PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH ASPERGILLUS FLAVUS CÓ TRONG BẮP VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH AFLATOXIN CỦA CÁC CHỦNG PHÂN LẬP ĐƯỢC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y
--- X W ---

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH ASPERGILLUS FLAVUS CÓ TRONG
BẮP VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH AFLATOXIN
CỦA CÁC CHỦNG PHÂN LẬP ĐƯỢC

Sinh viên thực hiện : VÕ THỊ ĐAN TRÂM
Ngành

: Dược Thú Y

Niên khóa

: 2004 - 2009

- 2009 -


PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH ASPERGILLUS FLAVUS CÓ TRONG
BẮP VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH AFLATOXIN
CỦA CÁC CHỦNG PHÂN LẬP ĐƯỢC

Tác giả

VÕ THỊ ĐAN TRÂM

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sỹ
ngành Thú Y

Giáo viên hướng dẫn

TS. LÊ ANH PHỤNG

- 2009 i


XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
Họ và tên sinh viên thực hiện: Võ Thị Đan Trâm
Tên đề tài: “Phân lập, định danh Aspergillus flavus có trong bắp và khảo sát khả
năng sinh aflatoxin của các chủng phân lập được”.
Đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp theo yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và ý
kiến nhận xét đóng góp của Hội đồng chấm thi tốt nghiệp khóa ngày 17 – 18/09/2009.

Giáo viên hướng dẫn

TS. Lê Anh Phụng

ii


LỜI CẢM ƠN
Kính dâng lên ba mẹ người đã có công sinh thành, yêu thương và dạy dỗ con
nên người.
Xin chân thành nhớ ơn TS. Lê Anh Phụng đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em
thực hiện và hoàn tất đề tài.
Xin cảm ơn Ban giám hiệu và Ban chủ nhiệm Khoa Chăn nuôi – Thú y trường

Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em
trong suốt quá trình học tập.
Trân trọng biết ơn các quý thầy cô đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức
cùng những kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt thời gian em học tập tại trường.
Xin cảm ơn các quý thầy cô thuộc bộ môn Vi sinh đã tạo điều kiện cho em
hoàn thành đề tài này.
Cảm ơn các bạn lớp Dược Thú Y 30 đã cùng tôi chia sẻ những khó khăn, vui
buồn trong cuộc sống sinh viên tại giảng đường Đại học Nông Lâm yêu dấu.

iii


TÓM TẮT LUẬN VĂN
Đề tài: “Phân lập, định danh Aspergillus flavus có trong bắp và khảo sát khả năng
sinh aflatoxin của các chủng phân lập được”, thực hiện tại phòng thực hành vi sinh,
khoa Chăn nuôi – Thú y, trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh trong thời gian
từ tháng 03/2009 đến tháng 07/2009. Qua quá trình khảo sát 30 mẫu bắp nguyên liệu
được lấy ngẫu nhiên từ các đại lý và cửa hàng bán lẻ thức ăn gia súc, chúng tôi thu
nhận được các kết quả sau:
• Tỷ lệ các mẫu bắp bị nhiễm nấm mốc là 100% với TSKL nấm mốc trung bình
có trong 1 g bắp là 42,66 x 104.
• Tỷ lệ các mẫu bắp bị nhiễm A. flavus/ parasiticus là 93% với TSKL A. flavus/
parasiticus trung bình có trong 1 g bắp là 1,82 x 104.
• Tỷ lệ khuẩn lạc A. flavus/ parasiticus so với TSKL nấm mốc là 75,35%.
• Sau khi phân lập: thu được 56 chủng nghi ngờ là A. flavus/ parasiticus.
• Sau khi định danh: có 100% chủng phân lập được đều là A. flavus.
• Có 20/56 chủng phân lập có khả năng sinh aflatoxin trên môi trường thạch
nước cốt dừa, chiếm tỷ lệ 35,71%.
• Trong 20 chủng có khả năng sinh aflatoxin, chúng tôi chọn ra 5 chủng được
xem là có khả năng sinh độc tố mạnh để nuôi cấy trên môi trường tấm gạo và

tiến hành định hàm lượng aflatoxin sinh ra của 5 chủng này. Kết quả về hàm
lượng aflatoxin sinh ra: cao nhất là 39.216 ppb (chủng 14) và thấp nhất là 3.367
ppb (chủng 52).

iv


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa........................................................................................................................i
Xác nhận của giáo viên hướng dẫn...............................................................................ii
Lời cảm ơn .................................................................................................................. iii
Tóm tắt luận văn ..........................................................................................................iv
Mục lục .........................................................................................................................v
Danh sách các từ viết tắt .............................................................................................vii
Danh sách các bảng .................................................................................................. viii
Danh sách các biểu đồ .................................................................................................ix
Danh sách các hình .......................................................................................................x
Chương 1: MỞ ĐẦU .....................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề.............................................................................................................1
1.2. Mục đích...............................................................................................................2
1.3. Yêu cầu.................................................................................................................2
Chương 2: TỔNG QUAN .............................................................................................3
2.1. Nấm mốc và độc tố nấm mốc...............................................................................3
2.1.1. Nấm mốc .......................................................................................................3
2.1.2. Độc tố nấm mốc ............................................................................................3
2.2. Nấm mốc A. flavus ...............................................................................................3
2.2.1. Phân loại........................................................................................................3
2.2.2. Đặc điểm hình thái ........................................................................................4
2.2.3. Đặc điểm nuôi cấy.........................................................................................5

2.2.4. Đặc điểm sinh thái.........................................................................................5
2.2.5. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển...............................................................5
2.3. Độc tố aflatoxin....................................................................................................6
2.3.1. Lịch sử phát hiện aflatoxin............................................................................6
2.3.2. Các loài nấm mốc có khả năng sinh aflatoxin ..............................................6
2.3.3. Đặc điểm của aflatoxin..................................................................................7
v


2.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo aflatoxin của nấm mốc ............................9
2.4. Bệnh nhiễm độc aflatoxin ..................................................................................10
2.4.1. Cơ chế gây bệnh ..........................................................................................10
2.4.2. Aflatoxicosis ...............................................................................................11
2.5. Các phương pháp phát hiện và định lượng aflatoxin .........................................12
2.5.1. Phương pháp sinh vật học ...........................................................................12
2.5.2. Phương pháp lý hóa.....................................................................................13
2.5.3. Phương pháp miễn dịch học........................................................................14
2.6. Giải pháp nhằm hạn chế tác hại của aflatoxin ...................................................14
2.6.1. Phòng nấm mốc xâm nhập và phát triển .....................................................14
2.6.2. Biện pháp loại trừ, vô hiệu hóa tính độc hại của aflatoxin .........................15
2.7. Một số công trình nghiên cứu có liên quan........................................................17
Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................18
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài...............................................................18
3.2. Vật liệu thí nghiệm.............................................................................................18
3.3. Nội dung đề tài ...................................................................................................19
3.4. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................19
3.5. Chỉ tiêu khảo sát.................................................................................................25
3.6. Phương pháp xử lý số liệu..................................................................................25
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................26
4.1. Kết quả đếm TSKL nấm mốc và TSKL nghi ngờ A. flavus/ parasiticus ..........26

4.2. Phân lập – Định danh nhóm A. flavus................................................................30
4.3. Khảo sát khả năng sinh aflatoxin của các chủng A. flavus đã định danh...........36
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..................................................................40
5.1. Kết luận ..............................................................................................................40
5.2. Đề nghị ...............................................................................................................41
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................42
PHỤ LỤC .....................................................................................................................45

vi


DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
• A. flavus: Aspergillus flavus
• AFB1: aflatoxin B1
• AFPA: Aspergillus Flavus and Parasiticus Agar
• ctv: cộng tác viên
• CYA: Czapek Yeast extract Agar
•

FAO: Food and Agriculture Organization (Tổ chức Lương Nông Quốc tế)

• IARC: International Agency for Research on Cancer
(Tổ chức về bệnh Ung thư Quốc tế)
• LD50: Lethal Dose – 50 (liều gây chết 50% tổng đàn)
• ppb: part per billion (phần tỷ)
• TAGS: thức ăn gia súc
• TSKL: tổng số khuẩn lạc
• UV: Ultra violet (tia cực tím)

vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Một số loài nấm mốc có khả năng sản sinh aflatoxin ....................................7
Bảng 2.2: Các tính chất lý hóa của một số aflatoxin chính.............................................8
Bảng 2.3: Liều gây chết LD50 của aflatoxin B1 cho uống 1 lần duy nhất.....................11
Bảng 2.4: Khả năng gây ung thư gan của aflatoxin B1 ở động vật thí nghiệm.............12
Bảng 2.5: Hàm lượng tối đa độc tố aflatoxin B1 và aflatoxin tổng số
trong thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gia súc, gia cầm ..............................16
Bảng 3.1: Bố trí số lượng mẫu ......................................................................................19
Bảng 4.1: TSKL nấm mốc và TSKL nghi ngờ A. flavus/ parasiticus trong 1 g bắp ....26
Bảng 4.2: Tỷ lệ phân lập các chủng nghi ngờ A. flavus/ parasiticus từ các mẫu bắp ..30
Bảng 4.3: Kết quả định danh xác định nấm mốc A. flavus từ các mẫu bắp..................31
Bảng 4.4: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc A. flavus theo thời gian nuôi cấy..................31
Bảng 4.5: Kích thước khuẩn lạc của các chủng A. flavus theo thời gian nuôi cấy .......32
Bảng 4.6: Kích thước các thành phần sợi nấm .............................................................33
Bảng 4.7: Tỷ lệ các chủng A. flavus có khả năng phát huỳnh quang
trên môi trường nước cốt dừa .......................................................................36
Bảng 4.8: Hàm lượng aflatoxin thu được của các chủng A. flavus
sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường tấm gạo ..............................................38

viii


DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ
Trang
Biểu đồ 4.1: Trung bình TSKL nấm mốc và TSKL nghi ngờ là
A. flavus/ parasiticuscó trong 1 g bắp (tính theo log cơ số 10) ...............27
Biểu đồ 4.2: Kích thước khuẩn lạc của các chủng A. flavus theo thời gian nuôi cấy..32

Biểu đồ 4.3: Tỷ lệ các chủng A. flavus phát huỳnh quang trên môi trường
thạch nước cốt dừa sau 5 ngày nuôi cấy ..................................................36

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH
Trang
Hình 2.1: Cấu trúc hình thái của A. flavus dưới kính hiển vi .........................................4
Hình 2.2: Quá trình sinh trưởng và phát triển của A. flavus ...........................................6
Hình 2.3: Cấu trúc hóa học của các aflatoxin chính .......................................................8
Hình 3.1: Giữ giống các chủng nghi ngờ A. flavus/ parasiticus...................................22
Hình 4.5: Khuẩn lạc A. flavus phát huỳnh quang dưới đèn UV ...................................23
Hình 4.1: Khuẩn lạc nghi ngờ A. flavus/ parasiticus trên môi trường AFPA ..............26
Hình 4.2: Khuẩn lạc A. flavus trên môi trường Czapek sau 3, 5, 7 ngày nuôi cấy.......32
Hình 4.4: Cuống sinh bào tử và thể bọng ở độ phóng đại 400 lần ...............................34
Hình 4.5: Thể bình 1 lớp và 2 lớp trên cùng thể bọng..................................................35
Hình 4.6: Khuẩn lạc A. flavus và khả năng phát huỳnh quang trên
môi trường thạch nước cốt dừa ....................................................................37
Hình 4.7: Môi trường tấm gạo sau 7 ngày nuôi cấy A. flavus ......................................38

x


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Các nhà chăn nuôi từ lâu đều biết rằng thức ăn là một trong những yếu tố quan
trọng quyết định sự thành bại trong ngành chăn nuôi. Tuy nhiên ở nước ta, với điều
kiện khí hậu nóng, ẩm và mưa nhiều rất thích hợp cho nấm mốc phát triển và sinh độc

tố trong quá trình bảo quản và sử dụng các loại thức ăn chăn nuôi giàu dinh dưỡng.
Aflatoxin là loại độc tố nấm mốc thường gặp nhất trong các nguyên liệu thức ăn
cho chăn nuôi ở nước ta và trên thế giới. Theo ước tính của tổ chức Lương Nông Quốc
tế (FAO: Food and Agriculture Organization) thì có khoảng 25% nông sản của thế giới
chịu ảnh hưởng nghiêm trọng bởi các độc tố nấm mốc, chủ yếu vẫn là aflatoxins. Đây
là độc tố do vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus sản sinh ra. Aflatoxin
có độc tính rất mạnh, có thể gây độc cho tất cả các loài vật khác nhau với liều lượng
khác nhau. Aflatoxin gây tổn thất cho gia súc, gia cầm, làm suy giảm miễn dịch, làm
giảm thấp sức đề kháng của cơ thể, tăng chỉ số chuyển biến thức ăn, tăng tỷ lệ chết….
Tổ chức về bệnh Ung thư Quốc tế (IARC – International Agency for Research on
Cancer) đã xếp aflatoxin vào danh sách những tác nhân gây ung thư gan cho người
(Dương Thanh Liêm, 2008).
Chính vì những tác hại nguy hiểm của aflatoxin, nên việc hiểu biết về nấm
A. flavus và khả năng sản sinh độc tố của chúng trên nguyên liệu thực sự là một nhu
cầu rất cần thiết, để từ đó có các biện pháp phòng chống thích hợp, giúp tăng năng suất
vật nuôi và mang lại hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi.
Xuất phát từ yêu cầu này, được sự chấp thuận của Khoa Chăn nuôi – Thú y,
trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh cùng với sự hướng dẫn của TS. Lê Anh
Phụng, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập, định danh Aspergillus flavus có
trong bắp và khảo sát khả năng sinh aflatoxin của các chủng phân lập được”.

1


1.2. Mục đích
- Tìm hiểu về tình hình nhiễm A. flavus trong nguyên liệu bắp và khả năng sản
sinh độc tố aflatoxin của các chủng phân lập được, nhằm giúp các nhà chăn nuôi có
các biện pháp phòng chống thích hợp, làm giảm tác hại của độc tố trong thức ăn, nâng
cao năng suất chăn nuôi.
- Chọn ra các chủng A. flavus có khả năng sinh aflatoxin cao nhằm ứng dụng

trong sản xuất độc tố aflatoxin để phục vụ cho các nghiên cứu về độc chất học.
1.3. Yêu cầu
- Đếm tổng số khuẩn lạc nấm mốc và tổng số khuẩn lạc nghi ngờ A. flavus/
parasiticus có trong 1 g mẫu bắp.
- Phân lập và định danh các chủng A. flavus từ các mẫu bắp.
- Khảo sát khả năng sinh aflatoxin của các chủng A. flavus phân lập được.

2


Chương 2
TỔNG QUAN
2.1. Nấm mốc và độc tố nấm mốc
2.1.1. Nấm mốc
Là nhóm vi sinh vật có những đặc điểm cơ bản sau: tế bào có nhân thật, cơ quan
sinh trưởng (sợi nấm) có cấu tạo đơn bào hay đa bào, không có diệp lục tố nên cơ thể
sống dị dưỡng, sinh sản hữu tính hoặc vô tính bằng bào tử, đôi khi cũng có sinh sản
sinh dưỡng do sợi nấm đứt ra hoặc bằng bào tử áo (Lê Lương Tề - Nguyễn Thị
Trường, 2005).
2.1.2. Độc tố nấm mốc (mycotoxin)
Mycotoxin là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp của mỗi loài nấm mốc thậm chí của
mỗi chủng nấm mốc nhất định, có trọng lượng phân tử thấp và có khả năng gây biến
đổi bệnh lý trên người và động vật (FAO, 1990).
Hiện nay đã có trên 300 loại độc tố nấm mốc được xác định, trong đó có 5 loại
độc tố quan trọng nhất vì tính chất độc hại cũng như tần số xuất hiện cao trong nông
sản, thực phẩm là: aflatoxin (AF), deoxynivalenol (DON), zearalenon, ochratoxin và
fumonisin (Dương Thanh Liêm, 2008).
2.2. Nấm mốc A. flavus
2.2.1. Phân loại
Giới: Mycotae (Fungi)

Ngành: Amastigomycota (Deuteromycota)
Lớp: Deuteromycetes (Fungi imperfecti)
Bộ: Plectascales (= Eurotiales = Aspergillales)
Họ: Aspergillaceae
Giống: Aspergillus
Loài: A. flavus Link (= Monilia flava Pers).

3


Giống Aspergillus là một nhóm lớn gồm hơn 100 loài theo khóa phân loại thông
dụng của Raper và Fennell (1965) đã được bổ sung bởi Samson và Gams (1986),
Kozakievics (1994) (Bùi Xuân Đồng và ctv, 2003).
2.2.2. Đặc điểm hình thái

Cuống sinh
bào tử
Thể bọng

Bào tử

Thể bình 1 lớp
Thể bình 2 lớp

Hình 2.1: Cấu trúc hình thái của A. flavus dưới kính hiển vi
Loài A. flavus rất dễ nhận diện bởi khuẩn lạc có màu vàng hơi lục. Cuống sinh
bào tử trong suốt, bề mặt thô, xù xì, chiều dài dưới 1 mm. Thể bọng hình cầu hay hơi
cầu, đường kính 10 – 65 µm. Thể bình thường có 2 lớp (40 – 100% số chủng) hoặc 1
lớp hoặc đôi khi cả 2 kiểu cùng có mặt trên 1 bọng. Các bào tử đính có kích thước khá
lớn (đường kính 5 – 7 µm), hình cầu, màu vàng nâu đến hơi lục, vách trơn láng hoặc

hơi nhăn. Hạch nấm thường có màu nâu đỏ cho đến đen, có thể gặp ở một số chủng
(Lê Anh Phụng, 2001).
Dựa vào hình thái chúng ta có thể phân biệt A. flavus và A. parasiticus tuy hơi
khó nhưng theo Pitt và Hocking (1997) thì bào tử của A. parasiticus có bề mặt nhăn
đều, đường kính thể bọng ít khi quá 30 µm và thể bình thường chỉ có 1 lớp khi xem
dưới kính hiển vi (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Minh Tần, 2004).

4


2.2.3. Đặc điểm nuôi cấy
A. flavus là loài hiếu khí, nhiệt độ cần cho sự phát triển vào khoảng 6 – 540C (tốt
nhất là ở 30 – 350C), thích hợp ở ẩm độ tương đối 80 – 85% và pH = 3,9 – 9,1 (tối ưu
là 5,5). Chúng phát triển mạnh trên môi trường có hàm lượng saccharose cao (30 – 200
g/l) và nitrat cao (3 – 6 g/l). Điều kiện nuôi cấy giàu O2 kích thích hệ sợi nấm phát
triển, trong khi CO2 kích thích sự hình thành bào tử (Moreau, 1974).
Khi nuôi cấy trên môi trường chuyên biệt AFPA (48 – 60 giờ ở 300C), A. flavus
cho khuẩn lạc có màu vàng cam sáng ở mặt dưới, mặt trên trắng mịn như nhung. Chú
ý tránh nhầm lẫn với A. niger vì trên môi trường AFPA, A. niger cũng có thể mọc và
mặt sau khuẩn lạc A. niger cũng có màu vàng nhưng các sợi mang bào tử đính lại có
màu đen hay nâu sậm. Ngoài ra, khuẩn lạc A. ochraceus cũng có màu vàng nhưng mọc
rất chậm (sau 4 – 5 ngày).
2.2.4. Đặc điểm sinh thái
A. flavus phân bố ở khắp nơi (đất và nông sản), đặc biệt thích hợp trên các loại
hạt cốc, hạt có dầu như bắp, đậu phộng, hạt gòn…. Trên lúa mì, gạo, cùi dừa, cám, hạt
kê: xâm nhiễm ít. Đặc biệt, A. flavus không phát triển nhiều trên đậu tương (Moss,
1991; trích dẫn bởi Lê Anh Phụng, 2001).
Ở các vùng nhiệt đới, bào tử A. flavus thường gặp trong đất quanh năm (Siraicha,
1991) làm nguồn nhiễm thường xuyên cho cây trồng. Loài nấm mốc này có thể xâm
nhiễm các loại hạt và xác thực vật ở ngoài đồng, trong quá trình thu hoạch, trong giai

đoạn bảo quản và giai đoạn chế biến (Lillehoj, 1975; trích dẫn bởi Lê Anh Phụng,
2001).
2.2.5. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển
A. flavus có thể sinh sản bằng 2 hình thức:
- Sinh sản vô tính: các bào tử đính khi chín tách ra khỏi thể bình, phát tán ra
ngoài, nảy mầm và phát triển thành hệ sợi nấm mốc mới.
- Sinh sản dinh dưỡng: một đoạn sợi nấm (khuẩn ty) phát triển dài ra hoặc
phân nhánh và trở thành hệ sợi nấm hoàn chỉnh.

5


Hình 2.2: Quá trình sinh trưởng và phát triển của A. flavus
2.3. Độc tố aflatoxin
2.3.1. Lịch sử phát hiện aflatoxin
Năm 1960, tại Anh xuất hiện một bệnh lạ (được gọi là bệnh X vì chưa rõ nguyên
nhân) gây chết 10 vạn gà tây con với các tổn thương gan rất nặng nề (hoại tử, chảy
máu trong gan, tăng sinh ống dẫn mật…). Bệnh còn được tìm thấy trên vịt con, gà lôi,
bê và heo. Những thiệt hại to lớn do bệnh X gây ra đã thúc đẩy các nhà khoa học
nghiên cứu tìm ra nguyên nhân gây bệnh. Các nghiên cứu này cũng mở đầu cho lĩnh
vực khoa học nghiên cứu về nấm mốc và độc tố nấm mốc. Thành công đầu tiên trong
lĩnh vực khoa học còn khá non trẻ này là việc phát hiện ra độc tố aflatoxin (cũng chính
là nguyên nhân gây ra căn bệnh X) bởi Sargeant và ctv vào năm 1961 (trích dẫn bởi Lê
Anh Phụng, 2001). Bệnh sau đó được gọi tên chính thức là Aflatoxicosis (Asplin,
1962; Auswich, 1963; Harvey, 1963; Butler, 1965; trích dẫn bởi Lê Anh Phụng, 2001).
Ở Việt Nam, thông báo khoa học đầu tiên về phát hiện aflatoxin (từ các chủng
thuộc loài A. flavus dùng trong một cơ sở lên men sản xuất nước chấm bằng đậu
tương) có từ năm 1970 do Phạm Văn Sổ thực hiện (Bùi Xuân Đồng, 2003).
2.3.2. Các loài nấm mốc có khả năng sinh aflatoxin
Các loài nấm mốc có vai trò quan trọng nhất trong sản sinh aflatoxin là A. flavus

và A. parasiticus. Ngoài ra, một số loài nấm mốc khác như Penicillium spp., Rhizopus

6


spp. cũng có khả năng sinh aflatoxin nhưng ít có vai trò gây bệnh trong thực tế (Bùi
Xuân Đồng và Hà Huy Văn, 2000).
Bảng 2.1: Một số loài nấm mốc có khả năng sản sinh aflatoxin
Loài nấm mốc
Aspergillus flavus
Aspergillus parasiticus
Aspergillus nomius
Aspergillus oryzae
Aspergillus niger
Aspergillus wentii
Aspergillus ruber
Aspergillus ostianus
Aspergillus ochraceus
Penicillium puberulum
Penicillium variabile
Penicillium frequentans
Penicillium citrinum
Rhizopus sp.

B1
+
+
+
+
+

+
+
+
+
+
+
+
+
+

Aflatoxin
B2
G1
+
+
+
+
+

G2
+
+

+
+

+

+

Tác giả
Sargeant và ctv, 1961
Coduer và ctv, 1963
Kurtzman và ctv, 1987
Basappa và ctv, 1967
Kulik và Holaday, 1967
Kulik và Holaday, 1967
Kulik và Holaday, 1967
Scott và ctv, 1968
Van Walbeck và ctv, 1968
Kulik và Holaday, 1967
Kulik và Holaday, 1967
Kulik và Holaday, 1967
Kulik và Holaday, 1967
Van Walbeck và ctv, 1968

(Nguồn: IARC, 1993)
2.3.3. Đặc điểm của aflatoxin
Hiện nay được biết là đã có đến 20 loại aflatoxin. Trong đó, cần đặc biệt chú ý
đến các aflatoxin B1, B2, G1, G2 vì các aflatoxin này có độc tính cao nhất, đồng thời
cũng là các aflatoxin được tạo thành với số lượng nhiều nhất cả trong các cơ chất tự
nhiên, trong các sản phẩm cũng như trong môi trường lên men (Bùi Xuân Đồng,
2003).
2.3.3.1. Cấu trúc hóa học
Aflatoxin là các chất có cấu trúc hóa học rất gần nhau và có khung hóa học giống
với dẫn xuất của cumarin nên được gọi là flavacumarin.
Phân tử aflatoxin gồm 1 gốc cumarin, 2 nhân furan và 1 vòng lacton. Sau đây là
cấu trúc hóa học của các aflatoxin chính:

7

Hình 2.3: Cấu trúc hóa học của các aflatoxin chính
2.3.3.2. Tính chất lý hóa
Aflatoxin có dạng tinh thể màu vàng nhạt, trọng lượng phân tử thấp, dễ bị hủy
bởi những chất kiềm nhưng tương đối bền với nhiệt (nhiệt độ cao hơn 1000C chỉ khử
được phần nào).
Aflatoxin tan trong một số dung môi hữu cơ như chloroform, acetonitril,
methanol, ethanol, aceton, benzen…nhưng không tan trong một số dung môi béo:
hexan, ether ethylic, ether dầu hỏa.
Bảng 2.2: Các tính chất lý hóa của một số aflatoxin chính
Aflatoxin

Công thức
phân tử

Trọng lượng
phân tử

Nhiệt độ
nóng chảy
(0C)

Màu huỳnh quang
dưới tia UV
(λ = 365 nm)

B1

C17H12O6

312

268-269

Xanh tím

B2

C17H14O6

314

286-289

Xanh tím

G1

C17H12O7

328

257-259

Xanh lục

G2

C17H14O7

330

237-240

Xanh lục

(Nguồn: Jone, 1977; trích dẫn Lê Anh Phụng, 2001)
2.3.3.3. Cơ chế sinh tổng hợp aflatoxin
Aflatoxin là chất biến dưỡng thứ cấp được tổng hợp theo con đường polyketid.
Theo Payne và Brown (1998), có 17 gen mã hóa cho 12 enzym tham gia trong các
phản ứng sinh tổng hợp aflatoxin và có mối liên hệ rõ ràng giữa sự sinh trưởng của
8


nấm mốc và khả năng sản xuất aflatoxin. Ở A. flavus, gen Alf-2 chịu trách nhiệm
chính trong sinh tổng hợp aflatoxin B1 và B2. Có 5 giai đoạn trong quá trình tổng hợp
aflatoxin (sơ đồ chuyển hóa được trình bày ở phần phụ lục):
(1). Giai đoạn tổng hợp từ hexanoyl CoA tạo thành norsolorinic acid do 1 polyketid
synthase xúc tác.
(2). Chuỗi bên của norsolorinic acid được chuyển hóa tạo thành averufin
(3). Giai đoạn tổng hợp dihydrofuran: bao gồm versiconal acetat làm trung gian và
dẫn đến hình thành versicolorin A
(4). Giai đoạn chuyển từ versicolorin A thành sterigmatocystin (STG)
(5). Giai đoạn methyl hóa: chuyển từ sterigmatocystin thành cumarin
(Townsend, 1992; trích dẫn bởi Lê Anh Phụng, 2001)
2.3.3.4. Tác động sinh học của aflatoxin trong cơ thể động vật
Aflatoxin xâm nhập vào cơ thể chủ yếu qua đường tiêu hóa (đôi khi qua các
đường khác như hô hấp, da…). Sau đó, độc tố này sẽ liên kết với tế bào máu hoặc
thành phần protein của huyết tương (chủ yếu là albumin) và được vận chuyển vào

máu. Sau khi qua hệ thống tĩnh mạch cửa, AFB1 tập trung chủ yếu ở các cơ quan đích
là gan, thận, mề.… Tiếp theo, tại các cơ quan đích (mà nhất là gan) sẽ hoạt hóa AFB1
thành AFB1- epoxide. Chất này có thể liên kết với DNA tế bào gan và protein tạo ra cơ
chế gây bệnh trên động vật. Tùy thuộc vào lượng AFB1- epoxide mà thú sẽ có biểu
hiện nhiễm độc cấp tính hay mãn tính. AFB1 không được hoạt hóa sẽ được bài thải ra
ngoài qua phân, nước tiểu hay qua sữa, trứng… (Campbell, 1976; trích dẫn bởi Lê
Anh Phụng, 2001).
2.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo aflatoxin của nấm mốc
Nhìn chung các điều kiện thuận lợi cho sinh trưởng của nấm mốc cũng thuận lợi
cho sự sản sinh aflatoxin (Northolt, 1979; Lê Anh Phụng, 2001).
2.3.4.1. Loài nấm mốc
Khả năng sinh aflatoxin của các loài nấm mốc, thậm chí của các chủng nấm mốc
trong một loài cũng rất khác nhau (Bùi Xuân Đồng, 2003). Theo Klich và Pitt (1998)
thì chỉ có 50% số chủng A. flavus là có khả năng sinh độc tố. Mức sản xuất aflatoxin
rất khác nhau từ các chủng sinh rất ít cho đến các chủng sinh lượng rất cao aflatoxin
(Doupnik, 1969; trích dẫn bởi Lê Anh Phụng, 2001).
9


2.3.4.2. Loại cơ chất
Aflatoxin thường được tìm thấy trên các nguyên liệu có hàm lượng
carbonhydrate cao như bắp, gạo, hạt kê, đậu phộng, cùi dừa, hạt hướng dương…
nhưng chủ yếu là các loại hạt có dầu, đặc biệt đậu phộng là loại cơ chất thuận lợi nhất
cho sản xuất aflatoxin (Lê Anh Phụng, 2001).
Theo một số tác giả (Ambrecht, 1963; Diener và David, 1969), các chủng
A. flavus nuôi cấy lâu trên môi trường tổng hợp sẽ bị giảm hoặc mất khả năng sinh
aflatoxin, trong khi nuôi cấy lâu trên môi trường tự nhiên lại làm tăng khả năng sản
xuất aflatoxin (trích dẫn bởi Lê Anh Phụng, 2001).
2.3.4.3. Điều kiện ngoại cảnh
Nhiệt độ thích hợp cho sự sản sinh aflatoxin dao động trong khoảng 25 – 300C,

tối ưu là 280C (Moreau, 1974).
Độ ẩm hạt tốt nhất cho sản xuất aflatoxin là 15 – 30%. Độ ẩm tăng sẽ làm tăng
sản xuất aflatoxin nhưng nếu độ ẩm trên 50% thì lại làm giảm sản xuất aflatoxin vì lúc
đó giữa các hạt có quá nhiều nước sẽ gây ra sự thiếu thoáng khí và làm tăng CO2 trong
môi trường (Moreau, 1974).
Ngoài ra, các yếu tố sinh vật như sâu mọt, gặm nhấm… thường mở đường cho
nấm mốc xâm nhập, phát triển và sinh độc tố. Sự cạnh tranh của nhiều loài nấm mốc
trên một cơ chất cũng ảnh hưởng làm tăng hoặc làm giảm lượng độc tố tạo thành
(Widstrom, 1990; trích dẫn bởi Lê Anh Phụng, 2001).
2.4. Bệnh nhiễm độc aflatoxin
2.4.1. Cơ chế gây bệnh
Aflatoxin liên kết với DNA trong nhân của tế bào vật chủ gây ức chế enzyme
polymerase của DNA, làm hạn chế sự tổng hợp RNA, nên việc tạo ra enzyme
polymerase t-RNA cũng giảm, hậu quả là làm giảm sút sự tổng hợp protein trong tế
bào. Từ đó làm rối loạn sự tăng trưởng bình thường của tế bào, dẫn đến một số bệnh
trên người và gia súc (Nexterin và Viarinova, 1971; trích dẫn bởi Dương Thanh Liêm,
2008).

10


2.4.2. Aflatoxicosis
2.4.2.1. Aflatoxicosis trên động vật
Nhiễm độc cấp tính
Bệnh xảy ra khi động vật ăn vào một lượng khá lớn độc tố. Tính gây độc cấp tính
thường được thể hiện qua liều gây chết LD50. Triệu chứng trúng độc không rõ ràng,
thường có biểu hiện thần kinh như nằm liệt, co giật; chết có thể xảy ra sau một thời
gian ngắn (thường dưới 72 giờ). Bệnh tích chủ yếu xảy ra trên gan (nhạt màu, hoại tử
nhu mô, tăng sinh ống dẫn mật…). Nhìn chung các loài gia cầm mẫn cảm hơn so với
gia súc. Thứ tự mẫn cảm như sau:

Gia cầm: vịt > gà tây > ngỗng > ngan > gà
Gia súc: chó > heo > bò > ngựa > cừu
(Allcroft, 1962; trích dẫn Nguyễn Hữu Nam, 1997)
Bảng 2.3: Liều gây chết LD50 của aflatoxin B1 cho uống 1 lần duy nhất
Loài động vật

LD50

(xếp theo thứ tự mẫn cảm)

(mg/kg thể trọng)

Vịt con
Heo
Chó
Cừu
Khỉ
Gà
Chuột bạch

0,3 - 0,6
0,6
1,0
2,0
2,2
6,3
9,0

(Nguồn: Ciegler, 1975; trích dẫn bởi Dương Thanh Liêm, 2008)
Nhiễm độc mãn tính

Bệnh xảy ra do thú tiếp nhận một lượng thấp độc tố trong thời gian dài; thường
xảy ra hơn so với nhiễm độc cấp tính do thú không chỉ ăn duy nhất một loại thức ăn.
Ức chế miễn dịch: Khi tiêu thụ lượng thấp độc tố sẽ làm cho thú giảm sức đề
kháng, suy giảm hệ miễn dịch do aflatoxin làm giảm tổng hợp protein, giảm khả năng
thực bào của tế bào đơn nhân ngoại vi (trích dẫn bởi Trần Bắc Vi, 2005). Trên gia
cầm, aflatoxin làm tổn thương, mất chức năng các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch:
teo túi Fabricius, teo tuyến ức, teo lách (Đậu Ngọc Hào, 2007).
Gây ung thư: AFB1 có khả năng gây ung thư gan mạnh nhất trên nhiều loài động
vật khi chúng bị nhiễm trong thời gian dài.
11


Bảng 2.4: Khả năng gây ung thư gan của aflatoxin B1 ở động vật thí nghiệm
Liều cho ăn

Thời gian nuôi dưỡng

Tần suất

(ppb)

(tháng)

(%)

Vịt con

30

14

72

Cá hồi

8

12

40

Chuột cống trắng

100

13,5 – 44

100

Chuột nhắt

150

20

0

Loài vật thí nghiệm

(Nguồn: Carnaghan, 1967; trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào, 2003)

Ngoài ra, aflatoxin còn gây ra các rối loạn sinh sản ở thú cái mang thai (chết thai,
khô thai hoặc gây sẩy thai). Đối với gia cầm vào thời kỳ đầu bị nhiễm aflatoxin, tỷ lệ
chết phôi là rất cao và tỷ lệ ấp nở là rất thấp (Dương Thanh Liêm, 2008).
2.4.2.2. Aflatoxicosis trên người
Ngoài việc gây ngộ độc cấp tính (liều gây chết người khoảng 10 mg), độc tố
aflatoxin còn được xem là nguyên nhân gây xơ gan và ung thư gan. Người ta đã biết
aflatoxin là một trong những chất gây ung thư gan mạnh nhất tác động qua đường
miệng – nếu hấp thu một tổng lượng 2,5 mg aflatoxin trong thời gian 89 ngày có thể
dẫn đến ung thư gan hơn 1 năm sau (Vũ Hướng Văn, 2009).
Aflatoxin ảnh hưởng rất nhiều đến miễn dịch trung gian tế bào (Pestka và Bondy,
1994; trích dẫn bởi Dương Thanh Liêm, 2008). Nó còn ảnh hưởng xấu lên những đứa
trẻ bị bệnh suy dinh dưỡng protein và năng lượng (PEM – Protein Energy
Malnutrition) ở các nước kém và đang phát triển (Dương Thanh Liêm, 2008).
2.5. Các phương pháp phát hiện và định lượng aflatoxin
2.5.1. Phương pháp sinh vật học
Phương pháp này dựa vào tác động sinh học của aflatoxin trên một số loài sinh
vật (vịt con, gà con, chuột nhắt, chuột bạch, phôi gà, chó, khỉ, ấu trùng giáp xác...).
Thông thường người ta dùng vịt con 1 ngày tuổi để phát hiện aflatoxin vì phương pháp
này cho độ nhạy cao (0,1 ppm) và thời gian thí nghiệm tương đối ngắn (7 – 10 ngày)
với các triệu chứng bệnh rõ rệt ở gan (Bùi Xuân Đồng, 2004).
Tuy nhiên hiện nay phương pháp sinh học ít được dùng do kém tính chuyên biệt
và mất nhiều thời gian; hơn nữa lại chỉ có thể định tính, không thể định lượng.

12


2.5.2. Phương pháp lý hóa
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào tính tan hay không tan của aflatoxin
trong một số dung môi hữu cơ thích hợp để chiết tách aflatoxin từ mẫu, sau đó xác
định aflatoxin nhờ vào khả năng phát huỳnh quang của aflatoxin qua thực hiện kỹ

thuật sắc ký (Lê Anh Phụng, 2002).
2.5.2.1. Sắc ký vi cột (minicolumn)
Phương pháp này gồm một cột thủy tinh có đường kính 5 – 6 mm, dài khoảng 20
cm được nhồi các chất hấp phụ độc tố như alumina, silicagel và florisil; calcium sulfat
giữ nước ở hai đầu. Cho mẫu được chiết bằng chloroform chảy qua cột nhờ trọng lực,
lớp hấp phụ sẽ giữ aflatoxin lại và ta sẽ phát hiện được khi chiếu dưới ánh đèn UV (Lê
Anh Phụng, 2002).
2.5.2.2. Sắc ký lớp mỏng (TLC – Thin Layer Chromatography)
Là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi nhất vì vừa có độ tin cậy tương đối cao, vừa
không cần có trang thiết bị đắt tiền.
Thực hiện với một bản mỏng kích thước 20 x 20 cm đã phết sẵn một lớp mỏng
chất silicagel. Nhỏ dịch chiết tinh sạch (đã được cô cạn trước khi pha loãng bằng
chloroform, aceton, methanol) và dịch chuẩn với những lượng tương đương nhau
(thường là 1, 2, 5, 10 µl) lên bản mỏng. Sau đó triển khai bản mỏng trong bình tối
chứa hỗn hợp dung môi (thường dùng chloroform và aceton) để tách rời các đơn chất.
Quan sát vị trí, cường độ ánh sáng của các đốm mẫu và các đốm chuẩn dưới ánh sáng
đèn UV để xác định loại độc tố, hàm lượng độc tố (Lê Anh Phụng, 2002).
2.5.2.3. Sắc ký lỏng cao áp (HPLC – High Pressure Liquid Chromatography)
Dùng một cột đã được nhồi sẵn các hạt chất hấp phụ rắn như silicagel, alumina,
chất trao đổi ion…. Dịch chiết được bơm vào cột dưới áp suất cao. Các đơn chất được
hấp phụ ở các mức độ khác nhau sẽ tạo ra sự phân tách vật lý giữa chúng, kết quả là
thời gian tách ra khỏi cột (RT – Retention Time) của mỗi chất cũng khác nhau. Các
chất này sẽ được nhận biết nhờ một công cụ thích hợp (đầu dò). Căn cứ vào RT tương
ứng của mẫu và chuẩn để xác định mẫu. Dựa vào chiều cao đỉnh (peak) của mẫu trên
sắc ký đồ để tính được diện tích mẫu. So sánh diện tích của mẫu và chuẩn để định
lượng độc tố đó (Lê Anh Phụng, 2002).

13

2.5.3. Phương pháp miễn dịch học
Phương pháp này dựa vào khả năng kết hợp thuận nghịch giữa kháng nguyên
(mycotoxin ta cần khảo sát) với kháng thể chuyên biệt (là kháng thể được tạo ra nhờ
kỹ thuật gây miễn dịch cho động vật bằng kháng nguyên kích thích miễn dịch) thành
một phức hợp kháng nguyên – kháng thể. Sau đó dùng kháng nguyên đánh dấu cạnh
tranh để đo lường phức hợp này (Lê Anh Phụng, 2002).
Một số phương pháp miễn dịch học được sử dụng trong những năm gần đây:
miễn dịch phóng xạ (RIA – Radio Immuno Assay), hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme
(ELISA – Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Các kỹ thuật này có độ nhạy cao,
giới hạn phát hiện thấp, phát hiện nhanh và các mẫu thử không cần phải làm sạch kỹ,
nhưng kỹ thuật phức tạp, đòi hỏi thao tác chính xác, nên chưa được dùng phổ biến.
2.6. Giải pháp nhằm hạn chế tác hại của aflatoxin
2.6.1. Phòng nấm mốc xâm nhập và phát triển
Đây là công việc có ý nghĩa đặc biệt quan trọng, vì nếu nông sản không có sự
xâm nhập của nấm mốc thì sẽ không có độc tố nấm mốc. Để thực hiện được điều này,
cần có sự phối hợp đồng bộ từ khâu trước thu hoạch, trong thu hoạch và sau thu hoạch.
(1). Giai đoạn trước thu hoạch: chuẩn bị tốt đất trồng trọt, chọn giống cây trồng có
sức kháng bệnh cao, sử dụng hóa chất để bảo vệ cây trồng chống lại sự tấn công của
nấm mốc, sâu rầy gây bệnh…
(2). Giai đoạn trong thu hoạch: tránh thu hoạch trong những điều kiện thời tiết bất
lợi cho cây trồng, cần tập trung thu hoạch nhanh và đưa về sấy khô nhanh để tránh sự
phát triển của nấm mốc. Giảm thiểu tối đa sự tồn đọng cây trồng trên đồng ruộng, hạn
chế sự trầy xước, dập bể nông sản khi thu hoạch.
(3). Giai đoạn sau thu hoạch: ngoài biện pháp vệ sinh đồng ruộng thì kỹ thuật bảo
quản nông sản sau thu hoạch như phơi, sấy khô, quạt sạch, bao gói kín, kho dự trữ
sạch sẽ cũng là yếu tố góp phần quyết định chất lượng của nông sản (Dương Duy
Đồng, 2006). Cần kiểm tra, đánh giá tình trạng nguyên liệu trước khi dự trữ. Nơi dự
trữ phải có cấu trúc hợp lý để duy trì môi trường khô, mát, ổn định. Kiểm soát và trừ
khử côn trùng, sâu mọt trong kho. Định kỳ kiểm tra lại nông sản, xử lý thêm nếu cần
(Dương Thanh Liêm, 2008).

14