140610 báo cáo thực hành trypsin BHK21 ra chai rouxs

140610 – Báo cáo thực hành ra bình Rouxs tế bào BHK21 – Nhuận TT

BÁO CÁO TRƯỞNG BỘ MÔN HÓA SINH – MIỄN DỊCH
V/v Thực hành trypsin tế bào BHK-21 ra chai Rouxs
1.Mục đích:
Thành thạo các bước của quy trình trypsin tế bào BHK21 từ chai T75 ra chai
Rouxs.
2.Thời gian, địa điểm:
Thời gian: Ngày 10 tháng 6 năm 2014.
Địa điểm: Phòng tế bào bộ môn Hóa sinh – Miễn dịch
3.Người thực hiện
Người thực hiện: Trần Thị Nhuận.
Người hướng dẫn: Phạm Thị Nga.
4.Cách tiến hành
4.1.Nguyên vật liệu:
a.Tế bào:
Tế bào BHK21 được nuôi cấy ngày 140607, P18 và 140608, P18.
Tế bào đã phát triển, tỉ lệ bám đáy 100%.
b. Môi trường, hóa chất, sinh phẩm:
MEM1x:
Thành phần:
NaHCO3………………...2,2g
MEM bột……..................9,53g
Gentamycin……………..50µg
Nước cất vô trùng vừa đủ 1 lít.


140610 – Báo cáo thực hành ra bình Rouxs tế bào BHK21 – Nhuận TT

MEM 5%
Thành phần:

MEM1x……………….280ml
FBS…………………….14ml
FBS:
Thành phần:
PBS bột …………………..9,55 gam
Nước cất vô trùng vừa đủ …….1 lít
Trypsin – EDTA
10ml trypsin EDTA / ống ly tâm 15ml
Trypan blue 0,4%
c. Dụng cụ an toàn sinh học
Mũ, quần áo, khẩu trang, găng tay
Chai xịt cồn 700 .
d.Dụng cụ hấp, sấy:
STT

Vật liệu

Số lượng

1

Cốc đựng thủy tinh

01

2

Ống ly tâm 50ml

01

3

Chai Rouxs

03

4

Hộp type 5ml

01

5

Hộp type 200µl

01

6

Type thủy tinh10ml

05

7

Chai Rouxs

03

8

Hộp giâý lau

01

e.Máy móc, thiết bị
STT

Vật liệu

Số lượng


140610 – Báo cáo thực hành ra bình Rouxs tế bào BHK21 – Nhuận TT

1

Pipet 5ml

01

2

Pipet 100- 1000µl

01

3

Pipet điện

01

4

Cabinet

01

5

Máy ly tâm

01

6

Tủ ấm CO2

01

7

Tủ lạnh 40C

01

8

Tủ lạnh -200C

01

9

Buồng đếm tế bào

01

10

Kính hiển vi soi ngược

01

4.2.Các bước thực hiện
Bước 1: Chuẩn bị Cabinet và đưa môi trường về nhiệt độ phòng
Chuẩn bị Cabinet:
Vô trùng Cabinet trong 15 phút
Chuyển môi trường về nhiệt độ phòng:
Chuyển môi trường đang bảo quản trong tủ lạnh đưa ra ngoài để tan đông.
Bước 2: Quan sát tế bào
Mục đích: quan sát mức độ phát triển của tê bào, tỷ lệ tế bào bám đáy.
Cách tiến hành:
Quan sát hai chai T75 tế bào BHK21 trên kính hiển vi soi ngược về hình dạng
tế bào, mức độ phát triển, tỷ lệ tế bào bám đáy.
Tế bào BHK21 sau khi nuôi cấy 4 ngày thấy tế bào hình thuôn nhỏ, tỷ lệ bám
đáy 100%.

Bước 3: Loại bỏ môi trường đang nuôi:
Mục đích: loại bỏ tế bào chết
Cách tiến hành:


140610 – Báo cáo thực hành ra bình Rouxs tế bào BHK21 – Nhuận TT

Lắc nhẹ chai nuôi, lắc ngang chai
Dùng pipet 5ml hút bỏ môi trường.
Chú ý: Cho đầu type xuống dưới đáy chai, hút hết môi trường nuôi cấy.
Bước 4: Rửa PBSMục đích: loại bỏ tế bào chết, huyết thanh và môi trường còn sót lại.
Cách tiến hành:
Thêm vào chai nuôi 15ml PBS- vào mỗi chai nuôi T75.
Lắc ngang chai, hút bỏ PBS- .
Rửa tế bào 2 lần với PBS-.
Bước 5: Trypsin tế bào
Mục đích: tách tế bào ra khỏi đáy chai.
Cách tiến hành:
Dùng pipet hút 3ml Trypsin cho vào mặt chai không có tế bào, nghiêng chai nhẹ
nhàng để các tế bào đồng pha cùng tách nhau.
Quan sát tế bào sau khi trypsin dưới kính hiển vi nếu tế bào bắt đầu co tròn lại,
tách rời nhau thì tiến hành dừng trypsin.
Thời gian trypsin tế bào BHK21(140607, P18) chai 1 là 4 phút, chai 2 (140608,
P18) là 5 phút.
Chú ý:
Không được lắc chai nuôi TB.

Bước 6: Trung hòa trypsin
Mục đích: Dừng quá trình trypsin
Cách tiến hành:

140610 – Báo cáo thực hành ra bình Rouxs tế bào BHK21 – Nhuận TT

Vỗ mạnh chai hoặc đập chai nuôi để các tế bào tách nhau hoàn toàn (tránh làm
môi trường bắn lên thành bình).
Dùng pipet hút 7ml môi trường MEM10% cho vào mỗi chai T75 để trung hòa
trypsin.
Dùng pipet đảo đều môi trường, tưới đều lên mặt tế bào bám đáy, lắc đều nhiều
lần để bong hết các tế bào bám dính đáy chai.
Chuyển hết huyễn dịch vào ống fancol 50ml. Đậy nắp, Bao dán paraffin, lắc
nhẹ, đem ly tâm.
Bước 7: Ly tâm và đánh tan cặn
Mục đích: thu cặn tế bào
Cách tiến hành:
Cho ống fancol 50 ml chứa huyễn dịch tế bào đem ly tâm 700vòng/phút trong
10 phút.
Sau khi ly tâm xong, dùng pipet hút hết dung dịch ở phía trên, giữ lại cặn tế bào
Hút 20 ml môi trường MEM5% cho vào ống, dùng pipet đảo đều hoặc rà đáy
ống vào mặt cabinet để đánh tan hoàn toàn cặn tế bào.
Chú ý :
Khi hút dung dịch phía trên, không để đầu type chạm vào đáy ống có tế bào sẽ
hút lẫn cặn tế bào.
Bước 8: Đếm tế bào
Mục đích: xác định lượng tế bào có trong 1ml huyễn dịch

Cách tiến hành:
Pha loãng tế bào 10 lần với MEM10% : Hút 900µl môi trường MEM10% cho
vào ống eppendorf. Cho vào 100µl huyễn dịch tế bào vào trộn đều.
Pha loãng huyễn dịch tế bào với thuốc nhuộm trypan blue theo hệ số 2: cho vào

ống eppendorf 100µl huyễn dịch tế bào vừa pha loãng 10 lần với 100µl trypan blue.


140610 – Báo cáo thực hành ra bình Rouxs tế bào BHK21 – Nhuận TT

Dùng pipet hút 1 lượng huyễn dịch tế bào sau khi nhuộm nhỏ từ từ vào buồng
đếm tế bào.
Đếm sô tế bào trên buồng đếm:
Đếm tế bào ở 4 góc, trong mỗi góc có 16 ô vuông nhỏ, đếm số tế bào nằm trong
khung 16 ô vuông nhỏ.
Đếm từng tế bào riêng lẻ trong đám tế bào.
Đếm theo hình zic zắc.
Đếm các tế bào có kích thước tương đồng nhau.
Không đếm các tế bào chết bắt màu xanh, chỉ đếm các tế bào còn sống.
Ước lượng số tế bào trong 1ml:
số tế bào/1ml = (số tế bào đếm được trong 4góc/4 )x 2 x độ pha loãng tế bào x 104.
Kết quả:
Số tế bào BHK21 /1ml = (66/4) x2 x 105 = 3,3 . 106 cell.
Tổng số tế bào trong 20 ml huyễn dịch là: 66. 106 cell.
Mỗi chai Rouxs cho 18.106 cell để sau 3 ngày, tỷ lệ bám đáy là 100%.
Vậy số ml huyễn dịch tế bào cho vào mỗi chai Rouxs 18. 10 6 : 3,3 . 106 = 5,5
ml.
Bước 10: Ra chai nuôi
Mục đích: Tiếp tục nuôi tế bào, để tế bào nhân lên.
Cách tiến hành:
Hơ 3 miệng chai Rouxs trên ngọn lửa đèn cồn.
Dùng pipet điện hút 90ml MEM10% cho vào mỗi chai Rouxs.
Dùng pipet lấy 5,5ml huyễn dịch cho vào chai nuôi
Lắc nhẹ nhàng để tế bào được trải đều khắp mặt đáy chai nuôi.
Đậy nắp cao su (không đóng chặt nắp chai) và giấy bạc, chuyển vào tủ ấm CO2.

Bước 11: Vệ sinh cabinet sau khi sử dụng
Thu dọn rác, Chuyển các dụng cụ vừa thao tác ra khỏi cabinet
Dùng giấy lau xịt cồn lau sạch Cabinet


140610 – Báo cáo thực hành ra bình Rouxs tế bào BHK21 – Nhuận TT

Đóng cửa Cabinet, bật UV trong 30 phút
Bước 12: Theo dõi sự phát triển của tế bào
Nuôi tế bào ở tủ ấm 370C, 5% CO2
Hằng ngày quan sát tế bào phát triển ở đáy chai nuôi trên kính hiển vi soi
ngược.
5. Nhận xét:
Đã nắm được các thao tác trypsin tế bào từ chai T75 ra chai Rouxs.
Thao tác mật độ ra các chai Rouxs còn chưa đều, chai 3 ra mật độ thấp do pipet
hút không đủ lượng tế bào.
Nắp nút cao su còn chặt làm môi trường trở nên kiềm tính.--> Khắc phục: Mang
chai Rouxs vào trong Cabinet đã được vô trùng 30 phút, tiến hành nới lỏng nắp chai
Thao tác cầm chai cho vào tủ ấm 5%CO2 không chú ý làm rơi rớt môi trường
ra miệng chai, ra nắp giấy bạc.

Bảng theo dõi tế bào BHK21 nuôi ở chai Rouxs (1400610,BHK-21, P19)
Ngày
theo
dõi

Thao tác Mật độ Thời
ra chai
gian
nuôi

Tỉ lệ tế Tỷ lệ Hình
bào
tế bào bào
bám
chết
đáy

thái

tế Màu môi
trường


140610 – Báo cáo thực hành ra bình Rouxs tế bào BHK21 – Nhuận TT

10/06/
2014

Trypsin 18.106
ra 3 chai cell/chai
Rouxs

11/06/
2014

Quan
sát
tế
bào

15h

12/06/
2014

Quan
sát
tế
bào

39h

13/06/
2014

Quan
sát
tế
bào

63h

Môi
trường đỏ
hồng tím,
trong
Chai 1, 1-2%
chai 2 :
3540%,

Chai 3:
20%
Chai 1, 1-2%
Chai 2:
6070%.
Chai 3:
40%
Chai 1, 1-2%
Chai 2:
9095%.
Chai 3:
5060%

Tế bào hình Môi
ngắn, nhiều tế trường đỏ
bào chết
hồng tím,
trong
Tế bào hình
thuôn
dài,
mượt, Chai 1
có 1 cụm tập
trung nhiều tế
bào.
Tế bào hình
thuôn
dài,
mượt, chai 1 có
1 cụm tập

trung nhiều tế
bào.

Môi
trường đỏ
hồng,
trong.
Môi
trường đỏ
hồng,
trong

Hà Nội, ngày 14 tháng 06 năm 2014
Người thực hiện
Trần Thị Nhuận