Nghiên cứu xác định đột biến gen CYP11B1 ở bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt 11betahydroxylase

VIỆN HÀN LÂM VÀ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN
GEN CYP11B1 Ở BỆNH NHÂN
TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH
DO THIẾU HỤT 11 BETA HYDROXYLASE

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2018


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN
GEN CYP11B1 Ở BỆNH NHÂN
TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH
DO THIẾU HỤT 11 BETA HYDROXYLASE
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 9 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Huy Hoàng
2. PGS.TS. Nông Văn Hải

Hà Nội - 2018


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành và chia sẻ tới
các bệnh nhân và gia đình họ. Đó là những người đang ngày đêm phải chống
chọi với bệnh tật. Họ là động lực giúp tôi luôn có khát khao được giúp đỡ,
được sẻ chia và phấn đấu trong nghiên cứu khoa học.
Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. TS.
Nguyễn Huy Hoàng và PGS. TS. Nông Văn Hải, là những người thầy hướng
dẫn khoa học, đã tận tình truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm vô cùng
quý báu để tôi có thể hoàn thành được luận án này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Công nghệ sinh học; ThS. Bùi Thị Hải
Hà - phụ trách đào tạo Viện Công nghệ sinh học; Viện Nghiên cứu hệ gen,
Phòng nghiên cứu hệ gen học chức năng- Viện Nghiên cứu hệ gen, đã giúp
đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành nghiên cứu thí nghiệm. Tôi
xin gửi lời cảm ơn tới GS. Rita Bernhardt, bộ môn Hóa sinh, trường ĐHTH
Saarlandes, CHLB Đức đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tôi
tiến hành thí nghiệm.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Giám đốc, các phòng ban
chức năng Bệnh viện Nhi trung ương, Khoa Nội tiết-Chuyển hoá-Di truyền và
Khoa Di truyền và Sinh học phân tử, Bệnh viện Nhi trung ương, cùng toàn thể
các đồng nghiệp trong khoa, là nơi tôi công tác, đã đồng hành và chia sẻ,
giúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành luận án.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. BS. Vũ Chí Dũng, trưởng
khoa Nội tiết-Chuyển hóa-Di truyền và TS. BS. Ngô Diễm Ngọc, trưởng khoa
Di truyền và Sinh học phân tử đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện và chia sẻ những

kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành luận án.

i


Tôi xin được bày tỏ sự kính trọng, tình yêu thương vô bờ bến đối với bố
mẹ, gia đình, Minh Anh và bạn bè tôi, đã ủng hộ và cổ vũ cho tôi trong suốt
thời gian học tập và làm việc.
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn và tình yêu thương sâu sắc tới chồng
tôi, BS. Đào Trung Dũng và hai con gái, Phương Linh-Minh Châu. Tình yêu,
sự chia sẻ, ủng hộ và những hy sinh thầm lặng của họ là chỗ dựa vững chắc,
giúp tôi thêm nghị lực để hoàn thành luận án này.
Lời cuối cùng, tôi xin dành tặng tới Người. Người đã cho tôi thấy tôi là
ai, con đường tôi đang đi và sẽ đi, để tôi thấy trong tôi luôn có một tình yêu
thương vô điều kiện và nhiệt huyết trong cuộc sống và công việc.
Hà Nội, ngày tháng năm 2018
Nguyễn Thị Phương Mai

ii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng
tác với các cộng sự khác.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một
phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự
đồng ý và cho phép của các đồng tác giả.
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày tháng năm 2018
Tác giả

Nguyễn Thị Phương Mai

iii


MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU……………………………………………………………...

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………….....

4

1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase………..

4

1.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới……………………….

4

1.1.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam……………………...

6

1.1.3. Dịch tễ học bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase……………

7

1.2. Định nghĩa, cơ sở hóa sinh và sinh lý bệnh học của TSTTBS
do thiếu hụt 11β-hydroxylase………………………………….

12

1.2.1. Định nghĩa TSTTBS và các enzyme tham gia tổng hợp
cortisol……………………………………………………

12

1.2.2. Cơ sở hóa sinh của bệnh TSTTBS……………………….

13

1.2.3. Sinh lý bệnh TSTTBS do thiếu 11β-hydroxylase……….

15

1.3. Di truyền phân tử của bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase…….

16

1.3.1. Gen CYP11B1…………………………………………………

16

1.3.2. 11β-hydroxylase…………………………………………

18

1.4. Đặc điểm lâm sàng bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase………...

22

1.4.1. Thể cổ điển………………………………………………

22

1.4.2. Thể không cổ điển……………………………………….

26

1.4.3. Người mang gen/dị hợp tử……………………………….

27

1.4.4. Một số các đặc điểm lâm sàng khác……………………..

27

1.5. Điều trị bệnh thiếu hụt 11 β hydroxylase…………………….

34

1.5.1. Liệu pháp thay thế glucocorticoid……………………….

34

1.5.2. Điều trị hạ huyết áp………………………………………

35

1.5.3. Chẩn đoán và điều trị trước sinh…………………………

35

1.6. Các phương pháp phân tích đột biến gen CYP11B1…………

36

1.6.1. Phương pháp giải trình tự gen CYP11B1………………...

36

1.6.2. Phương pháp phân tích sự ảnh hưởng của đột biến mới
iv


tới cấu trúc và chức năng của enzyme CYP11B1………..

37

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

39

2.1. Đối tượng nghiên cứu…………………………………………..

39

2.1.1. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân………………………………

39

2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ………………………………………..

40

2.2. Đạo đức trong nghiên cứu……………………………………...

40

2.3. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu………………………………..

41

2.3.1. Hóa chất nghiên cứu……………………………………...

41

2.3.2. Thiết bị nghiên cứu……………………………………….

41

2.4. Phương pháp nghiên cứu………………………………………

43

2.4.1. Quy trình thu thập và tách chiết mẫu nghiên cứu………..

45

2.4.2. Phương pháp giải trình tự gen CYP11B1…………………...

46

2.4.3. Phương pháp phân tích đột biến mới……………………..

47

2.4.4. Các phương pháp tin sinh học…………………………….

52

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…………………………..

54

3.1. Kết quả xác định đột biến gen CYP11B1……………………......

54

3.1.1. Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu…………………..

54

3.1.2. Kết quả khuếch đại gen CYP11B1………………………..

54

3.1.3. Kết quả xác định đột biến gen CYP11B1…………………

56

3.1.4. Mối tương quan kiểu gen- kiểu hình các đột biến mới…...

58

3.1.5. Mối tương quan kiểu gen p.R43Q- kiểu hình…………….

68

3.2. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các đột biến mới trên gen
CYP11B1 tới hoạt tính enzyme CYP11B1……………………

73

3.2.1. Đột biến p.R51K………………………………………….

73

3.2.2. Đột biến p.E147D-p.N152K……………………………...

75

3.3. Phân tích sự ảnh hưởng của đột biến mới trên gen CYP11B1

tới cấu trúc enzyme CYP11B1………………………………..

77

3.3.1. Kết quả mô hình cấu trúc 3 chiều của enzyme CYP11B1..

77

3.3.2. Ảnh hưởng của đột biến mới tới cấu trúc của enzyme
CYP11B1………………………………………………….
v

80


3.3.3. Đột biến vùng trượt gen IVS6+5G>T…………………….

83

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ………………………………

84

4.1. Các đột biến phát hiện trên gen CYP11B1 ở các bệnh nhân
nghiên cứu………………………………………………………

84

4.2. Sự ảnh hưởng của các đột biến mới tới hoạt tính enzyme
CYP11B1………………………………………………………..

88

4.2.1. Đột biến p.R51K………………………………………….

88

4.2.2. Đột biến p.E147D/p.N152K……………………………...

89

4.2.3. Đột biến Y395X…………………………………………..

91

4.3. Sự ảnh hưởng của các đột biến mới tới cấu trúc enzyme
CYP11B1………………………………………………………..

92

4.3.1. Đột biến thay thế axit amin……………………………….

93

4.3.2. Đột biến vùng trượt gen…………………………………..

98

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………….

104

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ
NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN…………………………..

106

TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH………………………

107

TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………

115

PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Danh sách các bệnh nhân nghiên cứu……………………..

1

Phụ lục 2. Mẫu bệnh án nghiên cứu…………………………………..

3

Phụ lục 3. Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch các mẫu DNA tách từ
máu ngoại vi của các bệnh nhân…………………………..

6

Phụ lục 4. Kiểu gen và kiểu hình bệnh nhân nghiên cứu……………..

7

vi


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

11βOH

11β-hydroxylase, enzyme
CYP11B1, 11-beta-hydroxylase

11βOHD

11β-hydroxylase deficiency

Thiếu hụt 11β-hydroxylase

17-CS

17-cetosteroid

17-OH

17-hydroxyl

17-OHCS

17-hydroxycorticosteroid

17-OHP

17-hydroxyprogesterone

21OH

21-hydroxylase

21OHD

21-hydroxylase deficiency

Thiếu hụt 21-hydroxylase

3D

3 Dimension

Ba chiều

ACTH

Adrenocorticotrophin hormone

Hormone kích thích vỏ
thượng thận

AD

Andreostenedione

Cl

Cloride

CMO

corticosterone methyloxidase

CMO I

Corticosterone

CMO II

18-hydroxycorticosterone

CRH

corticotropin releasing hormone

Hormone giải phóng
corticotropin

CVS

chorionic villus sampling

CYP

Cytochrome P450

DHEA

Dehydroepiandrosterone

DHEAS

DHEA sulfate

DMEM

Dulbecco’s modified Eagle’s
medium
vii

Gai rau


DMSO

Dimethysulfoxide

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTPs

Deoxy-NTPs

DOC

11-Deoxycorticosterone

E.Coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylenedinitrilotetraacetic acid

F

Cortisol

FBS

Fetal Bonvine serum

ffDNA

Fetal free-DNA

DNA thai nhi lưu hành tự do
trong máu mẹ

FSH

Follicle stimulating hormone

Hormone kích thích nang
trứng

GC-MS

Gas chromatography-mass
spectrometry

HGMD

Human gene mutations database

Dữ liệu đột biến gene người

Hc11B1

Human CYP11B1

Trình tự CYP11B1 ở người

Hc11B2

Human CYP11B2

Trình tự CYP11B2 ở người

HPTLC

High performance thin layer

Sắc ký lớp mỏng cao áp

chromatography
K

Kali

LDL

Low-density lipoprotein

LH

Luteinizing hormone

MaxENT

Maximum entropy model

MDD

Maximum dependence

Lipoprotein phân tử thấp

decomposition model
MM

Salt wasting

Mất muối

Na

Natri

NADPH

Nicotinamide adenine dinucleotide
viii


phosphate
NC

Non-classic

Thể không cổ điển

NHĐT

Simple virilization

Nam hoá đơn thuần

Pc11B1

Pig CYP11B1

Trình tự CYP11B1 ở lợn

POR

P450 oxidoreductase

PWM

Position weight matrix

Rc11B1

Rat CYP11B1

Trình tự CYP11B1 ở chuột

Rc11B2

Rat CYP11B2

Trình tự CYP11B2 ở chuột

RNA

Ribonucleic acid

S

11-deoxycortisol

SCRs

Structurally conserved regions

SDS

Sodium dodecylsulfate

SRS

Subtrate recognition site

Vùng nhận biết cơ chất

StAR

Steroidogenic acute regulatory

Protein điều hòa sản xuất

protein

steroid cấp tính

T

Testosterone

TART

Testicular adrenal rest tumors

Vùng bảo thủ

U tinh hoàn xuất phát từ tế

bào có nguồn gốc thượng
thận
Taq

Thermus aquaticus

TEMED

N,N,N’,N’tetramethylethylenediaminel

THS

Tetrahydro-11-decortisol

TSTTBS

Congenital adrenal hyperplasia

Tăng sản thượng thận bẩm

(CAH)

sinh

WT

Wild type

ix


DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1.

Các thể bệnh TSTTBS và thiếu hụt tổng hợp cortisol do thiếu
enzyme vỏ thượng thận……………………………………….

Bảng 1.2.

Phân loại các đột biến trên gen CYP11B1 dựa trên các nghiên
cứu in-vitro……………………………………………………

Bảng 1.3.

8
19

Các triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm hoá sinh và đặc điểm di
truyền của các bệnh liên quan tới thiếu hụt isozyme 11βhydroxylase……………………………………………………

33

Bảng 2.1.

Trình tự đoạn Oligonucleotides………………………………

42

Bảng 2.2.

Thành phần dung dịch đệm RF1, RF2……………………….

48

Bảng 2.3.

Thành phần gel tách/gel cô polyacrilamide…………………..

50

Bảng 3.1.

Kiểu đột biến gen CYP11B1 phát hiện trên các bệnh nhân
nghiên cứu…………………………………………………….

56

Bảng 3.2.

Kiểu gen- kiểu hình của các bệnh nhân có đột biến mới……..

57

Bảng 3.3.

Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-010…………

59

Bảng 3.4.

Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-011…………

62

Bảng 3.5.

Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-006 và MS.
CYP11B1-008………………………………………………..

64

Bảng 3.6.

Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-004…………

67

Bảng 3.7.

Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-012…………

69

Bảng 3.8.

Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-005…………

71

Bảng 3.9.

Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-002…………

73

Bảng 4.1.

Một số đột biến thay thế amino acid trên gen CYP11B1 dẫn
đến sự ảnh hưởng hoạt tính 11β-hydroxylase trong tế bào
động vật…………………………………………...................

97

Bảng 4.2.

Đột biến trượt gen đã được phát hiện trên gen CYP11B1…..

98

Bảng 4.3.

Chỉ số đánh giá trượt gen của các đột biến vùng splicing đã
được phát hiện trên gen CYP11B1…………………………..

x

101


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Trang
Hình 1.1.

Con đường tổng hợp hormone steroid từ cholesterol của vỏ
thượng thận……………………………………………..

14

Hình 1.2.

Các phản ứng xúc tác bởi enzyme CYP11B1………………

15

Hình 1.3.

Vị trí gen CYP11B1 và gen CYP11B2 trên NST số 8………

17

Hình 2.1.

Sơ đồ nghiên cứu…………………………………………...

44

Hình 2.2.

Sơ đồ nhân đoạn gen CYP11B1…………………………….

46

Hình 2.3.

Cấu trúc của vector pSVL………………………………….

47

Hình 3.1.

Phân loại kiểu hình các bệnh nhân nghiên cứu…………….

54

Hình 3.2.

Sản phẩm PCR khuếch đại gen CYP11B1….........................

55

Hình 3.3.

Phân bố các đột biến trên gen CYP11B1 trong nghiên cứu...

56

Hình 3.4.

Đột biến p.R51K ở bệnh nhân MS. CYP11B1-010………..

58

Hình 3.5.

Bệnh nhân MS.CYP11B1-010……………………………

59

Hình 3.6.

Đột biến p.E147D và p.N152K ở bệnh nhân MS.
CYP11B1-011………………………………………………

60

Hình 3.7.

Bệnh nhân MS. CYP11B1-011……………………………..

61

Hình 3.8.

Đột biến IVS6+5G>T bệnh nhân MS. CYP11B1-006……..

63

Hình 3.9.

Bệnh nhân MS. CYP11B1-006…………………………….

64

Hình 3.10.

Đột biến IVS6+5G>T ở bệnh nhân MS. CYP11B1-008…...

65

Hình 3.11.

Đột biến p.Y395X bệnh nhân MS. CYP11B1-004…………

66

Hình 3.12.

Bệnh nhân MS. CYP11B1-004……………………………..

67

Hình 3.13.

Kiểu hình các bệnh nhân có đột biến dị hợp tử p.R43Q……

68

Hình 3.14

Bệnh nhân MS. CYP11B1-012……………………………..

70

Hình 3.15.

Bệnh nhân MS. CYP11B1-005……………………………..

71

Hình 3.16.

Bệnh nhân MS. CYP11B1-002……………………………..

72

Hình 3.17.

Đột biến p.R51K biểu hiện trong tế bào động vật COS-1….

74

xi


Hình 3.18.

Phân tích hoạt tính của 11-hydroxylase có đột biến p.R51K
ở tế bào động vật COS-1……………………………………

Hình 3.19.

Đột biến p.E147D và p.N125K biểu hiện trong tế bào động
vật COS-1…………………………………………………..

Hình 3.20.

74

75

Phân tích hoạt tính của 11β-hydroxylase có đột biến
p.E147D và p.N152K ở tế bào động vật COS-1……………

76

Hình 3.21A. So sánh trình tự axit amin CYP11B1 và CYP11B2 của
người, bò, chuột, lợn và bằng chương trình CLUSTALW1..

77

Hình 3.21B. So sánh trình tự axit amin CYP11B1 và CYP11B2 của
người, bò, chuột, lợn và bằng chương trình CLUSTALW1..

78

Hình 3.21C. So sánh trình tự axit amin CYP11B1 và CYP11B2 của
người, bò, chuột, lợn và bằng chương trình CLUSTALW1..

79

Hình 3.21D. So sánh trình tự axit amin CYP11B1 và CYP11B2 của
người, bò, chuột, lợn và bằng chương trình CLUSTALW1..

80

Hình 3.22.

Mô hình cấu trúc 3D của đột biến p.R51K…………………

81

Hình 3.23.

Mô hình cấu trúc 3D của đột biến p.E147D………………..

82

Hình 3.24.

Mô hình cấu trúc 3D của đột biến p.N152K……………….

83

Hình 4.1.

Vị trí đột biến p.R43Q trên mô hình protein CYP11B1……

85

Hình 4.2.

Vị trí các đột biến trên gen CYP11B1 đã được công bố trên
thế giới……………………………………………………...

Hình 4.3.

Hình 4.4.

86

Mô hình cấu trúc không gian của enzyme CYP11B1 và vị
trí các đột biến được phát hiện trong nghiên cứu…………...

94

Mô hình cấu trúc 3D CYP11B1 ở người…………………...

95

xii


1

MỞ ĐẦU
Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) là một nhóm các bệnh di
truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường do sự khiếm khuyết một phần hoặc hoàn
toàn của một trong số các enzyme tham gia tổng hợp cortisol từ cholesterol ở
tuyến thượng thận. Đặc điểm lâm sàng và hoá sinh của bệnh phụ thuộc vào
khiếm khuyết enzyme đặc hiệu (Speiser và cs, 2010). Những nghiên cứu đầu
tiên về bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh được nhà giải phẫu học người
Italy, Luigi Crecchio, đưa ra vào cuối thế kỉ XIX khi ông phát hiện ra những
biểu hiện nam hóa ở những bệnh nhân nữ mà ông tiến hành phẫu thuật (Delle
Piane và cs, 2015). Những bệnh nhân đó không có đường cong ở nữ giới, có
râu, cơ bắp phát triển, âm vật bị biến đổi tuy nhiên họ vẫn có âm đạo, tử cung,
ống dẫn trứng và buồng trứng bình thường. Vào giữa thế kỉ XX, nhiều nghiên
cứu về hormone tuyến thượng thận trong cơ thể người đã được tiến hành và
thuật ngữ “tăng sản thượng thận bẩm sinh” (Congenital Adrenal Hyperplasia CAH) đã ra đời để giảm đi sự mơ hồ về bệnh này và nhấn mạnh những biến
đổi sinh lý do bệnh gây ra.
Khoảng 90-95% các trường hợp mắc TSTTBS là do thiếu hụt 21hydroxylase; 5-8% trường hợp TSTTBS bắt nguồn từ sự suy giảm 11βhydroxylase (Zachmann và cs, 1983). Còn lại là các trường hợp TSTTBS do
sự suy giảm các enzyme hiếm gặp khác như 17- hydroxylase (17-OH), 3βhydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD) và 20/22 Desmolase. Bệnh
TSTTBS với các dấu hiệu suy thượng thận cấp có thể dẫn đến tử vong ở thể
mất muối hay trẻ có các biểu hiện nam tính hoá ở trẻ gái, giả dậy thì sớm ở trẻ
trai gây ảnh hưởng nặng nề đến sự phát triển chiều cao, chức năng sinh dục,
sinh sản và tâm lý (Arlt và Krone, 2007, Merke và Bornstein, 2005, Ogilvie

và cs, 2006, White và Speiser, 2000).


2

TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase là bệnh hiếm gặp di truyền lặn
trên nhiễm sắc thể thường. Bệnh do sự thiếu hụt hoặc mất hoàn toàn hoạt tính
của enzyme 11β-hydroxylase (CYP11B1) dẫn đến sự thiếu hụt các hormone
tuyến thượng thận. Đặc điểm lâm sàng phổ biến nhất của hội chứng thiếu hụt
11β-hydroxylase là bất thường bộ phận sinh dục ngoài, tăng nhanh sự phát
triển xương dẫn đến tình trạng lùn của trẻ, dậy thì sớm ngoại biên, hạ kali
máu và tăng huyết áp. Các xét nghiệm hoá sinh thường dựa trên mức độ tăng
lên của 11-deoxycortisol và 11-deoxycorticosterol huyết thanh kết hợp với sự
gia tăng nồng độ của adrogen thượng thận.
TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase có các dấu hiệu đặc trưng nhưng
cũng còn nhiều thách thức trong vấn đề chẩn đoán và điều trị. Sự đa dạng về
kiểu hình, tỷ lệ phát hiện thấp là những lý do làm chậm chẩn đoán 11βhydroxylase. Hiện nay, trên thế giới và ở Việt Nam còn ít nghiên cứu về sự
ảnh hưởng của các loại đột biến tới chức năng hoạt động của 11βhydroxylase. Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài “Nghiên cứu xác định đột biến
gen CYP11B1 ở bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt
11 beta hydroxylase” được thực hiện nhằm góp phần phát hiện và làm sáng
tỏ nguyên nhân gây bệnh rối loạn chuyển hoá 11β-hydroxylase ở người Việt
Nam. Nghiên cứu này sẽ giúp cho các nhà nghiên cứu di truyền học giải thích
được cơ chế gây bệnh và các bác sĩ lâm sàng điều trị bệnh hiệu quả, đúng
hướng để nâng cao chất lượng cuộc sống. Hơn nữa, kết quả nghiên cứu cũng
được ứng dụng phòng bệnh thông qua thực hành tư vấn di truyền, là cơ sở cho
chẩn đoán và điều trị trước sinh khi có chỉ định.
Mục tiêu của đề tài:
1. Sàng lọc các đột biến trên gen CYP11B1 trên các bệnh nhân TSTTBS do
thiếu 11β-hydroxylase.

3

2. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các đột biến mới tới hoạt lực 11βhydroxylase trong tế bào động vật nuôi cấy.
3. Phân tích sự ảnh hưởng của các đột biến mới trong mô hình cấu trúc 3
chiều của 11β-hydroxylase.
Nội dung nghiên cứu:
1. Giải trình tự gen CYP11B1 trên các bệnh nhân nghi ngờ mắc TSTTBS thể
thiếu 11β-hydroxylase.
2. Chứng minh sự biểu hiện 11β-hydroxylase trong tế bào động vật bằng
phương pháp Western blot.
3. Tách chiết hormone steroid, đánh giá hoạt tính 11β-hydroxylase.
4. Sử dụng phần mềm spdbv, ViewerLite, MAXent phân tích vị trí các đột
biến mới.
Những đóng góp mới của luận án:
1. Phát hiện 06 đột biến trên gen CYP11B1 ở các bệnh nhân được chẩn đoán
lâm sàng là TSTTBS thể thiếu 11β-hydroxylase trong đó có 05 đột biến
mới p.R51K, p.E147D, p.N152K, IVS6+5G>T, p.Y395X
2. Các đột biến mới p.R51K, p.E147D, p,N152K làm giảm hoạt tính của 11βhydroxylase tương ứng là 29%, 48% và 36%.
3. Dự báo đột biến IVS6+5G>T có khả năng ảnh hưởng tới cấu trúc mRNA
bằng phần mềm MaxEnt.
4. 03 đột biến mới p.R51K, p.E147D, p.N152K đều có ảnh hưởng đến liên
kết hydro với axit amin bên cạnh trong mô hình cấu trúc ba chiều của 11βhydroxylase.


4

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BỆNH THIẾU HỤT 11 BETA HYDROXYLASE

1.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Năm 1951, các nhà khoa học đã nhận thấy có một số lượng bệnh nhân
TSTTBS có dấu hiệu như tăng huyết áp, có các triệu chứng của thiếu hụt
aldosterone, tăng natri, hạ kali máu. Các bệnh nhân này sau đó được phát hiện
có sự thiếu hụt 11- hydroxylase. Đây là các dấu hiệu phân biệt giữa bệnh
nhân TSTTBS do thiếu hụt 11- hydroxylase với các bệnh nhân TSTTBS do
thiếu hụt 21 hydroxylase

(Eberlein và Bongiovanni, 1955, Shepard và

Clausen, 1951, Wilkins và cs, 1952, Wilkins và cs, 1951).
Năm 1956, Eberlein và Bongiovanni đã miêu tả hiện tượng TSTTBS có
kèm theo triệu chứng cao huyết áp (Eberlein và Bongiovanni, 1955). Glenthoj
và cộng sự đã chẩn đoán 3 bệnh nhân TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase
mà trước đó, 3 bệnh nhân này đã được chẩn đoán TSTTBS do thiếu hụt 21hydroxylase (Glenthoj và cs, 1979). Năm 1982, Rosler và cộng sự đã báo cáo
26 bệnh nhân TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase ở 18 gia đình Do Thái
từ Morocco, Tunis, Thổ Nhĩ Kỳ và Iran. Trong đó có 7 gia đình kết hôn cận
huyết. Các bệnh nhân có triệu chứng tăng huyết áp nặng. Các bệnh nhân nữ
có triệu chứng lâm sàng đa dạng, từ âm vật phì đại đến thể nam hoá nặng.
10/14 bệnh nhân nữ được nuôi dưỡng giống như các trẻ trai và việc chẩn đoán
muộn ở giai đoạn dậy thì (Rosler và cs, 1982). Triệu chứng tăng huyết áp dẫn
đến tình trạng tử vong do bệnh tim mạch chỉ xuất hiện ở các bệnh nhân nam
hoá ở mức độ trung bình, thể nam hóa nặng có ngoại hình giống hoàn toàn
người nam ở các bệnh nhân nữ thì đôi khi lại có huyết áp bình thường. Sáu
bệnh nhân có hạ kali máu. Năm 1985, Hochberg và cộng sự đã mô tả 15 trẻ


5

gái và 9 trẻ trai có thiếu hụt 11β-hydroxylase. Các bệnh nhân này đều là
người Do thái di cư từ Morocco và Iran. Chiều cao cuối cùng của các bệnh
nhân đã bị ảnh hưởng nghiêm trọng. Trẻ trai có hiện tượng dậy thì sớm, phát
triển tuyến vú. Tất cả các bệnh nhân đều được nuôi dưỡng như các bé trai,
mặc dù có 2 bệnh nhân có kết quả nhiễm sắc thể 46,XX (Hochberg và cs,
1985). Năm 1992, Rosler và cộng sự mô tả đặc điểm của 38 bệnh nhân thiếu
hụt 11β-hydroxylase từ 25 gia đình trong vòng 39 năm. 19 gia đình đến từ
Morocco, và 2 gia đình khác có bố hoặc mẹ đến từ Morocco (Rosler và cs,
1992). Cũng năm 1992, Helmberg đã báo cáo 1 ca bệnh là trẻ trai 8 tuổi người
Thổ Nhĩ Kỳ, bố mẹ kết hôn cận huyết. Bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh
TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase. Bệnh nhân có tăng huyết áp, giả dậy
thì sớm, chiều cao và cân nặng hơn 97 bách phân vị, nam hoá hoàn toàn
(Prader type IV, lỗ đái thấp, phì đại âm vật). Bốn anh chị của bệnh nhân đã tử
vong ngay sau đẻ (Helmberg và cs, 1992). Năm 1995, Al-Jurayyan báo cáo 78
trẻ Ả rập mắc TSTTBS trong vòng 10 năm. Trong số đó, có 20 (25,6%) bệnh
nhân từ 11 gia đình có tiền sử mắc TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase.
Hiện tượng dậy thì sớm giả ở trẻ nam và các mức độ nam hoá ở trẻ gái đã dẫn
đến 7 bệnh nhân bị chẩn đoán nhầm về giới tính (58,3%). 3 trẻ sơ sinh ở thể
mất muối trước khi được điều trị (Al-Jurayyan, 1995). Năm 2000, Clark đã
mô tả 2 bệnh nhân mắc TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase thể không cổ
điển (P. A. Clark, 2000) với tỷ lệ nam hoá bào thai và cao huyết áp thấp hơn
so với thể cổ điển. Bệnh nhân đầu tiên là trẻ trai 6 tuổi có triệu chứng dậy thì
sớm ngoại biên. Bệnh nhân có chiều cao trung bình so với tuổi và có huyết áp
ở giới hạn trên của bình thường. Bệnh nhân thứ 2 là trẻ gái 1 tháng tuổi với
triệu chứng âm vật phì đại nhưng không có bìu chẻ đôi. Bệnh nhân có huyết
áp bình thường so với tuổi và có nồng độ 11-deoxycortisol tăng.


6

1.1.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Từ những năm 2000, một số tác giả đã ứng dụng kỹ thuật sinh học phân
tử để sàng lọc các đột biến trên gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS như tác giả
Võ Kim Huệ, Thái Thiên Nam đã ứng dụng kỹ thuật PCR để sàng lọc đột
biến mất 8bp ở các bệnh nhân mắc TSTTBS ở Việt Nam cũng như các thành
viên trong gia đình của bệnh nhân này (Thái Thiên Nam, 2002, Võ Kim Huệ,
2000). Năm 2006, tác giả Trần Kiêm Hảo cũng ứng dụng kỹ thuật PCR để
sàng lọc một số đột biến phổ biến trên các bệnh nhân TSTTBS tại Bệnh viện
Nhi trung ương (Trần Kiêm Hảo, 2006). Năm 2017, tác giả Vũ Chí Dũng
công bố chẩn đoán phân loại thể thiếu các enzyme đặc hiệu khác nhau trên
715 bệnh nhân TSTTBS bao gồm 375 (52%) trẻ trai và 340 (48%) trẻ gái tại
bệnh viện Nhi trung ương (Bùi Phương Thảo Vũ Chí Dũng, Nguyễn Ngọc
Khánh, Cấn Thị Bích Ngọc, 2015). Trong đó, thể thiếu 21-hydroxylase là 703
(98,3%) bệnh nhân; thiếu 11β-hydroxylase là 9 (1,3%) bệnh nhân; và thiếu
3β-hydsroxysteroid dehydrogenase type 2 là 3 (0,4%) bệnh nhân. Nghiên cứu
cho thấy, số bệnh nhân mắc TSTTBS ở Việt Nam là rất lớn. Đa số các bệnh
nhân mắc bệnh TSTTBS thể thiếu 21-hydroxylase. Tuy nhiên, còn rất ít các
nghiên cứu TSTTBS thể hiếm gặp. Gần đây, đã có một số nghiên cứu
TSTTBS thể hiếm gặp bằng các phương pháp sinh học phân tử và phân tích
sự ảnh hưởng của các đột biến mới. Năm 2012, tác giả Lê Bắc Việt mô tả một
bệnh nhân mắc bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase. Bệnh nhân có đột biến dị hợp
tử kép R43Q và A386V (Lê Bắc Việt, 2012). Đột biến A386V là đột biến làm
thay đổi axit amin Alanine thành Valine. Đột biến này xảy ra tại vị trí axit
amin thứ 386 và không nằm trên vùng quan trọng. Hai axit amin này đều là
axit amin trung tính, không làm thay đổi liên kết hydro trong phân tử protein.
Vì thế, tác giả dự đoán rằng, đột biến này không làm ảnh hưởng đến hoạt tính
protein. Những nghiên cứu sau đó của tác giả về sự biểu hiện của đột biến cho


7

thấy, đột biến này hoàn toàn không làm ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme 11βhydroxylase. Năm 2015, tác giả Vũ Chí Dũng và cộng sự công bố 3 bệnh
nhân TSTTBS thể thiếu 3β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 đều được
khẳng định bằng phân tích đột biến gen HSD3B2 và đã phát hiện các bệnh
nhân này mang đột biến mới đồng hợp tử của gen (Bùi Phương Thảo Vũ Chí
Dũng, Nguyễn Ngọc Khánh, et al, 2015). Những nghiên cứu này là rất cần
thiết và sẽ cung cấp các thông tin toàn diện hơn về các thể bệnh TSTTBS do
thiếu các enzyme khác nhau đang lưu hành tại Việt Nam.
1.1.3. Dịch tễ học bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase
Tỷ lệ mắc bệnh thiếu hụt 11β-hydroxylase thống kê trong các quần thể
còn rất hạn chế. Thông thường, tỷ lệ thiếu hụt 11β-hydroxylase chiếm khoảng
5-8% tổng số các bệnh nhân mắc hội chứng TSTTBS (Merke và Bornstein,
2005, White và Speiser, 2000, Zachmann và cs, 1983). Nghiên cứu tại Anh
(Arlt và cs, 2010) cho thấy chỉ có 3/203 bệnh nhân TSTTBS mắc bệnh thiếu
hụt 11β-hydroxylase (1,5%), và các bệnh nhân này chỉ chiếm khoảng 3-5% ở
thể cổ điển. Tuy nhiên, nghiên cứu quốc gia tại Thuỵ Điển nghiên cứu trên
90% các bệnh nhân TSTTBS, chỉ có 1/612 bệnh nhân TSTTBS do thiếu hụt
11β-hydroxylase (0,2%) (Gidlof và cs, 2013, Strandqvist và cs, 2014). Sự
khác biệt về tỷ lệ có thể do cách chọn mẫu hoặc do đặc trưng của quần thể
nghiên cứu. Tần suất bệnh TSTTBS ở trẻ sơ sinh khoảng 1/200.000 (White và
cs, 1994). Tần suất bệnh TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase thay đổi từ
0,8-8% trong các nghiên cứu trên các phụ nữ mắc hội chứng rậm lông và
cường androgen (Azziz và cs, 1991, Eldar-Geva và cs, 1990). Tần suất trẻ
mắc bệnh TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase cao nhất được tìm thấy ở
Israel trên người Do Thái di cư từ Morocco. Tần suất mắc bệnh ở nhóm người
này khoảng từ 1/5000-7000 trẻ đẻ sống và tỷ lệ người mang gen từ 1,2-1,4%
(Rosler và cs, 1992, Rosler và White, 1993).


8

Bảng 1.1. Các thể bệnh TSTTBS và thiếu hụt tổng hợp cortisol do thiếu enzyme vỏ thượng thận
Enzyme thiếu hụt

Tỷ lệ mới mắc và

Gen/NST

chủng tộc

Triệu chứng lâm sàng

21-hydroxylase

CYP21A2

Cổ điển 1:16000

(P450c21)

6p21.3

Thể không cổ điển Phì đại âm vật, suy thượng
<1:1000
Gặp

17OHP; AD; T

thận, mất muối, nam hoá sau
hơn

nhiều

Ashkenazi

Thể cổ điển: 46,XX

Jews

Yupik Eskimo

ở sinh ở các mức độ khác nhau.
và Thể không cổ điển: cường
androgen trong từ thời thơ ấu
đến trưởng thành, có thể
không có triệu chứng.

CYP21A2
TNXB

và

CAH-X:

ngoài

Dấu ấn sinh học

các

triệu

chứng như trên, còn có tăng
động, đau liên hoàn, sai khớp
đa chỗ, thiếu hụt đường giữa
bao gồm cả khả năng có thể


9

bất thường cấu trúc tim mạch
11β-hydroxylase

CYP11B1/8q24.3 1:200000 ở chủng tộc Thể cổ điển: 46,XX; phì đại DOC

(P450c11β)

da trắng; 1/7000 ở âm vật, tăng huyết áp ở hầu 11-deoxycortisol
Moroccan Jews

hết các bệnh nhân, hạ kali AD; T
máu, nam hoá sau sinh
Thể không cổ điển: cường
androgen, có thể không có
triệu chứng

3β-hydroxysteroid

HSD3B2/1p13.1

Hiếm

dehydrogenase type 2

Thể cổ điển: mất nước, hạ Pregnenolone
natri máu, tăng kali máu.

17OH-pregnenolone

46,XX: nam hoá

DHEA; DHEAS

46,XY: nam hoá kém
Thể cổ điển: Kiểu hình nữ Progesterone, DOC;

17-hydroxylase

CYP17A

1:50000 toàn thế giới

17,20-lyase

10q21-22

Phổ biến hơn ở Brazil (46,XX hoặc 46,XY nhưng corticosterone;

(P4450c17)

và Châu Á

nam hoá kém), tăng huyết áp, và FSH
hạ kali máu, thiểu năng sinh

LH


10

dục, nam hoá kém, tinh hoàn
trong ổ bụng
Một phần: 46,XY mơ hồ giới
tính theo các mức độ khác
nhau. 46,XX phát triển đặc
tính sinh dục ở các mức độ
khác nhau.
Steroidogenic
regulatory
(StAR)

acute STAR
protein 8p11.2

Hiếm, phổ biến hơn ở Thể cổ điển: kiểu hình nữ Giảm tất cả các
Nhật Bản, Palestine, (46,XX hoặc 46,XY có giới steroid
Hàn Quốc

tính đảo ngược) Suy thượng
thận, thượng thận phì đại,

thượng thận bị thâm nhiễm
lipid, cả hai giới có bộ phận
sinh dục ngoài giống nữ.
Thể không cổ điển: 46,XY
biểu hiện mơ hồ giới tính các


11

mức độ khác nhau,
Cholesterol side-chain CYP11A1
cleavage

Hiếm

enzyme 15q23-24

Thể cổ điển: kiểu hình nữ Giảm tất cả các
(46,XX hoặc 46,XY có giới steroid
tính đảo ngược), suy thượng

(P450scc)

thận, có thể không có tuyến
thượng thận, mất muối
Thể không cổ điển: 46,XY mơ
hồ giới tính ở các mức độ
khác nhau, suy thượng thận
Thiếu

P450- POR

oxydoreductase (POR) 7q11.2

Hiếm, phổ biến hơn ở Giảm thể tích tuần hoàn, dị tật Mức độ cao khác
Nhật Bản và Hàn xương (Antley-Bixler); nam nhau, thiếu hụt một
Quốc

hoá ở mẹ.

phần nhiều steroid

46,XX: nam hoá nhẹ đến
trung bình.
46,XY: nam hoá kém
(Nguồn: Hannah Shmouni và cs, 2017; Turcu và Auchus 2015)