PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TỪ ĐẤT VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG AFLATOXIN CỦA CÁC GỐC PHÂN LẬP ĐƯỢC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TỪ ĐẤT VÀ
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG AFLATOXIN CỦA
CÁC GỐC PHÂN LẬP ĐƯỢC

Giáo viên hướng dẫn: PGS – TS. Nguyễn Ngọc Hải
Họ và tên sinh viên: Trương Hương Thảo
Lớp: DH04DY
Niên khóa: 2004 – 2009

Tháng 9/2009


PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TỪ ĐẤT VÀ KHẢO
SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG AFLATOXIN CỦA CÁC GỐC PHÂN
LẬP ĐƯỢC

Tác giả

TRƯƠNG HƯƠNG THẢO

Khóa luận được đệ trình đề để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sỹ ngành Thú y

Giáo viên hướng dẫn:
PGS – TS. NGUYỄN NGỌC HẢI

Tháng 9/2009

i


LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin kính gửi lời cảm ơn Thầy Nguyễn Ngọc Hải đã hướng dẫn
cho em hoàn thành luận văn này với tất cả tinh thần, trách nhiệm và lòng nhiệt
thành.
Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Phòng Vi Sinh, Khoa Chăn Nuôi Thú
Y và Trường Đại Học Nông Lâm đã tận tình giúp đỡ và truyền đạt kiến thức quý
giá cho em trong suốt quá trình học tập ở trường.
Xin cảm ơn tất cả bạn bè đã luôn luôn bên cạnh giúp đỡ và đóng góp ý kiến
cho tôi trong quá trình học tập, trong cuộc sống cũng như khi thực hiện đề tài.
Và trên hết, con xin kính gửi đến Bố Mẹ những lời biết ơn chân thành và sâu
sắc nhất bởi những gì con đã và đang có như ngày hôm nay, tất cả là nhờ vào sự hi
sinh cao cả và vất vả của Bố Mẹ.
Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn đến tất cả mọi người với lòng tri ân
sâu sắc nhất.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2009
Trương Hương Thảo

ii


TÓM TẮT LUẬN VĂN
Qua thời gian thực hiện đề tài “Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất và
khảo sát khả năng kháng aflatoxin của các gốc phân lập được” từ tháng 2/2008 đến
tháng 8/2009 tại Phòng thực hành Vi Sinh khoa Chăn Nuôi – Thú Y, chúng tôi thu
được những kết quả như sau:

-

Đánh giá sơ bộ khả năng ức chế aflatoxin của các gốc Bacillus subtilis

phân lập được từ đất: sau 7 ngày nuôi cấy chung Bacillus subtilis và Aspergillus
flavus trên môi trường thạch nước cốt dừa, quan sát bên ngoài và dưới ánh đèn UV
cho thấy một số gốc có khả năng ức chế sự sản sinh aflatoxin và sự sinh trưởng của
nấm mốc Aspergillus flavus.
-

Khảo sát khả năng ức chế aflatoxin của các gốc vi khuẩn Bacillus

subtilis phân lập được từ đất trên môi trường bắp: kết quả cho thấy một số gốc vi
khuẩn có khả năng làm giảm aflatoxin trên môi trường bắp.
-

Thử nghiệm tác động của aflatoxin lên sự phát triển của Bacillus

subtilis: sau 7 ngày nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis trong môi trường TSB có bổ
sung aflatoxin theo các nồng độ khác nhau, các ống môi trường được gửi đi phân
tích hàm lượng aflatoxin. Kết quả là hàm lượng aflatoxin trong ống TSB có nuôi
cấy vi khuẩn giảm so với hàm lượng aflatoxin trong ống TSB không nuôi cấy vi
khuẩn. Số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis nuôi cấy trong môi trường không có
aflatoxin phát triển tốt hơn trong môi trường có aflatoxin. Kết quả này cho thấy
aflatoxin có thể ức chế sự phát triển của Bacillus subtilis và vi khuẩn Bacillus
subtilis làm giảm aflatoxin theo phương thức phá huỷ aflatoxin.

iii

MỤC LỤC

Trang tựa ..................................................................................................................... i
Lời cám ơn ................................................................................................................. ii
Tóm tắt luận văn ....................................................................................................... iii
Mục lục ..................................................................................................................... iv
Danh mục các chữ viết tắt........................................................................................ vii
Danh mục các bảng ................................................................................................. viii
Danh mục các biểu đồ............................................................................................... ix
Danh mục các hình......................................................................................................x
Danh mục các sơ đồ .................................................................................................. xi
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU.............................................................................................1
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................1
1.2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI ........................................................................................2
1.3. YÊU CẦU ĐỀ TÀI..........................................................................................2
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN.....................................................................................3
2.1. KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ...................................3
2.1.1. Lịch sử phát hiện ......................................................................................3
2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis ...........3
2.1.3. Đặc điểm nuôi cấy....................................................................................4
2.1.4. Đặc điểm sinh hóa ....................................................................................5
2.1.5. Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên .............................................................5
2.1.6. Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis .............................................................5
2.1.7. Tính chất đối kháng với vi sinh vật gây bệnh ..........................................8
2.1.8. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về tác dụng đối kháng với
Aspergillus của Bacillus subtilis ...............................................................................10

iv

2.2. SƠ LƯỢC VỀ NẤM MỐC SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN .........................12
2.2.1. Khái niệm về nấm mốc và độc tố nấm mốc...........................................12
2.2.2. Độc tố aflatoxin......................................................................................13
CHƯƠNG 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................24
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM ........................................................................24
3.1.1. Thời gian ................................................................................................24
3.1.2. Địa điểm .................................................................................................24
3.2. NỘI DUNG ĐỀ TÀI......................................................................................24
3.3. VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM ............................................................................24
3.3.1. Đối tượng khảo sát .................................................................................24
3.3.2. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm ..................................................................25
3.3.3. Môi trường nuôi cấy...............................................................................25
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................26
3.4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất ..............................................26
3.4.2. Thí nghiệm 1: Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của chủng nấm mốc
Aspergillus flavus và đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các gốc
Bacillus subtilis phân lập được. ................................................................................30
3.4.3. Thí nghiệm 2: Kiểm tra khả năng làm giảm aflatoxin trên môi trường
bắp của các gốc vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được........................................31
3.4.4. Thí nghiệm 3: Thử nghiệm tác động của aflatoxin lên sự phát triển của
vi khuẩn Bacillus subtilis ..........................................................................................35
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................37
4.1. Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis..........................................37
4.1.1. Đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis ..................................37
4.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis..............37
4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa của các vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus
subtilis…………… ...................................................................................................38
v

4.2. Thí nghiệm 1: Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của chủng nấm mốc
Aspergillus flavus và đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các
gốc Bacillus subtilis phân lập được. .....................................................................39
4.2.1. Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của chủng nấm mốc Aspergillus
flavus……………… .................................................................................................39
4.2.2. Thí nghiệm đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các
gốc Bacillus subtilis phân lập được...........................................................................40
4.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng làm giảm aflatoxin sản sinh trên môi
trường bắp của các gốc Bacillus subtilis phân lập được.......................................42
4.4. Thí nghiệm 3: Thử nghiệm tác động của aflatoxin lên sự phát triển của vi
khuẩn Bacillus subtilis ..........................................................................................44
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................50
5.1. KẾT LUẬN ...................................................................................................50
5.2. ĐỀ NGHỊ.......................................................................................................50
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................54
PHỤ LỤC.................................................................................................................54

vi


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt

Nguyên chữ

AND

Acid Deoxyribonucleic

ARN

Acid Ribonucleic

CFU

Colony Forming Units

ctv

cộng tác viên

CYA

Czapek Yeast Extract Agar

LD50

Lethal dose

Liều gây chết 50% tổng đàn

ppb

part per billion

Phần tỷ (μg/kg)

TSA

Trypticase Soya Agar

TSB

Trypticase Soya Broth

UV

Ultra violet

Nghĩa

Đơn vị hình thành khuẩn lạc

Tia cực tím

vii


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2-1: Sự khác nhau giữa tế bào dinh dưỡng và bào tử của Bacillus subtilis ......6
Bảng 2-2: Một số loài nấm mốc có khả năng sản sinh aflatoxin .............................14
Bảng 2-3: Ảnh hưởng của độ pH lên hàm lượng aflatoxin (μg/150ml) trong thí
nghiệm của A. Ciegler và ctv (1966) ........................................................................15
Bảng 2-4: Liều gây ngộ độc cấp tính qua miệng của aflatoxin B1 LD50................20
Bảng 3-1: Bố trí thí nghiệm 2...................................................................................35
Bảng 4-1: Kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin của thí nghiệm 2 .......................43
Bảng 4-2: Số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis của thí nghiệm 3 (log10) ................45
Bảng 4-3: Số lượng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis của thí nghiệm 3 (log10) .....45
Bảng 4-4: Kết quả phân tích nồng độ aflatoxin của thí nghiệm 3............................47

Bảng 5-1: Kết quả phân lập Bacillus subtilis từ đất .................................................50

viii


DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1: Số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis của thí nghiệm 3 .........................46
Biểu đồ 4.2: Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên hàm lượng aflatoxin....48

ix


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis ...........................................................4
Hình 2.2: Hình dạng tế bào sinh dưỡng và vị trí bào tử.............................................5
Hình 2.3: Công thức hoá học của sufactin .................................................................9
Hình 2.4: Công thức hoá học của agrastatin ..............................................................9
Hình 2.5: Công thức hoá học của iturin ....................................................................9
Hình 2.6: Quá trình sinh trưởng của nấm mốc.........................................................13
Hình 2.7: Công thức hoá học của một số aflatoxin..................................................16
Hình 2.8: Sơ đồ phân tử aflatoxin gắn vào chuỗi ADN...........................................18
Hình 3.1: Kết quả thử lecithinase.............................................................................29
Hình 3.2: kết quả thử nitrate.....................................................................................29
Hình 3.3: Kết quả thử citrate ....................................................................................29
Hình 3.4: Kết quả thử VP.........................................................................................29
Hình 3.5: Kết quả thử maltose .................................................................................29
Hình 4.1: Vi khuẩn phân lập từ đất trên môi trường TSA .......................................37
Hình 4.2: Hình dạng Bacillus subtilis sau khi nhuộm Gram....................................38
Hình 4.3: Khuẩn lạc Aspergillus flavus sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch

nước cốt dừa..............................................................................................................39
Hình 4.4: Khuẩn lạc Aspergillus falvus dưới ánh đèn UV sau 5 ngày nuôi cấy trên
môi trường thạch nước cốt dừa .................................................................................40
Hình 4.5: Khuẩn lạc Aspergillus flavus và Bacillus subtilis dưới ánh đèn UV sau 3
ngày nuôi cấy trên môi trường thạch nước cốt dừa ..................................................41

x


Hình 4.6: Khuẩn lạc Aspergillus flavus và Bacillus subtilis sau 5 ngày nuôi cấy trên
môi trường thạch nước cốt dừa .................................................................................41
Hình 4.7: Khuẩn lạc Aspergillus flavus và Bacillus subtilis dưới ánh đèn UV sau 5
ngày nuôi cấy trên môi trường thạch nước cốt dừa ..................................................42

xi


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất .....................................27
Sơ đồ 3.2: Các phản ứng sinh hoá của vi khuẩn Bacillus subtilis............................28
Sơ đồ 3.3: Các bước thực hiện thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế sản sinh
aflatoxin của các gốc Bacillus subtilis phân lập được ..............................................31
Sơ đồ 3.4: Phương pháp thu hoạch huyễn dịch bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis ...33
Sơ đồ 3.5: Phương pháp xác định số lượng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis .........34

xii


CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU

1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Nấm mốc và độc tố nấm mốc (mycotoxin) trong thức ăn chăn nuôi có ảnh
hưởng rất lớn đến năng suất vật nuôi. Nấm mốc phát triển trong ngũ cốc, nguyên
liệu và thức ăn chăn nuôi không những làm giảm giá trị dinh dưỡng của thức ăn mà
còn sản sinh ra các độc tố gây bệnh cho con người và vật nuôi. Hiện nay các nhà
khoa học đã phát hiện trên 300 loại độc tố mycotoxin từ hơn 100 loài nấm mốc.
Trong các loại độc tố nấm mốc đó, phải kể tới aflatoxin (Dương Thanh Liêm,
2008).
Aflatoxin có rất nhiều tác hại trên con người cũng như trên gia súc như gây
suy giảm miễn dịch, rối loạn chức năng, thoái hoá gan thận, ung thư trên động vật
thí nghiệm mà còn gây chết gia súc, gia cầm nếu nhiễm phải lượng lớn. Trong điều
kiện khí hậu nước ta (nóng ẩm gió mùa) rất thuận lợi cho sự phát triển của nấm mốc
sinh độc tố aflatoxin nếu như các loại nguyên liệu, thức ăn gia súc không được bảo
quản tốt. Nếu điều này xảy ra sẽ gây tổn thất rất lớn cho chăn nuôi, nguy hiểm nhất
là gián tiếp ảnh hưởng đến sức khoẻ con người.
Để hạn chế sự sản sinh aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi, người ta đã sử
dụng nhiều phương pháp, trong đó, phương pháp sinh học bổ sung vi khuẩn
Bacillus subtilis cũng đã được áp dụng. Bacillus subtilis tiết ra hoạt chất sinh học có
khả năng ức chế nấm mốc và aflatoxin.
Được sự phân công của khoa Chăn Nuôi Thú Y, trường Đại học Nông Lâm
Tp.HCM, sự đồng ý của phòng vi sinh khoa Chăn Nuôi Thú Y và sự hướng dẫn của
thầy Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi tiến hành đề tài: ”Phân lập vi khuẩn Bacillus
subtilis từ đất và khảo sát khả năng kháng aflatoxin của các gốc phân lập được”.

1


1.2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
Phân lập và tìm ra gốc Bacillus subtilis từ đất có khả năng ức chế aflatoxin,
phục vụ cho nghiên cứu ứng dụng Bacillius subtilis kiểm soát aflatoxin trong chăn

nuôi.

1.3. YÊU CẦU ĐỀ TÀI
-

Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất .

-

Xác định các gốc có khả năng kháng aflatoxin từ các gốc phân lập

-

Thử nghiệm tác động trực tiếp của độc tố aflatoxin lên sự phát triển

được.

của vi khuẩn Bacillus subtilis.

2


CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN
2.1. KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS
2.1.1. Lịch sử phát hiện
Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ
chức y học Nazi của Đức. Nhiều năm sau đó, vi khuẩn Bacillus subtilis được sử
dụng rộng rãi trên thế giới và nhanh chóng trở thành phương pháp hữu hiệu nhất để
trị bệnh kiết lỵ và các bệnh về đường ruột khác. Ngày nay, Bacillus subtilis đã trở
nên rất phổ biến không chỉ trong y học mà còn được ứng dụng rộng rãi trong trồng

trọt, chăn nuôi, công nghệ sinh học … (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Thanh Xuân,
2006).

2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.2.1. Đặc điểm phân loại
Theo phân loại của Bergey (1994) vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc:
Bộ : Eubacteriales
Họ : Bacillaceae
Giống : Bacillus
Loài : Bacillus subtilis

2.1.2.2. Đặc điểm phân bố
Bacillus subtilis là vi khuẩn hoại sinh được phân bố hầu hết trong tự nhiên
như đất, nước, không khí, thực vật bị phân hủy… và cỏ khô nên còn được gọi là
trực khuẩn cỏ khô. Tuy nhiên dưới hầu hết những điều kiện thì Bacillus subtilis bất
hoạt và tồn tại ở dạng bào tử (Nguyễn Lân Dũng, 2001).
3


2.1.2.3. Đặc điểm hình thái
Vi khuẩn Bacillus subtilis có dạng trực khuẩn ngắn và nhỏ, hai đầu tròn, bắt
màu Gram dương, kích thước 0,5 – 0,8µm x 1,5 - 3µm, thường đứng đơn lẻ hoặc
tạo thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 – 12 chiên mao, sinh bào
tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng, kích thước 0,9 – 0,6µm. Vị trí của bào
tử trong tế bào sinh dưỡng không theo một nguyên tắc chặt chẽ nào, có thể lệch tâm
hoặc gần tâm nhưng không chính tâm (Nguyễn Lân Dũng, 2001).

Hình 2.1: Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis
( />
2.1.3. Đặc điểm nuôi cấy

Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có thể phát triển được trong môi
trường thiếu oxy. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn là 37oC. Độ pH
thích hợp nhất từ 7,0 – 7,4. Dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn là
nguyên tố C, H, O và các nguyên tố khác (Lý Kim Hữu, 2005).
Trên môi trường thạch đĩa TSA, khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus subtilis có dạng
tròn, rìa răng cưa không đều, tâm sẫm màu, màu vàng sám, đường kính 3 – 5 mm.
Sau 1 – 4 ngày, bề mặt nhăn nheo, màu hơi sẫm (Phạm Hoàng Thái, 2007).
Trên môi trường thạch nghiêng TSA: vi khuẩn dễ mọc, màu hơi xám, rìa gợn
sóng (Phạm Hoàng Thái, 2007).

4


Môi trường canh TSB: vi khuẩn phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn
trên bề mặt môi trường canh, lắng cặn kết lại như vẫn mây ở đáy, khó tan đều khi
lắc lên (Phạm Hoàng Thái, 2007).

2.1.4. Đặc điểm sinh hóa
Các đặc điểm sinh hoá của vi khuẩn Bacillus subtilis: Indol âm, nitrate dương,
MR-VP dương, H2S âm, NH3 dương, catalase dương, amylase dương, casein
dương, citrate dương, maltose âm, lecithinase âm.
Một số dòng khuẩn Bacillus subtilis gây dung huyết trên thạch máu ngựa và
thỏ do có khả năng sinh hemolysine (Nguyễn Lân Dũng, 2001).

2.1.5. Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên
Bacillus subtilis có kháng nguyên O và H, cấu trúc kháng nguyên dạng D và L
của acid glutamic. Vi khuẩn sản sinh kháng sinh subtilin và bacitracin, có tác dụng
ức chế vi khuẩn Gram âm và Gram dương (Lý Kim Hữu, 2005).
Đa số chủng Bacillus subtilis không gây bệnh.

2.1.6. Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis
Bào tử vi khuẩn là một dạng biến đổi đặc biệt của tế bào sinh dưỡng trong
một giai đoạn nào đó của quá trình sinh trưởng của vi khuẩn. Mỗi tế bào chỉ tạo
thành một bào tử (trích dẫn bởi Nguyễn Khắc Tuấn, 1996).

Hình 2.2: Hình dạng tế bào sinh dưỡng và vị trí bào tử
của vi khuẩn Bacillus subtilis

5


( />
2.1.6.1. Cấu tạo bào tử
Gồm màng ngoài, lớp vỏ, màng trong và khối tế bào chất đồng nhất trong
cùng.
Vỏ gồm nhiều lớp, có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất
hòa tan trong nước.
Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất, vì vậy có thể giữ ở trạng
thái tiềm sinh trong nhiều năm (Tô Minh Châu, 2000).
Bào tử khác tế bào sinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hoá học và tính chất
sinh lý.
Bảng 2-1: Sự khác nhau giữa tế bào dinh dưỡng và bào tử của Bacillus subtilis
Đặc tính
Cấu trúc

Tế bào sinh dưỡng

Bào tử

Tế bào Gram (+), điển

Vỏ bào tử dày, khó thấm

hình

nước

Thành phần hoá học
Canxi

Thấp

Cao

Protein

Thấp hơn

Cao hơn

Hoạt tính enzyme

Cao

Thấp

Khả năng chịu nhiệt

Yếu

Cao

Chịu bức xạ

Kém

Mạnh

Yếu

Cao

Dễ nhuộm

Phương pháp đặc biệt

Hoạt tính các chất hóa học và
acid
Khả năng bắt màu thuốc
nhuộm

(trích dẫn bởi Tô Minh Châu, 2000)

6


2.1.6.2. Đặc điểm và tác dụng của bào tử
Bào tử vi khuẩn không thực hiện chức năng sinh sản mà chỉ là một thể biến
đổi của tế bào nhằm bảo tồn, đổi mới và nâng cao sức sống của vi khuẩn. Bào tử là
một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, có sự đề kháng cao với các nhân tố bất lợi

của ngoại cảnh.
Theo Nguyễn Xuân Thành và ctv (2005) thì sự tồn tại lâu dài của bào tử là
do chúng có đặc tính sau:
-

Nước trong bào tử phần lớn ở trạng thái liên kết, do đó không có khả

năng làm biến tính protein khi tăng nhiệt độ.
-

Do trong bào tử có một lượng lớn ion Ca++ và acid dipicolinic.

Protein trong bào tử kết hợp với dipicolinat canxi tạo thành một phức chất có tính
ổn định cao đối với nhiệt độ.
-

Các enzyme và các hoạt chất sinh học khác trong bào tử đều tồn tại

dưới dạng không hoạt động làm hạn chế sự trao đổi chất của bào tử với môi trường
bên ngoài.
-

Sự có mặt của các acid amin chứa lưu huỳnh, đặc biệt là cysteine giúp

bào tử đề kháng với tia cực tím.
-

Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp

màng, làm cho các chất hoá học và các chất sát trùng khó có thể tác động đến bào

tử.
Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành một tế
bào mới có sức sống mạnh mẽ hơn (Nguyễn Khắc Tuấn, 1996).

7


2.1.7. Tính chất đối kháng với vi sinh vật gây bệnh
2.1.7.1. Đối kháng với nấm
Mỗi loài sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều kiện môi trường khác nhau,
sinh khuẩn lạc khác nhau. Thay đổi môi trường hoặc các yếu tố môi trường bất lợi
tức là làm thay đổi điều kiện sống sẽ hạn chế hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh
vật. Thực tế khi môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis
với một số lượng lớn sẽ xảy ra sự cạnh tranh chất dinh dưỡng, cạnh tranh không
gian sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ
sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số
loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng và Hoàng
Đức Nhuận, 1976, trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006).
Phương thức diệt nấm và các tác nhân gây bệnh của vi khuẩn Bacillus
subtilis như sau :
-

Đầu tiên vi khuẩn Bacillus subtilis tạo thành khối xung quanh tác

nhân gây bệnh ngăn chặn không cho chúng bám vào vật thể chủ để gây bệnh.
-

Sau đó, Bacillus subtilis tiết ra hỗn hợp gồm nhiều lipopeptid (được

gọi là serenade) để làm thủng vách tế bào và màng tế bào chất của tác nhân gây

bệnh do đó ngăn chặn sự phát triển của chúng. Serenade có thể được bảo quản, sử
dụng như một loại thuốc trừ sâu hoá học tổng hợp, đã được kiểm tra và chứng minh
trong phòng thí nghiệm là không gây độc đối với cá hồi, ong mật, chim cút, sâu đất
và nhiều loài khác. Serenade gồm có 3 nhóm lipopeptid có tên là surfactin,
agrastatin và iturin. Ba nhóm này kết hợp với nhau để làm tăng hoạt tính diệt các
mầm bệnh kể cả vi sinh vật gây hại, nấm mốc và cả bào tử của chúng.
-

Surfactin là nhóm chất có hoạt tính sinh học, bản chất là lipopeptid.

Bản thân surfactin không gây độc cho nấm nhưng khi kết hợp với iturin thì trở
thành hợp chất diệt nấm. Surfactin có khả năng làm thủng vách tế bào của tác nhân
gây bệnh và bào tử của chúng, giúp cho agrastatin và iturin phát huy tác dụng.

8


Hình 2.3: Công thức hoá học của sufactin
( />
-

Agrastatin vừa mới được phát hiện, cũng có khả năng diệt nấm giống

như surfactin và iturin

Hình 2.4: Công thức hoá học của agrastatin
( />
-

Iturin là nhóm chất chiếm vai trò quan trọng nhất trong quá trình diệt

nấm, bản chất là lipopeptide được chiết từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus
subtilis. Iturin diệt nấm bằng cách tác động lên màng tế bào chất, làm tan màng, tạo
thành những lổ thủng trên đó để làm mất tính thẩm thấu chọn lọc của màng.

Hình 2.5: Công thức hoá học của iturin
( />
9


2.1.7.2. Đối kháng với vi khuẩn
Ngoài nấm gây bệnh ra thì Bacillus subtilis cũng đối kháng với vi khuẩn gây
bệnh như Escherichia coli. Khi nuôi cấy chung trên môi trường TSB thì Bacillus
subtilis có khả năng tổng hợp một số chất kháng sinh nên sẽ ức chế quá trình sinh
trưởng và phát triển của Escherichia coli.
Nguyễn Quỳnh Nam năm 2006 đã tiến hành thí nghiệm nuôi cấy Bacillus
subtilis và Escherichia coli trên môi trường TSB và theo dõi số lượng Escherichia
coli qua các thời điểm 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ và 36 giờ. Kết quả cho thấy: số lượng
Escherichia coli tăng dần khi nuôi cấy trên môi trường TSB không có Bacillus
subtilis. Còn khi nuôi cấy chung Bacillus subtilis và Escherichia coli trên môi
trường TSB thì số lượng Escherichia coli giảm dần theo thời gian.

2.1.8. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về tác dụng đối kháng với
Aspergillus của Bacillus subtilis
Trong nước
Nguyễn Hữu Phúc và cộng sự năm 1993 đã sử dụng vi khuẩn Bacillus
subtilis để ức chế sinh trưởng và sản xuất aflatoxin của Aspergillus flavus,
Aspergillus parasiticus trên bột đậu phộng (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Thanh
Xuân, 2006).
Nguyễn Đình Đào năm 1993 đã tiến hành kiểm tra khả năng đối kháng của

chủng Bacillus subtilis AO1 với Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus và kết
quả là có sự ức chế nấm mốc Aspergillus (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Thanh Xuân,
2006).
Nguyễn Thị Ngọc Trân năm 1995 đã tiến hành kiểm tra khả năng đối kháng
giữa chủng Bacillus subtilis AO1 (do Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học thuộc Liên
Hiệp Sản Xuất Hoá Chất cung cấp) với Aspergillus flavus trên môi trường thạch
khoai tây – glucose và kết quả đạt được rất khả quan (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc
Thanh Xuân, 2006).

10


Năm 2006, Nguyễn Ngọc Thanh Xuân với đề tài “Khảo sát khả năng sử dụng
vi khuẩn Bacillus subtilis có nguồn gốc từ đất trong xử lý nhiễm aflatoxin trên
nguyên liệu bắp” cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được từ đất có khả
năng làm giảm aflatoxin trên môi trường bắp. Tỷ lệ nuôi cấy bào tử nấm mốc/bào tử
vi khuẩn là 1/103 thì hàm lượng aflatoxin giảm 99,6 lần (25ppb so với đối chứng là
2490ppb).
Năm 2007, Phạm Hoàng Thái đã thực hiện đề tài “Phân lập vi khuẩn
Bacillus subtilis từ đất, khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng
phân lập được”. Kết quả cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được từ đất có
khả năng làm giảm aflatoxin trên môi trường bắp. Tỷ lệ nuôi cấy bào tử nấm
mốc/bào tử vi khuẩn là 1/105 thì hàm lượng aflatoxin giảm 8,8 lần (715ppb so với
đối chứng là 6300ppb). Tỷ lệ vịt chết khi ăn thức ăn nhiễm aflatoxin được bổ sung
vi khuẩn Bacillus subtilis giảm 50% so với đối chứng và giảm đáng kể những tổn
thương gan về mặt đại thể cũng như vi thể. Gan vịt trong lô thí nghiệm hơi sưng và
thoái hoá mỡ nhẹ so với lô đối chứng gan sưng to và thoái hoá mỡ nặng.
Năm 2008, Nguyễn Thị Minh Cương đã thực hiện đề tài “Khảo sát hiệu quả
của việc dùng Bacillus subtilis trong phòng và giảm tác hại của aflatoxin trên vịt”.
Kết quả cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ phân gà và ruột gà khả năng

làm giảm độc tố aflatoxin trên môi trường bắp. Ở tỷ lệ nuôi cấy bào tử nấm
mốc/bào tử vi khuẩn là 1/103 thì hàm lượng aflatoxin giảm 50 lần (5ppb so với đối
chứng là 250ppb). Tỷ lệ vịt chết khi ăn thức ăn nhiễm aflatoxin được xử lý vi khuẩn
Bacillus subtilis giảm 55% so với đối chứng và giảm đáng kể những tổn thương gan
về mặt đại thể cũng như vi thể. Vịt ăn thức ăn nhiễm aflatoxin được xử lý vi khuẩn
Bacillus subtilis gan chỉ sưng nhẹ, xuất huyết cục bộ và một vài điểm hoại tử, mô
gan bị thoái hoá mỡ nhẹ hơn so với lô đối chứng gan sưng to, xuất huyết gần như
toàn bộ, hoại tử, tế bào gan bị thoái hóa mỡ nặng.
Ngoài nước

11


Norio Kimura (1990) đã sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis để ngăn chặn sự
phát triển và sinh độc tố của các chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus
trên bột đậu phộng và bắp. Các chủng Bacillus subtilis NK 330 và NK – C – 3 ức
chế mạnh mẽ sự phát triển nấm mốc và tổng hợp aflatoxin. Khả năng ức chế này
thay đổi tuỳ theo từng chủng vi khuẩn (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Thanh Xuân,
2006).

2.2. SƠ LƯỢC VỀ NẤM MỐC SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN
2.2.1. Khái niệm về nấm mốc và độc tố nấm mốc
2.2.1.1. Nấm mốc
Theo Lê Anh Phụng (2001), mấm mốc là vi sinh vật (vi nấm) có cấu tạo gần
giống với giới thực vật, sống ký sinh hay hoại sinh trên nhiều loại chất khác nhau,
đặc biệt là các chất hữu cơ, đơn giản nhất là hydratcacbon.
Người ta tìm thấy nấm mốc ở khắp mọi nơi từ phân, đất, trên các cây cối
mục nát, quần áo, giày dép, trên ngũ cốc, ngay cả trên cơ thể sống của động vật và
con người.
Nấm mốc không chứa diệp lục tố, cơ thể dạng sợi có vách ngăn hoặc không

có vách ngăn. Những sợi nấm này phân nhánh, hình thành từng đám chằng chịt gọi
là hệ sợi nấm. có 2 loại sợi:
-

Sợi nấm dinh dưỡng: nằm trong lớp môi trường, làm nhiệm vụ hấp

thu chất dinh dưỡng cho toàn bộ hệ sợi.
-

Sợi nấm khí sinh : thường nhô lên trên môi trường, giữ vai trò sinh

sản (tạo bào tử)

2.2.1.2. Độc tố nấm mốc (mycotoxin)
Độc tố nấm mốc là sản phẩm phụ của quá trình trao đổi chất tự nhiên của
nấm mốc và có thể gây độc cho con người và gia súc. Độc tố nấm mốc có tính bền

12