NGHIÊN cứu CHUYỂN hóa SINH KHỐI LIGNOCELLULOSE bởi ENZYME FERULOYL ESTERASE từ nấm ALTERNARIA TENUISSIMA

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC


LUẬN VĂN THẠC SỸ
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU CHUYỂN HÓA SINH KHỐI
LIGNOCELLULOSE BỞI ENZYME FERULOYL
ESTERASE TỪ NẤM ALTERNARIA TENUISSIMA

NGUYỄN TRUNG HIẾU

Hà Nội, năm 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

---------------

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGHIÊN CỨU CHUYỂN HÓA SINH KHỐI
LIGNOCELLULOSE BỞI ENZYME FERULOYL
ESTERASE TỪ NẤM ALTERNARIA TENUISSIMA
NGUYỄN TRUNG HIẾU

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã ngành:8420201
HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. ĐỖ HỮU NGHỊ

Hà Nội, năm 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan, đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi dưới
sự hướng dẫn của TS. Đỗ Hữu Nghị. Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung
thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Học viên

Nguyễn Trung Hiếu


LỜI CẢM ƠN
Để có thể hoàn thành đề tài luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh, bên
cạnh sự nỗ lực cố gắng của bản thân còn có sự hướng dẫn nhiệt tình của quý
Thầy Cô, cũng những sự động viên ủng hộ của gia đình và bạn bè trong suốt
thời gian học tập nghiên cứu và thực hiện luận văn thạc sĩ.
Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến TS. Đỗ Hữu Nghị người đã hết
lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này.
Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến toàn thể quý thầy cô trong Khoa
đào tạo sau Đại học – Viện Đại học Mở Hà Nội đã tận tình truyền đạt những
kiến thức quý báu cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong
suốt quá trình học tập nghiên cứu và cho đến khi thực hiện đề tài luận văn.
Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến Phòng Sinh học thực nghiệmViện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã không ngừng hỗ trợ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi
trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn đến gia đình, các anh chị và các
bạn đồng nghiệp đã hỗ trợ cho tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập,
nghiên cứu và thực hiện đề tài luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh.

Hà Nội, tháng 10 năm 2017
Học viên thực hiện

Nguyễn Trung Hiếu


MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU

1

MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

4

1.1 Giới thiệu

4

1.2 Cấu trúc của lignocellulose

6

1.2.1 Cellulose

9

1.2.2 Hemicellulose

10

1.2.3 Lignin

11

1.3 Enzyme esterase

12

1.3.1 Acetyl esterase

13

1.3.2 Feruloyl esterase

14

1.4 Giới thiệu nấm túi Ascomycota và loài Alternaria tenuissima

16

1.4.1 Nấm túi Ascomycota

16

1.4.2 Nấm Alternaria tenuissima

18

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

20

2.1 Nguyên vật liệu

20

2.1.1 Chủng giống

20

2.1.2 Hóa chất

20

2.1.3 Môi trường

20

2.2 Máy móc thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

22

2.3 Phương pháp nghiên cứu

22

2.4 Thực hành

23

2.4.1 Định danh nấm theo hình thái và sinh học phân tử

23

2.4.2 Sàng lọc hoạt tính Feruloyl esterase

25

2.4.3 Xác định hoạt tính enzyme

26

2.4.4 Tách chiết, tinh sạch protein enzyme

27


2.4.5 Xác định nồng độ protein

27

2.4.6 Điện di gel polyacrylamide (SDS-PAGE)

28

2.4.7 Điện di điểm đẳng điện (IEF)

39

2.4.8 Xác định đặc tính của protein enzyme tinh sạch

31

2.4.9 Xúc tác chuyển hóa sinh học các vật liệu giàu lignocellulose

31

2.4.10 Phương pháp HPLC-DAD

32

2.4.11Phương pháp HPSEC

33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

34

3.1 Kết quả định danh chủng nấm bằng phương pháp sinh học phân tử

34

3.2 Sinh tổng hợp feruloyl esterase bởi Alternaria tenuissima

40

3.3 Tinh sạch và đặc tính protein enzyme từ môi trường nuôi cấy nấm

41

3.3.1 Tinh sạch FAE của Alt. tenuissima(AltFAE)

41

3.3.2 Trọng lượng phân tử của AltFAE

43

3.3.3 Hằng số xúc tác và tính đặc hiệu cơ chất của AltFAE

44

3.4 Quy trình lên men, chiết tách và tinh sạch enzyme esterase từ nấm

46

3.5 Chuyển hóa sinh khối lignocellulose giải phóng các phân ảnh lignin

48

3.6 Chuyển hóa sinh khối lignocellulose giải phóng acid hydroxycinnamic

49

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

52

TÀI LIỆU THAM KHẢO

53


DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1: Thành phần một số nguồn sinh khối giàu lignocellulose

8

Bảng 3.1: Tinh sạch protein enzyme hoạt tính feruloyl esterase từ dịch lên
men Alt.tenuissima (AltFAE)

41

Bảng 3.2: Hằng số động học xúc tác của FAE từ Alt. tenuissima (AltFAE)

45


DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1: Cấu trúc thành tế bào thực vật

8

Hình 1.2: Lignocellulose và các thành phần cấu tạo

9

Hình 1.3: Cấu trúc của Cellulose

10

Hình 1.4: Các đơn vị cơ bản của lignin

11

Hình 1.5: Cấu trúc xoắn đặc trưng của α/β-hydrolase và bộ ba axit amin

13

trung tâm xúc tác
Hình 1.6:Cơ chế xúc tác thủy phân ester của feruloyl esterase (FAE)

14

Hình 1.7: Hình ảnh nấm Alternaria tenuissima trên lá cây

19

Hình 1.8: Hình ảnh nấm Alternaria tenuissima dưới kính hiển vi x100

19

Hình 2.1:Phản ứng de-methyl hóa methyl ferulate xúc tác bởi feruloyl

26

esterase (FAE) tạo sản phẩm alcohol và acid ferulic xác định bằng phương
pháp HPLC.
Hình 2.2: Sơ đồ điện di SDS-PAGE

29

Hình 3.1: (A) Điện di ADN tổng số đại diện của các mẫu nấm trên gel

34

agarose 0,9%. (B) Sản phẩm PCR đại diện (mẫu SP66) của nấm phân tích
với cặp mồi ITS1/ITS4điện di trên gel agarose 0,9%. (M: marker phân tử
1 kb).
Hình 3.2: Chủng nấm phân lập Alternaria tenuissima [ký hiệu SP66; (A)]

36

phát triển trên môi trường thạch và hình thái bào tử [độ phóng đại x100;
(B)]
Hình 3.3: Mối quan hệ họ hàng của chủng nấm SP66 với các loài/dưới

37

loài trong cùng chi lấy trên Genbank trên cơ sở phân tích trình tự
nucleotide vùng gen ITS bằng phương pháp Maximum Likelihood (ML).

Tomophagus colossus (JN184396) được xem như loài ngoài nhóm
(outgroup)
Hình 3.4:Mối quan hệ họ hàng của chủng nấm SP66 với các loài/thứ
trong cùng chi lấy trên Genbank trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide

39


vùng gen ITS bằng phương Maximum Parsimony (MP). Tomophagus
colossus (JN184396) được xem như loài ngoài nhóm
Hình 3.5: Mối quan hệ họ hàng của chủng nấm SP66 với các loài/dưới
loài trong cùng chi lấy trên Genbank trên cơ sở phân tích trình tự
nucleotide vùng gen ITS bằng phương pháp Neighbor Joining (NJ).
Tomophagus colossus (JN184396) được xem như loài ngoài nhóm
Hình 3.6: Hoạt tính feruloyl esterase (FAE) của chủng nấm phân lập

39

40

Alternariatenuissima cho thấy vòng phân giải cơ chất chỉ thị ethyl
ferulate.
Hình 3.7: Động học sinh tổng hợp feruloyl esterase trong 24 ngày nuôi

41

cấy Alt. tenuissima trên các môi trường cơ chất cà chua (CC), bã ngô
(BN), đậu tương (DT), rơm (RR), khoai tây (KT) và mùn gỗ (MG).
Hình 3.8: Tinh sạch protein enzyme hoạt tính feruloyl esterase từ nấm

42

Alternariatenuissima (AltFAE) qua cột sắc ký trao đổi anion Q
Sepharose®;(─) protein hấp thụ ở λ=280 nm; (●) hoạt tính Alt FAE đối
với cơ chất methyl ferulate.
Hình 3.9: Protein tinh sạch (1) biểu hiện hoạt tính feruloyl esterase

43

(AltFAE) trên gel điện di SDS-PAGE (A); (2) protein marker.
Hình 3.10: Đường cong động học Michaelis–Menten (hình lớn) và đồ thị

45

phương trình Lineweaver–Burk (hình nhỏ) của feruloyl esterase từ Alt.
tenuissima (AltFAE) xúc tác thủy phânmethyl p-coumarate.
Hình 3.11: Quy trình chiết tách và tinh sạch protein enzyme hoạt tính

46

feruloyl esterase từ môi trường lên men nấm Alt. tenuissima
Hình 3.12: Sắc ký đồ HPSEC các phân mảnh hợp chất lignin từ cơ chất

48

mùn gỗ chuyển hóa in vivo bởi nấm X. polymorpha (sau 7 ngày nuôi cấy;
đường nét mảnh) và chuyển hóa in vitro bởi acetyl esterase (XpoAE, sau
48h; đường nét đậm). Đối chứng gồm cơ chất và enzyme XpoAE đã biến
tính (đường nét đứt). Peak (1) – alkaline lignin, (2) – axit sulfonic lignin.
Hình 3.13: Sắc ký TLC sản phẩm là axit hydroxycinnamic sau chuyển

hóa sinh khối rơm (RR) và mùn gỗ (MG) bởi “enzyme cocktail”. Chất

49


chuẩn: axit ferulic Rf(FA)= 0,63; p-coumaric Rf(p-CA) = 0,63; axit sinapic
Rf(SA) = 0,48.
Hình 3.14: Sắc ký đồ HPLC sản phẩm sau chuyển hóa sinh khối

50

lignocellulose.
Hình 3.15: Sản phẩm axit hydroxycinnamic (axit ferulic, p-coumaric) sau
chuyển hóa mùn gỗ (MG) bởi các đơn enzyme và “enzyme cocktail”.
AltFAE: feruloyl esterase từ nấm Alt. tenuissima, XpoAE: acetyl esterase
từ

X.

polymorpha,

cellulase/glucuronoxylanase.

CMCase/Xyl:

carboxymethyl

50

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AE
AltFAE
Bp
BSA
CA
CE
DAD
DEAE
EC
FA
FAE
HPLC
HPSEC
IEF
kcat
kDa
Km
λ
MW
MOPS
NCBI
SA
PCR
pI
SDS-PAGE
U
XpoAE

Enzyme acetyl esterase

Enzyme feruloyl esterase (tinh sạch) từ nấm Alternaria tenuisima
Base pair (cặp bazơ)
Bovine serum albumin (albumin huyết thanh bê)
Acid p-coumaric
Carbohydrate esterase
Đầu dò diode array
Diethylaminoethyl
Enzyme commision (Tiểu ban enzyme, Hội Hóa sinh quốc tế)
Acid ferulic
Ferulic acid esterase (≡ feruloyl esterase)
High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
High-performance size exclusion chromatography
Điện di đểm đẳng điện
Hằng số xúc tác enzyme
Kilo dalton
Hằng số Michaelis-Menten
Bước sóng
Molecular weight (trọng lượng phân tử)
Acid 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid
National Center For Biotechnology Information
Acid sinapic
Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymerase)
Isoelectric point (điểm đẳng điện)
Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (điện di SDSPAGE)
Unit (đơn vị enzyme)
Enzyme acetyl esterase tinh sạch từ nấm Xylaria polymorpha


MỞ ĐẦU
Sinh vật phân hủy sinh khối thực vật đóng một vai trò quan trọng trong

việc duy trì vòng tuần hoàn carbon nhờ khả năng chuyển hóa hiệu quả các vật
liệu thực vật bởi hệ enzyme thủy phân. Trong số các sinh vật phân hủy
lignocellulose, các loài nấm thuộc nấm đảm Basidiomycota và nấm túi
Ascomycota được biết là có hệ xúc tác sinh học hiệu quả nhất và được chia
thành 3 nhóm: nấm mục trắng, nấm mục nâu và nấm mục mềm [3]. Thật vậy,
nấm có hai hệ enzyme ngoại bào - hệ enzyme thủy phân có vai trò trong phân
hủy polysaccharide; và hệ enzyme oxy hóa, enzyme phân giải lignin ngoại
bào để phân hủy lignin và xúc tác phản ứng mở vòng phenyl. Các enzyme
phân giải thành tế bào thực vật nhận được nhiều sự quan tâm bởi chúng có thể
giải phóng các đơn vị đường C5-C6 cần thiết cho các quá trình lên men và
sản xuất ethanol sinh học cũng như giải phóng các hợp chất thơm (phenolic)
từ các vật liệu sinh khối thô [11].
Feruloyl esterase (EC 3.1.1.73), một phụ lớp của carboxylic ester
hydrolase, là enzyme thủy phân các liên kết ester trong cấu trúc sinh khối
thực vật để giải phóng các acid phenolic (acid ferulic, acidp-coumaric…) và
các dimer của chúng. Enzyme có hoạt tính feruloyl esterase gần đây nhận
được nhiều sự quan tâm bởi vai trò của chúng trong nhiều ngành công nghiệp
như hóa chất, giấy và bột giấy, dệt và nhiên liệu sinh học. Sự quan trọng của
enzyme này còn liên quan đến sự thu nhận các acid hydroxycinnamic từ phụ
phẩm nông nghiệp. Các acid hydroxycinnamic được biết là các chất chống
oxi hóa mạnh, cơ chất cho sản xuất vanillin, chống ung thư da và ung thư
đường ruột [40], [27], kháng virus, virus cúm, AIDS [26],[56] chứng minh
khả năng của acid ferulic làm tăng sinh các tế bào thần kinh gốc và cải thiện

1


sự đáp ứng với biểu hiện trầm cảm cho thấy tiềm năng sử dụng các acid
hydroxycinnamic trong y dược.
Đây là những cơ sở có ý nghĩa khoa học và ứng dụng thực tế để chúng

tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu chuyển hóa sinh khối lignocellulose bởi
enzyme feruloyl esterase từ nấm Alternaria tenuissima.

2


NỘI DUNG CỦA ĐỀ TÀI
- Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp feruloyl esterase (FAE) bởi nấm
Alternaria tenuissima
- Tinh sạch, nghiên cứu đặc tính hóa-lý và đặc hiệu cơ chất của protein
enzyme FAE
- Nghiên cứu chuyển hóa sinh khối lignocellulose giải phóng các phân
mảnh hợp chất thơm vàacid hydroxycinnamic bởi FAE và hỗn hợp enzyme
xúc tác.

3


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu
Sinh khối thực vật, nguồn carbohydrat có khả năng tái tạo lớn nhất trên
trái đất, được quang tổng hợp khoảng 200 tỷ tấn mỗi năm, trong đó
lignocellulose chiếm 60 % tổng sinh khối [46],[57]. Gần đây, các ý tưởng cho
mục đích tinh chế nguồn sinh khối thực vật nhận được nhiều quan tâm bởi
tiềm năng chuyển hóa vật liệu này thành các sản phẩm có giá trị cao, bao gồm
các hợp chất hữu cơ, cơ chất cho các quá trình lên men vi sinh, nhiên liệu sinh
học. Do vậy, các công nghệ mới đã và đang được phát triển nhằm thu được
nguồn nhiên liệu từ sinh khối một cách có hiệu quả, trong khi đó các quốc gia
phát triển và đang phát triển tập chung nỗ lực nghiên cứu nhằm thu được các
nhiên liệu sinh học như bioethanol và biodiesel [37]. Tại Việt Nam, năm 2007

Thủ tướng CP đã phê duyệt “Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm
2015, tầm nhìn đến năm 2025” nhằm mục tiêu tổng quát là phát triển nhiên
liệu sinh học để thay thế một phần nhiên liệu hóa thạch truyền thống, góp
phần đảm bảo an ninh lương thực và bảo vệ môi trường. Tới nay, nước ta vẫn
còn là một nước dựa trên kinh tế nông nghiệp, chủ yếu là cây lúa nước, ngô,
sắn, cây mía…, đây chính là nguồn nguyên liệu sinh khối rất tiềm năng cho
mục tiêu phát triển nhiên liệu sinh học cũng như các sản phẩm chuyển hóa có
giá trị khác.
Về cấu trúc, ngoài các thành phần chính là polysaccharide sinh khối
thực vật còn có các hydroxycinnamate liên kết cộng hóa trị với các polymer
này qua các liên kết ester- và ether. Có thể phát hiện các hydroxycinnamate ở
nhiều loài thực vật và chúng có hàm lượng cao ở các vật liệu như các sản
phẩm phụ công-nông nghiệp, ví dụ như rơm rạ (0,7% và 1,2% acidpcoumaric và ferulic) [33], cám (0,5-0,8% acid ferulic) [32]. Ở lớp vỏ trấu của

4


hạt đại mạch có khoảng 0.6-0.9% acid phenolic tổng tính theo trọng lượng
khô và hàm lượng cao nhất là ferulic và p-coumaric [13]. Hơn nữa, các hợp
chất phenolic từ bột cà phê cho thấy acid chlorogenic (5-O-caffeoyl quinic) là
thành phần chính trong đó chiếm tới khoảng 40% [45]. Sự thu hút về ứng
dụng công nghiệp của các acid phenolic này ngày càng tăng trong vài năm trở
lại đây bởi các hoạt tính sinh học của chúng, như hoạt tính chống oxy hóa
cũng như các lợi ích đối với sức khỏe. Acid phenolic cũng như các dẫn xuất
của chúng nhận được sự quan tâm đặc biệt như những chất bảo vệ tiềm năng
chống lại các bệnh mạn tính liên quan đến quá trình lão hóa hay suy giảm
miễn dịch ở người như tiểu đường, ung thư, AIDS và các bệnh tim mạch.
Theo đó, các enzyme xúc tác giải phóng hoặc chuyển hóa các hợp chất thơm
này cũng nhận được sự quan tâm đặc biệt [50],[14]. Một số các enzyme
carboxyl esterase liên quan đến sự thủy phân sinh khối thực vật (như feruloyl

esterase) đã được tinh sạch và nghiên cứu đặc tính, chủ yếu là từ nguồn nấm
và vi khuẩn (ví dụ như Clostridium spp., Pseudomonas spp., Aspergillus spp.,
Penicillium spp) [49]. Từ khi feruloyl esterase đầu tiên được phân lập từ
Schizophyllum commune, enzyme này được coi là thành viên của hệ enzyme
thủy phân hemicellulose ở nhiều loài vi sinh vật. Các esterase này đại diện
cho một nhóm rất đa dạng của các enzyme có khả năng xúc tác giải phóng
acid phenolic (acid ferulic và p-coumaric) và dimer của chúng từ các vật liệu
sinh khối thô.
Liên quan đến chuyển hóa sinh học các vật liệu sinh khối thực vật, đã
có những nghiên cứu của các nhà khoa học trong nước sử dụng các enzyme
thủy phân (cellulase, xylanase, β-glucosidase, pectinase) và enzyme
oxidoreductase (laccase, peroxidase) trong chuyển hóa các sản phẩm phụ
nông nghiệp [4],[7], [10]. PGS. Trần Đình Mấn, Viện Công nghệ sinh học
(Viện Hàn lâm KHCNVN) đã có nhiều năm nghiên cứu về các enzyme

5


cellulase chịu nhiệt từ vi sinh vật, như Geobacillus thermoglucosidasius,
Pantoea spp., Cellulomonas spp., Clostridium spp. được phân lập từ các vùng
suối nước nóng [6]. Nhóm nghiên cứu của TS. Võ Hoài Bắc (2012; Viện
CNSH) đã tạo được chủng Bacillus subtilis tái tổ hợp sinh enzyme pectinase
với hoạt tính cao và đã được thử nghiệm để loại pectin trong xử lý vải bông.
PGS.TS. Nguyễn Thị Xuân Sâm (2003) [8], Viện CNSH và thực phẩm - Đại
học Bách khoa HN, sử dụng β-glucosidase từ chủng nấm thuộc Ascomycota
là A. niger để thủy phân bã mía với hiệu quả cao, trong khi đó xylanase từ
loài nấm này cũng được nghiên cứu ứng dụng trong tẩy trắng bột giấy bởi
Nguyễn Văn Diệp et al. (2005) [2]. Tuy nhiên, ngoài nhóm nghiên cứu của
TS. Đỗ Hữu Nghị [42],[43]hiện chưa có công bố nào là kết quả của các
nghiên cứu trong nước về vai trò của các enzyme esterase (feruloyl esterase,

acetyl esterase…) đến quá trình chuyển hóa vật liệu sinh khối thực vật. Hiện
nay, chỉ một số feruloyl esterase được biết và chủ yếu từ nguồn vi khuẩn hoặc
vi nấm (Vd., Clostridium spp., Pseudomonas spp., Aspergillus spp.,
Penicillium spp., Fusarium spp., Aureobasidium pullulans) [59] và rất ít
feruloyl esterase từ nấm lớn được đề cập đến. Từ kết quả thu nhận, tinh sạch
và đặc tính của enzyme esterase từ nấm Alt. tenuissima, trong nội dung
nghiên cứu của luận văn này chúng tôi sử dụng enzyme feruloyl esterase từ
loài nấm túi này cũng như xúc tác phối hợp với các enzyme thủy phân và oxy
hóa (laccase) khác cho chuyển hóa hiệu quả sinh khối (rơm rạ, bã mía, mùn
gỗ, arabinoxylan…) thành các chất có giá trị cao hơn (đường đơn và acid
hydroxycinnamic).
1.2Cấu trúc của lignocellulose
Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và các
thực vật khác như cỏ, lúa, ngô…Trong tự nhiên, lignocellulose có thể tìm

6


thấy ở thực vật hay các chất thải nông nghiệp, lâm nghiệp và các chất thải rắn
trong thành phố. Thành phần chủ yếu của lignocellulose bao gồm cellulose
(25 -55%), hemicellulose (chủ yếu xylan, 8 - 30%) và lignin (18 -35%)
[21],[39]. Cellulose và hemicellulose là các đại phân tử cấu tạo từ các gốc
đường khác nhau, trongkhi lignin là một polymer dạng vòng được tổng hợp từ
tiền phenylpropanoid. Thành phần là cấu trúc của các polymer này là khác
nhau giữa các loài, trong cùng một cây hay các cây khác nhau là khác nhau
theo độ tuổi, giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây và các điều kiện khác.
Ngoài các thành phần này, Lilholt & Lawther (2000) còn cho rằng pectin
cũng là thành phần của lignocellulose thành tế bào, đặc biệt là ở các cấu trúc
sợi thực vật không phải thành phần gỗ [35].
Ngoài ra, một trong những lý do khó chuyển hóa vật liệu lignocellulose

là sự có mặt của các gốc acetyl hóa trong thành phần hemicellulose và pectin.
Các nhóm acetyl này có trong hemicellulose của gỗ dưới dạng liên kết mạch
nhánh, như O-acetyl-4-O-methyl-glucurono-β-D-xylans ở thực vật hạt kín và
O-acetyl-galacto-glucomannan ở thực vật hạt trần [29],[51]. Sự acetyl hóa ở
vị trí 3-O của gốc xylosyl liên kết với acid 4-O-methyl-D-glucuronic cũng
được thấy ở xylan của rơm hay cây ngũ cốc [41]. Khoảng 22-50% các gốc
xylose có liên kết với nhóm acetyl, đây là nguyên nhân góp phần hạn chế sự
chuyển hóa sinh học hemicellulose sinh khối thực vật [17],[18]. Do đó, các
enzyme có khả năng đề acetyl hóa vật liệu lignocellulose (như acetyl esterase
hay acetyl xylan esterase) có tiềm năng lớn trong các ứng dụng công nghiệp
như các xúc tác thân thiện với môi trường. Acetyl esterase (EC 3.1.1.6) là một
hydrolase xúc tác giải phóng nhóm acetyl từ polymer sinh học như pectin và
xylan của lignocellulose [16]. Cùng với hệ enzyme thủy phân cellulose và
xylan, acetyl esterase được biết là có vai trò quan trọng cho khả năng đồng
hóa các vật liệu thành tế bào thực vật. Enzyme này từ một số nấm

7


ascomycetes đã được miêu tả, bao gồm Trichoderma reesi [51], A. awamori
[62], A. niger [36], Penicillium purpurogenum [67], Fusarium oxysporum
[19] và Chrysosporium lucknowense [47].
Bảng 1.1: Thành phần một số nguồn sinh khối giàu lignocellulose
(Limayem & Rick, 2012)
Nguồn lignocellulose

Cellulose

Hemicellulose

Lignin

(%)

(%)

(%)

Thân gỗ cứng

40-55

24-40

18-25

Thân gỗ mềm

45-50

25-35

25-35

Giấy

85-99

0

0-15

Vỏ trấu

32.1

24

18

Lá cây

15-20

80-85

0

Hạt bông

80-95

5-20

0

Bã thô

33.4

30

18.9

Giấy báo

40-55

25-40

18-30

Giấy thải từ bột giấy hóa
học

60-70

10-20

5-10

25-40

25-50

10-30

Các loại cỏ (trị số trung
bình cho các loại)

Hình 1.1: Cấu trúc thành tế bào thực vật [68]

8


Hình 1.2: Lignocellulose và các thành phần
ph cấu tạoo [68]
1.2.1 Cellulose
Cellulose là polysaccharide phổ
ph biến nhất có mặt chủ yếếu trong thành
tế bào thực vật. Về cấuu trúc hóa hhọc, cellulose là một mạch thẳng
ng do các β-Dglucopyranosa liên kếtt với
v nhau qua liên kết 1,4-glucoside [9]
Các phân tử cellulose kết
k hợp với nhau tạoo thành các bó ssợi (mixel) có
chiều dài 50-100Å.
100Å. Các mixel lại
l tạo thành bó microfiril vớ
ới đường kính
khoảng 250Å có thể thấy
th được bằng kính hiển vi điện tử,, còn fibril tạo
t thành
từ các microfibril có đường
đư
kính 2000Å và có thể quan sát được
đư bằng kính
hiển vi thường. Các sợ
ợii cellulose chính là các fibril. Các phân ttử cellulose
trong các mixel nhờ có rất
r nhiều liên kết hydro nên tạo đượcc ddạng sợi bền

chắc.
c. Cellulose không tan trong nnước và dung môi hữu cơ
ơ như
nhưng tan trong
dung dịch
ch Schweitzer là hydroxyd đồng trong [Cu(CH3)4 ](OH)2 dung dịch
ammoniac, tan trong dung dịch
d kẽm chlorid đậm đặc.
c. Cellulose là thành ph
phần
chính tạo nên lớpp màng tế
t bào thực vật, giúp cho các mô thựcc vvật có độ bền
cơ học và tính đàn hồi.
i. Cellulose có nhiều
nhi trong bông (95-98%),
98%), đđay, gai, tre,
nứa, gỗ...(Cellulose
lose chiếm
chi khoảng 40-45% trong gỗ) [68]. Mộtt ssố nghiên cứu
cho thấyy cellulose có thể
th có vai trò trong điều hòa họa động củaa hhệ thống tiêu
hóa. Vi khuẩn
n trong dạ
d cỏ của gia súc, các động vât nhai lạại và động vật
nguyên sinh trong ruộ
ột của mối sản xuất enzyme phân giảii cellulose. N
Nấm

9

cũng có thể phân hủy cellulsoe để cung cấp nguồn carbon cho sự phát triển
của chúng.

Hình 1.3: Cấu trúc của Cellulose [68]
1.2.2 Hemicellulose
Các đơn vị mắt xích của hemicellulose thường là vòng anhydro của
nhiều saccharide như D-glucose, D-mannose, D-galactose (thuộc hexose), Dxylose, L-arabinose (thuộc pentose). Ngoài ra, còn có các đơn vị acid Dglucuronic, acid 4-O-metyl-D-glucuronic và D-galacturonic. Một số
polysaccharide hemicellulose còn liên kết với nhóm acetyl, làm thành phần
của hemicellulose trở nên phức tạp hơn [9].
Thành phần hemicellulose của cây gỗ cứng chủ yếu là O-acetyl-4-Omethylglucuronoxylan (hay xylan). Xylan là một polysaccharide hỗn tạp có
chứa các nhóm phụ là các gốc acety l,4-O-methyl-D-glucuronosyl và αarabinofuranosyl liên kết với bộ khung được tạo bởi các gốc xylopyranose.
Bộ khung này liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4-glycoside [29]. Xấp xỉ 6070% các đơn vị xylose được ester hóa với acid acetic ở nhóm hydroxyl của
carbon thứ hai hoặc thứ ba và trung bình thì cứ mười đơn vị xylose thì có một
nhóm acid uronic liên kết với gốc xylose theo kiểu α-1,2-glycoside [23].
Ở gỗ mềm, mannan chiếm ưu thế trong thành phần hemicellulose với
lượng xấp xỉ 20% trọng lượng khô. Mannan trong gỗ mềm điển hình là

10


glucomannan với các hàm lượng D-glucose khác nhau. Mannan với hàm
lượng galactose cao đã được đề cập như galactogluco mannan. Gỗ mềm cũng
có chứa arabinoglucuronoxylan, cấu tạo phân tử gồm L-arabinose, 4-Omethyl-α-D-glucoronic và D-xylose, tỉ lệ 1,3:2:10 [54].
1.2.3 Lignin
Sau cellulose, lignin là một trong những polymer có nguồn gốc sinh
học phổ biến nhất trong tự nhiên. Lignin chiếm khoảng 30% khối lượng gỗ
khô ở cây lá kim, khoảng 20% ở cây lá rộng và không tồn tại trong thực vật
bậc thấp như rong, tảo, nấm. Tỉ lệ phần trăm lignin ở cây gỗ cứng và gỗ mềm
là khác nhau [1]. Các đơn vị hình thành nên cấu trúc của lignin là

phenylpropan. Lignin của thực vật có thể được chia thành ba loại: lignin gỗ lá
kim, lignin gỗ lá rộng, lignin cây thân thảo và cây hàng năm. Lignin gỗ lá kim
gồm các đơn vị mắt xích guaiacylpropan còn chứa các đơn vị mắt xích 3,5dimetoxy-4-hydroxy phenylpropan. Lignin các loại cây thân thảo, ngoài các
đơn vị mắt xích trên còn có 4-hydroxy phenylpropan. Các nhóm chức ảnh
hưởng lớn nhất đến tính chất của lignin là nhóm hydroxylphenol, nhóm
hyroxyl và nhóm cacbonyl. Hàm lượng các nhóm chức thay đổi tùy theo loài
thực vật và tùy thuộc vị trí của lignin ở lớp liền kế, lớp sơ cấp hay thứ cấp của
tế bào thực vật.

Hình 1.4: Các đơn vị cơ bản của lignin [68]

11


1.3 Enzyme esterase
Esterase được phát hiện nhiều ở động vật, thực vật và vi sinh vật. Nhờ
đặc tính hữu ích như tương đối ổn định trong dung môi hữu cơ, phổ cơ chất
đặc hiệu rộng, không nhất thiết có mặt của các cofactors, esterase có vai trò
quan trọng và ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học và công nghiệp
[13]. Về mặt cấu trúc, hầu hết tất cả các esterase được biết đều có cấu trúc
gồm nếp gấp đặc trưng α/β-hydrolase và những phức hệ bộ ba xúc tác. Nếp
gấp này tạo nên cấu trúc đặc trưng cho bộ ba xúc tác của esterase (Ser, His và
Asp/Glu) và chuỗi thống nhất Sm-XAA-Ser-XAA-Sm (Sm = acid amin nhỏ;
XAA = acid amin bất kỳ) bảo vệ cho vùng hoạt động của acid amin. Kiểu
chuỗi này có sự thống nhất vị trí hoạt động của serine và là một penta peptid
đặc trưng cho hầu hết các esterase [43]. Gần đây, sự tồn tại của một kiểu khác
nhau Gly-XAA-XAA-Leu đã được mô tả. Tuy nhiên, cấu trúc thực của các
protein cho thấy rằng một số esterases chứa một xúc tác Ser-His thay vì bộ ba
phổ biến Ser-Aps-His, như được tìm thấy ở esterase từ Streptomyces. Các
chuỗi bên có tính acid, thường ổn định các điện tích dương của vị trí hoạt

động dư lượng của His, được thay thế bởi các cacbonyl xương sống của Trp
nằm vị trí đầu của His [58].
Cơ chế xúc tác thủy phân ester bởi esterase được biết đến gồm hai bước
chính: Bước đầu tiên là acetyl hóa - nguyên tử oxy của nhóm hydroxyl ở vùng
hoạt động của serine gắn vào carbon qua liên kết ester. Tiếp đến là bước
deacetyl hóa, nhóm hydroxyl của một phân tử nước tấn công carbon của phức
hệ acetyl-enzyme, các thành phần acetyl được giải phóng và các enzyme hoạt
động được tiếp tục [43].
Quá trình chuyển hóa lignocellulose cần hỗn hợp các enzyme thủy
phân bao gồm các cellulase, xylanase, carbohydrate esterase… có thể hoạt
động phối hợp với nhau để tấn công cấu trúc polymer [11].

12


Carbohydrate esterase (EC 3.1.1x) đại diện cho một nhóm lớn các
hydrolases xúc tác đặc biệt cho sự phân tách hoặc hình thành các ester no và
ester thơm. Một trong số các carbohydrate esterase tham gia vào chuyển hóa
lignocellulose là enzyme acetyl esterase và feruloyl esterase.

Hình 1.5: Cấu trúc xoắn đặc trưng của α/β-hydrolase
và bộ ba acid amin trung tâm xúc tác [68]
1.3.1 Acetyl esterase
Acetyl esterase (EC 3.1.1.6) là enzyme thủy phân xúc tác cho phản ứng
giải phóng nhóm acetyl từ các polysaccharit acetyl hóa như pectin hay xylan
của lignocellulose [16]. Acetyl esterase cùng với hệ enzyme thủy phân
cellulose và xylan đóng vai trò quan trọng trong khả năng chuyển hóa các vật
liệu thành tế bào thực vật, có thể loại bỏ các nhóm acetyl ester từ vị trí C-2,
C-3 của d-xylopyranosyl trong chuỗi xylan [16]. Acetyl esterase là enzyme
quan trọng tác động đến khả năng chuyển hóa các dưỡng chất cần thiết của

thành tế bào thực vật qua thủy phân liên kết ester giữa acetyl và xylose trong
cấu trúc xylan. Quá trình deacetyl này làm các đơn vị xylopyranosyl của
mạch chính xylan dễ bị phân hủy hơn bởi endo-β-1,4-xylanases (EC 3.2.1.8).
Các nhóm acetyl mạch nhánh có thể làm ảnh hưởng tiếp cận của các enzyme
phân cắt mạch chính bởi trở ngại về không gian,vì vậy hoạt động của enzyme

13


acetyl esterase sẽ phân cắt
c t các nhóm acetyl nhánh này, giúp enzyme phân cắt
c
mạch chính được dễ dàng hơn
h [43]. Enzyme này sẽ loại bỏ các nhóm O
O-acetyl
ở các vị trí 2/3 trên β-D
D xylopyranosyl của
c acetyl xylan.
Acetyl esterase có thể
th được tách chiết từ nguồn vi sinh vậật nhưBacillus
pumilis, Bacillussubtilis.
Bacillussubtilis Acetyl esterase từ các vi khuẩn hoạt độộng ở các điều
kiện nhiệt độ và pH khác nhau.
nh Với chủng B.pumilis,, enzyme có tr
trọng lượng
phân tử là 40 kDa, nhiệệt độ tối ưu để enzyme hoạt động
ng là 55ºC cùng vvới pH
tối ưu là 8,0; còn vớii ch
chủng B.subtilis enzyme trọng lượng
ng phân ttử là 31 kDa

và hoạt động tối ưu ở 45ºC. Enzyme tách chiết từ vi khuẩn đường
đư
ruột hoạt
động tối ưu ở 40ºC vớ
ới pH 8,0. Ngoài nguồn enzyme từ vi khuẩn
khu thì acetyl
esterase cũng đượcc tìm thấy
th từ một số nấm
m ngành Ascomycota đđã được miêu
tả, bao gồm T. reesi [13], A. awamori [51], A. niger [36], P. purpurogenum
[67], F. oxysporum [19] và Chr. lucknowense [47]. Theo đó, acetyl esterase
tinh sạch từ A. awamori có trọng lượng phân tử là 31 kDa và nhiệt
nhi độ tối ưu
để enzyme hoạt động
ng là ở nhiệt độ 40ºC với pH 7,0 [51].
1.3.2Feruloyl esterase

Hình 1.6:Cơ chế xúc tác thủy
th phân ester bằng feruloyl acid esterase (FAE) [59].

14