Nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính sinh học các dẫn xuất mới của alkaloid dừa cạn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

VÕ NGỌC BÌNH

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC
CÁC DẪN XUẤT MỚI CỦA ALKALOID DỪA CẠN

Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ
Mã số: 9 44 01 14

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. Ngô Quốc Anh
2. TS. Đoàn Duy Tiên

Hà Nội – 2018


Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và các cộng
sự. Các số liệu và kết quả nêu trong Luận án là trung thực và chưa được ai
công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu trước đây. Toàn bộ các thông tin
trích dẫn trong Luận án đã được chỉ rõ nguồn gốc xuất xứ.

Hà Nội, Ngày

tháng

Tác giả
Võ Ngọc Bình

I

năm 2018


Lời cảm ơn
Với lòng biết ơn sâu sắc, đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể thầy cô hướng
dẫn khoa học là PGS.TS. Ngô Quốc Anh và TS. Đoàn Duy Tiên - Viện Hóa học, Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giao đề tài và trực tiếp định hướng, chỉ bảo và
giúp đỡ tôi trong toàn bộ quá trình thực hiện Luận án.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy, các Cô, các cán bộ Viện Hóa học, Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giảng dạy, hướng dẫn tôi hoàn thành các
học phần và các chuyên đề trong Chương trình đào tạo.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS. Nguyên Lê Anh, ThS. Nguyễn Thị
Hằng, ThS. Trần Thị Yến, CN. Phạm Tùng Lâm và các cán bộ, nhân viên Trung tâm nghiên
cứu xuất sắc liên ngành về lĩnh vực các hợp chất thiên nhiên Việt Nam – Vương Quốc Anh,
Viện Hóa học đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện Luận án.
Cuối cùng, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động
viên, giúp đỡ tôi về mọi mặt trong suốt quá trình thực hiện Luận án.

Trân trọng cảm ơn !
Tác giả
Võ Ngọc Bình

II


“All sciences are vain and full of errors that are not born of
Experience, the mother of all Knowledge”

 Leonardo da Vinci

III


MỤC LỤC
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt ..............................................................................vii
Danh mục các bảng .............................................................................................................. x
Danh mục các hình vẽ, sơ đồ ...............................................................................................xi
MỞ ĐẦU.............................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .............................................................................................. 3
1.1. Microtubule - Một đích tác dụng quan trọng của các thuốc điều trị ung thư 3
1.1.1.

Định nghĩa ................................................................................................... 3

1.1.2.

Động học của microtubule ......................................................................... 4

1.1.3.

Các nhóm thuốc chống ung thư theo cơ chế tác dụng lên microtubule. 6

1.2. Vinca alkaloid ........................................................................................................ 9
1.2.1.

Giới thiệu về vinca alkaloid ....................................................................... 9

1.2.2.

Tổng hợp các vinca alkaloid .................................................................... 10

1.2.2.1. Bán tổng hợp .......................................................................................... 11
1.2.2.2. Tổng hợp toàn phần................................................................................ 16
1.2.2.3. Sinh tổng hợp và công nghệ sinh học .................................................... 18
1.2.3.

Mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính của vinca alkaloid ............................ 18

1.2.3.1. Những thay đổi trên phần khung vindoline ........................................... 19
1.2.3.2. Những thay đổi trên phần khung velbanamine ...................................... 21
1.2.4.

Ứng dụng lâm sàng của vinca alkaloid ................................................... 27

1.3. Định hướng và mục tiêu của luận án ................................................................ 27
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM ....................................................................................... 30
2.1. Hóa chất và thiết bị ............................................................................................. 30
2.1.1.

Hóa chất và dung môi ............................................................................... 30

2.1.2.

Thiết bị nghiên cứu ................................................................................... 30

2.1.2.1. Phổ hồng ngoại IR .................................................................................. 30
2.1.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR ........................................................ 30
2.1.2.3. Phổ khối lượng MS và HRMS ............................................................... 30
2.1.2.3. Năng suất quay cực riêng [α]D ............................................................... 31
IV


2.2. Các phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 31
2.2.1.

Các phương pháp tổng hợp hữu cơ......................................................... 31

2.2.2.

Phương pháp thử hoạt tính sinh học....................................................... 31

2.2.3.

Các phương pháp tinh chế và xác định cấu trúc ................................... 31

2.3. Tổng hợp một số dẫn xuất vinca alkaloid mới chứa mạch nhánh ketone α,βkhông no ........................................................................................................................ 32
2.3.1. Tổng hợp anhydrovinblastine 12 ................................................................ 32
2.3.2. Tổng hợp 18(S)-3’,5'-dimethoxyanilinecleavamine 77 .............................. 33
2.3.3. Tổng hợp một số dẫn xuất vinca alkaloid mới chứa mạch nhánh ketone
α,β-không no .............................................................................................................. 34
2.4. Tổng hợp một số dẫn xuất vinca alkaloid mới từ 3’-cyanoanhydrovinblastine

88……............................................................................................................................. 46
2.4.1.

Tổng hợp 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 .............................................. 46

2.4.2.
Tổng hợp các dẫn xuất alkaloid mới thông qua việc khử có chọn lọc
dẫn xuất 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 ............................................................... 48
2.4.2.2. Tổng hợp chất 3'R-cyano-(4’S,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 92a ..... 48
2.4.2.2. Tổng hợp chất 3'R-cyano-(4’R,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 92b .... 49
2.4.2.3. Tổng hợp chất (3'R-aminomethyl)-(4’S,5’-dihydro)-anhydrovinblastine
92c.......... ................................................................................................................ 51
2.4.2.4. Tổng hợp chất 3'S-cyano-4-deacetyl-anhydrovinblastine 92d và 3'Scyano-4-deacetyl-3-hydroxymethyl-anhydrovinblastine 92e................................ 52
2.4.3.
Tổng hợp một số dẫn xuất alkaloid mới thông qua việc khử alkyl hóa
của aminomethyl 92c ................................................................................................ 54
2.5. Thử nghiệm hoạt tính sinh học của các chất nghiên cứu ................................ 61
2.5.1.

Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro......................................... 61

2.5.1.2. Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên dòng tế bào ung thư
biểu mô KB và ung thư gan HepG2 ...................................................................... 61
2.5.1.2. Thử nghiệm hoạt tính sinh học trên dòng tế bào ung thư bạch huyết cấp
tính ở người HL-60 ................................................................................................ 62
2.5.2. Phương pháp mô hình mô phỏng Docking phân tử .................................. 65
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................... 68
3.1. Tổng hợp dẫn xuất vinca alkaloid mới chứa mạch nhánh ketone α,β-không no... 68
V

3.2. Tổng hợp các dẫn xuất vinca alkaloid mới từ 3’-cyanoanhydrovinblastine
88….. .............................................................................................................................. 84
3.2.1.
Tổng hợp các dẫn xuất vinca alkaloid mới thông qua việc khử chọn lọc
3’-cyanoanhydrovinblastine 88 ............................................................................... 84
3.2.2.
Tổng hợp các dẫn xuất vinca alkaloid mới thông qua việc khử alkyl
hóa aminomethyl 92c ................................................................................................ 99
3.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của các chất nghiên cứu.................................... 102
3.3.1.

Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro ............................................ 102

3.3.1.1. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB và ung thư gan
HepG2… .............................................................................................................. 102
3.3.1.2. Đánh giá hoạt tính sinh học trên dòng tế bào ung thư bạch huyết cấp
tính ở người HL-60 .............................................................................................. 106
3.3.2.

Kết quả Docking...................................................................................... 115

3.3.2.1. Kết quả docking phân tử sử dụng phần mềm Autodock 4.0 ................ 116
3.3.2.2. Kết quả docking phân tử sử dụng phần mềm Patchdock ..................... 117
KẾT LUẬN ..................................................................................................................... 120
NHỮNG ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN ......................................................................... 121
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ............................................................. 122
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................. 123
PHỤ LỤC ........................................................................................................................ 139

VI


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A
ADME

Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion

AVLB

Anhydrovinblastine

AZT

Azidothymidine

C
4CBL

4-chlorochablastine

4CCR

4-Chlorochacristine

CC

Column Chromatography

COSY

Correlation Spectroscopy

CBPI

Cytochalasin B proliferation index

m-CPBA

meta-Chloroperoxybenzoic acid

13

Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy

C-NMR

D
DCM

Dichloromethane

DEPT

Distortioless Enhancement by Polarisation Tranfer

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DABCO

1,4-Diazabicyclo(2.2.2)octane

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DDQ

2,3-Dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone

DMA

3,5-dimethoxyaniline

DPAS

Dihydroprecondylocarpine synthase

E
ESI-MS

Electrospray Ionization Mass Spectroscopy

EI-MS

Electron Ionization Mass Spectroscopy

EtOAc

Ethyl acetate

EtOH

Ethanol

VII


F
FDA

Fluorescein diacetate

H
HRMS

Hight resolution Mass Spectroscopy

1

Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Correlation

HMBC

Heteronuclear Multiple bond Correlation

H-NMR

s: singlet

d: double

t: triplet

m: multiplet dd: double doublet
Hep-G2

Human Heptocellular carcinoma

HL-60

Human leukemia 60

h

Hour

q: quartet
br: broad

I
IR

Infrared Spectroscopy

IC50

Inhibitory concentration of 50% of cell proliferation

K
KB

Human epidemoid carcinoma

M
MeOH

Methanol

N
NMR

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

NOESY

Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy

NIS

N-Iodosuccinimide

P
PAS

Precondylocarpine acetate synthase

PDB

Protein data bank

PBS

Phosphate buffered saline

R
RT

Room temperature
VIII

qui: quintet


T
TMS

Tetramethyl silan

THF

Tetrahydrofuran

TFA

Trifluoroacetic acid

TLC

Thin Layer Chromatography

V
VBL

Vinblastine

VCR

Vincristine

VFL

Vinflunine

VRB

Vinorelbine

IX


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Một số thuốc ức chế phân bào theo vị trí liên kết trên microtubule và ứng dụng
trong trị liệu .......................................................................................................................... 8
Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR trên phần vindoline của hợp chất 81b và anhydrovinblastine
12 trong CDCl3 ................................................................................................................... 74
Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR trên phần velbanamine của hợp chất 81b và
anhydrovinblastine 12 trong CDCl3 ................................................................................... 76
Bảng 3.3. So sánh phổ 1H NMR (CDCl3) của hợp chất 82b và 18(S)-3’,5'dimethoxyanilinecleavamine 77 ......................................................................................... 83
Bảng 3.4. Phản ứng khử 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 .................................................. 89
Bảng 3.5. Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất vinca alkaloid mới chứa mạch nhánh
ketone α,β-không no ......................................................................................................... 103
Bảng 3.6. Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất 3’-cyanoanhydrovinblastine ........ 105
Bảng 3.7. Khả năng sống của tế bào sau khi xử lý với vinca alkaloid (A) và vinca alkaloid
mới (B) với nồng độ khác nhau (chứng 0,1% DMSO, 1, 10, 100, 1000 nM) trong 24 giờ.
.......................................................................................................................................... 107
Bảng 3.8. Các thành phần năng lượng (kcal/mol) tương tác giữa các phân tử trong dãy
đầu tiên với tubulin ........................................................................................................... 116
Bảng 3.9. Các thành phần năng lượng (kcal/mol) tương tác giữa các phân tử trong dãy thứ
2 với tubulin...................................................................................................................... 116
Bảng 3.10. Hằng số ức chế (Ki, nM) và độ lệch chuẩn trung bình (RMSD, Å) dung sai
tương tác giữa các phân tử trong dãy đầu tiên với tubulin ............................................... 117
Bảng 3.11. Hằng số ức chế (Ki, nM) và độ lệch chuẩn trung bình (RMSD, Å) dung sai
tương tác giữa các phân tử trong dãy đầu thứ 2 với tubulin. ............................................ 117
Bảng 3.12. Kết quả docking của các phối tử dãy đầu tiên với tubulin tại vùng vinca bằng
cách sử dụng phần mềm Patchdock.................................................................................. 118
Bảng 3.13. Kết quả docking của các phối tử dãy thứ 2 với tubulin tại vùng vinca bằng
cách sử dụng phần mềm Patchdock.................................................................................. 119

X

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ
Hình 1.1. Cấu trúc và các quá trình polymer hóa, khử polimer hóa microtubule ............... 3
Hình 1.2. Microtubule trong hai tế bào xương osteosarcoma trong kỳ trung gian của chu
kỳ tế bào. Microtubule có màu đỏ, chromatin có màu xanh lam và các centromeres có
màu xanh lá cây .................................................................................................................... 4
Hình 1.3. Động học của microtubule ................................................................................... 6
Hình 1.4. Các nhóm thuốc chống ung thư theo cơ chế tác dụng lên microtubule và vị trí
liên kết của chúng trên microtubule ..................................................................................... 7
Hình 1.5. Vị trí gắn kết của vinblastine (màu xanh) và colchicine (màu vàng) trên tubulin ......... 7
Hình 1.6. Cây dừa cạn Catharanthus roseus ........................................................................ 9
Hình 1.7. Một số alkaloid dừa cạn được sử dụng trong lâm sàng ..................................... 10
Hình 1.8. Sự oxi hóa vinblastine 1 thành vincristine 2 ...................................................... 11
Hình 1.9. Tổng hợp vindesine 3......................................................................................... 11
Hình 1.10. Sinh tổng hợp vinblastine 1 từ Catharanthine 6 và vindoline 7....................... 12
Hình 1.11. Tổng hợp anhydrovinblastine theo Potier và các cộng sự ............................... 12
Hình 1.12. Tổng hợp anhydrovinblastine theo Vukovic ................................................... 13
Hình 1.13. Tổng hợp vinblastine từ anhydrovinblastine theo Potier ................................. 13
Hình 1.14. Tổng hợp vinblastine theo Kutney................................................................... 14
Hình 1.15. Tổng hợp in situ vinblastine từ catharanthine và vindoline theo Dale Boger .... 14
Hình 1.16. Sự chuyển hóa chloroindolenine 21 thành vinblastine 1 ................................. 15
Hình 1.17. Sự chuyển hóa amin bậc 3 24 thành vinblastine 1........................................... 15
Hình 1.18. Chuyển hóa của anhydrovinblastine N-oxide 26 hoặc chloro-indolenine 30
thành vinorelbine 4 ............................................................................................................. 16
Hình 1.19. Tổng hợp vinflunine 5 ..................................................................................... 16
Hình 1.20. Sự chuyển hóa của chloroindolenine 31 và 34 thành vinblastine 1................. 17
Hình 1.21. Tổng hợp toàn phần vinblastine theo Boger và các cộng sự, 2009 ................. 18
Hình 1.22. Các dẫn xuất được biến đổi trên phần vindoline: vinglycinate 42, vinzolidine
43, vintriptol 44, vinepidine 45, vinfosiltine 46 và 47 ....................................................... 21
Hình 1.23. Sự thay đổi cấu trúc vinblastine tại vị trí 12’................................................... 22
XI

Hình 1.24. Các dẫn xuất thế của vinblastine ở trị trí C-14’ ............................................... 22
Hình 1.25. Sự thay đổi trên phần velbanamine.................................................................. 23
Hình 1.26. Sự thay đổi cấu trúc vòng C’ trên phần khung velbanamine........................... 23
Hình 1.27. Các dẫn xuất 7’(8’)-homo-anhydrovinblastine mới từ vinorelbine ................ 24
Hình 1.28. Các dẫn xuất muối ammoni bậc IV của anhydrovinblastine và vinorelbine ... 24
Hình 1.29. Sự thay đổi cấu trúc trên vòng D’ .................................................................... 25
Hình 1.30. Các dẫn xuất 4’-ureavinblastine ...................................................................... 26
Hình 1.31. Tổng hợp dẫn xuất kiểu vinblastine 66 theo Boger, 2016 ............................... 26
Hình 1.32. Cấu trúc tia X của phức vinblastine kết hợp tubulin ....................................... 28
Hình 3.1. Tổng hợp các hợp chất lai anhydrovinblastine và vinorelbine – phomopsin A ... 68
Hình 3.2. Một số hợp chất ketone α,β-không no trong tự nhiên........................................ 69
Hình 3.3. Hợp chất lai giữa ketone α,β-không no và vinca alkaloid ................................. 70
Hình 3.5. Cấu trúc và đánh số theo IUPAC trên phần vindoline ...................................... 74
Hình 3.6. Cấu trúc và đánh số theo IUPAC trên phần velbanamine ................................. 76
Hình 3.7. Một phần phổ COSY (CDCl3) của hợp chất 81b .............................................. 78
Hình 3.8. Phổ 1H NMR (CDCl3) của hợp chất 81b ........................................................... 79
Hình 3.9. Phổ khối phân giải cao HR-EI-MS của hợp chất 81b ....................................... 80
Hình 3.10. Cấu trúc hợp chất 82b và cách đánh số theo IUPAC ...................................... 81
Hình 3.11. Phổ khối phân giải cao HR-EI-MS của hợp chất 82b ..................................... 81
Hình 3.13. Phổ DEPT (CDCl3) của hợp chất 82b ............................................................. 83
Hình 3.14. Hợp chất 85, 86 và 87 ...................................................................................... 84
Hình 3.15. Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất 88 ..................................... 86
Hình 3.16. Phổ IR của hợp chất 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 ...................................... 86
Hình 3.18. Phổ NOESY (CDCl3) của 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 ............................. 88
Hình 3.19. Sự khử hợp chất 88 sử dụng xúc tác hydrogenation Pd/C............................... 90
Hình 3.20. Phổ IR của hợp chất 3'R-cyano-(4’S,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 92a ..... 91
Hình 3.21. So sánh tương quan phổ 1H NMR của 92a và 88 ............................................ 92
Hình 3.22. Phổ NOESY của 3'R-cyano-(4’S,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 92a........... 92

Hình 3.23. Sự khử hợp chất 88 sử dụng LiAlH4................................................................ 93
Hình 3.24. So sánh một phần phổ 1H NMR (CDCl3) của hợp chất 88, 92d và 92e .......... 93
XII


Hình 3.25. Sự khử hợp chất 88 bằng NaBH3CN với xúc tác Ni2B ................................... 94
Hình 3.26. Phổ IR của 3'R-cyano-(4’R,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 92b. ................... 94
Hình 3.27. So sánh tương quan phổ 1H NMR (CDCl3) của 3'R-cyano-(4’R,5’-dihydro)anhydrovinblastine 92b và 88 ............................................................................................ 95
Hình 3.28. Phổ NOESY của 3'R-cyano-(4’R,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 92b ........... 95
Hình 3.29. Sự khử hợp chất 88 sử dụng NaBH4, xúc tác CoCl2 ....................................... 96
Hình 3.30. Phổ IR của hợp chất 92c .................................................................................. 96
Hình 3.31. Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất 92c.................................... 97
Hình 3.32. So sánh một phần phổ 1H NMR của hợp chất (3'S-aminomethyl)-(4’S,5’dihydro)-anhydrovinblastine 92c và 88 .............................................................................. 97
Hình 3.33. Cấu trúc và đánh số theo IUPAC của các hợp chất 93a-f ............................. 100
Hình 3.34. Phổ 1H NMR của hợp chất 93a...................................................................... 101
Hình 3.35. Phổ khối phân giải cao của hợp chất 93a ...................................................... 101
Hình 3.37. Sự tăng sinh sau khi xử lý với vinca alkaloid (A) và vinca alkaloid mới (B)
với nồng độ khác nhau (NC = 0,1% DMSO, 1, 10, 100, 1000 nM) trong 24 giờ. ........... 108
Hình 3.38. Tế bào apoptosis sau khi xử lý với vinca alkaloid (A) và alkaloids mới (B) với
nồng độ khác nhau (NC = 0,1% DMSO, 1, 10, 100, 1000 nM) trong 24 giờ .................. 110
Hình 3.39. Sự chết tế bào sớm sau khi xử lý với vinca alkaloid (A) và alkaloid mới (B)
với nồng độ khác nhau (NC = 0,1% DMSO, 1, 10, 100, 1000 nM) trong 24 giờ. ........... 111
Hình 3.40. Kiểm soát chu kỳ tế bào sau khi xử lý với vinca alkaloid được tạo thành (A)
và alkaloid mới (B) với nồng độ khác nhau (NC = 0,1% DMSO, 1, 10, 100, 1000 nM)
trong 24 giờ....................................................................................................................... 113
Hình 3.41. Tubulin – 83a ................................................................................................. 118
Hình 3.42. Tubulin-92b ................................................................................................... 119
Sơ đồ 3.1. Quy trình chung tổng hợp các hợp chất 76a-c. ................................................. 71
Sơ đồ 3.2. Tổng hợp các vinca alkaloid chìa khóa 12 và 77.............................................. 71
Sơ đồ 3.3. Cơ chế của phản ứng Vukovic .......................................................................... 72

Sơ đồ 3.4. Tổng hợp các vinca alkaloid mới chứa mạch nhánh ketone α,β-không no ...... 73
Sơ đồ 3.5. Tổng hợp 3’-cyanoanhydrovinblastine 88. ....................................................... 85
Sơ đồ 3.7. Một con đường thử nghiệm tổng hợp 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 ............ 89
XIII


Sơ đồ 3.10. Cơ chế phản ứng khử nitril thành amin 92c ................................................... 98
Sơ đồ 3.11. Cơ chế phản ứng khử liên kết đôi tại C4’-C5’................................................ 98
Sơ đồ 3.12. Tổng hợp các dẫn xuất vinca alkaloid mới thông qua việc khử alkyl hóa
aminomethyl 92c ................................................................................................................ 99
Sơ đồ 3.13. Cơ chế của phản ứng alkyl hóa aminomethyl 92c .......................................... 99

XIV


MỞ ĐẦU
Ung thư là một nhóm các bệnh được đặc trưng bởi sự phát triển không kiểm soát và
sự lan truyền của các tế bào bất thường. Tỷ lệ ung thư trên toàn thế giới ước tính khoảng 14
triệu trường hợp mới mỗi năm [1]. Trong năm 2017, khoảng 600.920 người Mỹ chết vì ung
thư, gần 1.650 người chết mỗi ngày. Ung thư là nguyên nhân phổ biến thứ hai gây tử vong ở
Mỹ chỉ sau bệnh tim, chiếm gần 1/4 số ca tử vong [2]. Tại Việt Nam, số trường hợp mắc mới
ung thư tăng nhanh từ 68.000 ca năm 2000 lên 126.000 năm 2010 và dự kiến sẽ vượt qua
190.000 ca vào 2020. Mỗi năm có khoảng 115.000 người chết vì ung thư, tương ứng 315
người/ngày. Các nguồn lực to lớn đang được đầu tư trên khắp thế giới để phát triển các
chiến lược phòng ngừa, chẩn đoán và điều trị ung thư [3]. Các công ty dược phẩm và
các tổ chức chính phủ, phi chính phủ đều tham gia tích cực vào việc phát hiện và phát
triển các chất chống ung thư [4].
Trong số các phương pháp điều trị hiện nay, hóa trị liệu là một phương pháp điều
trị ung thư sử dụng một hoặc nhiều thuốc kháng ung thư - gây độc tế bào. Một trong các
loại thuốc chống ung thư, được sử dụng ngày nay trong hóa trị liệu, tác động đến chu kỳ

tế bào để ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và sau đó gây ra sự chết tế bào theo
chương trình (apoptosis). Do đó, hai cách tiếp cận thường được sử dụng: nhắm mục tiêu
DNA (ngăn ngừa sự tổng hợp hoặc làm hỏng DNA) hoặc hạn chế các chức năng của
thoi phân bào [5]. Trong đó, thuốc tác dụng lên microtubule là một trong những loại
thuốc trị liệu được sử dụng rộng rãi nhất trong điều trị ung thư. Hiệu quả của chúng đã
được chứng minh để điều trị nhiều loại ung thư ở người, bao gồm ung thư vú, phổi,
buồng trứng và tuyến tiền liệt, cũng như các khối u ác tính về huyết học và ung thư ở trẻ
em [6-7].
Phần lớn các thuốc ức chế phân bào là các hợp chất tự nhiên ngăn chặn sự phân
bào bằng cách tương tác với microtubule, một protein thiết yếu của tế bào. Trong những
năm 1950, sự phát hiện ra vinblastine (Velban®) và vincristine (Oncovin®), hai alkaloid
tự nhiên từ cây dừa cạn Madagascar (Catharanthus roseus) là một trong những ví dụ
nổi bật nhất của loại hợp chất này, các vinca alkaloid gây chết tế bào bởi apoptosis bằng
cách ức chế động học của microtubule. Kể từ đó, những nỗ lực để thay đổi cấu trúc ban
đầu của các phân tử này đã dẫn tới sự phát triển và sau đó là sử dụng lâm sàng của ba
1


vinca alkaloid tổng hợp vindesine (Eldesine®), vinorelbine (Navelbin®) và vinflunine
(Javlor®).
Xuất phát từ cơ sở các kết quả nghiên cứu và tính cấp thiết trong thực tiễn, chúng
tôi đã thực hiện luận án: “Nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính sinh học các dẫn xuất
mới của alkaloid dừa cạn” với mục tiêu tổng hợp được các dẫn xuất mới của alkaloid
dừa cạn và đánh giá hoạt tính kháng ung thư của chúng.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1.

Microtubule - Một đích tác dụng quan trọng của các thuốc điều trị ung thư
Microtubule một thành phần của bộ khung tế bào bao gồm các tiểu đơn vị α và

β-tubulin. Heterodimer này liên quan đến nhiều quá trình sinh học tế bào như tín hiệu tế
bào, vận chuyển nội bào, duy trì hình dạng tế bào và sự phân cực tế bào [8]. Do vai trò
của chúng trong sự phân bào, chúng trở thành một mục tiêu quan trọng để phát triển
thuốc chống ung thư. Trong mục này, chúng tôi giới thiệu ngắn gọn về hệ tubulinmicrotubule, động học của microtubule và sơ lược về các nhóm thuốc chống ung thư
theo cơ chế tác dụng lên microtubule.
1.1.1. Định nghĩa
Microtubule – là thành phần chính của bộ khung tế bào - là polymer protein hình
ống dài, dạng sợi, được tìm thấy trong tất cả các tế bào nhân chuẩn. Chúng có vai trò rất
quan trọng trong việc phát triển và duy trì hình dạng tế bào, trong tín hiệu tế bào, vận
chuyển các túi, ty thể và các thành phần khác trong tế bào, sự di động của tế bào, trong
sự phân chia tế bào, sự nguyên phân và sự phân cực của tế bào.

Hình 1.1. Cấu trúc và các quá trình polymer hóa, khử polimer hóa microtubule [9]
3


Hình 1.2. Microtubule trong hai tế bào xương osteosarcoma trong kỳ trung gian của
chu kỳ tế bào. Microtubule có màu đỏ, chromatin có màu xanh lam và các centromeres
có màu xanh lá cây [10]
Có thể xem microtubule là các cấu trúc phân cực bao gồm các tiểu đơn vị dị dimer
(heterodimer) α-tubulin và β-tubulin được sắp xếp lại với nhau thành các chuỗi tiền tơ
(protofilament). Một microtubule đơn bao gồm 10-15 protofilament (thường là 13 trong
tế bào động vật có vú) liên kết với nhau để hình thành một ống xoắn rỗng rộng 24 nm
(kích thước 4 nm × 5 nm × 8 nm và khối lượng 100.000 daltton) với hai đầu kí hiệu là (+)
và (-) [10-14].

1.1.2. Động học của microtubule
Một điều quan trọng trong tính chất của các đại phân tử này là đặc tính động
học của nó. Có thể tạm hiểu là sự thay đổi cấu trúc theo thời gian. Có 2 kiểu động học
trong cấu trúc là: (a) “dynamic instability” cấu trúc của microtubule có thể dài ngắn tuỳ
theo chu kỳ; (b) “treadmilling” đầu (+) dài ra, sau đó đầu (-) ngắn lại, nhưng chiều dài
tổng thể không đổi. Đáng chú ý là các microtubule cấu tạo nên các sợi siêu vi, nơi bám
4


của các chromosome trong quá trình phân bào. Các sợi siêu vi microtubule này có tính
động học rất lớn, 4-100 lần so với sự thay đổi cấu trúc của các microtubule thông thường.
Các chức năng sinh học của các microtubule trong tất cả các tế bào được xác định
và được điều chỉnh phần lớn bởi các động học polimer hóa của chúng [15-18].
Microtubule cho thấy hai loại động học không cân bằng, cả với các hệ thống microtubule
tinh khiết trong in vitro và trong các tế bào (Hình 1.3). Một loại tính chất động học rất
nổi bật trong tế bào được gọi là "dynamic instability", là một quá trình trong đó các đầu
microtubule riêng lẻ chuyển đổi giữa các giai đoạn tăng trưởng và rút ngắn [19]. Hai
đầu của một mictubule không tương đương, một đầu được gọi là đầu dương tăng trưởng
và rút ngắn nhanh hơn và rộng hơn đầu kia (đầu âm). Sự thay đổi độ dài theo thời gian
ở các đầu của một nhóm các microtubule do quá trình “dynamic instability” được minh
họa trong hình 1.3a, 1.3b. Các microtubule trải qua thời gian tương đối dài của sự kéo
dài, thời gian ngắn của sự rút ngắn nhanh và thời kỳ các động học suy giảm hoặc tạm
dừng, khi các microtubule không phát triển cũng không thể rút ngắn được.
Kiểu động học thứ nhất, “Dynamic instability” được đặc trưng bởi bốn yếu tố
chính: tốc độ tăng trưởng microtubule, tốc độ rút ngắn, tần suất chuyển đổi từ trạng thái
tăng trưởng hoặc tạm dừng sang rút ngắn (quá trình chuyển đổi này được gọi là
“catastrophe”) và tần suất chuyển đổi từ rút ngắn sang tăng trưởng hoặc tạm dừng (gọi
là “rescue”). Các khoảng thời gian tạm dừng được xác định hoạt động khi bất kỳ sự thay
đổi độ dài microtubule nào có thể xảy ra thấp hơn độ phân giải của kính hiển vi quang
học. Yếu tố được gọi là “dynamicity” rất hữu ích để mô tả tổng thể nhìn thấy bằng mắt

thường tốc độ trao đổi của các tubulin dimer với các đầu microtubule.
Kiểu động học thứ hai, được gọi là “treadmilling” (Hình 1.3c), là sự tăng trưởng
ở đầu của một đầu microtubule và sự rút ngắn ở đầu đối diện [20-24]. Nó liên quan đến
dòng nội tại của các tiểu đơn vị tubulin từ đầu dương của microtubule đến đầu âm và
được tạo ra bởi sự khác biệt trong các nồng độ tiểu đơn vị quan trọng ở các đầu
microtubule đối diện. (Nồng độ tiểu đơn vị tới hạn là nồng độ các tiểu đơn vị tubulin tự
do trong trạng thái cân bằng với đầu của microtubule). Tính chất này xảy ra trong các tế
bào cũng như trong in vitro và có thể đặc biệt quan trọng trong sự phân bào.
“Treadmilling” và “dynamic instability” là những tính chất tương thích và một tập hợp
microtubule đặc trưng có thể thấy chủ yếu là tính chất “treadmilling”, tính “dynamic
instability” hoặc hỗn hợp cả hai. Các cơ chế kiểm soát mức độ mà một tập hợp
5


microtubule biểu hiện một hoặc một tính chất khác được hiểu một cách không rõ ràng
nhưng có thể liên quan đến thành phần tubulin của quần thể vi thể, mức độ biến đổi sau
dịch mã của tubulin và đặc biệt, các hoạt động của các protein điều hòa.
Đầu (+)

Đầu (-)

Chiều dài (mm)

Chiều dài (mm)

Thời gian (s)

Nhân Microtubule

Thời gian (s)

Thời gian (s)
Đầu (-)

Thời gian
(đơn vị bất kỳ)

Đầu (+)

Hình 1.3. Động học của microtubule [10]
1.1.3. Các nhóm thuốc chống ung thư theo cơ chế tác dụng lên microtubule
Các loại thuốc ức chế phân bào tác dụng lên microtubule thường được phân thành
hai nhóm chính. Một nhóm được biết đến như là các chất làm bất ổn định microtubule
(microtubule-destabilizing), ức chế quá trình polimer hóa microtubule ở nồng độ cao và
hầu hết các chất này liên kết với một trong hai vùng microtubule hoặc vùng vinca hoặc
vùng colchicine. Các chất liên kết trên vùng vinca bao gồm các vinca alkaloid
(vinblastine, vincristine, vinorelbine, vindesine và vinflunine), cryptophycin và
dolastatin (eribulin, spongistatin, rhizoxin, maytansinoid và tasidotin). Chất liên kết trên
vùng colchicine bao gồm colchicine và các chất tương tự, podophyllotoxin,
6


combretastatin,

CI-980,

2-methoxyoestradiol,

phenylahistin

(diketopiperazine),

steganacin và curacin [25-26]. Một số tác nhân làm mất ổn định microtubule bao gồm
hemiasterlin, estramustine, noscapine, thuốc diệt cỏ như carbendazim, các thuốc thần
kinh như phenytoin và các thành phần thực phẩm như sulphoraphane được tìm thấy
trong rau cải [27-28], liên kết với các vị trí mới trên tubulin.

ỔN ĐỊNH MICROTUBULE

BẤT ỔN ĐỊNH MICROTUBULE

Hình 1.4. Các nhóm thuốc chống ung thư theo cơ chế tác dụng lên microtubule và vị
trí liên kết của chúng trên microtubule [29]

Hình 1.5. Vị trí gắn kết của vinblastine (màu xanh) và colchicine (màu vàng) trên tubulin [30]
Nhóm thứ hai là các chất làm ổn định microtubule (microtubule-stabilizing), tăng
cường polimer hóa ở nồng độ cao bao gồm taxane, paclitaxel và docetaxel (Taxotere®),
epothilone, ixabepilone (Ixempra®) và patupilone, disodermolit, eleutherobin,
7


sarcodictyin, cyclostreptin, dictyostatin, laulimalide, rhazinilam, peloruside A, một số
steroid và polyisoprenyl benzophenone. Hầu hết các chất ổn định microtubule liên kết
với cùng một vị trí liên kết taxoid trên β-tubulin, nằm trên bề mặt bên trong của
microtubule [31]. Tuy nhiên, hai trong số các tác nhân, laulimalide và peloruside A,
không bị thay thế bởi paclitaxel và vì lý do này được cho là liên kết với một vị trí mới
trên microtubule [32-33]. Có tổng số hàng trăm hợp chất đã được báo cáo kìm hãm sự
phân bào bởi tác động của chúng đối với các microtubule. Trong tất cả các trường hợp
đã được nghiên cứu, cơ chế phổ biến nhất là ức chế động học microtubule [34-35].
Bảng 1.1. Một số thuốc ức chế phân bào theo vị trí liên kết trên microtubule và ứng

dụng trong trị liệu
Vùng liên kết

Tên biệt dược

Ứng dụng trị liệu

Tài liệu tham
khảo

Vùng Vinca

Vinblastine (Velban)

Bệnh Hodgkin, ung thư tế bào

[36-39]

mầm tinh hoàn
Vincristine (Oncovin)

Ung thư bạch cầu, ung thư bạch

[40-42]

huyết
Vinorelbine (Navelbine)

Các khối u rắn, ung thư bạch

[43-45]

huyết, ung thư phổi
Vinflunine

Ung thư bàng quang, ung thư phổi

[39, 46]

tế bào không nhỏ, ung thư vú
Vùng Colchicine

Colchicine

Các bệnh không gây ung thư

[47-48]

(gout, sốt Địa trung hải gia đình)
Combretastatin (AVE8062A,

Tác nhân nhắm mạch máu khối u

[49-50]

2-methoxyestradiol

-

[51-52]

Methoxybenzene-

Các khối u rắn

CA-1-P, CA-4-P, Nacetylcolchicinol-O-phosphate,
ZD6126)

[53]

sulphonamide
(như ABT-751,
E7010)
Vị trí Taxane

Paclitaxel (Taxol),

Ung thư buồng trứng, vú và phổi,

TL00139 và các chất

ung thư Kaposi

[54-57]

tương tự paclitaxel
Docetaxel (Taxotere)

Các u tuyến tiền liệt, não và u

[58-59]

phổi
Epothilone (như

Các khối u kháng Paclitaxel

8

[60-63]


BMS- 247550,
epothilone B và D)
Discodermolide

-

[64-68]

Vị trí liên kết

Estramustine

Tuyến tiền liệt

[69-73]

khác trên

……………

microtubule

1.2.

Vinca alkaloid
Vinca alkaloid là một trong những lớp chất chống ung thư quan trọng và lâu đời

nhất và là tác nhân tác dụng lên microtubule. Phần này chứa một số thông tin quan trọng
về vinca alkaloid, tổng hợp vinca alkaloid, mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính cho đến sự
phát triển lâm sàng.
1.2.1. Giới thiệu về vinca alkaloid
Cây dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G. DON (Vinca rosea L.) là loài cây có
nguồn gốc từ Madagasca thuộc họ Apocynaceae được trồng chủ yếu ở các nước có khí
hậu ấm, ban đầu được trồng làm cây cảnh vì nó có hoa màu hồng hoặc màu trắng rất
đẹp, hơn nữa nó cũng đã trở thành chè thuốc và dược liệu chữa trị nhiều loại bệnh. Từ
lâu, cây dừa cạn là vị thuốc dân gian được người dân các nước châu Phi và châu Á dùng
để chữa trị nhiều loại bệnh như tiểu đường, cao huyết áp, làm thuốc giảm đau, chữa bệnh
thiếu vitamin C,… [74-75].

Hình 1.6. Cây dừa cạn Catharanthus roseus
9


Hình 1.7. Một số alkaloid dừa cạn được sử dụng trong lâm sàng
Alkaloid dừa cạn (Vinca alkaloid) là một họ các hợp chất indole dạng dimer được
chiết xuất hoặc bán tổng hợp từ cây dừa cạn Catharanthus roseus, đại diện cho một
trong những lớp chất chống ung thư quan trọng nhất. Hoạt tính chống ung thư của
alkaloid dừa cạn được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ 20. Hơn 40 năm sau đó,

hai loại thuốc vinblastine 1 và vincristine 2 vẫn được sử dụng rộng rãi trong điều trị ung
thư và các dẫn chất bán tổng hợp, chẳng hạn như vindesine (Eldesine®) 3, vinorelbine
(Navelbine®) 4 và gần đây hơn là một dẫn xuất chứa flo, vinflunine (Javlor®) 5 (Hình
1.7) đã lần lượt được nghiên cứu và đưa vào sử dụng trong lâm sàng.
1.2.2. Tổng hợp các vinca alkaloid
Một vấn đề lớn đối với việc đưa vào sản xuất thương mại các sản phẩm thiên
nhiên làm thuốc là tính sẵn có của nó. Vinblastine 1 và vincristine 2 được phân lập với
hiệu suất rất thấp từ lá C. roseus. Phần lớn các thuốc đưa vào điều trị được sản xuất
bằng phương pháp bán tổng hợp, phương pháp tổng hợp toàn phần cũng đã được các
nhà khoa học chú ý mặc dù gặp phải những thách thức về sự phức tạp cấu trúc. Sự phát
triển các vinca alkaloid bằng công nghệ sinh học cũng đang được nghiên cứu.
10