PHÁT HIỆN VI KHUẨN E. COLI O157:H7 VÀ SALMONELLA BẰNG KỸ THUẬT PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
*********

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÁT HIỆN VI KHUẨN E. COLI O157:H7 VÀ SALMONELLA
BẰNG KỸ THUẬT PCR

Họ và tên sinh viên: LÊ THỊ CẨM TRINH
Ngành: THÚ Y
Niên khóa: 2004 – 2009

Tháng 09/2009


PHÁT HIỆN VI KHUẨN E. COLI O157:H7 VÀ SALMONELLA BẰNG
KỸ THUẬT PCR

Tác giả

LÊ THỊ CẨM TRINH

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sĩ ngành Thú Y

Giáo viên hướng dẫn
PGS. TS NGUYỄN NGỌC TUÂN
BSTY BÙI THỊ THU TRANG

Tháng 09/2009
i

LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí
Minh, Ban Chủ Nhiệm Khoa Chăn Nuôi Thú Y, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt
những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường.
Con xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Ngọc Tuân
– người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo điều kiện tốt nhất cho con thực hiện và
hoàn thành đề tài tốt nghiệp.
Tôi cảm thấy mình thật là may mắn khi được sự giúp đỡ nhiệt tình và quan tâm
động viên của chị Bùi Thị Thu Trang, với tất cả lòng thành em xin cảm ơn chị.
Xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị ở viện Công nghệ sinh học và Công nghệ
môi trường, trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
Chân thành cảm ơn thầy Lê Hữu Ngọc, cùng các bạn ở phòng Thực hành Kiểm
nghiệm thú sản và Môi trường sức khỏe vật nuôi đã giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đợt
thực tập.
Cảm ơn những kỉ niệm mà tôi đã có cùng các bạn lớp Thú Y 30 trong suốt năm
năm học.
Cảm ơn bạn bè thân hữu cùng phòng 211 thật nhiều, những người chia sẻ cùng
tôi những vui buồn trong những năm học cũng như thời gian thực tập tốt nghiệp.
Con mãi khắc ghi công ơn Nội đã động viên giúp con vượt qua được những
khó khăn trong những năm tháng xa nhà.
Và Con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dưỡng dục con nên
người, để con được như ngày hôm nay.

ii


TÓM TẮT
Sinh viên Lê Thị Cẩm Trinh, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, tháng 09/2009

“PHÁT HIỆN VI KHUẨN E. COLI O157:H7 VÀ SALMONELLA BẰNG KỸ
THUẬT PCR”
Người hướng dẫn: PGS. TS Nguyễn Ngọc Tuân, BSTY Bùi Thị Thu Trang
Đề tài được tiến hành nhằm phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7 và Salmonella
trong thực phẩm bằng kỹ thuật PCR. Phản ứng PCR được thực hiện với hai cặp
primer FliC và RfbE đối với E. coli O157:H7, còn Salmonella gồm hai cặp SUL và
SGX. Hai vi khuẩn này được gây nhiễm thực nghiệm trong các sản phẩm rau, thịt,
xúc xích, sữa và thịt hộp ở nồng độ 1 và 10 tế bào / 25 gam sản phẩm. Sau đó, tiến
hành tăng sinh trong môi trường peptone đệm. Sau 16 giờ, hút 500 µl dung dịch tăng
sinh cho vào eppendorf 1,5 ml và đem ly trích DNA bằng phương pháp nhiệt, sau đó
thực hiện phản ứng PCR. Kết quả được ghi nhận như sau:
 10 mẫu rau và 10 mẫu thịt thu thập từ siêu thị không phát hiện được E. coli
O157:H7 bằng PCR. Bằng phương pháp gây nhiễm thực nghiệm E. coli
O157:H7 ở nồng độ 1 và 10 tế bào / 25 gam sản phẩm, mPCR1 đã phát hiện
được E. coli O157:H7 trừ khi gây nhiễm 1 tế bào trên sản phẩm thịt.
 m PCR2 phát hiện được Salmonella ở tất cả các nồng độ gây nhiễm là 1 và 10 /
25 gam sản phẩm rau, thịt, xúc xích, sữa và thịt hộp.
 Nuôi cấy đồng thời hai loại vi khuẩn này trong cùng môi trường peptone thì m
- PCR chỉ phát hiện được Salmonella, còn E. coli O157:H7 không có kết quả.

iii


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa .................................................................................................................... i
Lời cảm ơn ................................................................................................................ ii
Tóm tắt ..................................................................................................................... iii
Mục lục .................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................ vii

Danh sách các hình và sơ đồ ..................................................................................... ix
Danh sách các bảng ................................................................................................... x
Chương 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1
1.2 Mục tiêu ............................................................................................................... 2
1.3 Yêu cầu ................................................................................................................ 2
Chương 2. TỔNG QUAN ........................................................................................ 3
2.1 Vi khuẩn Escherichia coli .................................................................................... 3
2.1.1 Đặc điểm ........................................................................................................... 3
2.1.2 Đặc tính nuôi cấy và sinh hóa ............................................................................ 3
2.1.3 Phân loại vi khuẩn Escherichia coli ................................................................... 4
2.1.3.1 Triệu chứng lâm sàng của EHEC ................................................................... 4
2.1.3.2 Cách sinh bệnh ............................................................................................... 5
2.1.3.3 Các yếu tố liên quan đến đặc tính gây bệnh của EHEC ................................... 6

iv


2.1.4 Giới thiệu về E. coli O157:H7 ........................................................................... 7
2.2 Vi khuẩn Salmonella ............................................................................................ 8
2.2.1 Lịch sử và phân bố ............................................................................................ 8
2.2.2 Cấu trúc kháng nguyên và độc tố ...................................................................... 8
2.2.2.1 Kháng nguyên ................................................................................................ 9
2.2.2.2 Độc tố ............................................................................................................ 9
2.2.3 Đặc điểm hình thái, nuôi cấy, sinh hóa của Salmonella ..................................... 9
2.2.4 Dịch tễ ............................................................................................................10
2.2.5 Cách sinh bệnh .................................................................................................11
2.2.6 Triệu chứng gây ngộ độc ..................................................................................12
2.3 Tình hình ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam và thế giới do Salmonella và E. coli ..12
2.3.1 Tại Việt Nam ...................................................................................................12

2.3.2 Trên thế giới ....................................................................................................13
2.4 Kỹ thuật PCR ......................................................................................................14
2.5 Phương pháp định lượng vi sinh vật ....................................................................15
2.5.1 Phương pháp đếm trực tiếp ..............................................................................15
2.5.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc ............................................................................15
2.5.3 Phương pháp màng lọc .....................................................................................18
2.5.4 Phương pháp MPN (Most Probable Number)................................................... 19
2.5.5 Phương pháp đo độ đục ....................................................................................20
Chương 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................21
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ..........................................................................21
3.2 Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................21
3.3 Phương pháp tiến hành ........................................................................................21
3.3.1 Nguyên vật liệu và dụng cụ thí nghiệm ............................................................ 21
3.3.2 Khảo sát sự hiện diện của E. coli O157:H7 trong rau và thịt tươi ......................21
3.3.3 Chuẩn bị dung dịch E. coli O157:H7 và Salmonella chuẩn ...............................22
3.3.4 Đếm số lượng vi khuẩn E. coli O157:H7 và Salmonella ...................................22
3.3.5 Gây nhiễm thực nghiệm E. coli O157:H7 và Salmonella ..................................23
3.3.6 Phát hiện E. coli O157:H7 và Salmonella bằng kỹ thuật PCR ..........................26
3.3.7 Xử lý số liệu .....................................................................................................27
v


Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..............................................................28
4.1 Kết quả phát hiện E. coli O157:H7 trong rau và thịt tươi .....................................29
4.2 Kết quả phát hiện E. coli O157:H7 sau khi gây nhiễm thực nghiệm .....................29
4.2.1 Kết quả tăng sinh gốc E. coli O157:H7 ............................................................29
4.2.2 Kết quả đếm tế bào vi khuẩn E. coli O157:H7...................................................30
4.2.3 Kết quả gây nhiễm thực nghiệm E. coli O157:H7 .............................................30
4.2.4 Kết quả phát hiện E. coli O157:H7 được gây nhiễm thực nghiệm bằng PCR.....32
4.3 Kết quả phát hiện Salmonella sau khi gây nhiễm thực nghiệm bằng PCR ...........34

4.3.1 Kết quả xây dựng quy trình PCR phát hiện Salmonella .....................................34
4.3.2 So sánh hiệu quả PCR giữa 2 phương pháp ly trích DNA..................................35
4.3.3 Kết quả đếm tế bào Salmonella để chuẩn bị gây nhiễm thực nghiệm.................36
4.3.4 Kết quả phát hiện Salmonella sau khi gây nhiễm thực nghiệm bằng PCR ........36
4.4 Kết quả xây dựng quy trình phát hiện đồng thời E. coli O157:H7 và Salmonella
bằng PCR ................................................................................................................. 38
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ................................................................... 39
5.1 Kết luận ..............................................................................................................39
5.2 Đề nghị ...............................................................................................................39
5.3 Tồn tại ................................................................................................................39
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................40
PHỤ LỤC .................................................................................................................46

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
pmol

picomol

µl

microgram

µM

micromol/ lite

ATCC

American type Culture Collection

A/E

Attaching and effacing

BHI

Brain Heart Imfusion Broth

BGA Brilliant Green Agar
bp

base pair

CDC

Center for Disease Control and Prevention

CFU

Colony forming unit

CIDRAP

Center for Infectious Disease Research & Policy

DNA Deoxyribonucleotic acid
dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

Eae

Escherichia coli attaching and effacing

EAEC

Enteroaggregative Escherichia coli

EHEC

Enterohemorrhagic Escherichia coli

EIEC Enteroinvasive Escherichia coli
EMB Eosin Methylen Blue
EPEC

Enteropathogenic Escherichia coli

FDA

Food and Drug Administration

FAO

Food and Agriculture Organization

FSIS

USA Department of Agriculture’s Food Safety and Inspection Service

HC

Haemorrhagic colitis

HUS

Haemolytic uraemic syndrome

IMViC

Indol, Methyl Red, Voges – Proskauer, Simmon Citrate

LT

heat labile

MAC

MacConkey

NA

Nutrient agar

NDDIC

National Digestive Diseases Information Clearinghouse

vii


NIAID

National Institute of Allergy and Infectious Diseases

OD

Optical density

PCR

Polymerase chain reaction

STEC Shiga toxin – producing Escherichia coli
Stx

Shiga toxin

SMAC

Soritol MacConkey

ST

heat stable

XLD

Xylose – Lysine – Deoxy Cholate Agar

TBE

Tris Borate EDTA

TSA

Trypticase Soy Agar

TSI

Triple Sugar Iron Agar

TBE

Tris borate EDTA

UV

Ultra violet

VT

Verotoxin

VTEC

Verotoxigenic Escherichia coli

WHO World Health Organization

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ
Hình 4.1: Kết quả điện di multiplex – PCR Salmonella (SUL, SGX) ...................... 33
Hình 4.2: Kết quả điện di mPCR1 để phát hiện E. coli O157:H7 ............................. 35
Sơ đồ 3.1 Quy trình định lượng E. coli bằng phương pháp MPN .........................................25

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 4.1: Kết quả định lượng E. coli bằng phương pháp MPN (MPN/g) .................. 28
Bảng 4.2: Kết quả phát hiện O157:H7 trong rau và thịt tươi bằng PCR .................... 29
Bảng 4.3: Kết quả đếm tế bào vi khuẩn E. coli O157:H7 .......................................... 30
Bảng 4.4: Kết quả định lượng coliforms, E. coli trong rau, thịt trước gây nhiễm
(MPN/g) ................................................................................................................... 31
Bảng 4.5: Kết quả định lượng E. coli trong rau, thịt sau gây nhiễm (MPN/g)............ 32
Bảng 4.6: Kết quả phát hiện E. coli O157:H7 sau gây nhiễm thực nghiệm bằng PCR
.................................................................................................................................33
Bảng 4.7: Kết quả ly trích DNA mẫu thực nghiệm ................................................... 35
Bảng 4.8 Kết quả đếm tế bào vi khuẩn Salmonella .................................................. 36
Bảng 4.9 Kết quả phát hiện Salmonella sau khi gây nhiễm thực nghiệm bằng PCR 36

x


Chương 1

MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
E. coli O157:H7 là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm phổ biến tại nhiều
quốc gia trên thế giới. Tại Nhật, có khoảng 10.000 ca ngộ độc do E. coli O157:H7 đã
được báo cáo vào năm 1996 (Watanabe và ctv, 1999). Hàng năm, Mỹ có hơn 73 ngàn
ca ngộ độc thực phẩm do nhiễm O157:H7, trong đó có 71 trường hợp tử vong; trong
đó uống sữa tươi là một nguyên nhân quan trọng (USA Department of Agriculture’s
Food Safety and Inspection Service, 2004). Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm của
Mỹ (U.S. Food and Drug Administration) công bố năm 2006 rằng lấy mẫu xét nghiệm
trên 204 người trong một trận dịch cho thấy có dương tính với E. coli O157:H7 tồn tại
trong rau. Ngày 4/10/2008, Cục thanh tra thực phẩm Canada (Canadian Food
Inspection Agency = CFIA) kết luận E. coli O157:H7 trong một ổ dịch có liên quan
đến rau diếp xuất xứ từ Mỹ vào Ontario (Cegelski và ctv, 2008). Ở Argentina, hội
chứng huyết niệu (HUS) do O157:H7 gây ra trở thành dịch địa phương (Anderson và
ctv, 2003). Cooley và ctv (2007) cho rằng O157:H7 thường kết hợp với tiêu chảy do
ngộ độc thực phẩm trên người. O157:H7 gây ra nhiều triệu chứng bệnh nguy hiểm,
đồng thời còn là một trong những tác nhân quan trọng gây tử vong cho trẻ em ở những
nước đang phát triển (Morin và ctv, 2004).
CDC (2007) cho biết Salmonella là nguyên nhân gây ra nhiều vụ ngộ độc
(6.790 ca, chiếm 38% tổng số các vụ ngộ độc). Tại Việt Nam, gần đây các vụ ngộ độc
do Salmonella tăng đến 70% tổng số các vụ ngộ độc (Bùi Manh Hà, 2006). Theo báo
cáo của Chi cục Thú y thành phố Hồ Chí Minh (2007), kết quả xét nghiệm 386 mẫu
thịt tươi cho thấy 46,4% mẫu không đạt chỉ tiêu vi khuẩn E. coli và 18,9% mẫu không
đạt chỉ tiêu Salmonella. Vi khuẩn Salmonella là tác nhân gây ra những đợt thương hàn
nghiêm trọng (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Đặc biệt, bệnh càng trở nên nguy hiểm hơn
khi có sự kết hợp của E. coli O157:H7 và Salmonella (Mohle-Boetani và ctv, 2001).
Do đó, cần phải có phương pháp phù hợp để phát hiện kịp thời những vi khuẩn này, để
1

góp phần chẩn đoán, phòng ngừa và khắc phục những ổ dịch có thể xảy ra. Vì vậy,
được sự cho phép của Khoa Chăn Nuôi Thú Y – Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ
Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Nguyễn Ngọc Tuân và BSTY Bùi Thị Thu
Trang, đề tài “Phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7 và Salmonella bằng kỹ thuật PCR”
được tiến hành.
1.2 Mục tiêu
Giới hạn phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7 và Salmonella bằng kỹ thuật PCR
sau khi gây nhiễm thực nghiệm trong môi trường peptone sau 16 giờ tăng sinh.
1.3 Yêu cầu
Nắm được quy trình phân lập E. coli và Salmonella
Phát hiện vi khuẩn E. coli và Salmonella bằng các cặp primer rfbE, fliC cho E. coli và
SUL, SGX cho Salmonella bằng kỹ thuật PCR.

2


Chương 2
TỔNG QUAN
2.1 Vi khuẩn Escherichia coli
Vi khuẩn E. coli là một vi khuẩn sống bình thường trong ruột người và động
vật, nhiều nhất ở ruột già (Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên, 2001). Phần lớn vi
khuẩn E. coli không gây bệnh, chúng đóng vai trò cân bằng sinh học trong đường ruột,
chỉ một số ít gây bệnh cơ hội cho tuyến vú, tử cung và phổ biến nhất là gây bệnh trên
đường ruột. Vi khuẩn E. coli có thể gây bệnh tiêu chảy trên thú và người, đặc biệt
chúng là nguyên nhân gây bệnh phù trên heo con sau cai sữa (Nguyễn Ngọc Hải,
2007).
2.1.1 Đặc điểm
Vi khuẩn E. coli được phân lập và mô tả đầu tiên vào năm 1985 bởi Theodor
Escherich. Vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia. E. coli là
trực khuẩn Gram âm, kích thước khoảng 1,5 x 1 – 3 µm, không hình thành bào tử và

tạo giáp mô mỏng (Trần Thị Bích Liên, 2001).
2.1.2 Đặc tính nuôi cấy và sinh hóa
E. coli là loài vi khuẩn hiếu khí tùy nghi, di động. Có thể sinh trưởng ở nhiệt độ
15 – 40oC, nhưng nhiệt độ tối hảo là 37oC, pH từ 6,4 – 7,4 (Trần Thanh Phong, 1996).
E. coli mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng, sau 24 giờ tạo khuẩn lạc tròn ướt
(dạng S), màu trắng đục, nếu để lâu khuẩn lạc trở nên khô, nhăn (dạng R). Kích thước
khuẩn lạc từ 2 – 3 mm. Trên thạch máu, có những chủng dung huyết (γ, β) hoặc
không. Trên môi trường canh, sau 4 – 5 giờ, E. coli làm đục nhẹ môi trường, càng để
lâu càng đục, có mùi hôi thối, sau vài ngày có thể tạo ván mỏng trên mặt môi trường.
Trên thạch gelatin, không gây tan chảy gelatin. Trên môi trường chuyên biệt EMB
(Eosin Methylene Blue), tạo khuẩn lạc tím ánh kim. Trên môi trường MAC, E. coli
cho khuẩn lạc màu hồng. Trên môi trường BGA, E. coli cho khuẩn lạc màu vàng. Trên
môi trường thạch bán nghiêng TSI, E. coli tạo vàng / vàng (Tô Minh Châu và Trần Thị
Bích Liên, 2001).
3


Các phản ứng sinh hóa của E. coli bao gồm: lên men sinh hơi các loại đường
như glucose, galactose, mantose, arabinose, xylose, rhamnose, fructose, lactose (đặc
tính lên men lactose được dùng để phân biệt với Salmonella). Phần lớn các chủng E.
coli đều có thể lên men saccharose, raffinose, salicin, esculin…(Trần Thanh Phong,
1996), cho phản ứng indol dương / âm tính, methyl red (MR) dương tính, Voges –
Proskauer (VP) âm tính và citrat âm tính, hoàn nguyên nitrat thành nitrit (Tô Minh
Châu và Trần Thị Bích Liên, 2001).
2.1.3 Phân loại vi khuẩn Escherichia coli
Dựa vào đặc điểm sinh bệnh, E. coli gây bệnh đường ruột được chia thành 5
nhóm sau: EAEC (enteroaggregative E. coli) gây kết dính và phá hủy tế bào thượng bì
ruột; EHEC (enterohemorrhagic E. coli) hay còn gọi là STEC (Shiga toxigenic E. coli)
hoặc là VTEC (Verotoxigenic E. coli) là những E. coli gây xuất huyết đường ruột;
EIEC (enteroinvasive E. coli) là những E. coli xâm lấn niêm mạc ruột; ETEC

(enterotoxigenic E. coli) là những E. coli sinh độc tố đường ruột; EPEC
(enterophathogenic E. coli) là những E. coli gây bệnh đường ruột (Nguyễn Ngọc Tuân,
2002).
Có ba cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E. coli: (1) Sản xuất độc tố
(ETEC, EAEC, EHEC), (2) Tấn công / xâm lấn (EIEC), (3) Bám dính truyền tín hiệu
qua màng (EPEC và EHEC). Tuy nhiên, tác động qua lại giữa cơ thể với vật chủ và
màng nhầy ruột thì đặc hiệu cho mỗi loại (Nataro và Kaper, 1998). Đặc biệt, nhóm
EHEC đóng vai trò quan trọng trong sức khỏe cộng đồng.
2.1.3.1 Triệu chứng lâm sàng của EHEC
Vài cá thể bị nhiễm EHEC có thể hoàn toàn không có triệu chứng dù có sự hiện
diện khá lớn của vi khuẩn cũng như độc tố trong phân, tuy nhiên sự hiểu biết về tỉ lệ
mang trùng không triệu chứng còn rất hạn chế (Brian và ctv, 1992).
Triệu chứng viêm kết tràng xuất huyết (HC = haemorrhagic colitis) xuất hiện từ
1 – 2 ngày sau khi ăn phải thực phẩm bị nhiễm, đôi khi thời gian có thể kéo dài hơn.
Triệu chứng bắt đầu thường nhẹ, tiêu chảy không có máu, sau đó có thể sốt nhẹ hoặc
đau bụng. Tiêu chảy lúc đầu sẽ tăng lên với cường độ mạnh trong khoảng thời gian từ
24 – 48 giờ hoặc 4 – 5 ngày. Sau đó, tiêu chảy có máu xuất hiện, kèm theo đau bụng
dữ dội, mất nước và viêm kết tràng xuất huyết. Biến chứng có thể xuất hiện ở bệnh
4


nhân bị viêm kết tràng xuất huyết là hội chứng huyết niệu (HUS = hemolytic uremic
syndrome). Bệnh HUS có thể xuất hiện sau đó khoảng 1 tuần, với nhiều triệu chứng dạ
dày ruột. Đặc điểm của triệu chứng này là sự thiếu máu do dung huyết, giảm tiểu cầu,
thiểu niệu, phù thủng, tổn thương thận cấp tính. Vài cá thể HUS có triệu chứng thần
kinh bao gồm bơ phờ, nhức đầu dữ dội, co giật và đau não (Boyce và ctv, 1995). Tiến
trình bệnh do EHEC gây ra có biến chứng hay không còn phụ thuộc vào sự tác động
qua lại giữa vi khuẩn và vật chủ. Mặc dù HUS xẩy ra trên tất cả các nhóm tuổi, nhưng
tỉ lệ mắc bệnh ở trẻ em (thường là trẻ dưới 10 tuổi) và người già thường cao hơn, có
thể là do sự yếu kém về miễn dịch ở trẻ em và sự suy giảm chức năng của hệ thống

miễn dịch trên người già (Paton và Paton, 1998).
2.1.3.2 Cách sinh bệnh
Để sinh bệnh cho vật chủ, nhóm EHEC phải trải qua nhiều giai đoạn, bao gồm:
(1) Định cư trong ống tiêu hóa: Khả năng bám vào tế bào biểu mô ruột của
nhóm EHEC, và định cư trong ống tiêu hóa người là một trong những yếu tố quyết
định độc lực của chúng. Người ta ước tính liều gây nhiễm của vài chủng EHEC
(O111:H- và O157:H7) là khoảng 10 - 100 CFU (Griffin và ctv, 1995). Liều này thấp
hơn nhiều lần so với ETEC và EPEC (Paton và Paton, 1998).
(2) Sức đề kháng acid của EHEC: Nét đặc trưng của nhóm EHEC là khả năng
định cư ở ống tiêu hóa người, đặc biệt là liều cảm nhiễm thấp. Chúng đề kháng được
độ acid của dạ dày. Tính trạng này được điều hòa bởi gen rpoS. Gen này có khả năng
giúp vi khuẩn E. coli kéo dài thời gian sống sót ở pH dưới 2,5 (Paton và Paton, 1998).
(3) Kiểu hình bám vào tế bào ruột: EHEC có khả năng sống sót trong điều
kiện khắc nghiệt của dạ dày, sau đó chúng phải thiết lập sự định cư trong đường ruột
bằng cách bám vào các tế bào biểu mô. EHEC định cư được ở đoạn kết tràng và có lẽ
cũng ở đoạn xa ruột non người, mặc dù chưa được chứng minh trực tiếp. Có nhiều cơ
chế bám dính khác nhau nhưng chưa được giải thích và chứng minh một cách rõ ràng
(Paton và Paton, 1998).

5


2.1.3.3 Các yếu tố liên quan đến đặc tính gây bệnh của EHEC
Có nhiều yếu tố liên quan đến đặc tính gây bệnh của EHEC như độc tố Stx, độc
tố bám dính và enterohemolysin.
 Độc tố Shiga
EHEC sản sinh độc tốc Stx gồm Stx1 và Stx2. Stx2 có nhiều biến chủng như
Stx2c và Stx2e. Độc tố Stx là những độc tố phức gồm 1 tiểu đơn vị A và 5 tiểu đơn vị
B. Trình tự acid amin dự đoán cho tiểu đơn vị A của độc tố Stx, Stx1, Stx2 lần lượt là
315, 315 và 318 aa; tiểu đơn vị B giống nhau khoảng 98% acid amin cho cả ba loại

độc tố. So sánh với trình tự acid amin đã tiên đoán, cho thấy độc tố Stx và Stx1 hầu
như giống nhau (chỉ khác nhau 1 acid amin trong tiểu đơn vị A); trong khi đó, Stx2 chỉ
có 56% giống nhau so với Stx, Stx1 ở cả 2 tiểu đơn vị A và B (Paton và Paton, 1998).
Trình tự chuỗi acid amin trên tiểu đơn vị A của Stx2e có nhiều hơn 1 acid amin
so với Stx2 và giống 94% so với Stx2. Tiểu đơn vị B của Stx2e ngắn hơn Stx2 hai acid
amin và chỉ có 87% giống với Stx2. Độc tố Stx tác động đến tế bào vật chủ thông qua
các thụ thể Gb3 và Gb4. Vì các tế bào Vero có số lượng Gb3 và Gb4 khá nhiều trên
màng bào tương, nên tế bào Vero được dùng để phát hiện tất cả các biến chủng của Stx
đã biết. Tế bào Hela cũng được sử dụng, nhưng do thiếu thụ thể Gb4, vì thế mà tế bào
Hela kém nhạy với Stx2e (Paton và Paton, 1998).
 Yếu tố bám
Để gây bệnh một cách đầy đủ, EHEC cần có một số yếu tố độc lực khác, đó là
intimin, một loại protein bám, do gen eae quy định. Gen này mã hóa intimin, một loại
protein màng ngoài với 939 aa, chúng làm nhiệm vụ trung gian cho việc bám dính vi
khuẩn với tế bào ruột. Intimin gây tổn thương dạng bám dính và phá hủy (E. coli
attaching và effacing, A/E). Khả năng hình thành bệnh tích A/E được thừa nhận đầu
tiên đối với các chủng EPEC. Sự hình thành bệnh tích A/E do gen định vị trên đảo sinh
bệnh có độ dài 35,5 kb, được gọi là vùng LEE (locus for enterocyte effacement).
Những biến đổi siêu cấu trúc của bệnh tích A/E gồm mất các vi nhung mao của tế bào
ruột và sự bám chặt của vi khuẩn trên bề mặt tế bào này. Phía dưới sự bám dính, có sự
tích tụ các thành phần của tế bào sợi cơ, kết quả là hình thành đế cột (Paton và Paton,
1998).

6


 Enterohemolysin
Beutin và ctv (1989) cho biết đa số các chủng EHEC đều cho kiểu hình dung
huyết alpha (Hly), do gen hlyA quy định. Gen này nằm trên plasmid 60 – Mda,
plasmid này được tìm thấy ở nhiều chủng O157:H7 và cũng hiện diện ở các chủng

EHEC không phải O157 (EHEC – non O157). Độc tố dung huyết hlyA là nguyên nhân
gây hư hại tế bào Vero, Hep – 2 hoặc Hela trong phòng thí nghiệm (Beutin và ctv,
1989). Gen hlyA được tìm thấy trong nhiều chủng EHEC, có liên quan đến một số
bệnh tiêu chảy không có máu và thường xuyên được tìm thấy trên người bị nhiễm
EHEC (Nataro và Kaper, 1998).
2.1.4 Giới thiệu về E. coli O157:H7
Hiện nay, Escherichia coli O157:H7 là serotype gây ra nhiều ổ dịch lớn trên thế
giới. Chủng E. coli này được phát hiện lần đầu tiên tại Mỹ vào năm 1982 (Riley và ctv,
1983), trong bánh hamburger chưa được nấu chín. Đợt bùng phát đầu tiên có 26 trường
hợp với 19 ca nhập viện ở Oregon; đợt thứ hai xảy ra sau ba tháng có 21 trường hợp và
14 ca nhập viện ở Michigan. Sau đó một thời gian ngắn, O157:H7 đã được xác định là
yếu tố gây bệnh trên người (Buchanan và Doyle, 1997). Karmali và ctv (1983) đã thu
thập mẫu phân của những đứa trẻ bị HUS, kết quả phân tích cho thấy serotype
O157:H7 là serotype nổi trội nhất. Đến năm 1996, tình trạng này cũng được ghi nhận
tại Osakai (1996) và nhiều nơi khác thuộc Nhật Bản. Nhiễm E. coli O157:H7 có thể
gây ra các triệu chứng tiêu chảy, HC, HUS (85 – 95%) (Neill và ctv, 1994). E. coli
O157:H7 sản sinh độc tố Stx1, Stx2 và một số biến chủng của Stx2 (Paton và Paton,
1998).
Không giống với các serotype E. coli khác, serotype O157:H7 sinh trưởng tối
đa ở nhiệt độ 42oC (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Tuân, 2002). Chúng có thể phát triển
được trong môi trường BHI ở 45oC, có thể sinh trưởng và sinh ga ở 44,5oC trong EC
nhưng không phải tất cả, có một số không phát triển được (Buchanan and Doyle,
1997). Nhờ khả năng đề kháng được với acid của dạ dày, O157:H7 có thể sinh độc tố
trong môi trường có pH 2 – 7. Serotype O157:H7 có thể sống sót ở pH = 2,5 từ 2 – 7
giờ trong 37oC (Benjamin và Datta, 1995; Buchanan và Edelson, 1996). Sự kháng acid
làm tăng khả năng tồn tại của vi khuẩn này trong những thực phẩm có tính acid; đặc
biệt khi bảo quản ở nhiệt độ lạnh, O157:H7 có thể tồn tại trên 28 ngày (Rowbury,
7

1995). O157:H7 có khả năng sống đến 56 ngày trong môi trường TSB ở pH = 4 (trích
dẫn bởi Jay, 2000). Khả năng chịu mặn của O157:H7 cũng khá tốt, vi khuẩn chỉ ngưng
phát triển khi nồng độ NaCl  8,5% (Jay, 2000).
Ngoài ra, O157:H7 còn có đặc tính không lên men đường sorbitol, trong khi
khoảng 93% các chủng E. coli khác lên men đường sorbitol trong vòng 24 giờ (Smith
và Scotaland, 1993). Dựa vào đặc điểm này, để nâng cao xác xuất phân lập serotype
O157:H7, người ta sử dụng môi trường MacConkey có bổ sung thêm đường sorbitol
(SMAC) hoặc CT – SMAC có bổ sung thêm kháng sinh cefixime và tellurite để hạn
chế sự tăng trưởng của những vi khuẩn gram dương, và vi khuẩn sống hoại sinh khác.
Những khuẩn lạc không lên men sorbitol sẽ được chọn để thử sinh hóa, thử nghiệm
huyết thanh học, hoặc gây độc cho tế bào Vero (Cebula và ctv, 1995).
2.2 Vi khuẩn Salmonella
2.2.1 Lịch sử và phân bố
Năm 1885, Salmon và Smith phân lập vi trùng Bacterium cholerae suis trong ca
bệnh dịch tả heo ở Hoa Kỳ, sau đó lần lượt được phát hiện tại các quốc gia khác. Bệnh
thường xuất hiện dưới dạng dịch lẻ tẻ, mang tính chất địa phương (Trần Thanh Phong,
1996).
Mỗi serotype hầu hết chỉ thích nghi đơn lẻ với một loại vật chủ như là
Salmonella typhi, S. paratyphi A, S. paratyphi C và S. sendai với con người,
Salmonella gallinarum với gia cầm, Salmonella typhisuis với heo, Salmonella
abortusequi với ngựa và Salmonella abortusovis với bò. Ngoài ra, Salmonella thỉnh
thoảng có thể là nguyên nhân gây bệnh trên các loài kí chủ khác.
2.2.2 Cấu trúc kháng nguyên và độc tố
Theo Monir và ctv (1987), Salmonella được chia thành 2 loài chính: Salmonella
enterica (gây bệnh) và Salmonella bongori (không hay ít gây bệnh). Theo phân loại
của Bergey (1994), Salmonella chỉ có một loại Salmonella choleraesuis, gồm nhiều
dưới loài, mỗi dưới loài có nhiều serovar. Các serovar được xác định bằng các thành
phần cấu trúc kháng nguyên (dẫn liệu bởi Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên,
2001).
2.2.2.1 Kháng nguyên

Vi khuẩn Salmonella có 2 loại kháng nguyên bề mặt chính, bao gồm kháng
8


nguyên O là kháng nguyên thân, bản chất là polysaccharide, gồm hơn 40 thành phần
khác nhau được đánh số La Mã hay Ả Rập. Do đó, có sự khác nhau giữa các loài
Salmonella về phương diện kháng nguyên. Người ta chia thành 34 nhóm: A, B, C1,
C2, C3, D1, D2, E1, E2, E3, E4, F, G1, G2, H, I, J, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U, V, W,
X, Y, Z, 49, 50. Kháng nguyên O không bị phân hủy bởi nhiệt độ 200oC / 2h; không bị
cồn, acid phenic phá hủy. Kháng nguyên H là kháng nguyên lông, bản chất là protein,
gồm 2 pha. Pha 1 là pha chuyên biệt, được biểu thị bằng chữ a, b, c, d, pha 2 là pha
không chuyên biệt, được biểu thị bằng số 1, 2, 3, 4. Ngoài ra, Salmonella còn có kháng
nguyên Vi là kháng nguyên vỏ bọc, bản chất là lipopolysaccharide (ở một số
Salmonella như S. typhi, S. paratyphi C, S. dublin) (dẫn liệu bởi Văn Thiên Bảo,
2004).
2.2.2.2 Độc tố
Độc tố đường ruột
Vi khuẩn Salmonella có 2 loại độc tố đường ruột giống với E. coli, đó là độc tố
LT (không bền với nhiệt), độc tố ST (bền với nhiệt). Salmonella có nội độc tố, bản
chất là lipopolysaccharide, đó chính là thành phần của vách tế bào vi khuẩn và được
phóng thích ra ngoài khi vi khuẩn bị giết chết. Nội độc tố rất bền với nhiệt. Điều kiện
cần thiết để ngộ độc Salmonella bộc phát là thực phẩm phải chứa hoặc nhiễm vi
khuẩn, số lượng vi khuẩn phải đủ cao trong lúc vấy nhiễm hoặc chúng phát triển mạnh
mẽ, vi khuẩn phải được đưa vào ống tiêu hóa (Dương Thanh Liêm, 2004).
2.2.3 Đặc điểm hình thái, nuôi cấy, sinh hóa của Salmonella
Giống Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, là trực khuẩn Gram âm, hình
gậy, hai đầu tròn, kích thước 0,7 – 1,5 x 2 – 5 µm, không giáp mô, không hình thành
bào tử, có tiêm mao quanh cơ thể (trừ Salmonella gallinarum) (Tô Minh Châu và Trần
Thị Bích Liên, 2001).
Salmonella sống trong môi trường hiếu khí hay yếm khí tùy nghi. Có thể phát

triển ở nhiệt độ 7 – 45oC, tối ưu ở 37 oC (Trần Thanh Phong, 1996), pH = 7,2 – 7,6.
Mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng NA, tạo khuẩn lạc trắng tròn, bóng, hơi
phồng, có hai dạng R và S (Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên, 2001). Trên môi
trường BGA, cho khuẩn lạc điển hình tròn, màu trắng hồng, hơi xám và hơi lồi. Trên
môi trường XLD, cho khuẩn lạc tròn trong suốt màu đỏ, có hay không có tâm đen,
9


vùng môi trường xung quanh có màu đỏ. Trên môi trường TSI, có biểu hiện đỏ/vàng,
sinh H2S hay không tùy loài. Trên môi trường BHI, vi khuẩn làm cho môi trường đục
đều, để lâu có cặn (trích dẫn bởi Văn Thiên Bảo, 2004).
Về đặc tính sinh hóa, phần lớn Salmonella lên men sinh hơi glucose, mannit,
sorbitol, arabinose, không thủy phân urea, không sản sinh indol, phản ứng lysine
decarboxylase dương tính, phản ứng oxidase âm tính, không lên men đường lactose
(Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên, 2001).
2.2.4 Dịch tễ
Ngộ độc do Salmonella thông qua thức ăn thường hay gặp trên người và động
vật. Có khoảng 2500 serotype của Salmonella đã được biết là nguyên nhân gây nhiễm
trùng trên người và / hoặc trên thú, mặc dù chỉ có khoảng 50 serotype được phân lập
với số lượng có ý nghĩa từ ca bệnh có biểu hiện lâm sàng, và được coi là tác nhân gây
bệnh (Võ Thị Trà An, 2007). Các loài Salmonella gây bệnh chủ yếu là Salmonella
typhymurium, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis và Salmonella dublin.
Trong số 32.021 trường hợp nhiễm Salmonella với 2.449 serotype, tỉ lệ nhiễm
Salmonella typhymurium và Salmonella enteritis chiếm 42% (CDC, 2000 – dẫn liệu
bởi Huỳnh Văn Điểm, 2005). Trong nghiên cứu của 172 ca nhiễm trùng máu do
Salmonella ở Tây Ban Nha, có khoảng 70% do S. enteritidis và 17% do S.
typhimurium, 16% bệnh nhân phát triển nhiễm trùng di căn và 16% đã chết (Võ Thị
Trà An, 2007). Thịt, sữa tiệt trùng, và sản phẩm từ sữa được coi là con đường truyền
lây Salmonella dublin đến người (Liebisch và Schwarz, 1996). S. typhymurium là
serovar phổ biến nhất được phân lập trên bệnh nhân bị tiêu chảy trong khi S.

choleraesuis, S. dublin và S. enteritidis thường được tìm thấy trên những bệnh nhân bị
nhiễm trùng máu (Chiu và Jonathan, 1996). Gia cầm và các sản phẩm gia cầm là
nguồn Salmonella chính gây nhiễm trùng trên người (Rusul và ctv, 1996). Nhiễm
trùng do Salmonella vẫn xuất hiện với tần số cao ở các quốc gia phát triển cũng như
đang phát triển. Nhiễm trùng do Salmonella tiếp tục trở thành vấn đề chính về sức
khỏe của con người (Malorny và ctv, 2003). Trong khoảng 10 năm trở lại đây, ảnh
hưởng của những trường hợp nhiễm trùng do Salmonella enteritidis trên người gia
tăng đột ngột tại Đài Loan, nhiễm trùng Salmonella trên người một cách thường xuyên
từ việc mua bán gia cầm, trứng gia cầm và thịt gia cầm bị nhiễm (Pan và Liu, 2002).
10


Ngộ độc Salmonella có liên quan đến thời tiết rất rõ, thường phát sinh vào mùa hè (từ
tháng 6 đến tháng 9). Nhiệt độ bên ngoài 20oC là thích hợp cho vi khuẩn phát triển,
ngoài ra khi thời tiết oi bức làm giảm năng lực chống đỡ của cơ thể, đường ruột dễ bị
cảm nhiễm (Dương Thanh Liêm, 2004).
2.2.5 Cách sinh bệnh
Hầu hết Salmonella xâm nhập vào thực phẩm thông qua đường tiêu hóa, đôi khi
qua hô hấp, đường sinh dục. Trong phòng thí nghiệm, có thể gây bệnh qua đường tiêm
phúc mạc. Ngoài ra, còn có sự lây lan giữa người và người. Để gây bệnh, Salmonella
phải có sự đa dạng của những thuộc tính gọi là yếu tố độc lực. Yếu tố này bao gồm (1)
khả năng xâm nhập vào tế bào, (2) lớp lipopolysaccharide hoàn chỉnh, (3) khả năng tái
sinh nội bào, (4) có thể tạo ra độc tố.
Garther (1988) cho rằng vi khuẩn sinh ra ngoại độc tố chịu nhiệt, loại độc tố
này gây bệnh cho người và động vật. Nhưng sau đó, nhiều tác giả lại chứng minh rằng
ngộ độc do Salmonella không phải do ngoại độc tố gây nên, mà do đường tiêu hóa hấp
thu một lượng lớn vi khuẩn Salmonella sống. Khi vào trong máu, vi khuẩn bị phá vỡ
và giải phóng ra nội độc tố gây ngộ độc cho cơ thể (Dương Thanh Liêm, 2004).
Salmonella gây bệnh khi vấy nhiễm vào thức ăn, có thể sống sót thông qua rào cản
acid dạ dày, sau đó xâm nhiễm vào màng nhầy của ruột non, ruột già và sản xuất độc

tố. Sự xâm nhập vào biểu mô ruột kích thích sản xuất yếu tố tiền viêm là cytokin, dẫn
đến phản ứng viêm. Vi khuẩn gây viêm ruột, phá hỏng tế bào niêm mạc ruột, tiết ra
độc tố. Độc tố này thấm qua thành ruột vào máu. Sau đó, theo hệ thống bạch huyết và
tuần hoàn gây nên tình trạng nhiễm trùng huyết, thâm nhập sâu vào các cơ quan của cơ
thể như gan, lách, và đi sâu vào tủy xương (Giannella, 1996). Nội độc tố chủ yếu tác
động trên hệ thần kinh vận động của huyết quản, làm giảm độ bền của thành mao quản
và giảm chức năng điều tiết thân nhiệt của cơ thể.
Thực phẩm trong các vụ ngộ độc thường có giá trị dinh dưỡng cao, hàm lượng
nước cao, không bảo quản đóng gói kín, tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát
triển. Nguyên nhân thực phẩm nhiễm Salmonella là điều kiện vệ sinh kém trong các
khâu chăm sóc, nuôi dưỡng, vận chuyển, trữ thú, qui trình giết mổ, dụng cụ giết mổ,
phương tiện vận chuyển quầy thịt và bày bán không đảm bảo vệ sinh (dẫn liệu bởi
Huỳnh Văn Điểm, 2005).
11


2.2.6 Triệu chứng gây ngộ độc
Thời gian ủ bệnh trung bình từ 12 -24 giờ, đôi khi chỉ vài giờ và cũng có khi vài
ngày. Tùy theo điều kiện mà biểu hiện triệu chứng sớm hay muộn. Triệu chứng thường
gặp là biếng ăn, nhức đầu, đau cơ, mặt tái nhợt, toát mồ hôi và sau đó nôn mửa, tiêu
chảy và tùy trường hợp sốt có thể kéo dài đến 3 – 7 ngày. Bệnh nặng có thể viêm dạ
dày, ruột giống như dịch tả, cảm cúm. Ngộ độc Salmonella thường ít gây tử vong trừ
khi cấp cứu không kịp và lúc cơ thể suy yếu. Tỉ lệ tử vong thường dưới 1% (Dương
Thanh Liêm, 2004).
2.3 Tình hình ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam và thế giới do Salmonella và E. coli
2.3.1 Tại Việt Nam
Ngộ độc thực phẩm do tác nhân vi sinh, tác nhân hóa học và sự tồn dư kháng
sinh trong các mẫu đem kiểm nghiệm rất cao. Theo thống kê chưa đầy đủ của ngành y
tế, từ năm 2001 đến hết năm 2005 đã xẩy ra 990 vụ ngộ độc thực phẩm với 23.201
người bị ngộ độc, trong đó có 265 người bị chết. Tổng số vụ ngộ độc là 141, số người

bị là 4.291, với 50 người chết (chỉ tính riêng trong năm 2005). Trong đó, nguyên nhân
gây ngộ độc do vi sinh vật là 73 vụ (chiếm 51,8%). Theo thống kê của Trung tâm Y tế
dự phòng Tp. Đà Nẵng từ năm 2002 - 2006, có 6/25 vụ ngộ độc thực phẩm ở Đà Nẵng
xuất phát từ thức ăn đường phố, chiếm 24%; số người bị ngộ độc là 114/378, chiếm
30,2%. Qua khảo sát các cơ sở kinh doanh thức ăn đường phố tại Đà Nẵng, có đến
53% số mẫu thức ăn nhiễm coliforms và 25,3% nhiễm E. coli (Việt báo, 2008). Theo
thông tấn xã Việt Nam, năm 2008 có hàng trăm học sinh trường tiểu học Phước Bình,
Q.9 Thành phố Hồ Chí Minh đã phải đi cấp cứu vì bị ngộ độc thực phẩm. Tại Bệnh
viện Nhi Đồng 2, bác sĩ Trần Văn Thảo cho biết các trường hợp ngộ độc là do thức ăn
bị nhiễm E. coli (thông tấn xã Việt Nam, nguồn www.dân trí.com.vn, 2008).
Theo Bác sĩ Phạm Văn Quyền, bệnh viện Từ Dũ (2008), E. coli còn gây nhiễm
trùng ối ở phụ nữ mang thai, gây tỉ lệ tử vong cao (35% trong tổng số các nguyên
nhân) (khoa hoc.net).
2.3.2 Trên thế giới
Ngộ độc do Salmonella
Theo thống kê của WHO, sốt thương hàn hằng năm gây bệnh trên 16 triệu
người, làm chết khoảng 600.000 người (dẫn liệu bởi Dương Thanh Liêm, 2008). Theo
12


An và ctv (2006), bệnh do Salmonella là bệnh động vật chính trên người, là nguyên
nhân gây ra 68% vụ ngộ độc thực phẩm ở châu Âu từ 1993 – 1998. Hàng năm, tại Hà
Lan, có khoảng 50.000 trường hợp (An và ctv, 2006). Tại Hoa Kỳ, ước tính khoảng
30.000 ca bị nhiễm Salmonella spp mỗi năm, trong đó có khoảng 4.000 trường hợp là
do thực phẩm bị vấy nhiễm (CDC, 2005).
Năm 1994, 10.009 trường hợp bị nhiễm S. enteritidis, tăng hơn 21% so với năm
1993 (8.258 trường hợp), tháng 9 và 10 là hai tháng bùng nổ bệnh cao nhất với 3.299
ca nhiễm trùng do S. enteritidis đã được báo cáo (Hennessy và ctv, 1996). Trong năm
1995, ở Đan Mạch có 2.911 trường hợp nhiễm Salmonella, trong đó 19% gây bệnh
thương hàn do ăn trứng và các sản phẩm của trứng. Tương tự, năm 1999, một nghiên

cứu ở Hàn Quốc cho thấy có 25,9% mẫu thịt gà tươi sống bị nhiễm Salmonella; tại Hà
Lan, có 23% thịt heo nhiễm Salmonella spp., trên 500 người ngộ độc do uống phải
nước cam nhiễm vi khuẩn Salmonella tại Úc. Năm 2001, nghiên cứu của Swanen và
ctv cho thấy 26% thịt heo nhiễm Salmonella spp (dẫn liệu bởi Phẩm Minh Thu, 2006).
Năm 2004, tại Hoa Kỳ và Canada, xảy ra 3 đợt dịch nhiễm khuẩn Salmonella liên
quan tới cà chua Roma, làm 561 người bị ngộ độc ở 18 bang Hoa Kỳ và 1 tỉnh của
Canada. Đến 2005, có trên 36.000 ca được báo cáo từ phòng thí nghiệm sức khỏe cộng
đồng xuyên quốc gia, giảm 12% so với thập niên trước đó, nhưng tăng 1,5% so với
2004 (CDC, 2007).
Ngộ độc do E. coli
Ở Hoa Kỳ, ước tính có khoảng 73.000 ca nhiễm E. coli O157:H7, 2000 ca nhập
viện và 61 người chết mỗi năm (CDC, 2005). Điển hình, vào năm 1993, với 700 người
bị bệnh và đã làm chết đi bốn trẻ em sau ổ dịch hamberger; sau đó một năm, vào 1995,
tại Scotland, có 71 người mắc bệnh và 1 người chết do nhiễm O157:H7 trên sữa chưa
tiệt trùng. Đến 1997 nguồn thịt bò tại địa phương bị nhiễm vi khuẩn này nên giết chết
18 người trong số 96 người mắc bệnh (Buzby, 2000). Theo FoodNet (2006), số ca
nhiễm bệnh do E coli O157:H7 là 545; E coli (EHEC) non-O157:H7 là 260, trong đó
có 82 ca HUS, liên quan tới nhiễm trùng E. coli trên trẻ em (nhỏ hơn 18 tuổi). E. coli
O157:H7 thật sự giảm thấp trong giai đoạn năm 2003 và 2004, sau đó gia tăng lại vào
năm 2005 và 2006 do vậy mà Chính phủ liên bang Hoa Kỳ đã thiết lập một mục tiêu
đặc biệt là giảm tỉ lệ ngộ độc thực phẩm vào 2010 (dẫn liệu của CDC, 2007). Gần đây
13


nhất, vào tháng 7 năm 2009, CDC đã cho biết có 80 người bị nhiễm O157:H7 ở 31
bang tại Hoa Kỳ.
2.4 Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) do Kary Mullis và cộng sự phát
minh năm 1985, hiện đang được sử dụng rất rộng rãi. Thực chất đây là một phương
pháp tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào.

Nguyên tắc của phản ứng PCR: PCR là phương pháp tổng hợp DNA dựa trên
mạch khuôn là một trình tự DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của
khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp
primer đặc hiệu cho đoạn DNA này.
Các bước của phương pháp PCR: Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu
kì nối tiếp nhau. Mỗi chu kì gồm 3 bước: Bước 1 là giai đoạn biến tính, phân tử DNA
được biến tính ở điều kiện nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử, ở điều
kiện này phân tử DNA từ dạng sợi đôi sẽ tách thành dạng sợi đơn, thường là ở nhiệt độ
94 – 95oC trong vòng 30 giây đến một phút. Bước 2 là giai đoạn ủ bắt cặp, trong bước
này nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của các primer, cho phép các primer
bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 –
60oC. Tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài
từ 30 – 60 giây. Bước 3 là giai đoạn kéo dài, dưới tác động của DNA polymerase, các
nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Mạch
mới được tạo thành từ mạch kéo dài trong khoảng 30 giây đến nhiều phút.
Mỗi chu kì trên gồm ba bước được lập đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần lặp lại sẽ
làm tăng gấp đôi số lượng DNA mẫu của lần trước. Tổng DNA khuếch đại được tính
theo công thức: m*2n (với n là số chu kì, m là số bản sao của chuỗi mã hóa).
2.5 Phương pháp định lượng vi sinh vật
Sự hiện diện của vi sinh vật có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp
khác nhau, nhằm xác định số lượng vi sinh trong các sản phẩm sinh học, lương thực và
thực phẩm hay để kiểm tra chất lượng môi trường nuôi cấy vi sinh vật thu sinh khối
(Nguyễn Ngọc Hải, 2005).
2.5.1 Phương pháp đếm trực tiếp
Mật độ vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn như nấm men, tảo… có thể được
14