TẬN DỤNG PHỤ PHẨM TRONG CHẾ BIẾN MỰC BẰNG CHẾ PHẨM ENZYME PROTEASE TỪ NẤM MỐC Aspergillus oryzae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA THỦY SẢN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TẬN DỤNG PHỤ PHẨM TRONG CHẾ BIẾN MỰC
BẰNG CHẾ PHẨM ENZYME PROTEASE
TỪ NẤM MỐC Aspergillus oryzae

Họ và tên sinh viên: VŨ HOÀNG HỘI
Ngành: CHẾ BIẾN THỦY SẢN
Niên khóa: 2005 – 2009

Tháng 9/2009


TẬN DỤNG PHỤ PHẨM TRONG CHẾ BIẾN THỦY
SẢN BẰNG CHẾ PHẨM ENZYME PROTEASE
TỪ NẤM MỐC Aspergillus oryzae

Tác giả

VŨ HOÀNG HỘI

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu
cấp bằng kỹ sư ngành Chế Biến Thủy Sản

Giáo viên hướng dẫn:
PGS.TS. LÊ THANH HÙNG
ThS. TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG

Tháng 9/2009
-i-


LỜI CẢM TẠ

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
Ban chủ nhiệm khoa cùng tất cả quý thầy cô trong Khoa Thủy Sản – Trường
Đại Học Nông Lâm TPHCM đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian tôi
học tập tại trường.
PGS.TS Thầy Lê Thanh Hùng – Trưởng Khoa Thủy Sản đã luôn có sự hỗ trợ
kịp thời để tôi hoàn thành tốt khóa luận này.
ThS Trương Quang Bình – Giảng viên Khoa Thủy Sản đã luôn tận tình hướng
dẫn, hỏi han động viên và giúp đỡ trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài.
Các thầy cô và các anh chị làm việc tại Viện nghiên cứu công nghệ sinh học và
môi trường – Trường Đại Học Nông Lâm TPHCM, đặc biệt là ThS Trương Phước
Thiên Hoàng đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất
để tôi hoàn thành khóa luận này.
Do còn hạn chế về kiến thức và thời gian nghiên cứu nên khó tránh khỏi thiếu
sót. Rất mong nhận được ý kiến đóng góp của quý thầy cô cùng các bạn.
Sinh viên thực hiện
VŨ HOÀNG HỘI

-ii-


TÓM TẮT
Đề tài nghiên cứu: “Tận dụng phụ phẩm trong chế biến mực bằng chế phẩm
enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae” được thực hiện tại phòng thí nghiệm

Khoa Thủy Sản và phòng thí nghiệm Viện nghiên cứu công nghệ sinh học và môi
trường – Trường Đại học Nông Lâm TPHCM từ 4/2009 đến 8/2009.
Chúng tôi đã sử dụng chế phẩm enzyme protease thu nhận từ nấm mốc
Aspergillus oryzae để thủy phân phụ phẩm thải ra từ quá trình chế biến mực. Sau khi
xác định được các yếu tố tối ưu cho quá trình thủy phân, chúng tôi lấy dịch thủy phân
bổ sung thêm bã đậu nành rồi đem sấy để thu sản phẩm bột. Ngoài ra, chúng tôi cũng
nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bã đậu nành bổ sung đến chất lượng của sản
phẩm thu được.
Kết quả nghiên cứu thu được:
1. Khi bổ sung 3% muối (NaCl), 40ml nước, pH tự nhiên của phế phẩm
mực, nồng độ enzyme là 3,57% sử dụng cho 100g phụ phẩm với thời
gian thủy phân là 20 giờ thì sẽ thu được dịch thủy phân có hiệu suất thu
nhận đạm hòa tan đạt 45% và hiệu suất thủy phân lên đến 82,83%.
2. Khi bổ sung thêm 50% bột bã đậu nành và đem sấy thì thu được sản
phẩm có hàm lượng đạm tổng số là 7,65 (g/100g NL) và hàm lượng ẩm
là 6,05%.

-iii-


MỤC LỤC
TRANG
TRANG TỰA

i

CẢM TẠ

ii

TÓM TẮT

iii

MỤC LỤC

iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG

viii

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

ix

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1

1.1 Đặt vấn đề

1

1.2 Mục đích của đề tài

2

1.3 Yêu cầu

3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4

2.1 Tổng quan về enzyme

4

2.1.1 Khái niệm enzyme

4

2.1.2 Sơ lược lịch sử nghiên cứu enzyme

5

2.1.3 Danh pháp – cấu tạo – phân loại

7

2.1.4 Tính chất lý hóa của enzyme

8

2.1.5 Tính đặc hiệu của enzyme

9

2.1.6 Cơ chế xúc tác của enzyme

11

2.1.7 Các yếu tố ảnh hưởng tới tốc độ phản ứng của enzyme

12

2.2 Tổng quát về protease

14

2.2.1 Khái niệm protease

14

2.2.2 Nguồn nguyên liệu thu nhận protease

15

2.2.3 Phân loại protease

19

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của protease

21

2.3 Ứng dụng của protease

23
-iv-


2.3.1 Trong thực phẩm

23

2.3.2 Trong y dược

23

2.3.3 Trong công nghiệp sản xuất nước giải khát

24

2.3.4 Trong nông nghiệp

24

2.3.5 Trong xử lý rác

24

2.4 Tổng quan về quá trình sấy

25

2.4.1 Bản chất quá trình sấy

25

2.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ sấy

26

2.5 Giới thiệu về mực ống và phụ phẩm từ mực ống

26

2.5.1 Giới thiệu chung

26

2.5.2 Vùng phân bố

27

2.5.3 Sản lượng khai thác

27

2.5.4 Xuất khẩu

27

2.5.5 Một số loài mực ống thường gặp ở biển Việt Nam

28

2.5.6 Phụ phẩm từ chế biến mực

30

2.6 Sơ lược về các phương pháp thủy phân

31

2.6.1 Thủy phân bằng acid

31

2.6.2 Thủy phân bằng kiềm

31

2.6.3 Thủy phân bằng enzyme

32

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

33

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

33

3.2 Vật liệu nghiên cứu

33

3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm

33

3.3.1 Khảo sát thành phần nguyên liệu dùng để thủy phân

33

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung vào quá trình thủy phân

33

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối bổ sung vào quá trình thủy phân

34

3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzym lên quá trình thủy phân

34

3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên quá trình thủy phân

35

3.3.6 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bã đậu nành bổ sung vào sản phẩm

35

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN

36

4.1 Kết quả khảo sát thành phần nguyên liệu dùng để thủy phân
-v-

36


4.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thể tích nước tới quá trình thủy phân

37

4.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối tới quá trình thủy phân

38

4.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới quá trình thủy phân

39

4.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian tới quá trình thủy phân

40

4.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bã đậu nành bổ sung vào sản phẩm

41

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

43

5.1 Kết luận

43

5.2 Đề nghị

43

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

-vi-


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
HSHC

Hệ số hiệu chỉnh

HSTP

Hiệu suất thủy phân

HSTNĐHT

Hiệu suất thu nhận đạm hòa tan

NF

Nitrogen formol

NTS

Nitrogen tổng số

NL

Nguyên liệu

-vii-


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng

Trang

Bảng 2.1 Bảng phân loại enzyme

8

Bảng 3.1 Bố trí các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bã đậu nành bổ sung 35
Bảng 4.1 Thành phần nguyên liệu phụ phẩm mực dùng để thủy phân

36

Bảng 4.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thể tích nước tới quá trình thủy phân

37

Bảng 4.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối tới quá trình thủy phân

38

Bảng 4.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng enzyme tới quá trình thủy phân

39

Bảng 4.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân

40

Bảng 4.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bã đậu nành bổ sung vào sản phẩm 41
Bảng 4.7 Các chỉ tiêu của sản phẩm bột đạm

- viii

42

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình

Trang

Hình 2.1 Các bậc cấu trúc của enzyme

7

Hình 2.2 Trùn quế

15

Hình 2.3 Tụy tạng

15

Hình 2.4 Nguồn thu protease từ thực vật

16

Hình 2.5 Bacillus subtilis

17

Hình 2.6 Nấm mốc

17

Hình 2.7 Xạ khuẩn

18

Hình 2.8 Mực ống Trung Hoa

28

Hình 2.9 Mực ống Nhật Bản

28

Hình 2.10 Mực Lá

29

Hình 2.11 Mực ống Thái Bình Dương

30

Hình 4.1 Phụ phẩm mực xay nhỏ

36

Hình 4.2 Dịch thủy phân phụ phẩm mực

41

Hình 4.3 Sản phẩm bột sau khi sấy và xay nhỏ

42

-ix-


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Với bờ biển dài trên 3260 km, hệ thống sông hồ dày đặc, cùng với khí hậu
thuận lợi đã tạo điều kiện cho ngành thủy sản của Việt Nam phát triển một cách mạnh
mẽ trong những năm qua. Việt Nam hiện đã đứng trong danh sách 10 nước xuất khẩu
thủy sản lớn nhất thế giới. Diện tích nuôi trồng ngày càng được mở rộng, kỹ thuật nuôi
ngày càng được cải tiến làm cho sản lượng thủy sản tăng liên tục trong những năm
qua. Sự phát triển mạnh mẽ không ngừng của ngành nuôi trồng thủy sản đã kéo theo
sự phát triển lớn mạnh của ngành chế biến và xuất khẩu thủy sản. Các nhà máy chế
biến thủy sản không ngừng được mở rộng quy mô sản xuất, kỹ thuật ngày càng được
nâng cao.
Kim ngạch xuất khẩu thủy sản của nước ta đã tăng một cách mạnh mẽ trong
những năm qua. Kim ngạch xuất khẩu thủy sản năm 1980 chỉ đạt khoảng 11 triệu
USD. Sau đó, hàng năm kim ngạch xuất khẩu thủy sản tăng đều, đến năm 1999 cũng
chỉ mới đạt khoảng 971 triệu USD. Năm 2003 kim ngạch này đã tăng lên 2,24 tỷ USD,
năm 2005 là 2,65 tỷ USD. Đến năm 2007 là 3,75 tỷ USD, tăng 12% so với năm 2006.
Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản (Vasep): năm 2008 xuất khẩu thủy sản
của cả nước đạt trên 1,2 triệu tấn, trị giá trên 4,5 tỷ USD, tăng 33,7% về khối lượng và
19,8% về giá trị so với năm 2007. Năm 2009, do ảnh hưởng của suy thoái kinh tế toàn
cầu nên đã tác động mạnh mẽ đến tình hình xuất khẩu của ngành thủy sản Việt Nam.
Tuy vậy, kế hoạch dự kiến vẫn là khoảng 3,5 – 4 tỷ USD trong năm 2009. Và phấn
đấu đến năm 2020 sẽ đạt khoảng 7 tỷ USD về kim ngạch xuất khẩu thủy sản.
Đi cùng với sự phát triển mạnh mẽ như vậy, ngành thủy sản cũng đang là

nguyên nhân gây ra những vấn đề hết sức đáng lo ngại. Đó chính là vấn đề ô nhiễm
môi trường do nước thải và các phụ phẩm của các nhà máy chế biến thủy sản gây ra.
Lượng phụ phẩm này một phần được sử dụng để sản xuất thức ăn cho gia súc
-1-


và thủy sản hoặc sản xuất phân bón, phần còn lại hoặc được xử lý trước khi thải ra môi
trường hoặc được thải trực tiếp ra môi trường mà không qua xử lý cùng với nước thải.
Hiện nay đa số các nhà máy chế biến thủy sản đều thải trực tiếp ra môi trường vì để xử
lý lượng phụ phẩm và nước thải này thì sẽ tốn một khoản tiền không nhỏ. Việc làm
này đã và đang làm cho môi trường sống của con người bị ô nhiễm nặng. Đứng trước
thách thức trên, đòi hỏi các nhà quản lý phải có những biện pháp xử lý và các công ty
phải có giải pháp để khắc phục.
Protease là một trong những enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng và được sử
dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau như: nông nghiệp, công nghiệp, y
học, thuộc da, mỹ phẩm, thực phẩm và xử lý rác thải. So với phương pháp thủy phân
bằng acid thì phương pháp sử dụng protease có nhiều ưu điểm hơn hẳn như: không
độc hại, đảm bảo giá trị dinh dưỡng của sản phẩm sau thủy phân. Chính vì vậy, trong
công nghiệp, protease có thể được bổ sung trực tiếp vào thức ăn nhằm tăng khả năng
hấp thu chất dinh dưỡng của vật nuôi hoặc được sử dụng để thủy phân các loại protein
khác nhau tạo sản phẩm chứa hàm lượng amino acid cao để bổ sung vào khẩu phần
dinh dưỡng cho người hoặc cho gia súc.
Được sự chấp thuận của Khoa Thủy Sản, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Tận
Dụng Phụ Phẩm Trong Chế Biến Mực Bằng Chế Phẩm Enzyme Protease Từ Nấm
Mốc Aspergillus oryzae”.
1.2 Mục đích của đề tài
Đề tài: “Tận Dụng Phụ Phẩm Trong Chế Biến Mực Bằng Chế Phẩm Enzyme
Protease Từ Nấm Mốc Aspergillus oryzae” được thực hiện với các mục đích như sau:
- Tận dụng nguồn phế thải dồi dào từ quá trình chế biến mực của các nhà máy
chế biến thủy sản nhằm giải quyết một phần vấn đề ô nhiễm môi trường hiện nay.

- Tạo ra sản phẩm có hàm lượng amino acid cao để bổ sung vào khẩu phần dinh
dưỡng của gia súc và thủy sản.

-2-


1.3 Yêu cầu
- Xác định các yếu tố (nồng độ muối, tỷ lệ nước, nồng độ enzyme bổ sung) tối
ưu cho quá trình thủy phân protein mực.
- Xác định thời gian tối ưu nhất cho quá trình thủy phân để có hiệu suất thủy
phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan cao nhất.
- Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bã đậu nành bổ sung để thu được sản phẩm bột
có hàm lượng đạm tốt nhất.

-3-


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về enzyme
2.1.1 Khái niệm enzyme
Trong cơ thể sống luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất. Một khi sự trao đổi
chất ngừng hoàn toàn thì sự sống không còn tồn tại. Quá trình trao đổi của một chất là
tập hợp của rất nhiều các phản ứng sinh hóa khác nhau. Các phản ứng phức tạp này có
liên quan chặt chẽ với nhau và điều chỉnh lẫn nhau. Enzyme là các hợp chất protein
xúc tác cho các phản ứng sinh hóa đó. Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản
ứng nhất định và đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định
với tốc độ nhịp nhàng trong cơ thể sống.
Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống. Và là những tác nhân
xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi là các chất xúc tác sinh học

nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học.
Ngoài những tính chất của một chất xúc tác, enzyme còn có những tính chất ưu
việt hơn so với các chất xúc tác khác như: hiệu suất cao trong điều kiện nhiệt độ và áp
suất bình thường, có tính đặc hiệu cao. Các tính chất này vẫn được giữ nguyên khi tách
enzyme ra khỏi hệ thống sống và hoạt động trong điều kiện In vitro (trong ống
nghiệm). Vì vậy enzyme được sử dụng rộng rãi trong thực tế sản xuất, trong công
nghiệp. Nhiều ngành liên quan đến enzyme đã được hình thành như công nghệ sản
xuất enzyme, công nghệ sản xuất các thiết bị có phần tử enzyme như biosensor (thiết
bị cảm biến sinh học).
Enzyme học là ngành khoa học nghiên cứu những chất xúc tác sinh học có bản
chất protein. Hay nói cách khác, enzyme học là ngành khoa học nghiên cứu những tính
chất chung, điều kiện, cơ chế tác dụng và tính đặc hiệu của các enzyme (Đỗ Quý Hai
và ctv, 2009).
-4-


2.1.2 Sơ lược lịch sử nghiên cứu enzyme
Do enzyme học được coi như cột sống của sinh hóa học cho nên phần lớn các
nghiên cứu sinh hóa từ trước tới nay đều có liên quan nhiều đến enzyme.
Trải qua quá trình phát triển lâu dài của học thuyết enzyme, có thể chia thành 4
giai đoạn như sau:
+ Giai đoạn 1
Trong giai đoạn trước thế kỷ XVII con người đã biết sử dụng các quá trình
enzyme trong đời sống. Song, chưa ai hiểu được đó là bản chất của quá trình hoạt động
của enzyme, mà chỉ biết làm qua kinh nghiệm thực tế và thông qua hoạt động của vi
sinh vật. Đó là các quá trình như lên men rượu, muối dưa, làm nước tương và nước
chấm.
+ Giai đoạn 2
Ở giai đoạn này, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu tìm hiểu bản chất
của các quá trình lên men. Các nghiên cứu ở thời kỳ này đã khái quát hiện tượng lên

men như là một hiện tượng phổ biến trong sự sống và enzyme là yếu tố gây nên sự
chuyển hóa các chất trong quá trình lên men.
Khoảng những năm 1600 của thế kỷ XVII, Van Helmont là người đầu tiên đã
cố gắng đi sâu tìm hiểu bản chất của quá trình lên men. Ông đã nhận thấy bản chất của
sự tiêu hóa là sự chuyển hóa hóa học của thức ăn và giải thích cơ chế của nó với sự so
sánh với quá trình lên men rượu. Danh từ ferment (fermentatio – sự lên men) được
Van Helmont dùng để chỉ tác nhân gây ra sự chuyển biến các chất trong quá trình lên
men rượu.
Sau đó người ta đã tìm ra và tách được nhiều enzyme khác như enzyme phân
giải protein của dịch tiêu hóa trong dạ dày như pepsin, trypsin.
+ Giai đoạn 3
Giai đoạn này bắt đầu từ giữa thế kỷ XIX đến 30 năm đầu của thế kỷ XX. Ở
giai đoạn này, một số lượng lớn các enzyme ở dạng hòa tan đã được các nhà khoa học
tách chiết.
-5-


Trong thời kỳ này, có hai trường phái có quan điểm trái ngược với nhau là:
trường phái Pasteur – nhà bác học người Pháp và trường phái Liebig – nhà bác học
người Đức.
* Trường phái Pasteur:
Năm 1856, Pasteur đã đề cập đến bản chất của quá trình lên men. Theo ông thì
không thể tách các enzyme ra khỏi tế bào. Ông cũng cho rằng tác dụng và tính chất
của enzyme gắn liền với sự sống của tế bào và quá trình lên men rượu là kết quả của
hoạt động sống của tế bào nấm men chứ không phải là kết quả của tác dụng enzyme.
Quan điểm sai lầm này của Pasteur đã thống trị ngành enzyme học trong một
thời gian dài. Năm 1878, Kuhne đã đề nghị dùng danh từ “ferment” (fermentatio – lên
men) để gọi các “enzyme có tổ chức” và đã gọi các chất chiết có tác dụng xúc tác cho
phản ứng hóa học là các enzyme (từ chữ Hy Lạp : en – bên trong, zyme – men rượu,
tức là “ở trong nấm men”) để gọi các enzyme “không có tổ chức”. Danh từ enzyme đã

được xuất phát từ đây.
* Trường phái Liebig:
Trái ngược với quan điểm trên của Pasteur, Liebig (trước đó có cả Berzelius)
cho rằng có thể không có hoạt động của các tế bào vi sinh vật vẫn có quá trình lên
men. Điều đó có nghĩa là ông coi enzyme như là một chất hóa học gây nên hiệu quả
tương tự như các chất xúc tác, tác dụng cả ở trong và ngoài tế bào, mà không phụ
thuộc vào hoạt động sống của vi sinh vật.
Nhưng năm 1871, Liebig thất bại vì thực nghiệm không chứng minh được quan
điểm trên của ông. Các thí nghiệm được tiến hành bằng cách lấy dịch chiết từ tế bào
nấm men đã nghiền nát đều không có tác dụng gây lên men rượu.
+ Giai đoạn 4
Bản chất hóa học của enzyme chỉ được xác định đúng đắn từ sau khi kết tinh
được enzyme. Năm 1926 nhà hóa sinh Mỹ trẻ tuổi Sumner (39 tuổi) đã thành công
trong việc chứng minh protein được kết tinh từ hạt đậu tương là chất giống enzyme
xúc tác cho phản ứng thủy phân urê. Đây cũng chính là enzyme đầu tiên được kết tinh.
Bốn năm sau (1930) ở Mỹ, Northrop đã tách được pepsin ở dạng tinh thể, và vào năm
1931 Northrop và Kunitz cũng đã tách được trypsin ở dạng tinh thể.
-6-


Trong mấy chục năm cuối của thế kỷ XX và đầu thế kỷ XXI, người ta đã chú ý
nghiên cứu việc ứng dụng enzyme. Người ta đã tận dụng các nguyên liệu giàu enzyme
để tách enzyme, dùng chế phẩm enzyme này để chế biến các nguyên liệu khác nhau
hoặc sử dụng vào mục đích khác nhau. Ở nhiều nước đã hình thành ngành công nghệ
enzyme, hàng năm đã sản xuất hàng trăm tấn chế phẩm enzyme để phục vụ cho các
ngành sản xuất khác nhau và cho y học (Đỗ Quý Hai và ctv, 2009).
2.1.3 Danh pháp – cấu tạo – phân loại
* Danh pháp
Tên enzyme = tên cơ chất + ase
Ví dụ: enzyme thủy giải protein: protease

Enzyme phân hủy nucleic: nuclease
Enzyme tổng hợp DNA: DNA-polymerase
Bên cạnh đó còn có những tên gọi theo thói quen, không cho thấy bản chất hóa
học của phản ứng do enzyme xúc tác, ví dụ như ligase (enzyme nối trong quá trình tự
sao DNA), amylase (enzyme thủy phân tinh bột, có trong dịch ruột)
* Cấu tạo
Enzyme 1 cấu tử: là enzyme trong thành phần cấu tạo chỉ có protein. Ví dụ :
pepsin, urease.
Enzyme 2 cấu tử: là enzyme trong thành phần của nó ngoài protein còn có
thành phần non-protein – nhóm ngoại. Người ta gọi phần protein là “feron” hay
“apoenzyme”, phần nhóm ngoại là “agon” hay “coenzyme”. Thường nhóm ngoại là
dẫn xuất của các vitamin, các nucleotide. Ví dụ: catalase, xitocrom

Hình 2.1 Các bậc cấu trúc của enzyme
-7-


Trung tâm hoạt động: chỉ có 1 phần rất nhỏ của enzyme tham gia phản ứng,
phần này gọi là trung tâm hoạt động, số trung tâm hoạt động có thể lớn hơn 1.
* Phân loại
Càng ngày càng có nhiều enzyme mới được phát hiện, để thống nhất tên gọi
enzyme, người ta đã phân tất cả enzyme làm 6 loại (xem bảng 2.1).
Bảng 2.1: Bảng phân loại enzyme
Loại enzyme

Loại phản ứng được xúc tác
Các enzyme này xúc tác các phản ứng oxi-hóa khử có nghĩa là

Oxidoreductase

chúng vận chuyển các nguyên tử hydro hoặc điện tử của chúng
từ cơ chất của chúng sang các phần tử nhận

Transferase

Hydrolase

Lyase

Izomerase

Các nhóm nhỏ các nguyên tử được vận chuyển từ cơ chất này
sang cơ chất khác
Các enzyme này làm gãy đứt các liên kết hóa học bằng phản ứng
thủy phân
Các enzyme này nối thêm một nhóm mới vào cơ chất bằng cách
làm gãy nối đôi, ngược lại nó cũng có thể xúc tác để tạo nối đôi
Chúng xúc tác sự tái phân bố các nguyên tử trong cơ chất, tức là
chúng tạo ra các đồng phân của cùng một hợp chất
Các enzyme này tạo liên kết hóa học mới, năng lượng từ ATP sẽ

Ligase

cần cho sự tạo các liên kết hóa học này, ligase giúp cho sự tổng
hợp nên hydrocarbon, protein và các đại phân tử khác
(Đỗ Quý Hai và ctv, 2009).

2.1.4 Tính chất lý hóa của enzyme
Enzyme sử dụng năng lượng liên kết tạo phản ứng xúc tác đặc hiệu thông qua
một số cơ chế như sau:

+ Giảm entropi.
+ Làm mất vỏ nước bao quanh cơ chất.
-8-


+ Năng lượng liên kết do các tương tác yếu tạo ra ở trạng thái chuyển tiếp.
+ Tạo ra khớp phản ứng làm cho phản ứng xảy ra dễ dàng hơn.
Sau khi tạo thành phức enzyme – cơ chất, các nhóm chức năng nằm ở vị trí đặc
biệt trong phức sẽ phát huy tác động của mình theo một số cơ chế. Phổ biến nhất là cơ
chế xúc tác acid – base và cơ chế xúc tác hóa trị.
- Cơ chế xúc tác acid – base: thường trong phản ứng sinh hóa luôn luôn có sự
hình thành các chất trung gian mang điện không bền, dễ dàng phân rã trở lại trạng thái
ban đầu. Tuy nhiên, chúng có thể ổn định nhờ sự trao đổi proton với sự tham gia của
H+, H3O+ và OH- trong môi trường nước tạo ra xúc tác acid – base riêng, khác với xúc
tác acid – base chung xảy ra trong môi trường phản ứng ngoài nước còn có chất cho và
nhận proton khác.
- Xúc tác thông qua liên kết hóa trị tạm thời: liên kết này tồn tại trong khoảng
thời gian rất ngắn giữa enzyme và cơ chất. Sự hình thành liên kết yếu tạm thời này
giữa enzyme và cơ chất sẽ hoạt hóa rất mạnh cho phản ứng.
- Xúc tác thông qua ion kim loại: rất nhiều trường hợp enzyme có chứa các kim
loại và cơ chất xuất hiện tương tác (thông qua ion kim loại) giúp định hướng cơ chất
vào tâm phản ứng. Ngoài ra kim loại còn tham gia vào phản ứng oxi-hóa khử.
2.1.5 Tính đặc hiệu của enzyme
* Khái niệm chung
Do cấu trúc lý hóa đặc biệt của phân tử enzyme và đặc biệt là của trung tâm
hoạt động mà enzyme có tính đặc hiệu rất cao so với những chất xúc tác thông thường
khác. Mỗi enzyme chỉ có khả năng xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số chất
nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định. Đặc tính tác dụng chọn lọc cao này gọi là
tính đặc hiệu hoặc tính chuyên hóa của enzyme. Tính đặc hiệu là một trong những đặc
tính cơ bản quan trọng nhất của enzyme.

* Các hình thức đặc hiệu
Có thể phân biệt hai kiểu đặc hiệu là: đặc hiệu kiểu phản ứng và đặc hiệu cơ
chất.

-9-


+ Đặc hiệu kiểu phản ứng
Đa số mỗi enzyme đều có tính đặc hiệu với một loại phản ứng nhất định.
Những chất có khả năng xảy ra nhiều loại phản ứng hóa học thì mỗi loại phản ứng ấy
phải do một enzyme đặc hiệu xúc tác. Ví dụ, amino acid có khả năng xảy ra phản ứng
khử carboxyl, phản ứng khử amin bằng cách oxy hóa và phản ứng vận chuyển nhóm
amin, vì vậy mỗi phản ứng ấy cần có một enzyme đặc hiệu tương ứng xúc tác theo thứ
tự là decarboxylase, aminoacid oxydase và aminotransferase.
+ Đặc hiệu cơ chất
Mỗi enzyme chỉ xúc tác cho sự chuyển hóa một hoặc một số chất nhất định.
Mức độ đặc hiệu cơ chất của các enzyme khác nhau không giống nhau, người ta
thường phân biệt thành các mức như sau:
- Đặc hiệu tuyệt đối
Một số enzyme hầu như chỉ xúc tác cho phản ứng chuyển hóa một cơ chất xác
định và chỉ xúc tác cho phản ứng ấy mà thôi. Ví dụ: urease, arginase, glucoseoxydase.
Đối với các enzyme này, ngoài các cơ chất đặc hiệu của chúng là ure, arginine, β- D –
glucose (theo thứ tự tương ứng) chúng cũng có thể phân giải một vài chất khác nhưng
với vận tốc thấp hơn nhiều. Chẳng hạn như urease, ngoài ure nó còn có thể phân giải
hydroxyure nhưng với vận tốc thấp hơn 120 lần. Đối với trường hợp glucose oxydase
thì enzyme này có trong các loại nấm mốc ngoài khả năng oxy hóa đặc hiệu β- D –
glucose thành gluconic acid, nó còn có khả năng phân giải 10 cơ chất nhưng với khả
năng nhỏ hơn nhiều.
Những enzyme có tính đặc hiệu tuyệt đối thường được dùng để định lượng
chính xác cơ chất của nó.

- Đặc hiệu nhóm tuyệt đối
Các enzyme này chỉ tác dụng lên những cơ chất có cùng một kiểu cấu trúc phân
tử, một kiểu liên kết và có những yêu cầu xác định đối với nhóm nguyên tử ở phần liên
kết chịu tác dụng. Ví dụ: maltase thuộc nhóm α- glucosidase chỉ xúc tác cho phản ứng
thủy phân liên kết glucoside được tạo thành từ nhóm OH- glucoside của α - glucose
với nhóm OH- của một monose khác.
-10-


- Đặc hiệu nhóm tương đối
Mức độ đặc hiệu của các enzyme thuộc nhóm này kém hơn nhóm trên. Enzyme
có khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất định trong phân tử cơ chất mà
không phụ thuộc vào cấu tạo của các phần tham gia tạo thành mối liên kết đó. Ví dụ
lipase có khả năng thủy phân được tất cả các mối liên kết este. Aminopeptidase có thể
xúc tác thủy phân nhiều peptid.
- Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể)
Hầu như tất cả các enzyme đều có tính đặc hiệu không gian rất chặt chẽ, nghĩa
là enzyme chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân không gian của cơ chất.
Trong tự nhiên cũng có các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tương hỗ
giữa các cặp đồng phân không gian tương ứng. Các enzyme này có vai trò quan trọng
khi sản xuất các chất dinh dưỡng bằng phương pháp hóa học, vì chúng có thể chuyển
các chất từ dạng cơ thể không thể sử dụng được thành dạng có thể hấp thụ (Đỗ Quý
Hai và ctv, 2009).
2.1.6 Cơ chế xúc tác của enzyme
Bước đầu tiên của bất kỳ phản ứng nào có sự xúc tác của enzyme là sự hình
thành mối liên kết đặc hiệu giữa các phân tử tạo thành phức enzyme – cơ chất, nhờ cấu
hình của enzyme phù hợp với cơ chất qua một khu vực tương đối lớn là trung tâm hoạt
động của enzyme, sau khi tạo ra phức này enzyme và cơ chất tác dụng với nhau (như
phần tính đặc hiệu) làm xảy ra phản ứng hóa học trong cơ chất và các sản phẩm tương
ứng được tạo ra liền sau đó enzyme tách khỏi cơ chất để sẵn sàng kết hợp với các cơ

chất mới, quá trình này diễn ra rất nhanh.
Quá trình trên có thể được tóm tắt qua sơ đồ như sau:
E+S

ES

Trong đó:
E: là enzyme
S: là cơ chất (Substrate)
ES: là phức hợp enzyme – cơ chất
P: là sản phẩm (Product)
-11-

P+E


- Giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành
phức hợp enzyme – cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi
năng lượng hoạt hóa thấp
- Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ
các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng
- Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng ra dưới
dạng tự do.
Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức hợp ES là:
tương tác tĩnh điện, liên kết hydrogen, tương tác Van der Waals. Mỗi loại liên kết đòi
hỏi những điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước.
Cơ chế hoạt động như trên là giả thuyết ổ khóa và chìa khóa, khái niệm này chỉ
có tính chất tương đối. Ổ khóa và chìa khóa ở đây không phải có cấu trúc cố định mà
tương tác với nhau kèm theo sự thay đổi của cả hai bên (Đỗ Quý Hai và ctv, 2009).
2.1.7 Các yếu tố ảnh hưởng tới tốc độ phản ứng của enzyme

+ Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Tốc độ phản ứng enzyme phụ thuộc nồng độ cơ chất. Nồng độ cơ chất tăng, tốc
độ phản ứng xúc tác của enzyme tăng, nhưng khi nồng độ cơ chất tăng đến mức cao
thì tốc độ phản ứng đạt đến mức cực đại và không tăng nữa. Thời điểm này enzyme
bão hòa cơ chất.
+ Ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Tốc độ phản ứng xúc tác bởi enzyme tỷ lệ thuận với hàm lượng enzyme nhưng
khi tăng cao nồng độ enzyme thì tốc độ cũng không tăng nữa do các sản phẩm được
tạo ra nhiều sẽ tác dụng vào vị trí dị lập thể của enzyme làm cho phản ứng đạt ở mức
độ bão hòa.
+ Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có tác dụng làm tăng tốc độ của phản ứng enzyme lên đến tốc độ cực
đại đến chừng nào enzyme chưa bị biến tính, mỗi khi tăng nhiệt độ lên 10oC, tốc độ

-12-


phản ứng sẽ tăng lên khoảng 2 lần. Khi nhiệt độ tăng đến khoảng 60 – 70oC thì phần
lớn các enzyme mất hẳn hoạt tính và nhiệt độ đó gọi là nhiệt độ tới hạn.
Mỗi enzyme yêu cầu một nhiệt độ xúc tác tối ưu riêng, ở nhiệt độ này phản ứng
enzyme đạt tốc độ cao nhất. Nhìn chung nhiệt độ thích hợp của enzyme gần với nhiệt
độ của cơ thể, vào khoảng 40oC. Ở các vi sinh vật chịu nhiệt độ cao, enzyme của
chúng có nhiệt độ thích hợp cao, ví dụ amylase động vật có nhiệt độ thích hợp cao,
enzyme ứng dụng khoảng 45 – 50oC; nhưng α-amylase của vi sinh vật chịu nhiệt có
nhiệt độ thích hợp là 70oC, đối với các enzyme của các vi sinh vật cảm ứng sống trong
các suối nước nóng thì nhiệt độ thích hợp vào khoảng gần nhiệt độ sôi của nước.
Nhiều enzyme thực vật vẫn có thể hoạt động ở nhiệt độ khá cao như papain ở 80oC.
+ Ảnh hưởng của pH
Enzyme rất nhạy cảm với pH của môi trường; nó ảnh hưởng rất lớn đối với vận
tốc của phản ứng enzyme. Mỗi enzyme có một giá trị pH tối ưu cho hoạt động của nó.

Đa số enzyme có pH tối ưu ở vùng trung tính, nhưng cũng có enzyme vẫn hoạt động
tốt ở vùng pH acid hay ở vùng pH kiềm. pH ảnh hưởng đối với các phản ứng của
enzyme do nhiều tác dụng rất khác nhau có thể là pH tác dụng vào trạng thái ion hóa
của phân tử enzyme ở các nhóm hoạt động của enzyme, vào trạng thái ion hóa của cơ
chất, vào độ bền vững của phân tử enzyme và ảnh hưởng đến sự kết hợp giữa phần
protein và phần phụ không phải protein.
Đối với enzyme có những nhóm hoạt động đặc biệt có thể tồn tại dưới nhiều
dạng ion khác nhau và thường chỉ ở một trạng thái có tác dụng xúc tác. pH có tác dụng
quyết định đối với trạng thái ion hóa của phân tử enzyme nói chung và các nhóm hoạt
động của enzyme nói riêng, nên ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme.
+ Ảnh hưởng của ion kim loại
Sự có mặt hay vắng mặt của ion kim loại không thể hiện rõ đối với một số
enzyme, nhưng cũng có nhiều enzyme chịu ảnh hưởng sâu sắc bởi nồng độ và bản chất
của ion kim loại. Có một số ion kim loại rất cần thiết cho sự hoạt động của một số
enzyme; nhưng cũng có những ion kim loại như Ag+, Hg+, Pb+ có độc tính cao với hầu
hết các enzyme. Một số ion kim loại ức chế enzyme này nhưng hoạt hóa enzyme kia.
-13-


Có những ion kim loại ức chế một enzyme ở nồng độ này nhưng lại hoạt hóa chính
enzyme đó ở nồng độ khác. Tác dụng của ion kim loại rất phức tạp vì nó còn tác dụng
với cả trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác của enzyme.
+ Ảnh hưởng của chất hoạt hóa
Chất hoạt hóa có khả năng làm tăng tác dụng xúc tác của enzyme. Chất hoạt
hóa thường có bản chất rất khác nhau. Ví dụ, các anion nhóm halogen như Cl-, Br-, Icó tác dụng hoạt hóa α-amylase. Glutathion có tác dụng hoạt hóa nhiều protease thực
vật, một số enzyme oxy hóa khử có nhóm hoạt động –SH. Cystein là acid amin hoạt
hóa nhiều men có nhóm –SH hoạt động. Tác dụng hoạt hóa của glutathion, cystein là
do khả năng khử liên kết disulfur của phân tử enzyme. Các enzyme có nhóm –SH hoạt
động thường chỉ hoạt động được khi các nhóm này ở dạng khử (Nguyễn Văn Nam và
ctv, 2007).

2.2 Tổng quát về protease
2.2.1 Khái niệm protease
Protease còn được gọi là các proteolytic enzyme, là các enzyme có khả năng
thủy phân các liên kết peptid của chuỗi peptid, protein thành các đoạn peptid ngắn hơn
và thành các acid amin. Các protease thủy phân các liên kết peptid bên trong chuỗi
polypeptid được gọi là các endoprotease và được chia thành 4 loại trên cơ sở các nhóm
hóa học tham gia vào quá trình xúc tác: Serin proteinase (EC3.4.21), Cystein
proteinase (EC3.4.22), Aspartic proteinase (EC3.4.23) và Metalloproteinase
(EC3.4.24). Trong cơ thể, các protease đảm nhiệm nhiều chức năng sinh lý như: hoạt
hóa zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, giải phóng hormon
và các peptid có hoạt tính sinh học từ các tiền chất, vận chuyển protein qua màng...
Ngoài ra, các protease có thể hoạt động như các yếu tố phát triển của cả tế bào ác tính
và tế bào bình thường, đó là tăng sự phân chia tế bào, sinh tổng hợp DNA.
Các protease có thể ở dạng:
- Hiện diện trong tế bào (protease nội bào)
- Được tiết vào môi trường nuôi cấy (protease ngoại bào)

-14-


Cho đến nay, các protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn so với protease
nội bào (Tiêu Thị Ngọc Thảo và ctv, 2008).
2.2.2 Nguồn nguyên liệu thu nhận protease
Protease có ở tất cả các loài động vật và thực vật. Tuy nhiên, sự phân bố của nó
không đồng đều ở các loài, các mô cũng như các cơ quan. Một số loài, cơ quan và mô
của động thực vật có chứa một hoặc một số protease nhất định có thể dùng làm nguyên
liệu để tách các enzyme tương ứng. Bên cạnh đó, các vi sinh vật cũng là một nguồn
thu nhận protease tương đối dồi dào.
¾ Nguồn động vật
- Tụy tạng: đây là nguồn thu enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều

enzyme nhất.
- Dạ dày bê: trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm
protease là renin. Renin đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệ phomat.
Renin làm biến đổi cazein thành paracazein có khả năng kết tủa trong môi trường sữa
có đủ nồng độ Ca2+. Đây là quá trình động tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và
ứng dụng đầy đủ nhất.
Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ các động vật khác như nội tạng cá
basa, đầu tôm sú, trùn quế.

Hình 2.2 Trùn quế

Hình 2.3 Tụy tạng

¾ Nguồn thực vật
Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu được từ
nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ
dứa (Pineapple plant). Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng
của bia khi làm lạnh do kết tủa protein. Những ứng dụng khác của protease thực vật
-15-