Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử SSR trong chọn giống bạch đàn lai (E. urophylla x E. exserta) (Luận văn thạc sĩ)

i

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THỊ LINH ĐAM

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR TRONG CHỌN
GIỐNG BẠCH ĐÀN LAI (EUCALYPTUS UROPHYLLA x E. EXSERTA)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội, 2017


ii

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THỊ LINH ĐAM

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR TRONG CHỌN
GIỐNG BẠCH ĐÀN LAI (EUCALYPTUS UROPHYLLA x E. EXSERTA)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14
\

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. Nguyễn Việt Cƣờng

Hà Nội, 2017


i

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Việt Cường – Trưởng
bộ môn Lai giống và sinh học hạt phấn đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn
thành luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn lãnh đạo Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ
sinh học Lâm nghiệp, phòng đào tạo sau đại học Viện sinh thái và Tài nguyên
sinh vật – Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam, các thầy cô giáo
cùng toàn thể anh chị em đồng nghiệp đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt
chương trình học và luận văn của mình.
Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè và các đơn vị
công tác đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn của mình.
Tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2017

Học viên

Nguyễn Thị Linh Đam

ii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN…………………………………………………………...…….i
MỤC LỤC ........................................................................................................ ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... iv
DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................... v
DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................ vi
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3
A. Ngoài nƣớc .................................................................................................. 3
1.1. Những nghiên cứu về chọn giống bạch đàn ............................................... 3
1.2. Giới thiệu về chỉ thị SSR và một số ứng dụng trong chọn giống .............. 5
1.2.1. Giới thiệu về chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat) ........................... 5
1.2.2. Ưu điểm của chọn giống bằng chỉ thị phân tử ...................................... 7
1.2.3. Một số ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn giống ........................ 9
B. Trong nƣớc ................................................................................................ 15
1.3. Những nghiên cứu về chọn giống bạch đàn ở Việt Nam ......................... 15
1.4. Ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn giống ở Việt Nam................... 17
CHƢƠNG II. MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ............................................................................................... 20
2.1. Mục tiêu.................................................................................................... 20
2.2. Nội dung ................................................................................................... 20
2.3. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 20
2.3.1. Vật liệu sử dụng để sàng lọc các cặp mồi SSR đa hình ...................... 20
2.3.2. Vật liệu sử dụng để phân tích sự liên quan của các cặp mồi SSR với
tính trạng sinh trưởng của bạch đàn lai ........................................................... 21
2.3.3. Các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu ...................................... 24
2.4. Hóa chất và thiết bị .................................................................................. 24

iii

2.4.1. Hóa chất .............................................................................................. 24
2.4.2. Thiết bị................................................................................................. 25
2.5. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 25
2.5.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá ................................ 25
2.5.2.Phương pháp đo nồng độ bằng quang phổ kế ...................................... 26
2.5.3. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ............................... 26
2.5.4. Phương pháp điện di trên gel agarose 1%........................................... 27
2.5.5. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 5%. ............................. 27
2.5.6. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu. ............................................. 29
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................. 32
3.1. Thu thập thông tin về trình tự từ các mồi SSR có liên quan đến loài bạch
đàn ................................................................................................................... 32
3.2. Sàng lọc các cặp mồi SSR để tìm ra các cặp mồi SSR đa hình ............... 34
3.2.1. Tách chiết ADN tổng số và điện di kiểm tra ...................................... 34
3.2.2. Xác định điều kiện PCR tối ưu cho việc nhân đoạn SSR ................... 36
3.2.3. Kết quả phân tích sự đa hình bằng điện di trên gel polyacrylamide ... 38
3.3. Xác định các cặp mồi SSR liên quan đến sinh trưởng nhanh .................. 47
3.4. Kiểm chứng các chỉ thị có liên quan đến tính trạng sinh trưởng ............. 53
CHƢƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................ 59
1. Kết luận ....................................................................................................... 59
2. Kiến nghị ..................................................................................................... 59
PHỤ LỤC ....................................................................................................... 67


iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
TT

Chữ viết tắt

Giải thích

1

ADN

Acid Deoxyribonucleic

2

AFLP

Amplified Fragments Length Polymorphism

3

ARN

Acid Ribonucleotide

4

bp

Cặp base (base pair)

5

C:I

Chloroform : Isoamyl Alcolhol

6

CTAB

Cetyl trimethylammonium bromide

7

dNTPs

Deoxynucleotide triphosphate

8

EDTA

Ethylene Diamin Tetra Acetate

9

OD

Optical density

10

PCR

Polymerase Chain Reaction

11

RAPD

12

QTL

Quantative trait locus

13

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism

14

SSR

Simple sequence repead

15

TAE

Tris acetic EDTA

16

TBE

Tris boric EDTA

17

UV

Tia tử ngoại (Ultraviolet)

18

UC

Bạch đàn lai giữa Uro và Camal

19

UE

Bạch đàn lai giữa Uro và Eserta

Random Amplified Polymorphic ADN

v

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Bảng

Nội dung

Trang

Hình 3.1 Kết quả điện di ADN tổng số các mẫu lá bạch đàn lai

35

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR với các cặp mồi SSR ở 56°C

37

Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR với các cặp mồi SSR ở 58°C

37

Hình 3.4 Mức độ đa hình của một số cặp mồi EMBRA

39

Hình 3.5

Kết quả điện di sản phẩm PCR các mẫu với chỉ thị

EMBRA39

Hình 3.6 Kết quả điện di 9 dòng bạch đàn lai với EMBRA229
Hình 3.7

Hình 3.8

Kết quả điện di 9 dòng bạch đàn lai với EMBRA78 trên gel
polyacrylamide 5%
Kết quả điện di 9 dòng bạch đàn lai với EMBRA209
trên gel polyacrylamide 5%

46
55
56

56


vi

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng

Nội dung

Trang

2.1

Danh mục 22 mẫu được sử dụng để sàng lọc cặp mồi SSR đa hình

20

2.2

Các dòng bạch đàn lai sinh trưởng nhanh và chậm ở Bầu Bàng
Bình Dương (2002-2012)

21

2.3

Các dòng bạch đàn lai được sử dụng trong nghiên cứu

22

2.4

Thành phần phản ứng PCR

26

3.1

Kết quả đo OD các mẫu ADN tổng số

35

3.2

3.3
3.4

Nhiệt độ bắt cặp của 205 cặp mồi EMBRA sau khi tối ưu sử dụng
trong nghiên cứu (chi tiết ở phụ lục 2)
Số alen và hệ số PIC của 106 cặp mồi có đa hình
53 chỉ thị SSR có độ đa hình cao được sử dụng để sàng lọc chỉ thị
SSR liên kết với sinh trưởng nhanh

38
40
42

3.5

Các kiểu gen của 104 cây được phân tích bởi chỉ thị EMBRA39

43

3.6

Kết quả điện di của 8 cặp mồi liên quan đến sinh trưởng với 60 dòng

47

3.7

Tương quan của các cặp mồi EMBRA với năng suất bạch đàn lai

50

3.8
3.9

Các dòng bạch đàn lai thể hiện năng suất cao và thấp tại các hiện
trường khảo nghiệm Bầu Bàng Bình Dương (2002-2010)
Sự liên kết giữa các chỉ thị SSR với tính trạng (NS - năng suất)

54
54


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cải thiện sinh trưởng (năng suất) cây rừng là một mục tiêu chọn giống
quan trọng trong nhiều chương trình nghiên cứu lâm nghiệp, tuy nhiên năng
suất có hệ số di truyền thấp. Năng suất là một tính trạng số lượng phức tạp
thể hiện qua các thông số đường kính và chiều cao, về cơ bản nó là tổng hợp
của nhiều tính trạng khác nhau, ảnh hưởng lớn bởi các yếu tố môi trường.
Sự khác biệt về năng suất không phải do sự phân li của một hoặc hai
gen mà là do sự phân li của rất nhiều gen, với ảnh hưởng của mỗi gen là nhỏ.
Tính trạng số lượng không phân li thành các nhóm cụ thể, do đó ta không thể
đơn giản chỉ sử dụng các nguyên lí di truyền Mendel để nghiên cứu.
Các nghiên cứu về chọn giống cây trồng lâm nghiệp trong nước và quốc
tế có sự trợ giúp của công nghệ sinh học đã có những thành công nhất định,
như nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống bạch đàn (E.
globulus, E. nitens) đã được Bundock và cộng sự 2008; Freeman và cộng sự
2009 cho thấy các chỉ thị SSRs, RAPDs có tương quan đến sinh trưởng về
đường kính cây với mức đóng góp biến dị kiểu hình từ 3,8 đến 17,9%, ngoài

ra tác giả cũng chỉ ra một số tính trạng về chất lượng như mật độ gỗ, hàm
lượng xenlulô, lignin cũng đóng góp cho mức biến dị từ 5,6 - 12,3% [20] [28].
Theo Brondani và cộng sự, (2006) trên bản đồ liên kết cho loài E.
grandis, trong số 172 chỉ thị có 153 (89%) chỉ thị giữ nguyên vị trí trên bản
đồ chung cho Eucalyptus. Trong khi đó trên bản đồ liên kết cho loài E.
urophylla có 140 trên 152 (92%) chỉ thị giữ nguyên vị trí trên bản đồ chung [19].
Anand Raj Kumar Kullan và cộng sự (2012) đã nghiên cứu về sự di
truyền của các tính trạng tăng trưởng, tỷ trọng gỗ và biểu hiện của gen ở trong
hai gia đình lai trở lại giữa loài Bạch đàn urô và Bạch đàn grandis đã xác định
được 2 QTL đường kính thân và 12 QTL cho tỷ trọng gỗ. Các QTLs cho
đường kính và tỷ trọng gỗ cho thấy mức đóng góp biến đổi kiểu hình là 3,1 -


2

12,2%. Như vậy cả tính trạng chất lượng lẫn số lượng ở các nghiên cứu chỉ
đóng góp dưới 18% biến dị cho các tính trạng nghiên cứu.
Một gợi ý của Bala R. Thumma và cộng sự 2010 là nghiên cứu chọn
giống truyền thống có sự trợ giúp của công nghệ sinh học (chỉ thị phân tử liên
kết với tính trạng sinh trưởng) để tăng hiệu quả lựa chọn cho những tính trạng
số lượng có di truyền thấp, như là năng suất vẫn là cách tiếp cận có hiệu quả.
Đây chính là hướng đề tài“ Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử SSR trong
chọn giống bạch đàn lai (E. urophylla x E. exserta)” được đề xuất và thực
hiện [41].
Luận văn này là một phần của đề tài “Nghiên cứu chọn giống bạch đàn
lai bằng chỉ thị phân tử” giai đoạn 2012-2016, do TS. Nguyễn Việt Cường
làm chủ nhiệm đề tài và tôi là cộng tác viên đề tài.


3

CHƢƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
A. Ngoài nƣớc
1.1. Những nghiên cứu về chọn giống bạch đàn
Các loài bạch đàn (Eucalyptus) có nguồn giống từ Australia và Indonesia
đã được gây trồng rộng rãi trên thế giới và đóng vai trò hết sức quan trọng
trong trồng rừng cung cấp nguyên liệu giấy, ván dăm, gỗ xây dựng và đồ nội
thất. Tổng diện tích rừng trồng bạch đàn trên thế giới đến năm 2000 là 17,9
triệu ha, tập trung chủ yếu ở các nước như Braxin, Công Gô, Trung Quốc, Ấn
Độ, Nam Phi. Chỉ riêng các nước khu vực Đông Nam Á và Nam Trung Quốc
(gồm có 2 tỉnh Quảng Đông và Quảng Tây), diện tích trồng rừng keo và bạch
đàn lên tới khoảng 7 triệu ha (Harwood và Nambiar, 2014) [30].
Nghiên cứu chọn giống bạch đàn là một khâu quan trọng trong chiến
lược cải thiện giống nhóm loài bạch đàn. Mặc dù, nhiều loài bạch đàn có biên
độ sinh thái rộng nhưng khi được trồng trên nhiều quốc gia khác nhau thì
bạch đàn có sự phân hóa mạnh về sinh trưởng. Các chương trình khảo nghiệm
bạch đàn ở một số quốc gia đã và đang được chú trọng như Công Gô (1970 1981) đã khảo nghiệm trên 100 xuất xứ của loài Bạch đàn urô. Hafeez. M,
Seikh M.I. (Pakistan) (1972) đã khảo nghiệm 22 xuất xứ của loài Bạch đàn
caman với nguồn hạt giống được nhập từ Úc, qua khảo nghiệm tác giả đã
chọn ra được 6 xuất xứ thích hợp và nhập nội hạt giống để trồng trên quy mô
lớn [29].
Chew T.K. (1980) đã khảo nghiệm 10 loài tại 3 nơi khác nhau trên bán
đảo Malaysia. Sau 10 năm trồng, tác giả nhận thấy sinh trưởng tốt nhất là loài
Bạch đàn caman (2 xuất xứ Bắc Úc) và Bạch đàn degluta, các loài triển vọng
khác là Bạch đàn brassiana, Bạch đàn urô và Bạch đàn tere [25].
Tại Nam Phi từ năm 1973 - 1974 đến năm 1980, Darrow W.K. (1983) đã
tiến hành 9 khảo nghiệm phối hợp của 26 xuất xứ Bạch đàn caman và 23 xuất

4

xứ của Bạch đàn tere. Kết quả cho thấy: ở những vùng ẩm thì Bạch đàn
grandis cho năng suất cao nhất, sau đó đến Bạch đàn tere, còn ở những vùng
khô hạn và có sương giá thì Bạch đàn caman lại cho năng suất cao hơn.
Rao D.V. (1984) tiến hành khảo nghiệm nhiều xuất xứ khác nhau của
Bạch đàn caman, Bạch đàn tere tại các vùng Pradesh, Maharastra và Haryana
của Ấn Độ. Qua điều tra sinh trưởng cho thấy có 10 xuất xứ Bạch đàn caman
và 5 xuất xứ Bạch đàn tere sinh trưởng tốt [34].
Ngoài ra, các năm 80 - 90 của thế kỷ XX còn có nhiều tác giả nghiên
cứu về chọn loài và xuất xứ bạch đàn ở nhiều nước khác nhau như: Agpaoa
A.C (1986) khảo nghiệm loài và xuất xứ bạch đàn tại Philippine. Watanabe H.
(1987) tiến hành khảo nghiệm các xuất xứ của loài Bạch đàn caman tại Thái
Lan [43]. Sun D., Dickinson G.R. (1997) thí nghiệm tuyển chọn 28 loài trên
đất mặn và đất không mặn tại miền Đông bắc nhiệt đới khô ở Úc [40].
Năm 1975 Viện nghiên cứu lâm nghiệp Quảng Tây (Trung Quốc) đã lai
giữa Bạch đàn saligna với Bạch đàn liễu tạo ra được một số tổ hợp lai có khả
năng vượt trội hơn loài Bạch đàn liễu tới 82% về thể tích thân cây, trong đó tổ
hợp lai nghịch Bạch đàn liễu x Bạch đàn saligna có sinh trưởng nhanh hơn tổ
hợp lai thuận Bạch đàn saligna x Bạch đàn liễu (Shuxiong, 1989) [39]. Hiện
các giống lai được trồng chủ yếu ở các vùng ven biển vì chúng có khả năng
chịu gió bão tốt đồng thời sinh trưởng nhanh.
Từ năm 1989 Viện lâm nghiệp nhiệt đới của Trung Quốc cũng tạo ra 204
cây lai từ các cặp bố mẹ giữa Bạch đàn urô với các loài Bạch đàn tere, Bạch
đàn caman, Bạch đàn liễu, Bạch đàn grandis, Bạch đàn saligna và Bạch đàn
pellita. Trong đó một số cá thể cây lai từ các tổ hợp Bạch đàn urô x Bạch đàn
tere và Bạch đàn urô x Bạch đàn caman đã có ưu thế lai rõ rệt về sinh trưởng
so với bố mẹ của chúng, cây lai có thể tích vượt bố mẹ với các trị số tương
ứng là 120,7% và 89,4% (Xiang & Wang, 1996; Shen, 2000) [38], [44] .

Luận văn đủ ở file: Luận văn full