD79a, CD80, CD117, CD133,
CD144, HLA-DR, c-kit, MyD88, STRO-1, Lin, HLA lớp II. Với kiểu hình này, các
tế bào gốc thu được từ mô mỡ thỏa mãn đặc tính của tế bào gốc trung mô; do vậy, có
tác giả gọi tế bào gốc thu được từ mô mỡ là tế bào gốc trung mô [22],[46].
So sánh tế bào gốc trung mô từ mô mỡ với tế bào gốc trung mô từ tủy xương,

De Ugarte và CS (2003) cho rằng dường như hai quần thể tế bào này tương tự nhau,
chỉ có một vài khác biệt nhỏ, chủ yếu là kiểu biểu hiện các phân tử bám dính, từ đó
15


tác giả đã giả thuyết rằng, tế bào gốc trung mô từ mô mỡ và tế bào gốc trung mô từ
tủy xương là hai tiểu nhóm tế bào gốc trung mô. Sự khác biệt một số dấu ấn của
chúng có lẽ do môi trường sống đem lại [33]. Nhìn trên phương diện thực hành,
phân lập tế bào gốc trung mô từ mô mỡ đơn giản hơn từ tủy xương, vì chỉ cần
gây tê cục bộ đồng thời thu được số lượng tế bào lớn hơn (khoảng 4x107 tế
bào/100 mL mỡ chọc hút so với 1x105 tế bào/30 mL dịch tủy xương). Hơn thế
nữa, nhìn trên phương diện khả năng tăng sinh và biệt hóa thành các dòng tế bào
khác nhau, nghiên cứu của Zhu và CS (2008) cho rằng các tế bào gốc mô mỡ tốt
hơn so với tế bào gốc từ tủy xương [62].
Một trong những mối quan ngại về tế bào gốc là khả năng tạo khối u quái.
Các nghiên cứu của Pilar và CS (2011); Ra và CS (2011) tiêm tế bào gốc mô mỡ
của người vào dưới da chuột nhắt không có miễn dịch thấy các tế bào gốc mô mỡ
người vẫn sống sót nhưng không sinh khối u sau 17 tháng kể từ ngày tiêm. Điều này
cho thấy các tế bào gốc mô mỡ của người trưởng thành ít có khả năng gây ung thư,
ngay cả trên cơ thể động vật không có miễn dịch là đối tượng ung thư dễ xuất hiện
từ các tế bào lạ nhất [50], [52]. Sử dụng tế bào gốc mô mỡ tự thân nuôi cấy tăng
sinh in vitro một thời gian rồi sau đó tiêm trở lại cơ thể để điều trị rò hậu môn trong
các nghiên cứu thử nghiệm giai đoạn I và II trên hàng trăm bệnh nhân không gặp
trường hợp nào sinh ung thư. Điều này cũng cho thấy thao tác nuôi cấy tăng sinh in
vitro không làm tế bào gốc mô mỡ biến đổi bất thường thành tế bào ung thư
(Garcia-Olmo và CS, 2005, 2009) [38],[39].
1.3.3. Ứng dụng tế bào gốc trung mô từ mô mỡ để điều trị bệnh ở người
Tế bào gốc thu nhận từ mô mỡ (Adipose derived stem cells-ADSC) có nhiều
đặc điểm tương tự tế bào gốc tủy xương (Bone marrved stem cells-BM-ASCs) cả về
mặt hình thái, sự phát triển và các phenotype trên bề mặt. Cả hai đều có nguồn gốc

từ lá phôi giữa trong thời kỳ phát triển của bào thai nên còn gọi chung là tế bào gốc
trung mô (Mesenchymal Stem Cells-MSC). Một tính chất rất quan trọng của ADSC,
MSC là có thể phát triển, biệt hóa thành các tế bào có nguồn gốc trung mô như tế
bào mô mỡ, nguyên bào sợi, tế bào cơ, xương, sụn, các tế bào tuyến… khi có các tín
hiệu và các yếu tố tăng trưởng phù hợp. Chúng dễ dàng tăng sinh trong môi trường
nuôi cấy khiến MSC trở thành nguồn tế bào gốc đầy hứa hẹn trong y học tái tạo và
liệu pháp tế bào.

16