Nghiên cứu xác định đột biến gen BRCA1 và BRCA2 trong ung thư vú ở phụ nữ việt nam

1
Bộ khoa học và công nghệ
Bệnh viện K





BáO CáO TổNG KếT

nghiên cứu xác định đột biến gen bcra1, bcra2
trong ung th vú

Thuộc đề tài:
Nghiên cứu ứng dụng công nghệ cao trong chẩn đoán và điều
trị một số bệnh ung th thờng gặp
Mã số: KC 10.14/06.10




Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Phạm Duy Hiển
Chủ nhiệm đề tài nhánh: TS. Tạ Văn Tờ
TS. Nguyễn Văn Định

Cơ quan chủ quản: Bệnh viện K

Hà Nội, 2010

2
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư vú (UTV) không những là một bệnh ung thư hay gặp nhất ở
phụ nữ mà còn là nguyên nhân chính gây tử vong đối với phụ nữ tại nhiều
nước. Tỷ lệ UTV ngày càng tăng ở các nước đang phát triển (khoảng
5%/năm) đặc biệt ở khu vực Đông Nam Á. Theo thống kê của Hội Ung thư
Hoa Kỳ (American Cancer Society) năm 2007 có khoảng 240510 phụ nữ mới
được chẩn
đoán ung thư vú, ước đoán khoảng 42460 ca tử vong. Tại Việt
Nam, theo Viện nghiên cứu Ung thư Quốc gia, mỗi năm có thêm khoảng
14000 phụ nữ bị mắc mới [3].
Căn nguyên bệnh sinh ung thư vú rất phức tạp, vì vậy việc phòng ngừa,
phát hiện sớm và điều trị còn gặp nhiều khó khăn. Ngày nay các nhà nghiên
cứu đang tập trung nghiên cứu các yếu tố nguy cơ ung thư vú để tìm ra những
yế
u tố chính với mục đích giảm tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong ung thư vú. Nhiều
nghiên cứu ở Mỹ và châu Âu cho rằng khoảng 10-15% ung thư vú có yếu tố
gia đình, nghĩa là người bệnh mang gen đột biến từ gen di truyền của mẹ.
Những ung thư này là kết quả của sự đột biến một số gen trong đó có 2 gen
quan trọng được nghiên cứu nhiều nhất đó là gen BRCA1 và BRCA2 [21].

Những phụ nữ có đột biến gen BRCA1 và BRCA2 sẽ có nguy cơ mắc
ung thư vú cao hơn so với những người không mang gen đột biến này. Ở Mỹ
tính trung bình 1 phụ nữ có khả năng mắc ung thư vú là 12% nếu họ sống đến
tuổi 90 và ung thư buồng trứng là 1,8%. Nhưng nếu một phụ nữ có đột biến
gen BRCA có thể tăng khả năng mắc ung thư vú lên đến 85% [21].
Tại châu Á, từ nă
m 1995 các nghiên cứu về đột biến gen BRCA1 và
BRCA2 trong ung thư vú và ung thư buồng trứng đã được tiến hành tại
Philipine [10], Mông Cổ [15], Thái Lan [38], và Singapor [26]. Những năm
gần đây, nhờ có sự phát triển của ngành sinh học phân tử, nhiều nhà khoa học
đã tiến hành nghiên cứu và phát hiện được nhiều đột biến điểm trên gen
BRCA1 và BRCA2. Những đột biến nguyên khởi liên quan đến ung thư vú

3
được nghiên cứu ở nhiều tộc người khác nhau và có liên quan mật thiết với
căn bệnh ung thư vú là đột biến 185delAG, 5382insC trên gen BRCA1 và
6174delT trên gen BRCA2. Các đột biến này đã được thống kê là xuất hiện
với tần suất giao động giữa các quốc gia. Việc phát hiện người bệnh mang đột
biến nguyên thủy trong các gia đình bệnh nhân ung thư vú sẽ rất có ý nghĩa
trong việc phòng bệnh, tiên lượng và điều tr
ị dự phòng. Mặt khác việc phát
hiện người lành mang gen đột biến cũng giúp các nhà tư vấn di truyền đưa ra
lời khuyên hoặc lời cảnh báo về một nguy cơ ung thư vú cho những thành
viên trong gia đình họ.
Theo hiểu biết của chúng tôi, hiện nay nước ta mới chỉ có nhóm tác giả
Lê Thị Minh Chính nghiên cứu đột biến gen này trên bệnh nhân ung thư vú
với số mẫu 24 bệnh nhân tại bệnh viện K. Kết quả không phát hiệ
n thấy đột
biến 185delAG ở gen BRCA1 và 6174delT ở gen BRCA2 [2]. Một câu hỏi
đặt ra liệu tần suất đột biến 2 gen này ở phụ nữ Việt Nam có thực sự thấp

không. Với 24 bệnh nhân được nhóm tác giả nghiên cứu thì kết quả này mới
chỉ mang tính chất thử nghiệm, thăm dò và gợi ý mà chưa đủ sức thuyết phục
để khẳng định chắc chắn về tần suất đột biế
n 2 gen nói trên.
Để tiếp tục công trình nghiên cứu về các yếu tố nguy cơ gây ung thư vú
cũng như những phân tích di truyền ở mức độ phân tử của phụ nữ Việt Nam,
chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu xác định đột biến gen BRCA1 và
BRCA2 trong ung thư vú ở phụ nữ Việt Nam” với mục tiêu:
Xác định tần suất đột biến gen BRCA1 và BRCA2 ở bệnh nhân nữ ung thư
vú tại Việt Nam.






4
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng gen BRCA1
Gen BRCA1 được phát hiện vào năm 1994 do các nhà khoa học thuộc
Viện nghiên cứu Sức khoẻ Quốc gia (NIH) Hoa Kỳ (www.nih.gov).
- Vị trí gen BRCA1: Gen BRCA1 nằm trên vai dài của NST 17, vùng 2, băng
1, băng phụ 2.

Hình 1.1. Sơ đồ nhiễm sắc thể 17 và vị trí của gen BRCA1
(Nguồn:www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps)
- Cấu trúc gen BRCA1: Gen BRCA1 gồm 24 exon và 2 intron, có kích thước
khoảng 80 kb, từ cặp nucleotide 92500 - 173688, tương đương 81188 bp.
Trong đ
ó, exon 11 lớn nhất, chiếm 55% chiều dài gen BRCA1. Kích thước
phiên mã của mARN là 7,8 kb, mã hoá cho phân tử protein gồm 1863 aa [8].

5

Hình 1.2. Cấu trúc gen BRCA1 [41]
- Chức năng gen BRCA1: Gen BRCA1

là một loại gen được biết đến như là
gen ức chế tạo u, nó có chức năng ngăn ngừa sự phát triển và phân chia nhanh
chóng hoặc không kiểm soát được của các tế bào. Mặt khác gen BRCA1 còn
sản sinh ra 1 loại protein tham gia trực tiếp vào việc sửa chữa trong quá trình
tái bản DNA, duy trì sự ổn định thông tin di truyền của tế bào. Ngoài ra
BRCA1 còn có chức năng điều hòa sự phát triển của biểu mô tuyến vú. Các
nghiên cứu đã phát hiện h
ơn 1000 đột biến ở gen BRCA1, trong số đó nhiều
đột biến làm tăng nguy cơ ung thư vú [37].
1.2 Vị trí, cấu trúc và chức năng gen BRCA2
Gen BRCA2 do GS Michael Stratton và TS Richard Wooster (Viện
nghiên cứu ung thư Anh) phát hiện năm 1995 [51].

- Vị trí gen BRCA2: Gen BRCA2 nằm trên vai dài của NST 13, vùng
1, băng 3, băng phụ 1.
BRCA2 - Chromosome 13







6
Hình 1.3. Sơ đồ nhiễm sắc thể 13 và vị trí của gen BRCA2
(Nguồn:
- Cấu trúc gen BRCA2: BRCA2 bao gồm 27 exon và 31 intron [34], với độ
lớn khoảng 80kb, từ cặp nucleotide 5000 đến cặp nucleotide 89192, tương
đương 84192 bp. Kích thước phiên mã của mRNA khoảng 10,4 kb, mã hoá
cho phân tử protein gồm 3418 axit amin [49].


Hình 1.4. Cấu trúc gen BRCA2 [41].
- Chức năng gen BRCA2: Cũng như gen BRCA1, gen BRCA2 có chức năng
kìm hãm sự phát triển của khối u, sửa chữa trong quá trình tái bản DNA, điều
hòa sự phát triển của biểu mô tuyến vú. Nhưng khác với gen BRCA1 là gen
BRCA2 không có liên quan đến ung thư buồng trứng. Các nghiên cứu đã phát
hiện hơn 800 đột biến ở gen BRCA2, trong số đó nhiều đột biến làm tăng
nguy cơ ung thư vú. Các đột biến gen BRCA2 thường là
đột biến chèn hoặc
xóa một số lượng nhỏ các base, chủ yếu là đột biến xoá [12].
1.3. Tình hình nghiên cứu gen BRCA1 trên thế giới
Theo kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Viện Walter & Eliza,

thành phố Melbourne - Australia: loại gen có tên gọi là BRCA1 bị biến đổi,
nó sẽ chiếm tới 65% nguyên nhân gây ung thư vú ở phụ nữ. Phát hiện này
được đánh giá là bước đột phá, đặt nền móng quan trọng trong quá trình điều
trị hiệu quả căn b
ệnh nguy hiểm này [24].

7
Năm 1993 Easton và cs cho rằng gen BRCA1 rất dễ bị tổn thương, ước
tính tỷ lệ đột biến gen BRCA1 là 1/700 phụ nữ, chiếm khoảng 71% trong số
các đột biến gen và nguy cơ ung thư vú trong số này là 62%, ung thư buồng
trứng là 11% ở tuổi 60 [14].
Năm 1996 Marcus và cs cho thấy ung thư vú do đột biến gen BRCA1
thường biểu hiện ở tuổi trẻ hơn và giai đoạn sớm hơn so với ung thư vú nói
chung (tuổi trung bình là 42,8 so v
ới ung thư vú chung là 62,9). Những u này
thường biểu hiện tỷ lệ tăng sinh cao, độ mô học cao và thường ở dạng dị hợp
tử [30]. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Tavani và cs (1999),
phụ nữ có đột biến gen BRCA1 thì nguy cơ phát triển ung thư vú đối bên là
64% và nguy cơ ung thư buồng trứng là 44 - 63% [48]. Roa và cs (1996) lại
cho rằng đột biến gen BRCA1 chiếm 8% ung thư vú trước tuổi phu; 5% sau
tuổi 30 và 41% sau tuổi 50 [44].
N
ăm 2000 Foulkes và cs cho thấy có 13,6% bệnh nhân ung thư vú
mang đột biến trong gen BRCA1. Nhưng một điều đáng quan tâm hơn là
những bệnh nhân mang đột biến BRCA1 có tỷ lệ tử vong cao hơn rất nhiều so
với những bệnh nhân không mang đột biến này (50% / 89,6%) [22].
Năm 2002 Maria và cs ước tính sự phổ biến của các đột biến trong gen
BRCA1 ở những trường hợp mắc ung thư vú được chọn lựa ngẫu nhiên tại
Philippin là 5,1% [31].
1.3.1 Tần su

ất các đột biến được tìm thấy ở gen BRCA1
Khi giải trình tự các đột biến trong gen BRCA1 thấy có những thay đổi
rất lớn ở những gia đình có quan hệ huyết thống tại nhiều nước và các miền
dân số khác nhau, trong đó ở Anh là 21%; Pháp là 24%; Canada là 40%; Mỹ
là 39%; Những gia đình ở Thụy Điển và Hunggary thì tỷ lệ đó là 35% [13].
David và cs (1996) đã phát hiện 5 đột biến dòng mầm (germ-line
mutation) trên gen BRCA1 ở 163 bệnh nhân Ashkenazi bị ung th
ư vú và ung

8
thư buồng trứng được lựa chọn ngẫu nhiên trong đó có 3 đột biến xảy ra trên
exon 11 và 2 đột biến xảy ra trên exon 2 [9].
Bảng 1.1. Các đột biến được phát hiện ở gen BRCA1 [9].
Ung thư vú Ung thư buồng trứng
Các đột
biến
Exon
Tần suất Tuổi Tần suất Tuổi
185delAG 2 39/163 36-63 26/163 47-60
188del11 2 23/163 44-84 1/163 47
4153delA 11 8/163 58 2/163 54
R1347G 11 4/163 44 2/163 53
4184del4 11 10/163 50 0/163 0
Thomas và cs (1998) phát hiện rất nhiều đột biến xảy ra ở gen BRCA1
với các bệnh nhân ung thư vú từ các phòng khám di truyền tại Mỹ [50].

Bảng 1.2. Các đột biến tìm thấy ở gen BRCA1 [50].
Tần suất Tần suất
Đột biến

UTV
≤50 tuổi
UTBT
tuổi bất kỳ
Đột biến

UTV
≤50 tuổi
UTBT
tuổi bất
kỳ
185delAG 15/103 3/103 3884insA 1/103 1/103
C61G 8/103 0 3889delAG 2/103 0
448delAG 2/103 1 3977del4 1/103 1/103
E143X 7/103 3 E908X 4/103 0
816delGT 6/103 1/103 E1060X 1/103 0
1135insA 1/103 2/103 Q563X 2/103 0
1205delGA 0/103 1/103 Q780X 1/103 1/103
1294del40 4/103 2/103 4280delTC 3/103 0
1374delG 3/103 1/103 R1443X 1/103 0
1832del5 4/103 2/103 R1835X 3/103 1/103
2072del4 1/103 2/103 4601delAA 1/103 0
2190delA 1/103 0 Y1563X 2/103 0

9
2329delCA 1/103 2/103 5296del4 4/103 1/103
2576delC 3/103 2/103 5382insCT 0/103 1/103
3600del11 1/103 1/103 5382insC 11/103 6/103
3604delA 1/103 4/103 W1837X 5/103 1/103
3875del4 3/103 1/103

Ewa và cs (2002) phát hiện 4 đột biến dòng mầm trên BRCA1 ở người
Ba Lan - Upper Silesia các đột biến đó là 185delAG, 5382insC, C61G, và
4153delA. Trong số này đột biến 185delAG và 5382insC là những đột biến
xuất hiện với tần số cao trong gen BRCA [18].
Helen và cs (2002) phát hiện 18 đột biến trên gen BRCA1 ở người da
trắng, người Mỹ-Phi và người gốc Mỹ La Tinh - Hispan [25].

Bảng 1.3. Các đột biến tìm thấy ở gen BRCA1 [25].
Các đột biến Tần suất Các đột biến Tần suấ
t
185delAG 6/28 3875del4 2/28
230delAA 1/28 5083del19 1/28
252del4 1/28 5439delAA 1/28
1014delGT 1/28 5382insC 4/28
1048delA 1/28 IVS20-1G>A 1/28
1790delA 1/28 E143X 1/28
2316del5 1/28 E1213X 1/28
2637delA 1/28 Y1563X 1/28
2800delAA 2/28 M11

1/28
Chú thích: IVS: Intron Variant Sequence: Trình tự biến đổi đoạn intron.

Lilian và cs (2004) phát hiện 18 đột biến thường xảy ra trên gen
BRCA1 ở 63 gia đình người Chi Lê [28].

10
Bảng 1.4. Các đột biến được tìm thấy ở gen BRCA1 [28]
Các đột biến Exon Codon Các đột biến Exon Codon
185 delAG 2 23 2804delAA 11c 895
C61G 5 61 3166ins5 11c 1016
331+1G>A 5 intron 3600del11 11d 1161
1135insA 11a 339 E1250X 11d 1250
1294del40 11a 392 3875del4 11d 1252
1675delA 11b 519 4184del4 11d 1355
Q563X 11b 23
IVS12-
1632del13835
12 intron
Q780X 11b 61 R1443X 13 1443
2800delAA 11c intron 5382insC 20 1756

1.3.2 Tần suất đột biến 185delAG và 5382insC trên gen BRCA1.
Tuy có rất nhiều đột biến xảy ra trên gen BRCA1, nhưng những đột
biến xuất hiện với tần số cao hơn các đột biến khác và có liên quan mật thiết
đến ung thư vú là đột biến 185delAG và 5382insC.
David B. Berman (1996), nghiên cứu 163 cá thể bị ung thư vú và hoặc
ung thư buồng trứng (ung thư buồng trứng ở các lứa tuổi, ung thư vú dưới
tuổi 50) người Ashkenazi. Kết qu
ả cho thấy đột biến 185delAG chiếm tỷ lệ
khá cao 13/163 (7,9%) [9].
Roa và cs (1996), nghiên cứu 3000 bệnh nhân bị ung thư vú người Do
Thái, các mẫu này được chọn lựa một cách ngẫu nhiên. Kết quả cho thấy đột
biến 185delAG và 5382insC là những đột biến thường xuyên xảy ra trên gen
BRCA1 lần lượt chiếm tỷ lệ 1,09% và 0,13% [103].
Ellen và cs (1999), nghiên cứu 412 bệnh nhân người Do Thái bị ung

thư vú. Kết quả cho thấy chỉ phát hiện 48 bệnh nhân mang các đột biến gen
BRCA. Trong đ
ó 26/412 (6,3%) bệnh nhân mang đột biến 185delAG, 8/412
(1,9%) bệnh nhân mang đột biến 5382insC. Tuổi trung bình của nhóm bệnh
nhân này là 46,4 [16].

11
Pak và cs (1999), thử nghiệm ở 66 phụ nữ Do Thái bị ung thư vú và
hoặc ung thư buồng trứng. Kết quả cho thấy xác định được 7 cá thể mang đột
biến 185delAG (10,6%), 4 cá thể mang đột biến 5382insC (6,0%) trên gen
BRCA1 [36].
Backe J và cs (1999), nghiên cứu 248 bệnh nhân mắc ung thư vú và
800 trường hợp được lựa chọn ngẫu nhiên người Đức. Kết quả cho thấy trong
số 248 bệnh nhân mắc ung thư vú phát hiện 10 bệnh nhân mang đột biến
5382insC trên gen BRCA1 chiế
m (4%) và trong số 800 trường hợp lựa chọn
ngẫu nhiên phát hiện 8 (1%) trường hợp mang đột biến 5382insC trên gen
BRCA1 [7].
Foulkes và cs (2000), nghiên cứu 118 phụ nữ người Do Thái bị ung thư
vú di truyền tuổi dưới 65. Kết quả cho thấy 11/118 bệnh nhân mang đột biến
185delAG chiếm tỷ lệ 9,3%; 5/118 bệnh nhân mang đột biến 5382insC chiếm
4,2%. Nhưng một điều đáng quan tâm hơn là những người mang đột biến
BRCA1 có tỷ lệ tử vong cao hơ
n rất nhiều so với những bệnh nhân không
mang đột biến này (50% / 89,6%) [22]. Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp
với kết quả nghiên cứu của Phương L. Mai, 2009: 27% / 25% những người có
quan hệ họ hàng mang đột biến so với những người không mang đột biến;
10% / 16% những người mang đột biến so với những người không mang đột
biến có quan hệ huyết thống [39]. Điều này nói lên mối liên quan của gen
BRCA1 với bệnh nhân ung th

ư vú nói chung và những gia đình có tiền sử ung
thư vú và hoặc ung thư buồng trứng nói riêng.
Ewa và cs (2000), phân tích một số đột biến dòng mầm: 5382insC,
185delAG, C61G và 4153delA trong gen BRCA1 ở 148 gia đình bị ung thư
vú người Ashkenazi. Kết quả cho thấy đã phát hiện 15 gia đình mang đột biến
dòng mầm trong gen BRCA1, trong đó có các đột biến là: 5382insC,
185delAG và C61G. Đột biến 185delAG có 2/15 (13,3%) trong tổng số các

12
gia đình có đột biến, đột biến 5382insC là đột biến dòng mầm hay xảy ra nhất
11/15 (73%) trên gen BRCA1 [17].
Ewa và cs (2002), nghiên cứu 47 gia đình bị ung thư vú /ung thư buồng
trứng người Ba Lan - Upper Silesia. Kết quả phát hiện thấy 11 (23,4%) gia
đình mang đột biến 5382insC. Tần suất của các đột biến thông thường này có
thể so sánh với những kết quả nghiên cứu trước ở người Do Thái Ashkenazi,
người Aixơlen và người Nga là tương đối cao. Tuy vậy tầ
n suất này cũng
không thể đại diện cho toàn dân số Ba Lan [18].
Lilian và cs (2004), nghiên cứu 18 đột biến thường xảy ra trong gen
BRCA1 ở 5 Exon (2,5,11,13 và 20) và 2 Intron (5 và 12) trong 63 gia đình bị
ung thư vú và/hoặc ung thư buồng trứng người Chi lê (bảng 5). Trong 18 đột
biến này, nhóm tác giả đi sâu nghiên cứu 5 đột biến gen BRCA1 đó là
185delAG (Exon 2), 1675delA (Exon 11b), E1250X (Exon 11d), R1443X
(Exon 13) và 5382insC (Exon 20). Qua 98 người có quan hệ họ hàng trong 63
gia đình bị ung thư vú và / hoặc ung thư buồng trứng. Kết quả cho thấy 5 gia
đình có đột biế
n ở gen BRCA1 (chiếm 7.93%), nhưng chỉ có 3 gia đình
(chiếm 4.76%) mang hai đột biến 185delAG ở Exon 2 và 5382insC ở Exon
20. Đột biến 185delAG là loại đột biến xảy ra với tần số cao nhất trong gen
BRCA1 [28].

Antoniou và cs (2003), nghiên cứu 498 bệnh nhân ung thư vú và hoặc
ung thư buồng trứng người Ashkenazi và người Đông Âu. Kết quả cho thấy
75/498 (15%) trường hợp mang đột biến 185delAG; 69/498 (13,8%) ở trường
hợp mang đột biến 5382insC và nguy cơ cao mắc ung thư vú 64% ở tuổ
i 70
với đột biến 185delAG, 67% ở tuổi 70 với đột biến 5382insC ở người Do
Thái [6].
Parvin và cs (2006), nghiên cứu trên 400 bệnh nhân ung thư vú người
Iran thời kỳ đầu và quan tâm đến các quan hệ huyết thống. Kết quả cho thấy
đột biến 185delAG được tìm thấy ở 2/400 (0,5%) đối với những trường hợp

13
có quan hệ huyết thống, cả hai đột biến này đều rơi vào 2 chị em gái của cùng
một gia đình (chị gái 45 tuổi, em gái 30 tuổi) [37]. Điều đó nói lên rằng trong
quan hệ huyết thống đột biến 185delAG chiếm tỷ lệ rất thấp ở người Iran.
Muhammad và cs (2006), nghiên cứu 176 gia đình ung thư vú và hoặc
ung thư buồng trứng người Pakistan. Kết quả cho thấy phát hiện 23 (13,07%)
đột biến dòng mầm gen BRCA1, trong đó 4
đột biến 185delAG, 185insA,
S1503X và R1835X xuất hiện thường xuyên, chiếm 52% trong tất cả đột biến
được phát hiện ở gen BRCA1[33].
Mitrofannov và cs (2009), phân tích 564 mẫu DNA của nhóm phụ nữ
người Đông Âu mắc ung thư vú. Kết quả cho thấy có 11 bệnh nhân (1,95%)
được phát hiện mang đột biến 5382insC ở dạng dị hợp tử [32].
Almulla và cs (2009), nghiên cứu 241 bệnh nhân bị ung thư vú và hoặc
ung thư buồng trứng để phát hiện đột biến dòng mầ
m ở người Yorkshire
(Anh) trên gen BRCA1. Kết quả cho thấy có 136 (56%) cá thể mang đột biến
gen BRCA1, trong số đó có 28 (20,5%) cá thể mang đột biến 185delAG xảy
ra ở Exon 2 [4].

1.4 Tình hình nghiên cứu gen BRCA2 trên thế giới
Các đột biến trong gen BRCA2 chiếm một lượng đáng kể trong các
trường hợp bị ung thư vú di truyền [25]. Một nghiên cứu mới đây về ung thư
vú gia đình cho thấy nguy cơ gây ung thư vú của gen BRCA2 chiếm khoảng
60-65% ở tuổi 70, 83-87% ở tu
ổi 80 người Ashkenazi [34]. Sự biến đổi ở gen
BRCA2 không phải chỉ có một mà có thể tới hàng chục thậm chí hàng vài
trăm đột biến và những đột biến trên gen BRCA2 không chỉ liên quan đến
ung thư vú mà còn liên quan đến ung thư buồng trứng [33].
1.4.1 Tần suất các đột biến được tìm thấy ở gen BRCA2
Trên thế giới, các đột biến được tìm thấy trên gen BRCA2 xuất hiện
với tần suất rất khác nhau. Khi giải trình tự gen BRCA2 thấ
y có những thay
đổi rất lớn ở những gia đình có quan hệ huyết thống tại nhiều nước và các

14
miền dân số khác nhau, trong đó ở Anh là 9%; Pháp là 18%; Canada là 16%;
Mỹ là 25%; Ở Thụy Điển và Hunggary thì tỷ lệ đó là 35% [13].
Thomas và cs (1998) phát hiện 31 đột biến gen BRCA2 của bệnh nhân
UTV và hoặc UTBT tại các phòng khám của Mỹ [50].
Bảng 1.5. Các đột biến được phát hiện ở gen BRCA2 [50].
Đột biến Tần suất Đột biến Tần suất Đột biến Tần suất
314delTT 1/53 3972del4 2/53 E1953X 2/53
886delGT 2/53 4706del4 4/53 7172del4 0
983del4 4/53 5466insT 0 7297delCT 0
1982delA 2/53 5950delCT 3/53 7990delA 2/53
2041insA 2/53 6174delT 4/53 8141del5 1/53
2041insA 3/53 6426delTT 4/53 9132delC 2/53
Q321X 2/53 6503delTT 2/53 9558ins3del5 0
2157delG 1/53 6696delTC 1/53 R3128X 1/53

2816insA 1/53 6872insA 0 Y3098X 1/53
3036del4 3/53 E1953X 3/53
Helen và cs (2002) phát hiện 7 đột biến trên gen BRCA2 ở người da
trắng, người Mỹ-Phi và người gốc Mỹ La Tinh - Hispan. Trong nghiên cứu
này đột biến 6174delT xuất hiện với tần số 1/9 (11,1%) [25].
Ewa và cs (2002) phát hiện 2 đột biến 6174delT và 9631delC trên gen
BRCA2 người BaLan. Đột biến 6174delT chiếm 1,13%, đột biến 9631delC
chiếm 1,04% trong tổng 148 bệnh nhân ung thư vú [18].
Almulla và cs (2009) phát hiện 10 đột biến trên gen BRCA2 ở người
Yorkshire (Anh) [4].






15
Bảng 1.6. Các đột biến được tìm thấy ở gen BRCA2 [4].
Các đột biến Exon
Tần
suất
Tỷ lệ
%
Các đột biến Exon
Tần
suất
Tỷ
lệ %
6714_6717del
ACAA

11 2 11,8 3386T>G 11 1 5,9
6503delTT
11 1 5,9
3036delACAA
11 1 5,9
6174delT
11 1 5,9
Tổng số
18
6137C>A
11 2 11,8
295G>T
2 4 100
5950delCT
11 2 11,8
Tổng số
4
5368delATTT
11 1 5,9
9138insA
23 1 100
5056insG
11 3 17,6
Tổng số
1
4859insA
11 2 11,8
860–1G>A
8 2 100
4329insA

11 1 5,9
Tổng số
2
4329delA
11 1 5,9

Tuy có rất nhiều đột biến xảy ra trên gen BRCA2 nhưng đột biến
6174delT được gọi là "đột biến thường xuyên" cũng xuất hiện với các tần suất
khác nhau ở mỗi tộc người khác nhau.
1.4.2 Tần suất đột biến 6174delT trên gen BRCA2
Neuhausen và cs (1996), nghiên cứu 200 phụ nữ ung thư vú thời kỳ
đầu gồm 107 người Ashkenazi và 93 người không phải Ashkenazi. Kết quả
cho thấy 6/80 (8%) bệnh nhân mang đột biến 6174delT ở tuổi trướ
c 42 và
2/27 (7%) bệnh nhân mang đột biến trên ở tuổi 42-50 có tiền sử gia đình bị
ung thư vú hoặc ung thư buồng trứng. Không phát hiện thấy đột biến
6174delT ở 93 người không có nguồn gốc Do Thái [34].
Roa và cs (1996), nghiên cứu 107 phụ nữ Do Thái ung thư vú. Kết quả
cho thấy 8/107 (7,4%) bệnh nhân mang đột biến 6174delT ở độ tuổi 50.
Nhưng khi nghiên cứu 3085 trường hợp được lựa chọn một cách ngẫu nhiên

16
trong dân số người Ashkenazi. Kết quả cho thấy đột biến 6174delT chiếm
1,52% [44].
Dvora và cs (1997), nghiên cứu 243 bệnh nhân bị ung thư vú và hoặc
ung thư buồng trứng, trong đó 199 bệnh nhân là người gốc Ashkenazi và 44
bệnh nhân không phải người Ashkenazi. bệnh nhân được chia thành 2 nhóm:
Nhóm ung thư buồng trứng và nhóm ung thư vú. Kết quả cho thấy trong tổng
số 199 người Ashkenazi có 14 bệnh nhân mang 6174delT (7%). Nhưng nếu
tính rêng nhóm ung thư buồng trứng thì những bệnh nhân mang đột biến

6174delT chi
ếm tỷ lệ 28,6% (6/21). Ở nhóm ung thư vú tỷ lệ bệnh nhân mang
đột biến 6174delT chiếm 4,5% (8/178). Nhóm bệnh nhân ung thư cả 2 vú thì
tỷ lệ bệnh nhân mang đột biến này lại là rất cao 7,1% độ tuổi dưới 40; 3,3% ở
tuổi 40-50; 4,5% ở tuổi trên 50 [12]. Trong khi đó nghiên cứu của Antoniou
(2003) thì tỷ lệ bệnh nhân người Do Thái mang đột biến 6174delT là 9.4% ở
tuổi 40; 10.8% ở tuổi 50; 21.6% ở tuổi 60 và 58.1% ở tuổi 70 [6].
Flora và cs (1998), nghiên cứu 268 phụ nữ Do Thái ung th
ư vú không
liên quan đến tiền sử gia đình. Kết quả cho thấy 8/268 (3%) bệnh nhân mang
đột biến 6174delT trên gen BRCA2 [20].
Theo Pak Cheung và cs (1999), nghiên cứu 66 phụ nữ người Do Thái bị
ung thư vú và hoặc ung thư buồng trứng. Kết quả phát hiện ra 3/66 (4,5%)
bệnh nhân mang đột biến 6174delT trên gen BRCA2 [36].
Ellen và cs (1999), nghiên cứu 412 bệnh nhân người Do Thái bị ung
thư vú. Kết quả đã phát hiện 15/412 (3,6%) bệnh nhân mang đột biến
6174delT gen BRCA2. Độ tuổi TB của những bệnh nhân này là 46,4 [16].
Foukes và cs ( 2000), bằng việc gi
ải trình tự gen BRCA2 của 118 bệnh
nhân ung thư vú người Do Thái Ashkenazi có độ tuổi dưới 65. Kết quả cho
thấy có 3/118 (2,5%) cá thể mang đột biến 6174delT trong gen BRCA2 [22].



17
1.5. Tình hình nghiên cứu gen BRCA1 và BRCA2 ở Việt Nam.
Lê Thị Minh Chính và cs (2004), đã tiến hành nghiên cứu đột biến gen
BRCA1 và BRCA2 ở 24 bệnh nhân ung thư vú được thu thập ngẫu nhiên tại
bệnh viện K Hà Nội. Kết quả cho thấy không phát hiện thấy đột biến
185delAG và 6174delT (những đột biến khá phổ biến ở các bệnh nhân ung

thư vú trên thế giới). Điều này cho thấy tần suất đột biến 185delAG và
6174delT có thể là rất thấ
p với dân số Việt Nam bị ung thư vú [2].
1.6. Một số phương pháp xác định đột biên gen BRCA1 và BRCA2
Các phương pháp di truyền phân tử đã được ứng dụng, phát hiện bất
thường gen BRCA1 và BRCA2 như: giải trình tự gen, PCR và RT-PCR.
1.6.1 Kỹ thuật giải trình tự gen
Từ những năm 1977 một số phương pháp giải trình tự gen đã được phát
minh như phương pháp hóa học (Alan Maxam và Walter Gilbert) và phương
pháp Dideoxy (Frederick Sanger 1977).
Nguyên lý chung của hai phương pháp là đều t
ạo ra các đoạn
oligonucleotid có chiều dài khác nhau và có xác suất xuất hiện như nhau trong
phản ứng. Các trình tự này được phân tích bằng điện di trên gel
polyacrilamid, kết quả được đọc trên bản phóng xạ tự ghi hoặc nhờ máy dò tự
động.
Máy giải trình tự gen tự động được thiết kế trên nguyên tắc sử dụng
dideoxynucleotid (dNTP). Với các máy thế hệ sau này người ta dùng 4 màu
huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại dNTP. Nhờ vậ
y phản ứng giải
trình tự có thể thực hiện trong một ống nghiệm và chỉ cần điện di trên 1 hàng
chứ không phải trên 4 hàng như trước đây. Đối với phương pháp này, mỗi khi
có một vạch điện di đi qua, phân tử dNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA
sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc và
chuyển về máy tính phân tích. Dựa vào màu huỳnh quang, máy sẽ
nhận diện

18
được các nucleotid, từ đó biết được trình tự của DNA đích. Phương pháp này
giúp phát hiện chính xác các đột biến xuất hiện ở gen BRCA1 và BRCA2.

Hình 1.5. Hình ảnh minh họa giải trình tự một đoạn DNA
(Nguồn: Sanger cequencing read display.gif)
1.6.2 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Kỹ thuật PCR được Karl Mullis người Mỹ thực hiện vào năm 1985. Từ
đó đến nay kỹ thuật này được sử dụng rất phổ biến và ứ
ng dụng rất nhiều
trong các thí nghiệm về sinh học phân tử.
a, Nguyên tắc của phản ứng PCR.
Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi
tính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của các DNA
polymerase chịu nhiệt (Taq-polymerase) với nguyên liệu là 4 loại
deoxyribonucleotide (dATP, dTTP, dGTP, dCTP). Enzym DNA - polymerase
xúc tác tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn. Phản ứng đòi hỏi
sự có m
ặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu
của trình tự DNA khuôn.
Taq-polymerase là một loại DNA - polymerase (tách chiết từ vi khuẩn
chịu nhiệt Thermus aquaticus), còn mồi (primer) là những đoạn DNA ngắn có
khả năng bắt cặp với một đầu của mạch khuôn, DNA polymerase sẽ nối dài
mồi để hình thành đoạn mới. Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụ
ng
để làm khuôn cho các phản ứng tiếp theo. Sau mỗi chu kỳ, số lượng phân tử
DNA tăng gấp đôi, vậy sau n chu kỳ số lượng sản phẩm PCR là 2
n
, đủ số

lượng để tách ra, giải mã hoặc tách dòng.

19
b, Phương pháp tiến hành:
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mối chu kỳ
gồm 3 bước:
- Bước 1: Là giai đoạn biến tính (denaturation). Thành phần phản ứng PCR
nói chung gồm những thành phần cơ bản sau: Dung dịch đệm PCR, dNTP,
mồi xuôi và ngược, Taq-polymerase và DNA khuôn. Trong giai đoạn này
DNA được biến
tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân t
ử, thường là 94
0
C-
95
0
C với thời gian 30-60 giây.
- Bước 2: Giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ lúc này phải hạ thấp để các
mồi bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này trong khoảng 40-70
0
C tuỳ thuộc Tm của
các mồi sử dụng và được kéo dài 30-60 giây.
- Bước 3: Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension). Nhiệt độ được tăng lên
72
0
C để các enzym polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian tuỳ thuộc vào độ
dài trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 phút đến nhiều phút.
Sau mỗi chu kỳ các chuỗi DNA mới tạo thành tiếp tục được dùng làm
khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Sản phẩm cuối
của sản phẩm PCR là những đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài bằng khoảng

cách giữa hai đoạ
n gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm được xác định
bởi đầu tận 5' của 2 đoạn gen mồi.
Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1,5-3%, chạy cùng với
marker để so sánh đối chiếu độ lớn của đoạn DNA cần quan tâm.






20













Hình 1.6. Các bước cơ bản của phản ứng PCR
(Nguồn: Vierrstraete, 1999)
c, Các kỹ thuật PCR thường được sử dụng để phát hiện đột biến gen BRCA.
* PCR đơn mồi (monoplex PCR): Đây là kỹ thuật PCR kinh điển nhất. Mỗi
phản ứng PCR sử dụng duy nhất một cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại một

đoạ
n gen đặc hiệu từ phân tử DNA của tế bào. Sau khi khuếch đại đoạn DNA
cần quan tâm, sử dụng enzyme cắt để xác định đột biến điểm xảy ra trên gen
BRCA1 hoặc BRCA2. Nhiều tác giả đã sử dụng kỹ thuật PCR đơn mồi này
để phát hiện 3 đột biến thông thường 185delAG, 5382insC trên gen BRCA1
và 6174delT trên gen BRCA2 ở bệnh nhân ung thư vú.
Năm 1997 Dvora và cs đã tiến hành thực hiện phản ứng PCR đơn m
ồi
để phát hiện đột biến 185delAG gen BRCA1 và 6174delT gen BRCA2. Sản
phẩm PCR được cắt lần lượt bởi enzym HinfI, BbrPI tương ứng với 2 gen
trên. Nếu là alen bình thường sẽ có một vị trí đặc hiệu cho enzyme cắt, còn
30 - 40 chu kỳ
Mỗi chu kỳ gồm 3
b
ớ
Mồi xuôi và mồi
Bước 1: Biến tính
94
0
C trong 1 phút
Bước 2: Bắt cặp
54
0
C trong 45 giây
Bước 3: Kéo dài
72
0
C trong 2 phút

21
alen đột biến không có vị trí đặc hiệu cho enzyme cắt, nghĩa là độ lớn của
alen bình thường và alen đột biến chênh nhau khoảng 20 bp sau khi sử dụng
enzyme cắt. Qua điện di gel agarose 3% ta có thể dễ dàng phát hiện các alen
đột biến [12].






a b
Hình 1.7. Điện di đồ phát hiện ĐB 6174delT và 185delAG (Dvora 1997)
a, Phân tích giới hạn (BbrPI) của đột biến 6174delT; b, Phân tích giới hạn
(HinfI) của đột biến 185delAG; H: Dị hợp tử; N: bình thường; u: Không cắt
Năm 2004 Lilian Jara và cs cũng sử dụng enzyme cắt HinfI và DdeI để
phát hiện đột biến 185delAG gen BRCA1 và 5382insC gen BRCA2 của 63
gia đình người Chi Lê. Sản phẩm cắt được kiểm tra trên gel agarose 3%, so
sánh với chỉ thị DNA để phát hiện alen đột bi
ến [28].
*PCR đa mồi (multiplex PCR): PCR đa mồi là phương pháp PCR sử dụng
đồng thời nhiều cặp mồi đặc hiệu khác nhau để nhân các đoạn DNA đặc trưng
khác nhau trên một phân tử DNA hoặc trên các phân tử DNA khác nhau
[36,37].

22

















Bằng phương pháp PCR đa mồi được mô tả trên, Pavin và cs (2006) đã
sử dụng phương pháp này để phát hiện đồng thời 3 đột biến thông thường
185delAG, 5382insC và 6174delT ở 400 bệnh nhân ung thư vú thời kỳ đầu
người Iran. Kết quả thể hiện trên hình 1.10.

Hình 1.8. Phản ứng PCR đa mồi phát hiện các đột biến 185delAG,
5382insC và 6174delT [37]
1 Marker 6 Đột biến 6174delT
2 Dạ
ng hoang dại 7 Đột biến 185delAG và 5382insC
3 Dạng hoang dại 8 Đột biến 185delAG và 6174delT

4 Đột biến 185delAG 9 Đột biến 5382insC và 6174delT
CÁC BƯỚC TRONG QUY TRÌNH CHUẨN CỦA KÝ THUẬT PCR ĐA THÀNH PHẦN
Bước 1: Chọn chuỗi mồi
- GC = 30%
- Kích thước 20 bp hoặc dài hơn
- Sản phẩm khuếch đại được điện di riêng rẽ
trên gel
Bước 2: Thử nghiệm/ghép đôi
các cặp mồi
- mồi xuôi với mồi ngược
- Chạy chương trình Blast để kiểm tra lại
trình tự các mồi
Bước 3: PCR ở từng vị trí
- Khuếch đại từng vị trí một trong cùng điều
kiện
- Dùng Buffer 1x, không có các thành phần
phụ
- Chỉ điều chỉnh điều kiện của chu kỳ
Bước 4: PCR đa thành phần:
Trộn các mồi với tỷ lệ tương đương
- 0,1-0,4 µM với mỗi mồi
- Sử dụng chương trình PCR từ bước 3
- Chỉ điều chỉnh điều kiện của chu kỳ
Bước 5 A. Nếu các băng xuất hiện mờ thì:
a, Tăng thời gian bắt cặp
b, Giảm nhiệt độ xuống còn 62-68
o
C
c, Giảm nhiệt độ thực hiện phản ứng thành từng
bước nhỏ (2

o
C)
d, Điều chỉnh nồng độ Taq-polymerase
e
,
Kết h
ợp
Aa
,
Ab
,
Ac và Ad
Bước 5 B. Nếu các băng ngắn mờ
a, Tăng nồng độ Buffer từ 1x lên1,4 hoặc
2x
b, Giảm nhiệt độ thực hiện quy trình
và/hoặc nhiệt độ kéo dài
c, Tăng nồng độ mồi đối với các vị trí
mờ
d, Kết hợp Ba, Bb, Bc
Bước 5 C. Nếu các băng dài mờ thì:
a, Tăng thời gian kéo dài
b, Tăng nhiệt độ thực hiện quy trình và/hoặc
nhiệt độ kéo dài
c, Tăng nồng độ mồi đối với các vị trí mờ
d, Giảm nồng độ Buffer xuống còn 0,7-0,8x,
nhưng giữ nguyên nồng độ MgCl
2
ở mức 1,5-
2mM

e, Kết hợp Ca, Cb, Cc, Cd
Bước 5 D. Nếu xuất hiện băng không đặc hiệu
a, Với băng dài: tăng nồng độ Buffer lên 1,4-2x
b, Với băng ngắn: Giảm nồng độ Buffer xuống còn 0,7-
0,9x
c, Tăng dần nhiệt độ thực hiện quy trình
d, Giảm nồng độ DNA và enzyme
e, Tăng nồng độ MgCl
2
lên 3, 6, 9 và 12 mM nhưng giữ
nguyên nồng độ dNTP ở mức 200 µM đối với mỗi băng
f, Kết hợp Da, Db, Dc, Dd, De
Bước 5 E. Không có các trường hợp trên thì:
a, Sử dụng các thành phần khác: BSA 0,1-0,8 µg/µl
b, Sử dụng các thành phần khác 5% (v/v) DMSO hoặc glycerol
c, Kiểm tra lại mối tương quan giữa các mồi
d, Tha
y
đổi tất cả các
p
hươn
g

p
há
p
và sử dụn
g
nồn
g

độ dNTP
m
ới

23
5 Đột biến 5382insC 10 Đột biến 185delAG, 5382insC và 6174delT
Theo tác giả, nếu mỗi bệnh nhân có 1 alen đột biến sẽ xuất hiện 2 băng
trên bản gel điện di. Như vậy tối đa một người có thể nhận được 6 băng trên
bản gel điện di nếu mỗi đột biến chỉ xuất hiện ở 1 alen và người đó mang
đồng thời 3 đột biến 185delAG, 5382insC và 6174delT [37].
1.6.3 Phương pháp Real-Time PCR
Ngoài 2 phương pháp như giải trình tự gen và PCR, hiện nay nhiều tác
giả đã sử dụng phương pháp Real-Time PCR để phát hiện các đột biến gen
BRCA1 và BRCA2. Trong kỹ thuật PCR sau khi hoàn tất khuếch đại đoạn
DNA đích, phải điện di sản phẩm PCR trên gel agarose để kiểm tra xem có
vạch sản phẩm khuếch đại đúng kích thước hay không? Còn Real-time PCR
là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị được ngay sau mỗ
i
chu kỳ nhiệt của phản ứng. Do đặc điểm này nên người làm thí nghiệm
không cần phải làm tiếp các bước thí nghiệm khác để xác định có sản phẩm
khuếch đại đích hay không. Như vậy có thể nói Real-time PCR là kỹ thuật
nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ
nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với
phản ứng khuếch đại xảy ra để người làm thí nghiệm có thể thấy được [45].
Tuy vậy, kỹ thuật này đòi hỏi phải có một hệ thống thiết bị máy móc hiện đại,
độ tin cậy cao thì kết quả mới chính xác.
Scort và cs (2006), Mitrofanov và cs (2008), sử dụng phương pháp Real-
Time PCR để phát hiện các đột biến 185delAG; 5382insC trên gen BRCA1 và
6174delT gen BRCA2 ở người Ashkenazi [45,32].

24


CHƯƠNG 2












Hình 1.9. Phát hiện các đột biến 158delAG, 5382insC và 6174delT bằn
g

Real-Time PCR (Scort và cs, 2006).
1,
Số chu kỳ của phản ứng PCR; 2, Chu kỳ nhiệt các đột biến và dạng bình
thường


25
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu gồm 150 bệnh nhân nữ ung thư vú được chẩn

đoán và điều trị tại Bệnh viện K. Các trường hợp này được lựa chọn một cách
ngẫu nhiên từ tháng 3/2007 - 3/2009. Bệnh nhân được lấy mẫu DNA để xác
định đột biến gen BRCA1 và BRCA2.
2.2. DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HOÁ CHẤT NGHIÊN CỨU
2.2.1. Dụng cụ
Các dụng cụ phải được vô trùng tuyệ
t đối (hấp ướt ở 120
o
C trong 20 -
30 phút, sau đó sấy khô ở 36
o
C). Như eppendorf 1,5ml; ống Falcol 1,0 ml,
đầu côn 2.2.2. Trang thiết bị
Đề tài đã sử dụng các trang thiết bị tại Trung tâm nghiên cứu Gen-
Protein, Trường Đại học Y Hà Nội và các trang thiết bị của phòng Công Nghệ
Gen Động Vật, Viện Công Nghệ Sinh học, thuộc Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.
Bảng 2.1. Các thiết bị phân tích và thí nghiệm đã sử dụng
TT Thiết bị Hãng sản xuất Tên nước
1 Tủ lạnh sâu -20
0
C, -70
0
C Sanyo Nhật
2 Lò vi sóng Samsung Hàn Quốc
3 Cân phân tích AB204- Mettler
Toledo
Mỹ
4 Máy vortex Rotolab Scientific
Industries

Mỹ
6 Bể ổn nhiệt Eppendorf Đức
7 Nồi khử trùng Cooperation Mỹ
8 Quang phổ kế Dioderray
spectophotometer 8452A
Thermo
Mỹ
9 Máy ly tâm lạnh Hitachi Nhật