Nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính sinh học các dẫn xuất mới của alkaloid dừa cạn (Luận án tiến sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

VÕ NGỌC BÌNH

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC
CÁC DẪN XUẤT MỚI CỦA ALKALOID DỪA CẠN

Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ
Mã số: 9 44 01 14

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. Ngô Quốc Anh
2. TS. Đoàn Duy Tiên

Hà Nội – 2018


Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và các cộng
sự. Các số liệu và kết quả nêu trong Luận án là trung thực và chưa được ai
công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu trước đây. Toàn bộ các thông tin
trích dẫn trong Luận án đã được chỉ rõ nguồn gốc xuất xứ.

Hà Nội, Ngày

tháng

Tác giả
Võ Ngọc Bình

I

năm 2018


Lời cảm ơn
Với lòng biết ơn sâu sắc, đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể thầy cô hướng
dẫn khoa học là PGS.TS. Ngô Quốc Anh và TS. Đoàn Duy Tiên - Viện Hóa học, Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giao đề tài và trực tiếp định hướng, chỉ bảo và
giúp đỡ tôi trong toàn bộ quá trình thực hiện Luận án.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy, các Cô, các cán bộ Viện Hóa học, Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giảng dạy, hướng dẫn tôi hoàn thành các
học phần và các chuyên đề trong Chương trình đào tạo.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS. Nguyên Lê Anh, ThS. Nguyễn Thị
Hằng, ThS. Trần Thị Yến, CN. Phạm Tùng Lâm và các cán bộ, nhân viên Trung tâm nghiên
cứu xuất sắc liên ngành về lĩnh vực các hợp chất thiên nhiên Việt Nam – Vương Quốc Anh,
Viện Hóa học đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện Luận án.
Cuối cùng, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động
viên, giúp đỡ tôi về mọi mặt trong suốt quá trình thực hiện Luận án.

Trân trọng cảm ơn !
Tác giả
Võ Ngọc Bình

II


“All sciences are vain and full of errors that are not born of
Experience, the mother of all Knowledge”

 Leonardo da Vinci

III


MỤC LỤC
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt ..............................................................................vii
Danh mục các bảng .............................................................................................................. x
Danh mục các hình vẽ, sơ đồ ...............................................................................................xi
MỞ ĐẦU.............................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .............................................................................................. 3
1.1. Microtubule - Một đích tác dụng quan trọng của các thuốc điều trị ung thư 3
1.1.1.

Định nghĩa ................................................................................................... 3

1.1.2.

Động học của microtubule ......................................................................... 4

1.1.3.

Các nhóm thuốc chống ung thư theo cơ chế tác dụng lên microtubule. 6

1.2. Vinca alkaloid ........................................................................................................ 9
1.2.1.

Giới thiệu về vinca alkaloid ....................................................................... 9

1.2.2.

Tổng hợp các vinca alkaloid .................................................................... 10

1.2.2.1. Bán tổng hợp .......................................................................................... 11
1.2.2.2. Tổng hợp toàn phần................................................................................ 16
1.2.2.3. Sinh tổng hợp và công nghệ sinh học .................................................... 18
1.2.3.

Mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính của vinca alkaloid ............................ 18

1.2.3.1. Những thay đổi trên phần khung vindoline ........................................... 19
1.2.3.2. Những thay đổi trên phần khung velbanamine ...................................... 21
1.2.4.

Ứng dụng lâm sàng của vinca alkaloid ................................................... 27

1.3. Định hướng và mục tiêu của luận án ................................................................ 27
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM ....................................................................................... 30
2.1. Hóa chất và thiết bị ............................................................................................. 30
2.1.1.

Hóa chất và dung môi ............................................................................... 30

2.1.2.

Thiết bị nghiên cứu ................................................................................... 30

2.1.2.1. Phổ hồng ngoại IR .................................................................................. 30
2.1.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR ........................................................ 30
2.1.2.3. Phổ khối lượng MS và HRMS ............................................................... 30
2.1.2.3. Năng suất quay cực riêng [α]D ............................................................... 31
IV


2.2. Các phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 31
2.2.1.

Các phương pháp tổng hợp hữu cơ......................................................... 31

2.2.2.

Phương pháp thử hoạt tính sinh học....................................................... 31

2.2.3.

Các phương pháp tinh chế và xác định cấu trúc ................................... 31

2.3. Tổng hợp một số dẫn xuất vinca alkaloid mới chứa mạch nhánh ketone α,βkhông no ........................................................................................................................ 32
2.3.1. Tổng hợp anhydrovinblastine 12 ................................................................ 32
2.3.2. Tổng hợp 18(S)-3’,5'-dimethoxyanilinecleavamine 77 .............................. 33
2.3.3. Tổng hợp một số dẫn xuất vinca alkaloid mới chứa mạch nhánh ketone
α,β-không no .............................................................................................................. 34
2.4. Tổng hợp một số dẫn xuất vinca alkaloid mới từ 3’-cyanoanhydrovinblastine

88……............................................................................................................................. 46
2.4.1.

Tổng hợp 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 .............................................. 46

2.4.2.
Tổng hợp các dẫn xuất alkaloid mới thông qua việc khử có chọn lọc
dẫn xuất 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 ............................................................... 48
2.4.2.2. Tổng hợp chất 3'R-cyano-(4’S,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 92a ..... 48
2.4.2.2. Tổng hợp chất 3'R-cyano-(4’R,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 92b .... 49
2.4.2.3. Tổng hợp chất (3'R-aminomethyl)-(4’S,5’-dihydro)-anhydrovinblastine
92c.......... ................................................................................................................ 51
2.4.2.4. Tổng hợp chất 3'S-cyano-4-deacetyl-anhydrovinblastine 92d và 3'Scyano-4-deacetyl-3-hydroxymethyl-anhydrovinblastine 92e................................ 52
2.4.3.
Tổng hợp một số dẫn xuất alkaloid mới thông qua việc khử alkyl hóa
của aminomethyl 92c ................................................................................................ 54
2.5. Thử nghiệm hoạt tính sinh học của các chất nghiên cứu ................................ 61
2.5.1.

Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro......................................... 61

2.5.1.2. Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên dòng tế bào ung thư
biểu mô KB và ung thư gan HepG2 ...................................................................... 61
2.5.1.2. Thử nghiệm hoạt tính sinh học trên dòng tế bào ung thư bạch huyết cấp
tính ở người HL-60 ................................................................................................ 62
2.5.2. Phương pháp mô hình mô phỏng Docking phân tử .................................. 65
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................... 68
3.1. Tổng hợp dẫn xuất vinca alkaloid mới chứa mạch nhánh ketone α,β-không no... 68
V

3.2. Tổng hợp các dẫn xuất vinca alkaloid mới từ 3’-cyanoanhydrovinblastine
88….. .............................................................................................................................. 84
3.2.1.
Tổng hợp các dẫn xuất vinca alkaloid mới thông qua việc khử chọn lọc
3’-cyanoanhydrovinblastine 88 ............................................................................... 84
3.2.2.
Tổng hợp các dẫn xuất vinca alkaloid mới thông qua việc khử alkyl
hóa aminomethyl 92c ................................................................................................ 99
3.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của các chất nghiên cứu.................................... 102
3.3.1.

Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro ............................................ 102

3.3.1.1. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB và ung thư gan
HepG2… .............................................................................................................. 102
3.3.1.2. Đánh giá hoạt tính sinh học trên dòng tế bào ung thư bạch huyết cấp
tính ở người HL-60 .............................................................................................. 106
3.3.2.

Kết quả Docking...................................................................................... 115

3.3.2.1. Kết quả docking phân tử sử dụng phần mềm Autodock 4.0 ................ 116
3.3.2.2. Kết quả docking phân tử sử dụng phần mềm Patchdock ..................... 117
KẾT LUẬN ..................................................................................................................... 120
NHỮNG ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN ......................................................................... 121
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ............................................................. 122
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................. 123
PHỤ LỤC ........................................................................................................................ 139

VI


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A
ADME

Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion

AVLB

Anhydrovinblastine

AZT

Azidothymidine

C
4CBL

4-chlorochablastine

4CCR

4-Chlorochacristine

CC

Column Chromatography

COSY

Correlation Spectroscopy

CBPI

Cytochalasin B proliferation index

m-CPBA

meta-Chloroperoxybenzoic acid

13

Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy

C-NMR

D
DCM

Dichloromethane

DEPT

Distortioless Enhancement by Polarisation Tranfer

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DABCO

1,4-Diazabicyclo(2.2.2)octane

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DDQ

2,3-Dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone

DMA

3,5-dimethoxyaniline

DPAS

Dihydroprecondylocarpine synthase

E
ESI-MS

Electrospray Ionization Mass Spectroscopy

EI-MS

Electron Ionization Mass Spectroscopy

EtOAc

Ethyl acetate

EtOH

Ethanol

VII


F
FDA

Fluorescein diacetate

H
HRMS

Hight resolution Mass Spectroscopy

1

Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Correlation

HMBC

Heteronuclear Multiple bond Correlation

H-NMR

s: singlet

d: double

t: triplet

m: multiplet dd: double doublet
Hep-G2

Human Heptocellular carcinoma

HL-60

Human leukemia 60

h

Hour

q: quartet
br: broad

I
IR

Infrared Spectroscopy

IC50

Inhibitory concentration of 50% of cell proliferation

K
KB

Human epidemoid carcinoma

M
MeOH

Methanol

N
NMR

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

NOESY

Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy

NIS

N-Iodosuccinimide

P
PAS

Precondylocarpine acetate synthase

PDB

Protein data bank

PBS

Phosphate buffered saline

R
RT

Room temperature
VIII

qui: quintet


T
TMS

Tetramethyl silan

THF

Tetrahydrofuran

TFA

Trifluoroacetic acid

TLC

Thin Layer Chromatography

V
VBL

Vinblastine

VCR

Vincristine

VFL

Vinflunine

VRB

Vinorelbine

IX


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Một số thuốc ức chế phân bào theo vị trí liên kết trên microtubule và ứng dụng
trong trị liệu .......................................................................................................................... 8
Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR trên phần vindoline của hợp chất 81b và anhydrovinblastine
12 trong CDCl3 ................................................................................................................... 74
Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR trên phần velbanamine của hợp chất 81b và
anhydrovinblastine 12 trong CDCl3 ................................................................................... 76
Bảng 3.3. So sánh phổ 1H NMR (CDCl3) của hợp chất 82b và 18(S)-3’,5'dimethoxyanilinecleavamine 77 ......................................................................................... 83
Bảng 3.4. Phản ứng khử 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 .................................................. 89
Bảng 3.5. Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất vinca alkaloid mới chứa mạch nhánh
ketone α,β-không no ......................................................................................................... 103
Bảng 3.6. Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất 3’-cyanoanhydrovinblastine ........ 105
Bảng 3.7. Khả năng sống của tế bào sau khi xử lý với vinca alkaloid (A) và vinca alkaloid
mới (B) với nồng độ khác nhau (chứng 0,1% DMSO, 1, 10, 100, 1000 nM) trong 24 giờ.
.......................................................................................................................................... 107
Bảng 3.8. Các thành phần năng lượng (kcal/mol) tương tác giữa các phân tử trong dãy
đầu tiên với tubulin ........................................................................................................... 116
Bảng 3.9. Các thành phần năng lượng (kcal/mol) tương tác giữa các phân tử trong dãy thứ
2 với tubulin...................................................................................................................... 116
Bảng 3.10. Hằng số ức chế (Ki, nM) và độ lệch chuẩn trung bình (RMSD, Å) dung sai
tương tác giữa các phân tử trong dãy đầu tiên với tubulin ............................................... 117
Bảng 3.11. Hằng số ức chế (Ki, nM) và độ lệch chuẩn trung bình (RMSD, Å) dung sai
tương tác giữa các phân tử trong dãy đầu thứ 2 với tubulin. ............................................ 117
Bảng 3.12. Kết quả docking của các phối tử dãy đầu tiên với tubulin tại vùng vinca bằng
cách sử dụng phần mềm Patchdock.................................................................................. 118
Bảng 3.13. Kết quả docking của các phối tử dãy thứ 2 với tubulin tại vùng vinca bằng
cách sử dụng phần mềm Patchdock.................................................................................. 119

X

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ
Hình 1.1. Cấu trúc và các quá trình polymer hóa, khử polimer hóa microtubule ............... 3
Hình 1.2. Microtubule trong hai tế bào xương osteosarcoma trong kỳ trung gian của chu
kỳ tế bào. Microtubule có màu đỏ, chromatin có màu xanh lam và các centromeres có
màu xanh lá cây .................................................................................................................... 4
Hình 1.3. Động học của microtubule ................................................................................... 6
Hình 1.4. Các nhóm thuốc chống ung thư theo cơ chế tác dụng lên microtubule và vị trí
liên kết của chúng trên microtubule ..................................................................................... 7
Hình 1.5. Vị trí gắn kết của vinblastine (màu xanh) và colchicine (màu vàng) trên tubulin ......... 7
Hình 1.6. Cây dừa cạn Catharanthus roseus ........................................................................ 9
Hình 1.7. Một số alkaloid dừa cạn được sử dụng trong lâm sàng ..................................... 10
Hình 1.8. Sự oxi hóa vinblastine 1 thành vincristine 2 ...................................................... 11
Hình 1.9. Tổng hợp vindesine 3......................................................................................... 11
Hình 1.10. Sinh tổng hợp vinblastine 1 từ Catharanthine 6 và vindoline 7....................... 12
Hình 1.11. Tổng hợp anhydrovinblastine theo Potier và các cộng sự ............................... 12
Hình 1.12. Tổng hợp anhydrovinblastine theo Vukovic ................................................... 13
Hình 1.13. Tổng hợp vinblastine từ anhydrovinblastine theo Potier ................................. 13
Hình 1.14. Tổng hợp vinblastine theo Kutney................................................................... 14
Hình 1.15. Tổng hợp in situ vinblastine từ catharanthine và vindoline theo Dale Boger .... 14
Hình 1.16. Sự chuyển hóa chloroindolenine 21 thành vinblastine 1 ................................. 15
Hình 1.17. Sự chuyển hóa amin bậc 3 24 thành vinblastine 1........................................... 15
Hình 1.18. Chuyển hóa của anhydrovinblastine N-oxide 26 hoặc chloro-indolenine 30
thành vinorelbine 4 ............................................................................................................. 16
Hình 1.19. Tổng hợp vinflunine 5 ..................................................................................... 16
Hình 1.20. Sự chuyển hóa của chloroindolenine 31 và 34 thành vinblastine 1................. 17
Hình 1.21. Tổng hợp toàn phần vinblastine theo Boger và các cộng sự, 2009 ................. 18
Hình 1.22. Các dẫn xuất được biến đổi trên phần vindoline: vinglycinate 42, vinzolidine
43, vintriptol 44, vinepidine 45, vinfosiltine 46 và 47 ....................................................... 21
Hình 1.23. Sự thay đổi cấu trúc vinblastine tại vị trí 12’................................................... 22
XI

Hình 1.24. Các dẫn xuất thế của vinblastine ở trị trí C-14’ ............................................... 22
Hình 1.25. Sự thay đổi trên phần velbanamine.................................................................. 23
Hình 1.26. Sự thay đổi cấu trúc vòng C’ trên phần khung velbanamine........................... 23
Hình 1.27. Các dẫn xuất 7’(8’)-homo-anhydrovinblastine mới từ vinorelbine ................ 24
Hình 1.28. Các dẫn xuất muối ammoni bậc IV của anhydrovinblastine và vinorelbine ... 24
Hình 1.29. Sự thay đổi cấu trúc trên vòng D’ .................................................................... 25
Hình 1.30. Các dẫn xuất 4’-ureavinblastine ...................................................................... 26
Hình 1.31. Tổng hợp dẫn xuất kiểu vinblastine 66 theo Boger, 2016 ............................... 26
Hình 1.32. Cấu trúc tia X của phức vinblastine kết hợp tubulin ....................................... 28
Hình 3.1. Tổng hợp các hợp chất lai anhydrovinblastine và vinorelbine – phomopsin A ... 68
Hình 3.2. Một số hợp chất ketone α,β-không no trong tự nhiên........................................ 69
Hình 3.3. Hợp chất lai giữa ketone α,β-không no và vinca alkaloid ................................. 70
Hình 3.5. Cấu trúc và đánh số theo IUPAC trên phần vindoline ...................................... 74
Hình 3.6. Cấu trúc và đánh số theo IUPAC trên phần velbanamine ................................. 76
Hình 3.7. Một phần phổ COSY (CDCl3) của hợp chất 81b .............................................. 78
Hình 3.8. Phổ 1H NMR (CDCl3) của hợp chất 81b ........................................................... 79
Hình 3.9. Phổ khối phân giải cao HR-EI-MS của hợp chất 81b ....................................... 80
Hình 3.10. Cấu trúc hợp chất 82b và cách đánh số theo IUPAC ...................................... 81
Hình 3.11. Phổ khối phân giải cao HR-EI-MS của hợp chất 82b ..................................... 81
Hình 3.13. Phổ DEPT (CDCl3) của hợp chất 82b ............................................................. 83
Hình 3.14. Hợp chất 85, 86 và 87 ...................................................................................... 84
Hình 3.15. Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất 88 ..................................... 86
Hình 3.16. Phổ IR của hợp chất 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 ...................................... 86
Hình 3.18. Phổ NOESY (CDCl3) của 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 ............................. 88
Hình 3.19. Sự khử hợp chất 88 sử dụng xúc tác hydrogenation Pd/C............................... 90
Hình 3.20. Phổ IR của hợp chất 3'R-cyano-(4’S,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 92a ..... 91
Hình 3.21. So sánh tương quan phổ 1H NMR của 92a và 88 ............................................ 92
Hình 3.22. Phổ NOESY của 3'R-cyano-(4’S,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 92a........... 92

Hình 3.23. Sự khử hợp chất 88 sử dụng LiAlH4................................................................ 93
Hình 3.24. So sánh một phần phổ 1H NMR (CDCl3) của hợp chất 88, 92d và 92e .......... 93
XII


Hình 3.25. Sự khử hợp chất 88 bằng NaBH3CN với xúc tác Ni2B ................................... 94
Hình 3.26. Phổ IR của 3'R-cyano-(4’R,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 92b. ................... 94
Hình 3.27. So sánh tương quan phổ 1H NMR (CDCl3) của 3'R-cyano-(4’R,5’-dihydro)anhydrovinblastine 92b và 88 ............................................................................................ 95
Hình 3.28. Phổ NOESY của 3'R-cyano-(4’R,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 92b ........... 95
Hình 3.29. Sự khử hợp chất 88 sử dụng NaBH4, xúc tác CoCl2 ....................................... 96
Hình 3.30. Phổ IR của hợp chất 92c .................................................................................. 96
Hình 3.31. Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất 92c.................................... 97
Hình 3.32. So sánh một phần phổ 1H NMR của hợp chất (3'S-aminomethyl)-(4’S,5’dihydro)-anhydrovinblastine 92c và 88 .............................................................................. 97
Hình 3.33. Cấu trúc và đánh số theo IUPAC của các hợp chất 93a-f ............................. 100
Hình 3.34. Phổ 1H NMR của hợp chất 93a...................................................................... 101
Hình 3.35. Phổ khối phân giải cao của hợp chất 93a ...................................................... 101
Hình 3.37. Sự tăng sinh sau khi xử lý với vinca alkaloid (A) và vinca alkaloid mới (B)
với nồng độ khác nhau (NC = 0,1% DMSO, 1, 10, 100, 1000 nM) trong 24 giờ. ........... 108
Hình 3.38. Tế bào apoptosis sau khi xử lý với vinca alkaloid (A) và alkaloids mới (B) với
nồng độ khác nhau (NC = 0,1% DMSO, 1, 10, 100, 1000 nM) trong 24 giờ .................. 110
Hình 3.39. Sự chết tế bào sớm sau khi xử lý với vinca alkaloid (A) và alkaloid mới (B)
với nồng độ khác nhau (NC = 0,1% DMSO, 1, 10, 100, 1000 nM) trong 24 giờ. ........... 111
Hình 3.40. Kiểm soát chu kỳ tế bào sau khi xử lý với vinca alkaloid được tạo thành (A)
và alkaloid mới (B) với nồng độ khác nhau (NC = 0,1% DMSO, 1, 10, 100, 1000 nM)
trong 24 giờ....................................................................................................................... 113
Hình 3.41. Tubulin – 83a ................................................................................................. 118
Hình 3.42. Tubulin-92b ................................................................................................... 119
Sơ đồ 3.1. Quy trình chung tổng hợp các hợp chất 76a-c. ................................................. 71
Sơ đồ 3.2. Tổng hợp các vinca alkaloid chìa khóa 12 và 77.............................................. 71
Sơ đồ 3.3. Cơ chế của phản ứng Vukovic .......................................................................... 72

Sơ đồ 3.4. Tổng hợp các vinca alkaloid mới chứa mạch nhánh ketone α,β-không no ...... 73
Sơ đồ 3.5. Tổng hợp 3’-cyanoanhydrovinblastine 88. ....................................................... 85
Sơ đồ 3.7. Một con đường thử nghiệm tổng hợp 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 ............ 89
XIII


Luận án đầy đủ ở file: Luận án full