phuong phap khoi pho

TOPIC 9:

SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP
KHỐI PHỔ VÀ
DẤU PHÓNG XẠ TRONG
NGHIÊN CỨU SINH HỌC
THỰC NGHIỆM
Giảng viên hướng dẫn : PGS.TS Lê Thị Phương Hoa
TS. Đào Văn Tấn
Học viên : Nguyễn Thị Ngọc Liên
Mã học viên:
K27 0257


NỘI DUNG CHÍNH
A. Phương pháp khối phổ:
• I. Tổng quan về phương pháp khối phổ ?
• II. Ứng dụng

B. Phương pháp dấu phóng xạ:
• I. Tổng quan về phương pháp dấu phóng xạ?
• II. Ứng dụng


A. Phương pháp khối phổ:
I. Tổng quan về phương pháp khối phổ:
1. Khối phổ là gì?
2. Nguyên lý của phương pháp khối phổ
3. Sự hình thành khối phổ (sự ion hóa)
4. Máy khối phổ
II. ứng dụng:

1. Ứng dụng của máy khối phổ trong phân tích protein
2. Sự kết hợp các phương pháp sinh học phân tử khác_ ứng
dụng
2.1 Sắc kí khí kết hợp khối phổ
2.2 Sắc kí lỏng kết hợp khối phổ
2.3 Điện di kết hợp khối phổ


1. Khối phổ là gì?
• Khối phổ (mass spectrometry – MS): là một kỹ thuật
quang phổ do nhà vật lí học người Anh Joseph John
Thomson phát minh ra vào năm 1897.
• Chính nhờ kĩ thuật này đã giúp Thomson phát hiện ra các
đồng vị của nguyên tố và chứng minh sự tồn tại hai đồng
vị của khí Neon.
• Với phát minh này đã giúp Thomson giành được giải
thưởng Nobel năm 1906.


1. Khối phổ là gì?
•  Là một kỹ thuật phân tích hóa học giúp xác định hàm
lượng và loại chất hóa học có trong một mẫu bằng cách đo
tỷ lệ khối lượng trên điện tích và số lượng của các ion pha
khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu.
• Dùng thiết bị chuyên dụng là khối phổ kế.
• Kĩ thuật này có nhiều ứng dụng, thường được kết hợp với
một số sinh học phân tử khác như:
– Khối phổ kết hợp với sắc ký khí.
– Khối phổ kết hợp với sắc ký lỏng.
– Khối phổ kết hợp điện di

2. Nguyên lý của phương pháp khối phổ:
- Là kỹ thuật phân tích đo phổ về khối lượng của các phân tử tích
điện khi chúng di chuyển trong điện trường.
- Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách
riêng nhờ bộ phận phân tích khối phổ trước khi đến detector.
- Tất cả các quá trình này diễn ra trong hệ thiết bị chân không.
- Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch
(pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ
hoặc phổ khối.
- Dữ liệu phổ khối được tự động ghi lại và sử dụng để nhận dạng
mẫu bằng các công cụ tin sinh học. Đồng thời, có thể xác định cấu
trúc cũng như là định lượng các chất trong mẫu mà ta phân tích


2. Nguyên lý của phương pháp khối phổ:

/>

3. Sự hình thành khối phổ (sự ion hóa):
- Để có thể nghiên cứu các chất bằng pp khối phổ thì các phân
tử chất nghiên cứu ở dạng khí hoặc hơi phải được ion hóa
bằng phương pháp thích hợp.
* Phương pháp ion hoá bằng va chạm điện tử
(dùng phổ biến nhất)
• Trong buồng ion hoá, các điện tử phát ra từ cathode (làm
bằng vonfram hoặc reni) bay về anode với vận tốc lớn.
• Các phân tử chất nghiên cứu ở trạng thái hơi sẽ va chạm
với điện tử trong buồng ion hoá, có thể nhận năng lượng

điện tử và bị ion hoá.


3. Sự hình thành khối phổ (sự ion hóa):
•  


4. Máy khối phổ:
•là một thiết bị dùng cho phương
pháp khối phổ, cho ra phổ khối lượng
của một mẫu, để tìm ra thành phần
của nó.
•Có thể ion hóa mẫu và tách các ion
của nó với các khối lượng khác nhau
và lưu lại thông tin dựa vào việc đo
đạc cường độ dòng ion.
•Tùy theo loại điện tích của ion đem
nghiên cứu mà người ta phân biệt
máy khối phổ ion dương hoặc ion âm.

/>ew/phuong-phap-khoi-phoms.html


4. Máy khối phổ:

Một khối phổ kế thông thường gồm 3 phần:
• phần nguồn ion
• phần phân tích khối lượng
• phần đo đạc.

/>

3. Máy khối phổ:
Cấu tạo:
• Bất kỳ máy khối phổ nào cũng có bốn khối chức năng sau đây:
+ Hệ thống nạp mẫu: Đưa mẫu vào máy, nếu mẫu ở dạng lỏng hoặc rắn
cần phải chuyển sang dạng hơi bằng các biện pháp thích hợp.
+ Buồng ion hoá: Ion hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu ở trạng thái
khí hoặc hơi.
+ Bộ phân tích: Tách các ion theo tỉ số khối lượng và điện tích của ion
(m/z). Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng của từ trường ,
điện trường để đi đến detector.
+ Bộ ghi tín hiệu: chuyển các ion đã đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ
điện tử của máy khối phổ
- Tín hiệu điện từ detector được khuếch đại trước khi chuyển thành tín
hiệu số phục vụ xử lí dữ liệu theo những yêu cầu khác nhau: ghi phổ
khối, so sánh với dữ liệu phổ trong thư viện phổ hay định lượng mẫu.


3. Máy khối phổ:

21

/>
Hỏi: Theo bạn bộ phận nào là quan trọng nhất?


4. Máy khối phổ:
Nguyên lý hoạt động của máy khối phổ:
• Mẫu chất cần phân tích sẽ được chuyển thành trạng thái

hơi, sau đó mới bắt đầu quá trình đo khối phổ.
• Để đo được đặc tính của các phân tử cụ thể, máy khối phổ
sẽ chuyển chúng thành các ion, kiểm soát chuyển động của
chúng bởi các điện từ trường bên ngoài.
• quá trình được thực hiện trong môi trường chân không.


4. Máy khối phổ:
• Trong khi áp suất khí quyển vào khoảng 760 mmHg, áp
suất môi trường xử lý ion thường từ 10-5 đến 10-8 mmHg
(thấp hơn một phần tỉ của áp suất khí quyển).
• Ion sau khi được tạo thành sẽ được phân tách bằng cách gia
tốc và tập trung chúng thành một dòng tia mà sau đó sẽ bị
uốn cong bởi một từ trường ngoài.
• Các ion sau đó sẽ được thu nhận bằng đầu dò điện tử và
thông tin tạo ra sẽ được phân tích và lưu trữ trong một máy
vi tính.


4. Máy khối phổ:

/>

-Phương pháp khối phổ có thể dùng để nghiên cứu tất cả
các nguyên tố hay hợp chất có thể biến thành dạng khí hay
hơi.
+ Đối với hợp chất vô cơ: PPKP dùng để nghiên cứu thành
phần đồng vị hoặc để xác định vết các chất nghiên cứu.
+ Đối với hợp chất hữu cơ: PPKP thường dùng trong quá
trình đồng nhất chất hoặc phân tích cấu trúc.

-Xác định các loại vitamin, hoocmon kích thích sinh
trưởng.
-Phân tích dư lượng của các loại thuốc kháng sinh, thuốc
trừ sâu
-Xác định được các hợp chất chưa biết dựa vào khối lượng
và thành phần của các nguyên tố trong hợp chất đó.
-Xác định cấu trúc của các đồng vị trong hợp chất.


1. Ứng dụng của máy khối phổ trong phân tích protein:

• Protein được tinh chế rồi cắt bằng enzyme pepsin . Enzyme
pepsin cắt polypeptide tại những điểm nhất định trên chuỗi
=> Ta có thể dự đoán được các mảnh (fragments)
polypeptide sau khi bị cắt.
• Đưa mẫu đã xử lý pepsin vào đĩa và cho máy chạy. Laser
ion hoá các fragments làm cho chúng tích điện dương và
bật ra bay vào ống. Ống này có chiều dài nhất định, 4 phía
gắn 2 loại điện cực (+) và (-).


1. Ứng dụng của máy khối phổ trong phân tích protein:
• Có 2 loại hệ thống hay được sử dụng chính trong
proteomics là MALDI-TOF và ESI-MS/MS. Chúng bổ
sung cho nhau để nhận dạng protein.

/>

1. Ứng dụng của máy khối phổ trong phân tích protein:

/>

1. Ứng dụng của máy khối phổ trong phân tích protein:
• ống có thể xoay tròn, do đó các cực điện đổi chiều liên tục
làm cho các mảnh polypeptide không bám được vào thành
mà bay theo chiều xoắn ốc.
• Vận tốc bay của 1fragment phụ thuộc 2 yếu tố
• điện tích (z)
• khối lượng (m)
13
• Máy khối phổ đo được thời gian, biết trước quãng đường =>
tính được vận tốc => xác định được chỉ số m/z của
fragment.
• Các tín hiệu được phát hiện bởi detector và khuếch đại, cuối
cùng biểu diễn trên đồ thị ở dạng các đỉnh (peak). Mỗi đỉnh
tương ứng 1 fragment.


1. Ứng dụng của máy khối phổ trong phân tích protein:
• Với máy MS/MS (tandem MS) thì đây mới là lần MS thứ
nhất, cho phép hiển thị các fragment của một polypeptide bị
cắt bằng pepsin. Lần MS thứ 2 cho phép khẳng định chắc
chắn 1 fragment nhất định nhờ hệ thống lọc.

Figure : Schematic of a MALDI-TOF Mass Spectrometer


1. Ứng dụng của máy khối phổ trong phân tích protein:

Phân tích kết quả:
• Vì protein bao gồm 20 amino acid có khối lượng khác
nhau do đó khối lượng của một trình tự đủ nhỏ cũng nói
lên được trình tự của nó.
VD: Giả sử + Valin có khối lượng là 3.
+ Methionin có khối lượng là 5.
Hỏi: Một fragment có khối lượng là 8, theo bạn sẽ có trình
tự như thế nào?


2. Sự kết hợp các phương pháp sinh học phân tử khác_
ứng dụng
2.1 Khối phổ kết hợp với sắc kí khí(Gas Chromatography
Mass Spectometry)
• Phương pháp Sắc ký khí kết hợp với Khối phổ (viết tắt là
GC-MS hoặc GCMS) là một phương pháp mạnh mẽ với độ
nhạy cao được sử dụng trong các nghiên cứu về thành phần
các chất trong không khí.
• Bản chất GC-MS là sự kết hợp của Sắc ký khí (Gas
Chromatography) và Khối phổ (Mass Spectometry).
Ngưỡng phát hiện của phương pháp này là 1 picogram.