Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng vi khuẩn scherichia coli O157 H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu

Header Page 1 of 148.

i

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dƣới sự hƣớng
dẫn của PGS. TS

và PGS. TS

. Các số liệu trình

bày trong luận án là trung thực.
Một số kết quả đã đƣợc công bố riêng hoặc đồng tác giả, phần còn lại chƣa
đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận án này!
0

Hoàng Phú Hiệp

Footer Page 1 of 148.

03 năm 2014


Header Page 2 of 148.

ii

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS. TS

Lê Quang Huấn, PGS. TS Nguyễn Bích Nhi đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình ngay từ
những bước đi đầu tiên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án này.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp
–
thực hiện đề tài luận án.
Tôi xin cảm ơn Bộ môn Di truyền và SHHĐ, Khoa Sinh-KTNN, Trường Đại
học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt
thời gian học tập, nghiên cứu.
Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè tôi đã tạo mọi điều kiện và động viên tôi
trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn!!!
Thái Nguyên, ngày 05 tháng 03 năm 2014
Nghiên cứu sinh

Hoàng Phú Hiệp

Footer Page 2 of 148.


Header Page 3 of 148.

iii

Trang
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
1.

Đặt vấn đề......................................................................................................... 1

2.

Mục tiêu nghiên cứu ......................................................................................... 2

3.

Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 3
1.1.

VI KHUẨN E. COLI O157:H7 ........................................................................ 3

1.1.1. Đặc điểm chung của chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 .................................... 3
1.1.2. Độc tố Shiga-like toxin: Bản chất và tác hại .................................................... 7
1.1.3. Nguyên nhân và diễn biến khi ngộ độc .......................................................... 11
1.1.4. Tình hình ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn ở Việt Nam ................................. 13
1.2.

CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH VI KHUẨN

E. COLI O157:H7 ..................................................................................................... 14
1.2.1. Phƣơng pháp PCR dựa trên DNA .................................................................. 14
1.2.2. Kỹ thuật LAMP .............................................................................................. 18
1.2.3. Sử dụng kháng thể tái tổ hợp trong phát hiện E. coli O157:H7 ..................... 19
1.3.

KHÁNG THỂ ................................................................................................. 23

1.3.1. Mảnh kháng thể .............................................................................................. 25
1.3.2. Kháng thể tái tổ hợp ....................................................................................... 26

1.3.3. Kỹ thuật phage display ................................................................................... 27
1.3.4. Tình hình nghiên cứu sử dụng kháng thể ở Việt Nam ................................... 32
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 35
2.1.

Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 35

2.1.1. Sinh phẩm ....................................................................................................... 35

Footer Page 3 of 148.


Header Page 4 of 148.

iv

2.1.2. Hóa chất.......................................................................................................... 35
2.1.3. Các cặp mồi đƣợc sử dụng ............................................................................. 36
2.2.

Thiết bị ........................................................................................................... 36

2.3.

Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................ 37

2.3.1. P

ứu DNA ...................................................................... 37

2.3.2. Kỹ thuật bộc lộ trên thực khuẩn thể (phage display) ..................................... 43
ứu protein ................................................................... 45

2.3.3.

2.3.4. Phƣơng pháp phân tích và xử lý số liệu ......................................................... 51
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...................................... 52
: .................................................................................. 52
3.1. XÁC ĐỊNH VI KHUẨN E. COLI O157:H7 BẰNG KỸ THUẬT GEN ......... 52
3.1.1. Xác định chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 bằng kỹ thuật phân tích
gen mã hóa 16S rRNA .............................................................................................. 52
3.1.2. Sử dụng đoạn gen Stx1 và Stx2 để xác định E. coli O157:H7 ....................... 58
3.1.3. Sử dụng kỹ thuật LAMP xác định vi khuẩn E. coli O157:H7 ....................... 63
3.2.

NGHIÊN CỨU THU NHẬN KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU ĐỐI VỚI

VI KHUẨN E. COLI O157:H7 VÀ TÁCH DÒNG XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ
GEN MÃ HÓA KHÁNG THỂ ................................................................................. 69
3.2.1. Sàng lọc kháng thể từ thƣ viện Griffin.1 ........................................................ 70
3.2.2. Chọn dòng phage kháng thể đặc hiệu với vi khuẩn E. coli O157: H7 ........... 72
3.2.3. Nhân bản gen mã hóa kháng thể bằng PCR ................................................... 74
3.2.4. Giải trình tự gen mã hoá kháng thể ................................................................ 75
3.3. TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP ......... 79
3.3.1.

.................................................... 79

3.3.2. Thiết kế vector pET28a-TRX biểu hiện gen mã hóa kháng thể..................... 80

Footer Page 4 of 148.


Header Page 5 of 148.

v

3.3.3.

................................................................. 82

3.3.4.

ểu hiện gen mã hóa kháng thể ............................ 83

3.4.

TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA KHÁNG THỂ

TÁI TỔ HỢP ............................................................................................................ 85
3.4.1.

................................... 85

3.4.2.
pháp lai blot ............................................................................................................... 88
3.4.3. Kiểm tra hoạt tính của kháng thể tái tổ hợp bằng ELISA .............................. 90
3.4.4.

ạt nano .............. 91

................................................................................... 93

....................................................................................................... 94
......................................................................................... 95
PHỤ LỤC ................................................................................................................ 108

Footer Page 5 of 148.


iv

Header Page 6 of 148.

vi

THUẬT NGỮ VIẾT TẮT
STT
1
2

Ký hiệu
Amp
bp

3

CDC

4
5

6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35

36
37
38

CDR
Cfu
ddNTP
DNA
dNTP
E. coli
EDTA
EHEC
ELISA
EtBr
FDA
HRP
HC
HUS
IPTG
Kana
Kb
kDa
LAMP
LB
mAb
OD
PBS
PCR
PEG
rRNA

SDS
SDS-PAGE
STEC
TAE
TE
TEMED
v/p
VH
VL

Footer Page 6 of 148.

Tên đầy đủ
Ampicillin
Base pair
Centers for Disease Control and Prevention- Trung tâm Kiểm
soát và Phòng chống Dịch bệnh Mỹ
Complementarity Determining Region- Vùng quyết định tính bổ trợ
Colony forming unit
Dideoxynucleotide
Deoxyribonucleic Acid
Deoxynucleotide
Escherichia coli
Ethylene Diamine Tetra acetic Acid
Enterohaemorrhagic E. coli- E. coli gây xuất huyết ruột
Enzyme-linked immunosorbent assay
Ethidium Bromide
Food and Drug Administration
Horseradish peroxidase
Hemorrhagic Colitis- Viêm đại tràng xuất huyết

Hemolytic Uremic Syndrome- Hội chứng dung huyết và suy thận
Isopropyl--D-Thiogalactopyranoside
Kanamycin
Kilo base pair
Kilo Dalton
Loop-mediated Isothermal Amplification
Lauria Bertani
Monoclonal antibody- kháng thể đơn dòng
Optical Density
Phosphate buffer saline
Polymerase Chain Reaction
Polyethylene Glycol
Ribosomal RNA
Sodium Dodecyl Sulphate
SDS- Polyacrylamide gel electrophoresis
Shiga-like toxin producing Escherichia coli
Tris - Acetate – EDTA
Tris – EDTA
N, N, N’, N’- Tetramethyl ethylenediamine
Vòng/phút
Variable heavy - Vùng biến đổi chuỗi nặng
Variable light - Vùng biến đổi chuỗi nhẹ


Header Page 7 of 148.

Số hiệu
bảng
1.1

v
vii

Tên bảng
hông số hệ gen của vi khuẩn E. coli O157:H7

Trang
06

1.2

Đặc điểm của các mảnh kháng thể

26

2.1

Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

36

2.2

Thành phần phản ứng PCR

39

2.3

Thành phần phản ứng xử lý DNA bằng enzme giới hạn

40

2.4

Thành phần phản ứng nối ghép

40

2.5

Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng LAMP

42

2.6

Thành phần gel polyacrylamide

46

3.1

3.2

3.3

3.4

Footer Page 7 of 148.

Kết quả so sánh trình tự gen HQ658163 với các trình tự gen 16S
rRNA từ GenBank
Kết quả so sánh trình tự gen Stx1 với các trình tự gen Stx1 từ
GenBank
Kết quả so sánh trình tự gen Stx2 với các trình tự gen Stx2 từ
GenBank
Kết quả của phản ứng ELISA xác định độ nhạy của kháng thể tái
tổ hợp và kháng thể chuẩn

56

61

62

90


vi

Header Page 8 of 148.

viii

Số hiệu
hình
1.1

Hình ảnh vi khuẩn E. coli O157:H7 trên kính hiển vi điện tử

03

1.2

Hình ảnh vi khuẩn E. coli O157:H7 trên môi trƣờng có MUG

04

1.3

Bản đồ

05

1.4

Cấu trúc độc tố Shiga-like toxin

07

1.5

Nguyên lý gây chết tế bào của Shiga-like toxin

08

1.6

Nguyên lý gây bệnh của E. coli O157:H7

12

1.7

Cấu trúc chung của một số loại kháng thể

24

1.8

Sơ đồ cấu tạo của mảnh kháng thể đơn chuỗi

25

3.1

Sơ đồ bố trí thí nghiệm của luận án

52

3.2

Hình ảnh điện di tách DNA tổng số

3.3

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa 16S rRNA

53

3.4

Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả tách chiết DNA plasmid

54

3.5

Hình ảnh điện di kiểm tra DNA plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI

55

Tên hình

Trang

(genome) của vi khuẩn E. coli O157:H7

ẩn E. coli O157:H7

53

Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ giữa E. coli O157:H7 với chủng
khác đƣợc xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự gen 16S RNA của chủng
3.6

E. coli O157:H7 nghiên cứu (mã số HQ658163) và các chủng khác trên

57

Ngân hàng Gen Quốc tế
3.7

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen Stx1 và Stx2

58

3.8

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen Stx1 với cặp mồi vector pJET

59

3.9

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen Stx2 với cặp mồi vector pJET

60

3.10

Vị trí và trình tự cặp mồi FIP/BIP

64

3.11

Hình ảnh điện di tách chiết DNA tổng số

64

3.12

Hình ảnh điện di sản phẩm phản ứng LAMP

65

3.13

Hình ảnh điện di sản phẩm LAMP xác định hàm lƣợng DNA

66

3.14

Sản phẩm LAMP khi nhuộm

68

SYBR Green I

Khả năng gắn kết của hỗn hợp phage thu đƣợc sau mỗi vòng sàng lọc
3.15

với dòng tế bào E. coli O157:H7

71

Sơ đồ nguyên lý kỹ thuật ELISA dùng trong xác định ái lực của phage

3.16
3.17

Footer Page 8 of 148.

với E. coli O157:H7
Kết quả của phản ứng ELISA đánh giá ái lực của hỗn hợp phage vòng

72
73


Header Page 9 of 148.

ix
sàng lọc 5
Kết quả đánh giá ái lực của dòng phage 20 với tế bào E. coli O157:H7

3.18

74

và tế bào E. coli ATCC 25922

3.19

Kết quả điện di sản phẩm PCR của dòng 20 với cặp mồi LABF/LABR

75

3.20

Cấu trúc 3D kháng thể tái tổ hợp

77

3.21

Hình ảnh điện di sản phẩ

80

3.22

Thiết kế vector pET28a-TRX biểu hiện gen mã hóa kháng thể

81

-PAGE

3.23

82

3.24

kháng thể tái tổ hợp

83

3.25

Khảo sát nhiệt độ biểu hiện của kháng thể tái tổ hợp

84

Hình ảnh điệ
3.26

-

ủa kháng thể tái tổ
86

hợp
Hình ảnh kết quả điện di SDS-PAGE quá trình tinh sạch protein tái tổ

3.27

87

hợp bằng phƣơng pháp Hybrid
Hình ảnh điện di kết quả phản ứng Western blot của kháng thể tái tổ hợ

3.28

88

-tag
Hình ảnh kết quả phản ứng Dot blot của kháng thể tái tổ hợp với kháng

3.29
3.30

Footer Page 9 of 148.

89

thể chuẩn mã số AB75244 (Hãng Abcam).
Hình ảnh phức

kháng thể- silica bắt

tế bào E. coli O157:H7

91


Header Page 10 of 148.

1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ngộ độc thực phẩm xảy ra khi chúng ta sử dụng thức ăn, nƣớc uống không
đƣợc bảo quản đúng cách dẫn đến sản phẩm bị hƣ thối do nhiễm khuẩn hoặc hóa
chất độc hại... Các nghiên cứu gần đây đã xác định một trong những nguyên nhân
của nhiều trƣờng hợp ngộ độc thức ăn là do vi khuẩn E. coli.
E. coli thuộc nhóm vi khuẩn đƣờng ruột Enterobacteriaceae, có nhiều trong
tự nhiên, trong ruột của ngƣời và gia súc. Trong đƣờng ruột, chúng hiện diện chủ

yếu ở đại tràng nên còn đƣợc gọi là vi khuẩn đại tràng. E. coli nhiễm vào đất,
nƣớc… từ phân của động vật. Khi gặp điều kiện thuận lợi cho sự phát triển chúng sẽ
gây bệnh. Đa số các chủng E. coli là những chủng ít độc hại, tuy nhiên cũng có vài
chủng rất độc nhƣ chủng E. coli O157:H7 có thể tìm thấy trong ruột và trong phân
của các loài gia súc, đặc biệt là trong phân bò, chất thải của bò và các sản phẩm nhƣ
thịt bò, sữa bò chƣa khử trùng... [49].
Các bệnh có liên quan đến E. coli là tiêu chảy, viêm phổi, viêm đƣờng dẫn tiểu
và một số bệnh khác. Triệu chứng bị nhiễm trùng vi khuẩn thƣờng khác nhau, nhƣng
nhìn chung, bệnh nhân hay có các triệu chứng nhƣ: nôn, đau bụng, sốt, xuất huyết
dƣới da, tăng huyết áp, tiêu chảy thƣờng có máu... Đại đa số bệnh nhân phục hồi sau
5 đến 7 ngày. Vì vi khuẩn E. coli quá phổ biến, nên hàng năm trên khắp thế giới đều
có ngƣời mắc bệnh do vi khuẩn này. Các chuyên gia ƣớc tính rằng ở Mỹ mỗi năm có
khoảng 70 nghìn ngƣời mắc bệnh liên quan đến E. coli O157:H7 [106].
Ở Việt Nam, theo thống kê của Cục Vệ sinh An toàn Thực phẩm, năm 2010 có
175 vụ ngộ độc với 5664 ngƣời mắc, trong đó có 3978 ngƣời phải nhập viện và 51
ngƣời tử vong. Năm 2011 có 148 vụ ngộ độc, trong đó có 4700 ngƣời mắc với 3663
ngƣời phải nhập viện và 27 ngƣời tử vong. Năm 2012 có 168 vụ ngộ độc, trong đó có
5541 ngƣời mắc với 4335 ngƣời nhập viện và 34 ngƣời tử vong. Nhƣ vậy, trong ba
năm liên tiếp có 491 vụ ngộ độc với 112 ngƣời tử vong. Trong năm 2013 nƣớc ta xảy
ra nhiều vụ ngộ độc nghiêm trọng nhất là những tháng cuối năm. Số liệu thống kê
trong quý III năm 2013 cho thấy, trong 40 vụ ngộ độc thực phẩm thì 23 vụ do vi sinh
vật gây ra. Chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 đƣợc xác định lần đầu tiên ở Việt Nam

Footer Page 10 of 148.


Header Page 11 of 148.

2

vào năm 2005 [63], tiếp đó đã có những nghiên cứu về E. coli O157:H7 [7], [9], [92].
Trong các vụ dịch gây tiêu chảy ở nƣớc ta hiện chƣa tìm thấy sự hiện diện của chủng
E. coli O157:H7, tuy nhiên những vi khuẩn thuộc các nhóm khác gây ngộ độc và các
bệnh liên quan đã đƣợc phát hiện trong nhiều trƣờng hợp [35]. Trong sinh hoạt hàng
ngày, không ngoại trừ trƣờng hợp chúng ta bị nhiễm E. coli O157:H7 thông qua tiếp
xúc hay phơi nhiễm với phân ngƣời, động vật và gia cầm.
Việc xác định nhanh, chính xác sự có mặt của vi khuẩn E. coli O157:H7
trong các mẫu thực phẩm góp phần bảo vệ sức khỏe cho con ngƣời là cần thiết.
Việc sử dụng kháng thể kháng E.coli O157:H7, một trong những yếu tố quan trọng
để phát hiện E. coli O157:H7 vẫn còn chƣa đƣợc nghiên cứu. Chính vì vậy, chúng
tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng vi khuẩn
Escherichia coli O157:H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu các kỹ thuật phát hiện chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 và tạo
kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu với E. coli O157:H7.
3. Nội dung nghiên cứu
(i) Xác định chủng E. coli O157:H7 bằng các kỹ thuật di truyền: (1) Tách dòng
và xác định trình tự gen 16S rRNA; (2) Tách dòng và xác định trình tự gen
mã hóa cho các độc tố Stx1, Stx2 và (3) Kỹ thuật LAMP.
(ii) Tạo dòng gen mã hóa cho kháng thể đặc hiệu chủng vi khuẩn E. coli
O157:H7 bằng kỹ thuật phage display;
(iii) Thu nhận kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7;
(iv) Xác định độ nhạy, tính đặc hiệu của kháng thể tái tổ hợp.

Footer Page 11 of 148.


Header Page 12 of 148.

3

Chƣơng 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. VI KHUẨN E. COLI O157:H7
1.1.1. Đặc điểm chung của chủng vi khuẩn E. coli O157:H7
Vi khuẩn E. coli O157:H7 hiện diện một cách tự nhiên trong ruột ngƣời và
động vật, có thể đƣợc tìm thấy trong ruột và trong phân của các loài gia súc, đặc biệt
là trong phân bò... Thịt băm, thịt xay, thịt hamburger thƣờng có tỷ lệ nhiễm khuẩn
cao nhất, ngoài ra E. coli cũng còn có thể nhiễm vào nguồn nƣớc, rau xanh, trái cây,
giá sống, rƣợu táo, sữa và các loại nƣớc trái cây trong lon, trong hộp nếu chúng
không đƣợc hấp khử trùng trƣớc khi bán ra. Ở những ngƣời bình thƣờng, E. coli
O157:H7 gây rối loạn tiêu hóa nhƣ đau bụng, tiêu chảy, nôn, thân nhiệt có thể tăng
chút ít. Bình thƣờng bệnh tự khỏi sau 1 tuần hay 10 ngày. Bệnh có thể rất nặng ở trẻ
em, ngƣời cao tuổi và ở những ngƣời mà hệ miễn dịch đã bị suy yếu do bệnh tật. 35% trƣờng hợp có thể gây biến chứng sau vài ba tuần bị nhiễm bệnh. Độc tố Shigalike toxin của E. coli O157:H7 gây sung huyết, hủy hoại niêm mạc ruột, gây tiêu chảy
có máu, làm hƣ thận và đồng thời làm giảm lƣợng nƣớc tiểu. Đây là hội chứng xuất
huyết đƣờng ruột (Hemolytic Uremic Syndrome, HUS), rất nguy hiểm có thể gây tử
vong, hoặc phải lọc thận suốt đời [72].
Vị trí phân loại:
Giới :

Bacteria

Ngành(phylum): Proteobacteria
Lớp (class):

Gamma Proteobacteria

Bộ (ordo):

Enterobacteriales

Họ (familia):

Enterobacteriaceae

Chi (genus):

Escherichia

Loài (species):

E. coli

Chủng:

O157: H7

Hình 1.1. Hình ảnh vi khuẩn E. coli
O157:H7 trên kính hiển vi điện tử [104]

E. coli O157:H7 thuộc nhóm vi khuẩn đƣờng ruột Enterobacteriaceae, thuộc
loại trực khuẩn Gram âm, di động bằng tiêm mao quanh tế bào, không tạo bào tử, có
vỏ ngoài (capsule) và có lông bám (pili) (Hình 1.1). E. coli O157:H7 có cấu tạo đơn

Footer Page 12 of 148.


Header Page 13 of 148.

4

giản gồm bên ngoài là vách tế bào, tiếp theo là màng sinh chất, hai lớp màng này
liên kết chặt chẽ với nhau để bảo vệ tế bào. Bên trong lớp màng là tế bào chất, nơi
chứa các enzyme, đƣờng, ATP, và các phân tử khác [60], [64].
E. coli O157:H7 là vi sinh vật kị khí không bắt buộc, có khả năng hô hấp và
lên men, không sinh bào tử, tế bào tồn tại dạng đơn lẻ hoặc theo cặp đôi. Khoảng
nhiệt độ tồn tại của vi khuẩn này từ 7-50C, tối thích ở 37C, bị tiêu diệt ở nhiệt độ
trên 70C. E. coli O157:H7 sinh trƣởng đƣợc trên môi trƣờng có pH từ 4,4-9,0 và
có thể tồn tại đƣợc ở điều kiện pH 2,5 ở 37C trong 2-7 giờ, pH tối ƣu cho vi khuẩn
hoạt động là từ 6-7 [16]. Vi khuẩn bị ức chế trong môi trƣờng có nồng độ muối là
8,5%, chậm phát triển ở nồng độ muối trên 2,5%. E. coli O157:H7 sản sinh ra độc
tố gọi là Shiga-like toxin (hoặc Verocytoxin) do có sự giống nhau với độc tố gây
bệnh lị đƣợc tạo ra bởi Shigella dysenteria type 1, vi khuẩn này cũng gây ra hội
chứng xuất huyết đƣờng ruột (HUS) ở nhiều quốc gia trên thế giới. Có rất nhiều
chủng vi khuẩn E. coli cũng sản sinh Shiga-like toxin nhƣng E. coli O157:H7 là
chủng phổ biến nhất. Độc tố này đƣợc cho là yếu tố gây bệnh của vi khuẩn [33].

Hình 1.2. Hình ảnh vi khuẩn E. coli O157:H7 trên môi trƣờng có MUG [103].
Dƣới ánh sáng UV 365 nm, trên môi trƣờng có MUG vi khuẩn E. coli O157:H7
không phát quang, các chủng vi khuẩn E. coli khác phát quang.

E. coli O157:H7 không có khả năng lên men đƣờng sorbitol và cellobiose,
không tạo ra β-D-glucuronidase do đó không chuyển hóa 4-methylumbelliferyl-βD-glucuronide (MUG) thành 4- methylumbelliferone nên khi chiếu dƣới đèn UV
khuẩn lạc không phát huỳnh quang (Hình 1.2). Khi nuôi cấy trên môi trƣờng

Footer Page 13 of 148.

Header Page 14 of 148.

5

Fluorocult có bổ sung sorbitol và MUG do không có khả năng lên men đƣờng
sorbitol, khuẩn lạc có màu xanh nhạt phân biệt với các vi khuẩn E. coli khác khuẩn
lạc có màu vàng do lên men đƣợc đƣờng sorbitol. Đây là đặc điểm đƣợc sử dụng
trong xét nghiệm để phát hiện sự có mặt của vi khuẩn này [60].

Hình 1.3. Bản đồ hệ gen (genome) của vi khuẩn E. coli O157:H7 [105].

DNA của vi khuẩn E. coli O157:H7 gồm hệ gen vùng nhân có kích thƣớc
khoảng 5,5 triệu bp, gồm 5483 gen và 2 plasmid: plasmid lớn (pO157) có kích
thƣớc 9,3 kb và plasmid nhỏ (pOSAKI) kích thƣớc 3,3 kb, 7 chuỗi rRNA (16S, 23S,
5S); số chuỗi của tRNA và mRNA là 102 (Bảng 1.1). Tỷ lệ G+C là 50,5 %. Chủng
E. coli O157:H7 là loại vi khuẩn sinh độc tố, trong hệ gen vùng nhân chứa 2 gen mã
hóa cho độc tố đặc trƣng của vi khuẩn này là Stx1 và Stx2 [62], đƣợc sử dụng nhƣ là
những marker cho việc phân loại và phát hiện. Mặt khác các phƣơng pháp này cho
thấy các chủng là thể liên tục chứ không phải phân thành các chủng khác nhau.
Tên của vi khuẩn bắt nguồn từ 2 loại kháng nguyên quan trọng nhất của E.
coli là kháng nguyên O (Ohne- kháng nguyên soma) và kháng nguyên H (Hauchkháng nguyên lông) [33], ngoài ra còn có kháng nguyên K (capsular) và kháng
nguyên F (fimbriae). Kháng nguyên soma O đƣợc xác định bởi phần polysaccharide
của thành thế bào lipopolysaccharide, còn kháng nguyên H đƣợc xác định bởi

Footer Page 14 of 148.


Header Page 15 of 148.

6

protein roi. Có 174 kháng nguyên O (đánh số thứ tự từ 1- 181, trong đó không có
các số 31, 47, 67, 72, 93, 94 và 122) và 53 kháng nguyên H.
Bảng 1.1. Các thông số hệ gen của vi khuẩn E. coli O157:H7
Đặc điểm

Hệ gen

pO157

pOSAK1

Kích thƣớc (bp)

5498450

92721

3306

Tỉ lệ G+C (%)

50,5

47,6

43,4

Khung đọc mở (ORF):

5361

83

3

Vùng mã hóa protein (%)

88,1

82,5

52,8

Chiều dài trung bình của các ORF (bp)

904

922

579

7

0

0

103

0

0

rRNA (16S-23S-5S)
tRNA và mRNA

Khái niệm về type gây bệnh chỉ hữu ích cho việc nghiên cứu về tác nhân gây
bệnh, truyền bệnh và có thể có có ích trong thiết lập các quy trình chẩn đoán. Cách
phân loại nhƣ vậy cho thấy sự đa dạng giữa các chủng STEC (Shiga Toxin-Producing
E.coli). Nielsen tìm thấy 312 chủng STEC phân lập từ bệnh nhân ở Đan Mạch thuộc
50 nhóm O và 75 type O:H [64]. Phƣơng pháp phân loại dựa vào kháng nguyên O và
H là chủ yếu, tuy nhiên nhiều vi khuẩn E. coli đƣợc phân lập bao gồm cả một số
nhóm STEC chỉ có một kháng nguyên O hoặc một kháng nguyên H hoặc không có cả
hai trong hệ thống quốc tế, do đó không thể phân loại bằng type huyết thanh.
Do type huyết thanh O157:H7 có vai trò quan trọng đối với các bệnh ở
ngƣời, vì vậy thông thƣờng vi khuẩn STEC cũng có thể chia thành 2 type chính là
O157 và nonO157. Tuy nhiên nhiều type nonO157 nhƣ O104:H4 vẫn gây ra các
dịch ngộ độc thực phẩm và các bệnh liên quan [13]. Sự kết hợp giữa các type huyết
thanh với các mức độ gây bệnh khác nhau ở ngƣời dẫn tới việc đề xuất phân chia
nhóm STEC thành 5 type gây bệnh từ A tới E. Type gây bệnh A chứa nhóm
O157:H7 và O157:NM, đƣợc coi là nguy hiểm nhất. Type gây bệnh B chứa các type
O26:H11, O103:H2, O111:NM, O121:H19 và O145:NM giống với chủng STEC
O157 về nguyên nhân gây bệnh nhƣng tỷ lệ bùng phát thành dịch thì thấp hơn. Type
gây bệnh C bao gồm những type ít liên quan tới bệnh HUS, không tạo thành dịch

Footer Page 15 of 148.


Header Page 16 of 148.

7

nhƣ O91:H21 và O113:H21. Type gây bệnh D gồm một số type liên quan tới bệnh
tiêu chảy và type E gồm nhiều chủng STEC không gây bệnh ở ngƣời.
1.1.2. Độc tố Shiga-like toxin: Bản chất và tác hại
Theo CDC (Centers for Disease Control and Prevention-Trung tâm Kiểm
soát và Phòng chống Dịch bệnh Mỹ), E. coli O157:H7 là một trong bốn chủng vi
khuẩn gây bệnh tiêu chảy sau các chủng Campylobacter sp., Salmonella sp.và
Shigella sp. Bốn chủng này nằm trong nhóm độc tố Shiga toxin đƣợc sản xuất bởi
E. coli (shiga toxin-producing E.coli, STEC). Nhân tố gây bệnh chính của STEC là
prophage mã hóa cho độc tố Shiga. Độc tố này gây bệnh tiêu chảy và cả hội chứng
HC và HUS [86]. STEC sinh ra hai loại độc tố gọi là Shiga toxin 1 và Shiga toxin 2.
Các yếu tố gây độc khác bao gồm một protein màng ngoài gọi là intimin (protein
quan trọng giúp vi khuẩn tồn tại trong ruột) và enterhemolysin mã hóa bởi một
plasmid đƣợc gọi là pO157. Enterohemolysin góp phần gây độc bằng cách phân hủy
tế bào hồng cầu giúp tạo ra nguồn cung cấp sắt cho vi khuẩn.

Shiga- like toxin

Tiểu phần B

Hình 1.4. Cấu trúc độc tố Shiga-like toxin [104].

Độc tố Shiga toxin đƣợc xác định lần đầu tiên bởi Kiyoshi Shiga vào năm
1898 do vi khuẩn Shigella dysenteriae tiết ra. Vài năm sau ngƣời ta nhận thấy mối
liên quan giữa độc tố này với các bệnh tiêu chảy, hội chứng HUS và một số bệnh
khác. Độc tố Shiga toxin có hai họ là Shiga toxin I và Shiga toxin II đƣợc mã hóa
bởi 2 gen tƣơng ứng là Stx1 và Stx2. Hai độc tố này có thể phát hiện trong E. coli
O157:H7 và các type huyết thanh STEC độc lập hoặc cùng với nhau [15]. Loại độc

tố này không gây hại đối với động vật, nhƣng khi đƣợc vi khuẩn tiết ra trong ruột

Footer Page 16 of 148.


Header Page 17 of 148.

8

của ngƣời nó có thể gây xung huyết. Độc tố Shiga toxin là một protein có cấu trúc
A1B5, trọng lƣợng phân tử trên 70 kDa, bao gồm 1 tiểu phần A (32,225 kDa) và 5
tiểu phần B (mỗi tiểu phần có khối lƣợng 7,691 kDa) (Hình 1.4) [12], [28], [33].
Trong đó tiểu phần A chứa một mảnh A1 (27,5 kDa) có chứa các vị trí cắt của
enzyme và một mảnh A2 (7,5 kDa) đƣợc liên kết thông qua một cầu disulfide [40].
Tiểu phần A nằm trên một mặt phẳng tạo bởi 5 tiểu phần B, đầu C của tiểu phần A
đƣợc giữ ở vị trí trung tâm của 5 tiểu phần B.

Hình 1.5. Nguyên lý gây chết tế bào của Shiga-like toxin.

Tiểu phần A có vai trò nhƣ một enzyme N-glycosidase cắt một base adenine ở
vị trí 4324 của tiểu phần 28S rRNA thuộc ribosome 60S dẫn tới quá trình tổng hợp
protein trong tế bào nhiễm bệnh bị dừng lại. Đây là nguyên nhân chính dẫn đến quá
trình chết của tế bào do không tạo ra đƣợc các sản phẩm cần thiết cho quá trình sống
[27]. Tiểu phần B có vai trò đƣa độc tố vào trong tế bào chủ. Năm tiểu phần B có các
vị trí kết hợp với glycolipid trên bề mặt của tế bào đích, do vậy, năm tiểu phần này
tƣơng tự nhƣ cầu nối trung gian để tiểu phần A xâm nhập vào trong tế bào. Trong
trƣờng hợp không có tiểu phần A, tiểu phần B vẫn tạo cấu trúc pentamer có chức
năng tƣơng tự holotoxin trong quá trình liên kết với glycolipid trên bề mặt tế bào.
Thụ thể của độc tố Shiga-like toxin là glycolipid globotriaosylceramide (Gb3), Gb3

Footer Page 17 of 148.


Header Page 18 of 148.

9

có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của độc tố bởi tất cả các tế bào dễ bị
nhiễm Shiga-like toxin thì đều có Gb3 trên bề mặt tế bào, trong khi đó những tế bào
không có Gb3 trên bề mặt thì có khả năng kháng lại độc tố (Hình 1.5).
Năm 1977, Konowalchuk và cộng sự đã báo cáo rằng chủng gây bệnh E. coli
O26:H11 thuộc nhóm EPEC (Enteropathogenic E. coli- E. coli gây bệnh đƣờng ruột)
sản xuất một chất độc tác động trên tế bào Vero và đặt tên là Vero toxin [46]. O'Brien
và cộng sự (1987) cho rằng, độc tố Vero toxin mà Konowalchuk nghiên cứu rất giống
với độc tố Shiga toxin đƣợc sản xuất bởi Shigella dysenteriae type 1, và nó có thể bị
vô hiệu hóa bằng anti-Shiga toxin, do đó một tên mới đƣợc đƣa ra là Shiga-like toxin
[69]. Độc tố Vero toxin do Konowalchuk và cộng sự mô tả giống với độc tố Shiga
toxin về đặc điểm di truyền và protein. Do vậy, các tên Shiga-like toxin, Shiga toxin
và Vero toxin đƣợc sử dụng thay thế cho nhau, kết quả là tên các chủng VTEC
(verotoxin producing E. coli), SLTEC (Shiga-like toxin producing E. coli) và STEC
đều đƣợc sử dụng. Các bệnh nhƣ HC, HUS thƣờng gây ra bởi nhóm STEC hoặc
EHEC (Enterohemorrhagic Escherichia coli). Tất cả các chủng EHEC đều đƣợc cho
là gây bệnh, tuy nhiên không phải tất cả các chủng STEC đều gây bệnh HC hoặc
HUS. Nhóm vi khuẩn E. coli O157:H7 thuộc nhóm EHEC. Nếu xét về độc tố của nó,
E. coli O157:H7 phải thuộc về nhóm VTEC, SLEC hoặc STEC. Điều này có thể
đƣợc khẳng định khi cơ chế gây bệnh của vi khuẩn đƣợc mô tả đầy đủ.
Shiga-like toxin I
Shiga-like toxin I là một nhân tố độc lực của E. coli O157:H7 gây bệnh ở
ngƣời. Giống nhƣ các độc tố khác của họ Shiga toxin, nó bao gồm một tiểu phần
(A) có chức năng enzyme và năm bản sao của một tiểu đơn vị liên kết (Bpentamer). Shiga-like toxin 1 đƣợc mã hóa bởi gen Stx1. Các gen Stx1 có cấu trúc

bảo tồn cao giống với độc tố Shiga toxin do dysenteriae loại 1 tạo ra. Trƣớc đây,
gen Stx1 đƣợc biết chỉ có duy nhất một biến thể [53], ngày nay ngƣời ta biết thêm
một số biến thể khác của Stx1 là Stx1c [100] và Stx1d [17]. Biến thể Stx1c không
tìm thấy trong vi khuẩn STEC và không liên quan đến bệnh ở ngƣời.
Shiga toxin và Shiga-like toxin I đều là những thành viên trong họ độc tố
Shiga toxin. Chúng chỉ khác nhau ở một điểm (Ser45 và Thr45) trong tiểu phần A

Footer Page 18 of 148.


Header Page 19 of 148.

10

và tiểu phần B giống hệt nhau. Cấu trúc tinh thể 5 mặt pentamer tiểu phần B của
Shiga-like toxin và Shiga holotoxin đã đƣợc xác định, cả hai cấu trúc đều chứa cấu
trúc thụ cảm. Cấu trúc dự đoán của hai vị trí thụ cảm đã đƣợc xây dựng mô hình
dựa trên những đặc điểm bề mặt khác của các độc tố trong họ. Đã có báo cáo rằng
cấu trúc tinh thể của năm mặt Shiga-like toxin I B tạo phức hợp với cấu trúc tƣơng
tự Gb3. Cấu trúc này đã chỉ ra sự tồn tại của ba vị trí kết hợp với Gb3 của tiểu phần
B, một trong đó tƣơng ứng với vị trí đƣợc dự đoán trƣớc. Kết quả về cấu trúc của
Ling và cộng sự là nghiên cứu đầu tiên về sự tƣơng tác giữa độc tố và thụ thể của nó
(là vị trí trung gian nhận dạng tế bào đích) [50].
Độc tố Shiga-like toxin II
Độc tố Shiga-like toxin II trong E. coli O157:H7 do gen Stx2 mã hóa. Gen
Stx2 có nhiều biến thể nhƣ Stx2, Stx2b, Stx2c, Stx2d,... [44], nhƣng chỉ có biến thể
Stx2c đƣợc tìm thấy trong chủng E. coli O157:H7 [27]. Các biến thể Stx2 đƣợc phân
biệt với nhau nhờ các đặc điểm nhƣ hoạt tính sinh học, phản ứng miễn dịch, hoặc
thụ thể mà nó kết hợp. Do đặc tính kết hợp với thụ thể khác nhau dẫn đến khả năng
gây độc đối với từng tế bào khác nhau. Các nghiên cứu cho thấy chủng vi khuẩn

STEC tạo Stx2 (Stx2a, 2c và 2d) có liên quan chặt chẽ với hội chứng HUS hơn các
chủng vi khuẩn chỉ sinh ra Stx1 [29]. Shiga-like toxin II không giống hoàn toàn với
Shiga-like toxin I. Shiga-like toxin II có nhiều đặc tính sinh học giống với Shiga
toxin đặc biệt là trình tự nucleotide và protein, Shiga-like toxin II có cùng điểm
đẳng điện và độ bền nhiệt với Shiga toxin, cùng bị trung hòa bởi huyết thanh. Các
kỹ thuật giải trình tự nucleotide và so sánh amino acid cho thấy Shiga-like toxin I
và Shiga-like toxin II có tỷ lệ tƣơng đồng về gen là 99% và chỉ khác nhau một
amino acid trong tiểu phần “A”. Tuy nhiên Shiga-like toxin II lại có tính kháng
nguyên khác với Shiga-like toxin I bên cạnh đó Shiga-like toxin II không bị vô hiệu
bởi anti-Shiga-like toxin hoặc kháng thể kháng Shiga-like toxin I. Shiga-like toxin
II có nhiều trình tự và tính kháng nguyên đa dạng hơn Shiga-like toxin I [27], [33].
Shiga-like toxin 2 có liên quan với HUS. Stx1 và Stx2 có độc tính khác nhau
đối với từng loại tế bào. So với Shiga-like toxin 1, Shiga-like toxin 2 độc hơn gấp
1000 lần đối với tế bào nội mô mao mạch thận của ngƣời [11]. Siegler và cộng sự

Footer Page 19 of 148.


Header Page 20 of 148.

11

(2003) đã thử nghiệm và so sánh ảnh hƣởng của Shiga-like toxin 1 và Shiga-like
toxin 2 trên mô hình động vật linh trƣởng [85]. Siegler đã tiêm Shiga-like toxin 2
vào tĩnh mạch dẫn tới biểu hiện lâm sàng và bệnh đặc trƣng cho HUS, trong khi tiến
hành tƣơng tự đối với Shiga-like toxin 1 thì không thấy có sự phát triển bệnh. So
sánh cấu trúc tinh thể của Shiga-like toxin 2 và Shiga toxin cho thấy có 4 điểm cấu
trúc khác biệt lớn có thể giải thích cho sự liên quan giữa Shiga-like toxin 2 với
HUS. Sự khác biệt lớn nhất là do vị trí hoạt động của Shiga-like toxin 2, sự tăng
cƣờng khả năng gây độc có thể do tiểu đơn vị A của Shiga-like toxin 2 hình thành

cấu trúc xoắn 2 vòng sau khi đi qua vòng trung tâm cấu trúc pentamer của 5 tiểu
phần B. Một trong ba vị trí liên kết với thụ thể trong cấu trúc pentamer tiểu phần B
của Shiga-like toxin 2 có hình dạng khác so với các cấu trúc pentamer-B của Shigalike toxin. Vị trí đầu carboxyl đoạn A1 của Shiga-like toxin 2 liên kết với một vị trí
trong Shiga-like toxin 2 [27].
Shiga-like toxin 2 không chỉ gây độc tế bào đối với tế bào Vero và Hela, mà
còn gây độc trong ruột thỏ, gây chết do tê liệt trên chuột thí nghiệm. Tuy nhiên khi
phân tích các mẫu E. coli O157:H7 phân lập đƣợc từ các đợt dịch và những bệnh
nhân mắc HUS cho thấy rằng các chủng này không sản sinh một độc tố duy nhất mà
cùng sản xuất cả hai loại Shiga-like toxin. Nhƣ vậy có thể có một mối liên hệ giữa
cả hai loại độc tố này trong quá trình gây bệnh của vi khuẩn, tuy nhiên điều này vẫn
chƣa đƣợc làm sáng tỏ [20].
1.1.3. Nguyên nhân và diễn biến khi ngộ độc
Sau khi ăn hoặc uống thực phẩm nhiễm E. coli O157:H7, vi khuẩn cùng với
thức ăn qua thực quản, dạ dày, ruột non xuống ruột già của bệnh nhân. Tại đây, vi
khuẩn sẽ bám lên các gờ răng lƣợc của thành ruột, sinh sản, tiết ra độc tố phá hủy tế
bào niêm mạc ruột, xâm nhập vào các mạch máu bên dƣới thành ruột. Vì độc tố của
vi khuẩn làm tế bào niêm mạc ruột bị phá hủy nên thành ruột trở nên mỏng hơn, gây
ra xuất huyết ruột và đi ngoài ra máu. Khi độc tố của vi khuẩn đã vào trong các
mạch máu, nó sẽ gây ra sự ngƣng kết các tế bào tiểu cầu và fibrin tạo thành khối,
các khối tiểu cầu và fibrin này khi di chuyển trong lòng mạch sẽ gây cản trở tốc độ
di chuyển của các tế bào máu khác, làm tăng áp suất của máu lên thành mạch, trong

Footer Page 20 of 148.


Header Page 21 of 148.

12

thời gian dài sẽ làm tăng huyết áp của bệnh nhân (Hình 1.6). Mặt khác, các khối

ngƣng kết này chính là nguyên nhân gây ra HUS vì chúng làm nghẽn các mạch máu
nhỏ, khiến máu không đi hết đƣợc tới các tế bào làm giảm chức năng của các cơ
quan gây suy tạng đặc biệt là thận.

Hình 1.6. Nguyên lý gây bệnh của E. coli O157:H7.

Triệu chứng điển hình nhất khi bị nhiễm vi khuẩn E. coli O157:H7 là: tiêu
chảy, ói mửa, đau bụng quặn thắt, sốt nhẹ, mệt mỏi, đôi khi đi ngoài có máu. Tiếp
theo là một số vấn đề sức khỏe gồm các triệu chứng sau: (i) Viêm đại tràng xuất
huyết có triệu chứng là đau bụng, đi ngoài có thể đi ngoài ra máu. Viêm đại tràng
xuất huyết đƣợc coi là biểu thị đặc trƣng cho việc nhiễm E. coli O157:H7 hoặc là sự
phát triển của HUS. 38-61% trƣờng hợp nhiễm E. coli O157:H7 đều có triệu chứng
này. Thời kỳ ủ bệnh thƣờng từ 1-9 ngày trong các đợt dịch. Đối với trẻ em hiện
tƣợng tiêu chảy kéo dài lâu hơn (9,1 2 ngày) so với ngƣời trƣởng thành (6,6 1,1
ngày) và cuối cùng thƣờng là triệu chứng đi ngoài ra máu [16], [20]; (ii) Hội chứng
dung huyết suy thận (HUS) đƣợc đặc trƣng bởi các dấu hiệu nhƣ: thiếu máu do dung
huyết, tiểu cầu vón cục và suy thận, hội chứng này xuất hiện chủ yếu xuất hiện ở trẻ
dƣới 10 tuổi và ngƣời cao tuổi. Các triệu chứng đầu tiên của HUS là: ngƣời bệnh
xanh xao, thiếu máu, bí tiểu, phù và suy thận cấp, các triệu chứng này bắt đầu từ
khoảng một tuần sau khi nhiễm vi khuẩn. Một nửa bệnh nhân HUS phải lọc thận và tỉ
lệ tử vong của số bệnh nhân này là 3-5%. Một số biến chứng khác của HUS có thể
gồm tai biến, hôn mê, đột quỵ, tăng huyết áp, khoảng 15% trƣờng hợp bệnh nhân gặp
các biến chứng nhƣ trên sẽ bị suy thận mãn tính [16], [20]; (iii) Tử vong: các trƣờng

Footer Page 21 of 148.


Header Page 22 of 148.

13

hợp tử vong do E. coli O157:H7 thƣờng xảy ra với ngƣời cao tuổi với nguyên nhân
chủ yếu do tiêu chảy, HUS, xuất huyết, phát ban, sốt cao [20].
1.1.4. Tình hình ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn ở Việt Nam
Theo thống kê của của Bộ Y tế, từ năm 2004-2009 đã có 1.058 vụ ngộ độc
thực phẩm, trung bình 176,3 vụ/năm, số ngƣời bị ngộ độc thực phẩm là 5.302
ngƣời/năm, số ngƣời chết là 298 ngƣời (49,7 ngƣời/năm), tính trung bình tỷ lệ
ngƣời bị ngộ độc thực phẩm cấp tính là 7,1 ngƣời/100 nghìn dân/năm. Năm 2009 có
152 vụ ngộ độc thực phẩm với 5.212 ngƣời mắc và 31 ngƣời tử vong. So sánh với
năm 2008, số vụ ngộ độc/năm 2009 giảm 53 vụ (25,9%); số ngƣời mắc giảm 2.616
ngƣời (33,4%); số ngƣời đi viện giảm 1.888 ngƣời (31,3%); và số ngƣời bị tử vong
giảm 26 trƣờng hợp ( 42,6%). Về nguyên nhân ngộ độc thực phẩm, 29,6% số vụ do
thực phẩm bị ô nhiễm vi sinh vật, 5,2% số vụ do hóa chất, 24,7% do thực phẩm có
sẵn độc tố tự nhiên, 40,5% số vụ không xác định đƣợc nguyên nhân [102].
Trong năm 2013, ở nƣớc ta đã xảy ra nhiều vụ ngộ độc nghiêm trọng, trong
đó nguyên nhân chủ yếu là do vi khuẩn E. coli gây ra (thống kê trong quý III năm
2013 trong 40 vụ ngộ độc thực phẩm thì 23 vụ do vi sinh vật gây ra). Trong 5 ngày
(từ 23-28/5/2013) có 163 ngƣời ở Bến Tre nhập việ

. Kết quả kiểm nghiệm của Viện
ủa tiệm bánh mì

Pasteur TP HCM cho thấ
này nhƣ t

-

E. coli

. Ngày 4/10/2013 xảy ra vụ ngộ độc tại Công ty TNHH Một

thành viên Wondo Vina (trụ sở tại xã Long Bình Điền, huyện Chợ Gạo tỉnh Tiền
Giang) làm 1200 công nhân phải nhập viện. Nguyên nhân đƣợc xác định là do thức
ăn nhiễm vi khuẩn Salmonella. Ngày 16/10/2013 gần 400 ngƣời bị ngộ độc khi sử
dụng bánh mỳ ở Quảng Trị, trong đó 382 ngƣời phải nhập viện. Nguyên nhân cũng
đƣợc xác định do vi khuẩn Salmonella gây ra. Tiếp theo ngày 17/10/2013, 113 công
nhân ở Bình Dƣơng ngộ độc do ăn thịt bò, trong đó có 47 công nhân có triệu chứng
điển hình ngộ độc thực phẩm. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm đƣợc xác định
là do thịt bò xào thập cẩm bị nhiễm vi khuẩn lostridium perfringens. Trƣa 16/11 tại

Footer Page 22 of 148.


Header Page 23 of 148.

14

gia đình bà Lê Thị Thêm (Đông Châu, Thạch Văn, Thạch Hà, Hà Tĩnh), có hơn 58
ngƣời dân đa phần ở xã Thạch Văn bị ngộ độc thực phẩm, trong đó 43 ngƣời phải
chuyển vào Trạm Y tế xã nằm lại để thăm khám, trong đó có đến 15 ngƣời ở thể
nặng phải chuyển tiếp lên Bệnh viện Đa khoa tỉnh Hà Tĩnh cấp cứu, chăm sóc.
Ngay sau khi vụ ngộ độc xảy ra, Chi Cục Vệ sinh An toàn Thực phẩm tỉnh Hà Tĩnh
đã phối hợp với Trung tâm Y tế Dự phòng huyện Thạch Hà và Trạm Y tế xã Thạch
Văn tổ chức thực hiện điều tra để xác định nguyên nhân. Kết quả điều tra cho thấy
nguyên nhân ngộ độc là do nhiễm khuẩn.
Hàng năm trên cả nƣớc xảy ra nhiều vụ ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng,
tuy nhiên chƣa có vụ ngộ độc thực phẩm nào gây ra bởi E. coli O157:H7. Mặc dù
vậy, không thể loại trừ khả năng vi khuẩn này sẽ bùng phát thành dịch bệnh trên
diện rộng. Trong nhiều nghiên cứu [7], [9] các nhà nghiên cứu đã phát hiện đƣợc vi
khuẩn này nhiễm trong thịt lợn, thịt bò tại các cửa hàng tạp hóa. Do vậy, việc đƣa ra
các phƣơng pháp phát hiện,chẩn đoán nhanh và kháng thể đối với vi khuẩn E. coli

O157:H7 là có tính thiết thực.
1.2.

CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH VI KHUẨN E.
COLI O157:H7

1.2.1.

Phƣơng pháp PCR dựa trên DNA
Hiện nay, phƣơng pháp truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái, huyết

thanh vẫn đang là công cụ quan trọng trong phân loại vi khuẩn. Các phƣơng pháp
về hình thái học, huyết thanh học thƣờng đƣợc kết hợp với các phƣơng pháp nhuộm
(ví dụ nhƣ nhuộm Gram) thƣờng đƣợc sử dụng trong nhận dạng. Tuy nhiên, các
phƣơng pháp truyền thống này chƣa đủ để phân loại những loài gần nhau. Trong
một số trƣờng hợp, phân loại truyền thống gặp trở ngại do một số đặc tính dùng cho
nhóm vi sinh vật này nhƣng lại không có ý nghĩa với nhóm vi sinh vật khác. Điều
này dẫn đến nhiều trƣờng hợp phải xác định lại tên phân loại của một số vi sinh vật.
Mặt khác, đối với những loài có độ tƣơng đồng cao về mặt hình thái thì phân loại
truyền thống sẽ khó có thể đạt đƣợc hiệu quả. Nhƣợc điểm này của phân loại truyền
thống hoàn toàn có thể bổ sung nhờ phân loại học phân tử.

Footer Page 23 of 148.


Header Page 24 of 148.

15

Ngày nay, do những tiến bộ khoa học kĩ thuật trong sinh học phân tử, di

truyền học phân tử, phƣơng pháp phân loại vi khuẩn đã đƣợc bổ sung nguồn đặc
điểm phân loại theo genotype. Các kết quả nghiên cứu so sánh sinh hóa đã chứng
minh đƣợc rằng thành phần và trình tự nucleotide của DNA và rRNA, các loại gen
điều khiển trao đổi chất, thành phần và cấu tạo các bào quan là những bằng chứng
đáng tin cậy để xác định loài. Kết hợp với phƣơng pháp phân loại theo đặc điểm
hình thái (phenotype) thì phƣơng pháp phân loại dựa vào những phân tích, so sánh
trình tự gen đang đƣợc coi là công cụ để xác định vi khuẩn ở nhiều bậc định loại
loài. Đặc biệt phân tích trình tự của rRNA còn là phƣơng tiện để điều tra và định
danh những loài vi khuẩn không thể nuôi cấy trong môi trƣờng nhân tạo [3]. Hiện
nay, đại đa số các nhà khoa học đồng ý với quan niệm 2 chủng đƣợc coi là 2 loài
riêng biệt nếu chúng giống nhau dƣới 70% khi tiến hành lai DNA. Keswani và cộng
sự (2001) đã chứng minh rằng nếu sự tƣơng đồng giữa hai trình tự gen 16S rRNA
thấp hơn 98,6% thì xác suất để mức độ giống nhau trong phép lai DNA thấp hơn
70% sẽ là 99%. Vì thế giá trị tƣơng đồng 98,6% của trình tự gen 16S rRNA đƣợc
coi là ngƣỡng để phân biệt hai loài khác nhau. Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa
học lấy giá trị này là 98% [43].
Phân loại vi khuẩn theo phƣơng pháp sinh học phân tử là sự phát hiện, mô tả,
và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức độ phân tử giữa các loài và các chủng
trong phạm vi một loài. Có thể dựa trên sự nghiên cứu so sánh các gen trong hệ gen
nhân, hệ gen các bào quan (ty thể và lục lạp) hoặc các sản phẩm của gen (protein,
enzyme). Trong các bào quan, ribosome là bào quan có vai trò sản xuất protein từ
những phân tử mRNA. Về cấu tạo, ribosome gồm có protein và rRNA. rRNA của
ribosome thƣờng bảo thủ giữa các loài và là vùng ít bị biến đổi. Những gen này tiến
hóa chậm hơn so với các gen khác, do vậy, chúng đƣợc sử dụng nhƣ những công cụ
để phân loại. Các rRNA thƣờng giống nhau. Khác với các vi khuẩn, ribosome nhân
chuẩn (Eukaryotes) chứa 4 loại phân tử rRNA là: 5S, 5,8S, 18S và 28S. Đối với các
vi sinh vật nhân sơ (Prokaryotes), ribosome chỉ chứa 3 loại phân tử rRNA là: 5S,
16S và 23S. Trong đó, gen 16S rRNA mã hóa cho phân tử rRNA loại 16S đƣợc xem
là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại các vi sinh vật nhân sơ. Gen mã hóa
cho 5S rRNA có kích thƣớc khoảng 120 nucleotide, dễ đọc và so sánh trình tự,

Footer Page 24 of 148.


Header Page 25 of 148.

16

nhƣng lại không đủ để phân biệt một cách chi tiết giữa các chủng. Ngƣợc lại, gen
mã hóa cho 23S rRNA lại có kích thƣớc lớn, khoảng 3.000 nucleotide, gây khó
khăn cho việc tách dòng, đọc và so sánh trình tự. Do vậy, trong định danh vi khuẩn
thƣờng dựa vào trình tự của đoạn 16S rRNA. Gen 16S rRNA có kích thƣớc khoảng
1540 nucleotide [73], có nhiều ƣu điểm: (i) phổ biến trong tất cả các sinh vật
Prokaryotes; (ii) kích thƣớc và tính bảo thủ về chức năng của gen là kết quả của tỷ
lệ đột biến thấp trong suốt quá trình tiến hóa và (iii) vùng bảo thủ có thể đƣợc sử
dụng để thiết kế mồi trên các đơn vị phân loại, cũng nhƣ chín vùng siêu biến (V1V9) có thể đƣợc sử dụng hiệu quả để phân biệt giữa các đơn vị phân loại. Chính vì
thế nên gen 16S rRNA có thể đƣợc coi là một marker cho nghiên cứu phân loại
[54]. Thêm vào đó, trên gen 16S rRNA có chứa các vùng biến đổi (variable) và
vùng bán bảo tồn (semi-conserved) cho phép xác định tính đặc trƣng ở mức độ
chủng, loài [19]. Do vậy, gen 16S rRNA đã đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu kỹ
lƣỡng và đã thiết kế đƣợc rất nhiều cặp mồi để nhân đoạn gen này bằng kỹ thuật
PCR. Đây là một thuận lợi cho các nghiên cứu phân loại dựa trên các gen mã hóa
16S rRNA. Ngoài ra, ngƣời ta còn sử dụng vùng đệm giữa gen 16S rRNA và 23S
rRNA để nghiên cứu về tính đa dạng của prokaryotes [30]. Có nhiều kết quả nghiên
cứu sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện hoặc phân loại các loài vi khuẩn. Ví dụ gần
đây nhất, Mizrahi-Man (2013) cũng sử dụng trình tự ngắn gen 16S rRNA để phân
loại [54]. Theo Hoo và cộng sự, trong 7 năm (2001- 2007) sử dụng trình tự 16S
rRNA đã phát hiện đƣợc 215 loài mới trong đó có 29 loài mới. Tác giả cũng khẳng
định nên sử dụng các phƣơng pháp khác để bổ sung cho phƣơng pháp sử dụng gen
16S rRNA [99].

Bên cạnh các gen rRNA, các gen độc tố cũng đƣợc sử dụng trong phân loại
học phân tử. Các gen này thƣờng là những gen gây độc nằm trong các vi khuẩn gây
bệnh ở các loài. Ví dụ, đối với E. coli O157:H7 các gen độc tố thƣờng đƣợc sử dụng
nhƣ gen Stx1, Stx2, eae, ehxA, saa... Hầu hết các kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc sử
dụng để phát hiện và phân loại vi khuẩn đều là những phƣơng pháp hiện đại nhƣ
PCR, Real-time PCR, kỹ thuật LAMP...Mỗi phƣơng pháp có ƣu điểm và nhƣợc
điểm riêng phù hợp với từng đối tƣợng và các gen nghiên cứu. Việc sử dụng các
gen độc tố để phát hiện các vi khuẩn độc trong các mẫu nghiên cứu hoặc mẫu thực

Footer Page 25 of 148.