KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SỐNG SÓT CỦA B.SUBTILIS TRONG SẢN PHẨM BỘT ĐẬU NÀNH LÊN MEN BỞI B.SUBTILIS Họ và tên sinh viên : PHÙNG THỊ XUÂN THƯỜNG Ngành : CHẾ BIẾN BẢO QUẢN NÔNG SẢN THỰC PHẨM VÀ DINH DƯỠNG Lớp : DH05DD Niên khóa : 2005 – 2009 Tháng 8

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SỐNG SÓT CỦA B.SUBTILIS TRONG
SẢN PHẨM BỘT ĐẬU NÀNH LÊN MEN BỞI B.SUBTILIS

Họ và tên sinh viên : PHÙNG THỊ XUÂN THƯỜNG
Ngành

: CHẾ BIẾN BẢO QUẢN NÔNG SẢN
THỰC PHẨM VÀ DINH DƯỠNG

Lớp

: DH05DD

Niên khóa

: 2005 – 2009

Tháng 8/2009


KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SỐNG SÓT CỦA B.SUBTILIS TRONG SẢN
PHẨM BỘT ĐẬU NÀNH LÊN MEN BỞI B.SUBTILIS

Tác giả

PHÙNG THỊ XUÂN THƯỜNG

Khóa luận được đệ trình đề để đáp ứng u cầu cấp bằng Kỹ sư ngành
Chế Biến Bảo Quản Nông Sản Thực Phẩm và Dinh Dưỡng Người

Giáo viên hướng dẫn:
TS. LÊ CHIẾN PHƯƠNG
ThS. VƯƠNG THỊ VIỆT HOA

Trang tựa

Tháng 8/20089
i


LỜI CẢM ƠN
Tơi xin gửi lịng biết ơn sâu sắc đến:
Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, Ban chủ nhiệm Khoa
Công Nghệ Thực Phẩm, cùng tất cả qúy thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong
suốt quá trình học tại trường.
TS. Lê Chiến Phương, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tơi
trong suốt thời gian thực tập và hồn thành khố luận tốt nghiệp này.
ThS. Vương Thị Việt Hoa, người đã hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện
để tơi hồn thành quá trình thực tập trong thời gian vừa qua.
KS. Phan Văn Dân, KS. Võ Thị Thanh Trang đã hướng dẫn tận tình trong suốt
q trình hồn thành khóa luận.
Các bạn lớp DH05DD đã luôn bên tôi, giúp đỡ, động viên, chia sẻ cùng tôi
trong thời gian thực tập cũng như trong suốt những năm học vừa qua.
Cha mẹ, bậc sinh thành đã sinh ra và nuôi dưỡng tôi, các anh chị em trong gia
đình ln quan tâm, ủng hộ tơi học tập và hồn thành khố luận tốt nghiệp này.
Những người bạn thân luôn luôn bên tôi, động viên trong quá trình thực hiện đề

tài.

Sinh viên thực hiện
Phùng Thị Xuân Thường

ii


TÓM TẮT
Đề tài nghiên cứu “Khảo sát khả năng sống sót của B.subtilis trong sản phẩm
bột đậu nành lên men bởi B.subtilis”, được thực hiện với mục đích xây dựng quy trình
chế biến bột đậu nành lên men bởi B.subtilis và khảo sát khả năng sống sót của
B.subtilis nhằm xem đây là thực phẩm chức năng, có thể bổ sung probiotic vào cơ thể
người và có khả năng làm tiêu huyết khối.
Đề tài được thực hiện tại Phịng Cơng nghệ Biến Đổi Sinh Học của Viện Sinh
Học Nhiệt Đới, thời gian từ 23/02/2009 đến 09/07/2009.
Đề tài được bố trí qua 3 thí nghiệm và thu được kết quả như sau:
- Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của B.subtilis theo
thời gian:
Chúng tôi thực hiện trong điều kiện ni cấy lắc và nhiệt độ phịng, pH khảo sát
ở các mức là 6, 6,5, 7, 7,5 và các mức thời gian là 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 và 96
giờ.
Với kết quả thu được: B.subtilis phát triển mạnh nhất ở pH = 6,5 và thời gian 24
giờ với lượng tế bào là 12,18 log(CFU/ml).
Thí nghiệm 2: So sánh khả năng thủy phân của B.subtilis với 2 chủng B.natto.
o Thủy phân tinh bột.
o Thủy phân casein.
o Thủy phân fibrin.
Chúng tơi tiến hành thí nghiệm với:
9 Yếu tố cố định: pH (6,5), ni lắc, nhiệt độ phịng.

9 Yếu tố thay đổi: thời gian, với các mức là 0, 12, 24, 36 và 48 giờ.
Với kết quả thu được: Hoạt độ amylase và protease của các chủng vi khuẩn
khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê và hoạt độ amylase và protease của các chủng vi
khuẩn mạnh nhất tại 24 giờ.
Thí nghiệm 3: Khảo sát tỉ lệ B.subtilis sống sót trong sản phẩm bột đậu nành
lên men. Với kết quả thu được:
• Trung bình lượng tế bào B.subtilis trong 1 g đậu nành lên men trước khi sấy
là 4,2.1010 CFU/g tính theo trọng lượng khơ tuyệt đối.

iii


• Trung bình lượng tế bào B.subtilis trong 1 g bột đậu nành lên men là
1,29.1010 CFU/g tính theo trọng lượng khơ tuyệt đối.
• Tỉ lệ trung bình lượng tế bào B.subtilis sống sót trong 1 g sản phẩm bột đậu
nành lên men so với đậu nành lên men trước khi sấy là 30,71%.
• Xây dựng được quy trình chế biến bột đậu nành lên men bởi B.subtilis.

iv


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa......................................................................................................................... i
Lời cảm ơn.....................................................................................................................ii
Tóm tắt..........................................................................................................................iii
Danh sách các bảng ......................................................................................................ix
Danh sách các hình ....................................................................................................... xi
Danh sách các đồ thị và sơ đồ .....................................................................................xii
Danh sách các chữ viết tắt ..........................................................................................xiii

Chương 1 ...................................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề............................................................................................................ 1
1.2 Mục đích.............................................................................................................. 2
1.3 Nội dung.............................................................................................................. 2
Chương 2 ...................................................................................................................... 3
2.1 Tổng quan về B.subtilis....................................................................................... 3
2.1.1 Lịch sử phát hiện.......................................................................................... 3
2.1.2 Phân loại....................................................................................................... 4
2.1.3 Đặc điểm phân bố ........................................................................................ 4
2.1.4 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển.............................................................. 4
2.1.5 Bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis........................................................... 6
2.1.5.1 Sự hình thành bào tử............................................................................. 6
2.1.5.2 Thành phần hố học của bào tử ............................................................ 7
2.1.5.3. Sức đề kháng của bào tử...................................................................... 7
2.1.6. Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với một số vi sinh vật gây bệnh 7
2.1.7 Hệ enzyme của Bacillus subtilis .................................................................. 8
2.1.7.1 Hệ enzyme protease.............................................................................. 8
2.1.7.2 Hệ enzym amylase................................................................................ 8
2.1.8 Ứng Dụng của vi khuẩn B.subtilis ............................................................... 9
2.1.8.1 Ứng dụng ở Việt Nam .......................................................................... 9
2.1.8.1.1 Trong y học ................................................................................... 9
2.1.8.1.2 Trong công nghiệp ...................................................................... 10

v


2.1.8.1.3 Trong thực phẩm ......................................................................... 10
2.1.8.1.4 Trong nông nghiệp ...................................................................... 10
2.1.8.2 Ứng dụng trên thế giới........................................................................ 11
2.1.8.2.1 Trong y học ................................................................................. 11

2.1.8.2.2 Trong công nghiệp ...................................................................... 11
2.1.8.2.3 Trong nông nghiệp ...................................................................... 11
2.1.8.2.4 Trong thực phẩm ......................................................................... 11
2.2 Tổng quan về Đậu nành .................................................................................... 12
2.2.1. Đặc điểm phân loại ................................................................................... 12
2.2.2 Thành phần dinh dưỡng của đậu nành....................................................... 12
2.2.2.1 Protein................................................................................................. 13
2.2.2.2 Chất sinh tố và chất khoáng................................................................ 14
2.2.2.3 Chất béo và chất cholesterol............................................................... 15
2.2.3 Công dụng của đậu nành............................................................................ 15
2.2.4 Các sản phẩm từ đậu nành ......................................................................... 17
2.2.4.1 Đậu phụ............................................................................................... 17
2.2.4.2 Chao.................................................................................................... 17
2.2.4.3 Tương ................................................................................................. 17
2.2.4.4 Miso .................................................................................................... 18
2.2.4.5 Natto ................................................................................................... 18
2.2.4.6 Tempeh ............................................................................................... 18
Chương 3 .................................................................................................................... 19
3.1 Vật liệu .............................................................................................................. 19
3.2 Dụng cụ và thiết bị ............................................................................................ 19
3.3 Phương pháp thí nghiệm ................................................................................... 20
3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của B.subtilis
theo thời gian. ..................................................................................................... 20
3.3.2 Thí nghiệm 2: So sánh khả năng thủy phân của B.subtilis với 2 chủng
B.natto................................................................................................................. 21
3.3.2.1 Thủy phân tinh bột.............................................................................. 21
3.3.2.1.1 Định tính amylase........................................................................ 21

vi

3.3.2.1.2 Xác định hoạt độ enzym amylase................................................ 22
3.3.2.2 Thủy phân casein ................................................................................ 24
3.3.2.2.1 Định tính protease ....................................................................... 24
3.3.2.2.2 Xác định hoạt độ protease: dùng casein làm cơ chất .................. 24
3.3.2.3 Thủy phân fibrin ................................................................................. 26
3.3.2.3.1 Phương pháp thu fibrin từ huyết heo........................................... 26
3.3.2.3.2 Định tính protease: dùng fibrin làm cơ chất................................ 27
3.3.2.3.3 Xác định hoạt độ protease: dùng fibrin làm cơ chất ................... 27
3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng sống sót B.subtilis trong bột đậu nành lên
men bởi B.subtilis. .............................................................................................. 28
3.3.3.1 Quy trình chế biến bột đậu nành lên men dự kiến bởi B.subtilis ....... 28
3.3.3.2 Giải thích quy trình............................................................................. 28
3.3.3.3 Khảo sát tỉ lệ B.subtilis và thời gian ảnh hưởng đến chất lượng đậu
nành lên men................................................................................................... 28
3.3.3.4 Xác định độ ẩm của đậu nành lên men trước và sau sấy.................... 29
3.3.4.5 Kiểm tra tỉ lệ B.subtilis sống sót trong sản phẩm bột đậu nành lên men
........................................................................................................................ 30
3.4 Phương pháp sử lý số liệu ................................................................................. 31
Chương 4 .................................................................................................................... 32
4.1 Kết quả thí nghiệm 1: Khảo sát yếu tố pH ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng
của B.subtilis theo thời gian. ................................................................................... 32
4.2 Kết quả thí nghiệm 2: So sánh khả năng thủy phân của B.subtilis với 2 chủng
B.natto. .................................................................................................................... 33
4.2.1 Kết quả thủy phân tinh bột......................................................................... 33
4.2.1.1 Kết quả định tính amylase .................................................................. 33
4.2.1.2 Kết quả hoạt độ amylase..................................................................... 34
4.2.2 Kết quả thủy phân casein ........................................................................... 36
4.2.2.1 Kết quả định tính protease.................................................................. 36
4.2.2.2 Kết quả hoạt độ protease: dùng casein làm cơ chất............................ 37

4.2.3 Kết quả thủy phân fibrin ............................................................................ 38
4.2.3.1 Kết quả thu fibrin từ huyết heo........................................................... 38

vii


4.2.3.2 Kết quả định tính protease.................................................................. 38
4.2.3.3 Kết quả hoạt độ protease: dùng fibrin làm cơ chất............................. 39
4.3 Kết quả thí nghiệm 3: Khảo sát tỉ lệ B.subtilis sống sót trong sản phẩm bột đậu
nành lên men. .......................................................................................................... 40
4.3.1 Kết quả khảo sát tỉ lệ B.subtilis bổ sung vào đậu nành.............................. 40
4.3.2 Quy trình chế biến bột đậu nành lên men .................................................. 42
4.3.3 Giải thích quy trình .................................................................................... 43
4.3.4 Kết quả độ ẩm (%) của đậu nành lên men trước và sau sấy ...................... 44
4.3.5 Kết quả khảo sát tỉ lệ B.subtilis sống sót trong sản phẩm bột đậu nành lên
men...................................................................................................................... 44
Chương 5 .................................................................................................................... 45
5.1 Kết luận ............................................................................................................. 45
5.2 Đề nghị .............................................................................................................. 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 47

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Đặc điểm sinh hóa của B.subtilis ................................................................. 5
Bảng 2.2: Thành phần axit amin trong protein đậu nành ........................................... 13
Bảng 2.3: Thành phần khoáng trong đậu nành ........................................................... 14
Bảng 2.4: Thành phần vitamin của đậu nành.............................................................. 15

Bảng 3.1: Bố trí kết quả lượng tế bào B.subtilis khảo sát pH theo thời gian ............. 21
Bảng 3.2: Bố trí kết quả hoạt độ amylase của B.subtilis và 2 chủng B.natto theo thời
gian .............................................................................................................................. 23
Bảng 3.3: Bố trí kết quả hoạt độ protease của B.subtilis và 2 chủng B.natto theo thời
gian .............................................................................................................................. 26
Bảng 3.4: Bố trí kết quả hoạt độ protease của B.subtilis và 2 chủng B.natto theo thời
gian .............................................................................................................................. 27
Bảng 3.5: Bố trí kết quả cảm quan khảo sát tỉ lệ B.subtilis bổ sung vào đậu nành theo
thời gian ....................................................................................................................... 29
Bảng 3.6: Bố trí kết quả lượng tế bào B.subtilis khảo sát tỉ lệ B.subtilis bổ sung vào
đậu nành theo thời gian ............................................................................................... 29
Bảng 3.7: Bố trí kết quả độ ẩm (%) của đậu nành lên men trước và sau khi sấy ....... 30
Bảng 3.8: Bố trí kết quả lượng tế bào B.subtilis ở đậu nành lên men trước và sau sấy31
Bảng 4.1: Kết quả lượng tế bào B.subtilis thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH theo
thời gian ....................................................................................................................... 32
Bảng 4.2: Kết quả hoạt độ amylase trung bình của B.subtilis và 2 chủng B.natto theo
thời gian ....................................................................................................................... 34
Bảng 4.3: Kết quả hoạt độ protease của B.subtilis và 2 chủng B.natto với casein làm
cơ chất theo thời gian .................................................................................................. 37
Bảng 4.4: Kết quả hoạt độ protease trung bình của B.subtilis và 2 chủng B.natto với
fibrin làm cơ chất theo thời gian.................................................................................. 39
Bảng 4.5: Kết quả cảm quan khảo sát tỉ lệ vi khuẩn và thời gian thích hợp để lên men
đậu nành....................................................................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 4.6: Kết quả lượng tế bào B.subtilis khảo sát tỉ lệ vi khuẩn và thời gian thích hợp
để lên men đậu nành .................................................................................................... 41

ix


Bảng 4.7: Kết quả độ ẩm trung bình của đậu nành lên men trước và sau sấy............ 44

Bảng 4.8: Kết quả trung bình lượng tế bào vi khuẩn B.subtilis của đậu nành lên men
trước và sau sấy ........................................................................................................... 44

x


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1: Hình thái vi khuẩn B.subtilis ........................................................................ 3
Hình 2.2: Quá trình tạo bào tử ...................................................................................... 6
Hình 2.3: Hạt đậu nành............................................................................................... 12
Hình 4.1: Vịng phân giải tinh bột bởi amylase của B.N 1 .......................................... 33
Hình 4.2: vịng phân giải tinh bột bởi amylase của B.N2............................................ 34
Hình 4.3: Vòng phân giải tinh bột bởi amylase của B.subtilis ................................... 34
Hình 4.4: Vịng phân giải casein bởi protease của B.N1 ............................................. 36
Hình 4.5: Vịng phân giải casein bởi protease của B.N2 ............................................. 36
Hình 4.6: Vịng phân giải casein bởi protease của B.subtilis ..................................... 36
Hình 4.7: Sợi fibrin trước sấy ..................................................................................... 38
Hình 4.8: Sợi fibrin sau khi sấy .................................................................................. 38
Hình 4.9: Vịng phân giải fibrin bởi protease của B.N1 .............................................. 38
Hình 4.10: Vòng phân giải fibrin bởi protease của B.N2 ............................................ 38
Hình 4.11: Vịng phân giải fibrin bởi protease của B.subtilis .................................... 39
Hình 4.12: Đậu nành sau khi lên men 24 giờ ............................................................. 43
Hình 4.13: Bột đậu nành lên men bởi B.subtilis......................................................... 43

xi


DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ VÀ SƠ ĐỒ
Trang

Sơ đồ 3.1: Quy trình chế biến bột đậu nành lên men dự kiến bởi B.subtilis .............. 28
Đồ thị 4.1: Đường cong sinh trưởng của B.subtilis theo kết quả log(CFU/ml).......... 33
Đồ thị 4.2: Biểu diễn hoạt độ amylase trung bình của B.subtilis và 2 chủng B.natto
theo thời gian ............................................................................................................... 35
Đồ thị 4.3: Biểu diễn hoạt độ protease trung bình của B.subtilis và 2 chủng B.natto
theo thời gian ............................................................................................................... 37
Đồ thị 4.4: Biểu diễn hoạt độ protease trung bình của B.subtilis và 2 chủng B.natto
theo thời gian với fibrin làm cơ chất. .......................................................................... 39
Đồ thị 4.5: Kết quả lượng tế bào B.subtilis theo tỉ lệ B.subtilis và thời gian ............. 41
Sơ đồ 4.1: Quy trình chế biến bột đậu nành lên men bởi B.subtilis ........................... 42

xii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
B.subtilis: Bacillus subtilis.
B.natto: Bacillus natto.
KL: Khuẩn lạc.
KLtb: Khuẩn lạc trung bình.
LDL: Lipoprotein tỷ trọng thấp.
HDL: Lipoprotein tỷ trọng cao.
UI: Unit International.
CFU: Colony Forming Unit.

xiii


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, nền kinh tế ngày càng phát triển cùng với những tiến bộ khoa học
cuộc sống con người có nhiều thay đổi lớn, tinh thần vật chất càng cao, do đó nhu cầu
chất lượng sản phẩm tăng cao đòi hỏi nhà sản xuất phải nâng cao chất lượng sản phẩm
của mình để đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng. Từ đó người ta tìm đến những loại
thực phẩm vừa bổ dưỡng, đảm bảo năng lượng, đậu nành cũng là một trong những
nguồn thực phẩm có chức năng như vậy. Đậu nành là loại nông sản phổ biến ở Việt
Nam và các nước Châu Á. Đậu nành có giá trị dinh dưỡng cao, là nguồn cung cấp đạm
tốt trong khẩu phần đặc biệt trong khẩu phần của người ăn chay. Hiện nay người ta
xem đậu nành là cây trồng hết sức quan trọng để giải quyết vấn đề thiếu protein đối
với dinh dưỡng con người. Nó chứa đầy đủ các axit amin thiết yếu và được nhiều
người ưa chuộng.
Đậu nành chứa chất kháng dinh dưỡng nên cần được chế biến thích hợp để nâng
cao giá trị dinh dưỡng của nó. Lên men là một phương pháp hữu hiệu để giải quyết
vấn đề này. Việc sử dụng vi khuẩn B.subtilis lên men đậu nành đã trở thành những
món ăn truyền thống của nhiều nước Châu Á như: Nhật Bản, Ấn Độ, Nepan,…
B.subtilis chứa enzym amylase và protease, có khả năng sinh tổng hợp nhiều
kháng sinh khác nhau.
Chính vì tính độc đáo của đậu nành và B.subtilis chúng tôi kết hợp chế biến bột
đậu nành lên men bởi B.subtilis và kiểm tra khả năng sống sót của B.subtilis trong sản
phẩm này nhằm cung cấp probiotic và có khả năng chữa một số bệnh và chúng tơi xem
đây là một thực phẩm chức năng.

1


1.2 Mục đích
Xây dựng quy trình chế biến đậu nành lên men bởi B.subtilis và khảo sát khả
năng sống sót của B.subtilis với mục đích bổ sung probiotic vào cơ thể người, có khả
năng chống lại các vi sinh vật gây hại trong ruột, làm tan các cục máu đông giúp điều
trị các bệnh đột quỵ và tai biến mạch máu não, đồng thời nâng cao giá trị kinh tế của

đậu nành và sử dụng B.subtilis rộng rãi hơn.
1.3 Nội dung
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của B.subtilis theo
thời gian.
Thí nghiệm 2: So sánh khả năng thủy phân của B.subtilis với 2 chủng B.natto.
o Thủy phân tinh bột.
o Thủy phân casein.
o Thủy phân sợi fibrin.
Thí nghiệm 3: Khảo sát tỉ lệ B.subtilis sống sót trong sản phẩm bột đậu nành
lên men.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về B.subtilis
2.1.1 Lịch sử phát hiện
B.subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ chức y học
Nazi của Đức. Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho các binh sĩ Đức
chiến. Việc điều trị phải đợi đến những năm 1949 - 1957, khi Henrry và các cộng sự
tách được chủng thuần khiết của B.subtilis. Từ đó “subtilis therapy” có nghĩa là "thuốc
subtilis" ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn
tiêu hoá. Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong
y học, chăn nuôi, thực phẩm ( Lý Kim Hữu, 2005).

Hình 2.1: Hình thái vi khuẩn B.subtilis

3

2.1.2 Phân loại
Phân loại khoa học
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Subtilis
Tên kép: Bacillus subtilis
2.1.3 Đặc điểm phân bố
Là vi khuẩn đường ruột, phân bố nhiều trong đất, nước, cỏ khô, bụi, phân, chủ
yếu phân bố trong đất.
Nước và bùn ở cửa sơng cũng như nước biển có sự tồn tại của bào tử và tế bào
sinh dưỡng B.subtilis (Vũ Thị Thứ, 1996).
2.1.4 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển
B.subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu trịn, kích thước 0,5 - 0,8 µm x 1,8 - 3 µm.
xếp thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động có từ 8 -12 tiêm mao (khi còn non nhờ tiêm
mao, về sau tiêm mao rụng khi tế bào già nên vi khuẩn mất khả năng di động trong
môi trường), Gram (+), hiếu khí. Sinh nha bào, kích thước khoảng 0,9 x 0,6µm, không
phân bố theo một nguyên tắc nào (lệch tâm hoặc gần tâm, nhưng khơng chính tâm), có
kháng ngun H và O. Cấu trúc kháng nguyên dạng D hoặc L - glutamic axit.
Nhiệt độ tối thích của B.subtilis vào khoảng 36 – 500C, pH = 6 – 7,5. Nồng độ
muối ăn làm ngừng phát triển là 10 – 15% ( Nguyễn Hữu Phúc, 1998).
Khi nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa khuẩn lạc trịn, khơng đều hay phân tán,
đường kính khuẩn lạc từ 3 – 5 mm, màu vàng xám, rìa có hình răng cưa. Sau 1 – 4
ngày bề mặt khuẩn lạc nhăn nheo, màu hơi nâu.
Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng, sinh khối tạo lớp màng nhăn trên bề mặt
môi trường (Nguyễn Đức Duy Anh, 2005).

B.subtilis không được xem là mầm bệnh gây bệnh cho người. Chúng thường có
trong thực phẩm nhưng hiếm khi gây ngộ độc thực phẩm.

4


Người ta đã chứng minh B.subtilis có tập tính “ăn lẫn nhau”. Chúng dùng cách
này như một phương pháp đơn giản để thoát khỏi những trường hợp điều kiện sống
giới hạn.
B.subtilis có khả năng sinh tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau như:
subtilin, subtilosin A, sublancin, chlorotetain, mycobacillin, rhizocticins, bacillanene,
difficidin…(Nguyễn Quỳnh Nam, 2006).
Phân bố trong đất và các chất hữu cơ bị phân hủy và là một đối tượng dùng
trong nghiên cứu khả năng lây bệnh trong phòng thí nghiệm (Trần Đỗ Quyên, 2004).
Bảng 2.1: Đặc điểm sinh hóa của B.subtilis
Phản ứng sinh hố

Kết quả

Hoạt tính catalase

+

Sinh indol

-

MR

+

VP

+

Sử dụng citrate

+

Khử nitrate

+

Tan chảy gelatin

+

Di động

+

Phân giải tinh bột

+

Arabinose

+

Xylose

+

Saccharose

+

Mannitol

+

Glucose

+

Lactose

-

Maltose

+

(Trần Đỗ Quyên, 2004).

5


2.1.5 Bào tử của vi khuẩn B.subtilis
Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, nó giúp cho vi khuẩn vượt qua

những điều kiện bất lợi như: môi trường nghèo dinh dưỡng, nhiệt độ, pH khơng thích
hợp, mơi trường tích luỹ nhiều sản phẩm trao đổi chất bất lợi, mỗi vi khuẩn chỉ tạo
được một bào tử. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm để trở về dạng tế bào
sinh dưỡng (Lê Đỗ Mai Phương, 2004).
2.1.5.1 Sự hình thành bào tử
Một trong những đặc điểm quan trọng của B.subtilis là khả năng tạo bào tử trong
những điều kiện nhất định. B.subtilis có khả năng hình thành bào tử trong chu trình
phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi (Lê Đỗ Mai Phương, 2004).
Quá trình hình thành bào tử gồm các bước
1. Hình thành vách ngăn.
2. Sự tạo tiền bào tử.
3. Tạo lớp vỏ bào tử.
4. Sự tổng hợp các lớp vỏ bào tử.
5. Sự giải phóng bào tử.

Hình 2.2: Quá trình tạo bào tử
Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập
trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc và tạo thành tiền
bào tử. Tiền bào tử dần được bao bọc bởi các lớp màng. Tiền bào tử phát triển và trở
thành bào tử.
Khi bào tử trưởng thành, tế bào sinh dưỡng phân giải và bào tử được giải phóng
ra khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử hút nước và bị trương ra. Sau
đó vỏ của chúng bị phá huỷ và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào
sinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử ( Lê Đỗ Mai Phương, 2004).

6


2.1.5.2 Thành phần hoá học của bào tử
Các lớp bao và màng của bào tử có cấu tạo cơ bản là protein có chứa nhiều

glyxin, tyroxin và đặc biệt là cystein, ngồi ra cịn có sự tham gia của keratin. Nguyên
sinh chất của bào tử có chứa nhiễm sắc thể, ribosome và enzyme chuyển hố ở trạng
thái khơng hoạt động. Khi bào tử nảy mầm thì những enzyme này bắt đầu hoạt động.
Bào tử có chứa một lượng lớn canxi, magie và axit dipicolinic. Axit này chiếm từ
5 – 12% khối lượng khô của bào tử (axit này không bao giờ có trong tế bào sinh
dưỡng, nó được hình thành trong quá trình hình thành bào tử và mất đi khi nảy mầm).
Lượng nước trong bào tử rất thấp và tồn tại ở dạng liên kết ( Lê Đỗ Mai Phương,
2004).
2.1.5.3. Sức đề kháng của bào tử
Bào tử có sức đề kháng cao đối với các yếu tố vật lý và hố học như: nhiệt độ, tia
cực tím, áp suất và chất sát trùng.
Sở dĩ bào tử có sức đề kháng cao và sống lâu là do các yếu tố sau:
- Nước trong bào tử phần lớn ở trạng thái liên kết, do đó khơng có khả năng
làm biến tính protein khi tăng nhiệt độ.
- Do bào tử có khối lượng lớn ion Ca2+ và axit dipicolinic, protein của bào tử
kết hợp với dipicolinate canxi thành một phức chất có tính chất ổn định cao đối với
nhiệt độ.
- Các enzyme và các hoạt chất sinh học khác chứa trong bào tử đều tồn tại
dưới dạng không hoạt động, hạn chế sự trao đổi chất của bào tử đối với tế bào bên
ngồi.
- Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp màng
làm cho các chất hố học và chất sát trùng khó có thể tác động tới bào tử (Lê Đỗ Mai
Phương, 2004).
2.1.6. Tính chất đối kháng của B.subtilis
Với các vi sinh vật gây bệnh:
Mơi trường ni cấy nấm bệnh có sự hiện diện của B.subtilis với một số lượng
lớn sẽ gây ra sự cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh trạnh không gian sống giữa vi khuẩn và
nấm.

7

Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất
dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra kháng sinh subtilin nên sự sinh trưởng
của nấm bị ức chế.
Với đồng loại: khi chất dinh dưỡng bắt đầu cạn kiệt, các vi sinh vật đối phó bằng
cách chuyển sang tình trạng “ngủ đơng” trong một thời gian dài. B.subtilis thực hiện
điều đó bằng cách tạo ra bào tử, có thể duy trì trạng thái sống tiềm tàng trong nhiều
năm, thậm chí hàng thế kỉ, ở giai đoạn rất sớm của sự hình thành bào tử, một vài tế bào
B.subtilis đã tạo ra kháng sinh để giết chết những tế bào vi khuẩn ở bên cạnh chưa bắt
đầu quá trình này. Chất kháng sinh sẽ phá vỡ màng tế bào vi khuẩn bị tấn công, giải
phóng chất dinh dưỡng và được tế bào đang hình thành bào tử tiêu thụ. Đặc biệt, khi
dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt, vi khuẩn sẽ tiêu diệt những kẻ xung quanh
để hút chất dinh dưỡng và kéo dài thời kì chờ đợi này, cho đến khi phải chuyển sang
sống tiềm sinh (Nguyễn Duy Khánh, 2006).
2.1.7 Hệ enzyme của B.subtilis
2.1.7.1 Hệ enzyme protease
B.subtilis có khả năng tổng hợp protease trung tính và kiềm.
B.subtilis tổng hợp protease ngoại bào phân giải protein và các cơ chất cao phân
tử khác có trong mơi trường dinh dưỡng thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật dễ
dàng hấp thụ. Đây là chức năng rõ ràng nhất của các protease ngoại bào.
Glucose, saccharose, mantose, fructose, socbit là nguồn cacbon tốt nhất cho quá
trình tổng hợp protease của B.subtilis (Trần Minh Tâm, 2000).
2.1.7.2 Hệ enzym amylase
Amylase là hệ enzym phổ biến trong thế giới vi sinh vật. Các enzym này thuộc
nhóm enzym thủy phân xúc tác sự thủy giải các liên kết nội phân tử trong
polysaccharide với sự tham gia của nước: R – R/ + R – H + R/OH
B.subtilis có khả năng tạo một lượng lớn α - amylase. Tuy nhiên, amylase của
B.subtilis được tạo thành ở quá trình sinh trưởng hoặc đang kết thúc quá trình sinh
trưởng. Cả trong môi trường nuôi cấy lẫn trong bản thân tế bào vi khuẩn “trẻ” đều

khơng tìm thấy amylase.
Amylase của B.subtilis khơng có các liên kết sulfihidril và có khả năng phân
giải tinh bột nhanh gấp 2 ÷ 2,5 lần so với α - amylase nấm mốc.

8


α - amylase của vi khuẩn B.subtilis thủy phân tinh bột tạo ra các dextrin có

mạch dài khoảng 6 - 8 gốc glucose. Các dextrin này lại bị phân giải tiếp tục theo sơ đồ:
G 6 → G1 + G5

G7 → G1 + G6 hay G2 + G5 (ít)

G8 → G2 + G6 hay G3 + G5 (ít)
Sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân cơ chất bởi amylase là glucose và
maltose đến 70 – 75%.
Vận tốc thủy phân tinh bột bởi α - amylase vi khuẩn ở giai đoạn đầu cao hơn
α - amylase Asp.oryza tới 25% và giảm mạnh khi đạt được 30 – 32% sự thủy phân.
pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của α - amylase B.subtilis
là từ 5,6 ÷ 6,2. Trong hồ tinh bột, α - amylase vi khuẩn chỉ bắt đầu vô hoạt nhanh khi
nhiệt độ cao hơn 770C. Amylase của B.subtilis bị vơ hoạt hồn tồn ở pH = 4,0 và bị
vô hoạt một nửa ở pH = 8,0.
Sinh tổng hợp α - amylase ở B.subtilis khơng có chất cảm ứng đặc hiệu
(nguồn: Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng, 1982).
2.1.8 Ứng Dụng của vi khuẩn B.subtilis
2.1.8.1 Ứng dụng ở Việt Nam
2.1.8.1.1 Trong y học
B.subtilis được dùng rất nhiều để điều trị bệnh đường ruột mãn tính và cịn điều
trị một số bệnh khác.

B.subtilis được Đặng Đức Trạch, Hoàng Thuỷ Nguyên là các giáo sư, bác sĩ
quân y (trong chiến tranh chống Pháp) đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm B.subtilis đưa
ra chiến trường nhằm giải quyết bệnh tiêu chảy, góp phần bảo vệ sức khoẻ cho cán bộ
chiến sĩ.
Năm 1958 - 1960, bác sĩ Phạm Ngọc Thạch đã sản xuất đồng loạt chế phẩm
B.subtilis dùng trị bệnh đường ruột, apxe phổi và chữa bệnh lao.
Năm 1960, xí nghiệp thuốc thú y đã sản xuất chế phẩm B.subtilis để chữa bệnh
tiêu chảy phân trắng ở heo con.
Bệnh viện Bạch Mai Hà Nội đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm B.subtilis dùng
điều trị bệnh tiêu chảy ở người.

9


Năm 1971, Trần Minh Hùng, Lê Thị Ba, Nguyễn Văn Hùng đã nghiên cứu sản
xuất chế phẩm B.subtilis dạng viên, nuôi cấy trên môi trường đậu tương, cua đồng hấp
thụ bằng tinh bột tan.
B.subtilis còn dùng làm kháng nguyên trong thử nghiệm ELISA, dùng B.subtilis
để sản xuất tiểu đơn vị độc tố ho gà với hiệu suất cao 60 - 100 mg/l.
Viện Pasteur Nha Trang đã tiến hành sản xuất chế phẩm Biosubtyl từ chủng
B.subtilis đa sử dụng có hiệu quả trong phòng trị bệnh tiêu chảy.
Từ năm 1983 đến nay viện Vacxin cơ sở 2 Đà Lạt đã sản xuất thuốc Biosubtyl
dạng khô rất thuận tiện cho người sử dụng (Lê Ngọc Tú, 2004).
2.1.8.1.2 Trong công nghiệp
Enzyme amylase của B.subtilis được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất giấy
để xử lý tinh bột có trọng lượng phân tử nhất định.
Enzyme protease của B.subtilis được ứng dụng trong công nghiệp dệt tơ tằm:
dùng để khử protein cho tơ lụa tự nhiên, làm bóng mượt tách rời giữa các sợi tơ tằm
(Lê Ngọc Tú, 2004).
2.1.8.1.3 Trong thực phẩm

Trong sản xuất tương người ta bổ sung thêm B.subtilis để hạn chế sự phát triển
của một số nấm mốc độc khác, đồng thời giảm nồng độ độc tố aflatoxin thường hiện
diện trong một số sản phẩm tương truyền thống.
Enzyme protease của B.subtilis được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm
làm mềm thịt tạo vị ngon hơn, sản phẩm khi nấu sẽ nhanh chín, mềm dễ tiêu hố hơn
nhiều.
Trong cơng nghiệp sản xuất bia: protease thủy phân protein thành những hợp
chất có phân tử lượng trung bình hoặc thấp, do đó bia giữ được chất lượng, khơng vẩn
đục, ngồi ra cịn có khả năng giữ bọt cho bia (Lê Ngọc Tú, 2004).
2.1.8.1.4 Trong nông nghiệp
Trung tâm Sinh học thuộc Liên hiệp sản xuất hoá chất thuộc Bộ công nghiệp
nặng TP. HCM đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bactophyl từ B.subtilis để phòng trừ
các loại nấm bệnh trên rau quả.
Hồ Thị Mỹ Hồng, Nguyên Thanh Bình thuộc Trung tâm ứng dụng Sinh học Hà
Nội đã sản xuất chế phẩm B.subtilis dùng để phòng trừ nấm bệnh trên bắp Ostrinia

10


furnacalos. Ngồi ra, B.subtilis có khả năng ức chế mạnh mẽ sự phát triển các chủng
nấm sinh aflatoxin là Aspergillus flavus, A.parasiticus và các chủng nấm gây bệnh cho
cây trồng như: Fusarium, Rhizoctonia, Uromyces fabae (Lê Ngọc Tú, 2004).
2.1.8.2 Ứng dụng trên thế giới
2.1.8.2.1 Trong y học
Nhiều cơng trình của thế giới, nhất là Anh Quốc cho thấy B.subtilis, có tác dụng
với vi khuẩn Gram (-), góp phần làm sáng tỏ cơ chế tác dụng điều trị nhiễm khuẩn của
các chế phẩm chứa B.subtilis.
Nha bào của B.subtilis được dùng làm chất tải vaccin và được sử dụng như men
tiêu hoá sống cho cả người và động vật (Lê Ngọc Tú, 2004).
2.1.8.2.2 Trong công nghiệp

Tại Nhật, hàng năm người ta sản xuất tới hàng chục nghìn tấn chế phẩm
amylase và protease từ chủng B.subtilis.
Ở Đức đã tuyển chọn được một chủng B.subtilis mà amylase của nó có độ bền
như amylase của nấm mốc (Lê Ngọc Tú, 2004).
2.1.8.2.3 Trong nông nghiệp
Năm 1990 Norio Kimura Yokohamo, đã sử dụng B.subtilis để ngăn chặn sự
phát triển và sinh độc tố của chủng Aspergillus flavus và A.parasiticus.
Roman và các cộng sự đã nghiên cứu sử dụng B.subtilis (ATCC - 6633,
ATTCC - 9372) làm giảm 40% aflatoxin trong vòng 20 ngày (Lê Ngọc Tú, 2004).
2.1.8.2.4 Trong thực phẩm
Bupur khi nghiên cứu sử dụng chế phẩm α - amylase của B.subtilis đã xác định
rằng, việc thêm chế phẩm vào bột nhào đã làm một phần bột được chuyển hố thành
đường có trọng lượng phân tử thấp, thích hợp cho giống nấm men bánh mì phát triển.
Do vậy đã làm tăng việc tạo khí, dẫn đến làm tăng thể tích bánh lên 20%, tăng lượng
đường lên 28%, tăng chất thơm lên đến 30 - 47% và làm bánh lâu bị cứng hơn (Lê
Ngọc Tú, 2004).

11