TÌM HIỂU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN Pseudomonas fluorescens TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
TÌM HIỂU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN
Pseudomonas fluorescens TRÊN CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus)

Họ và tên sinh viên :

ĐÀO THỊ THANH HUÊ

Ngành

:

NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

Chuyên ngành

:

NGƯ Y

Niên khóa

:

2005 – 2009

Tháng 9/2009

i


TÌM HIỂU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN
Pseudomonas fluorescens TRÊN CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus)

Tác giả
ĐÀO THỊ THANH HUÊ

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng
Kỹ Sư Nuôi Trồng Thủy Sản chuyên ngành Ngư Y

Giáo viên hướng dẫn
TS. Nguyễn Hữu Thịnh

ii


Tháng 9 năm 2009

iii


LỜI CẢM ƠN
Chúng tôi xin chân thành cảm ơn đến:
Ông bà, cha mẹ và gia đình đã luôn ở bên cạnh, động viên và hỗ trợ về tinh thần
lẫn vật chất cho con trong suốt những năm đi học cũng như tạo điều kiện thuận lợi
nhất để con hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.

Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản.
Cùng toàn thể quý thầy cô Khoa Thủy Sản đã tạo mọi điều kiện và tận tình
giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho chúng tôi trong suốt quá trình học tập.
Đặc biệt chúng tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Hữu Thịnh đã
quan tâm, hướng dẫn và giúp đỡ chúng tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt
nghiệp.
Đồng thời xin gửi lời cảm ơn đến anh Tuấn giám đốc trại sản xuất cá giống
Bình Thạnh – An Giang đã giúp đỡ tạo điều kiện cho chúng tôi thực hiện và hoàn
thành đề tài.
Xin cám ơn tất cả các bạn DH05NY đã cùng gắn bó, chia sẻ, giúp đỡ tôi hoàn
thành đề tài.
Với thời gian hạn hẹp và kiến thức còn hạn chế nên luận văn này không tránh
khỏi những thiếu sót. Chúng tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của quý
thầy cô và các bạn để luận văn được hoàn chỉnh hơn.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn.

iv


TÓM TẮT
Trong đề tài này chúng tôi tiến hành:
- Thu mẫu, phân lập và định danh vi khuẩn Pseudomonas trên cá tra bệnh.
- Tiến hành thí nghiệm cảm nhiễm ngược trên cá bằng hai phương pháp tiêm
và ngâm.
Mẫu cá bệnh được chúng tôi thu từ trại sản xuất cá giống Bình Thạnh, tỉnh An
Giang.
Chúng tôi đã phân lập được 2 giống vi khuẩn Pseudomonas và Aeromonas.
Giống vi khuẩn Pseudomonas chúng tôi định danh được 2 loài là Pseudomonas
aeruginosa với 8 chủng vi khuẩn chiếm 10% và Pseudomonas fluorescens với 22
chủng vi khuẩn chiếm 27,5%. Giống vi khuẩn Aeromonas định danh được loài là

Aeromonas hydrophila chiếm tỉ lệ cao nhất 62,5% với 50 chủng vi khuẩn. Tất cả vi
khuẩn đều được định danh bằng bộ test API-20E và được phân biệt bằng các phản ứng
sinh hóa đặc trưng.
Thí nghiệm gây cảm nhiễm ngược được tiến hành với vi khuẩn Pseudomonas
fluorescens bằng hai phương pháp tiêm và ngâm.
 Phương pháp tiêm
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức và 3 lần lặp lại.
-

ĐC: là nghiệm thức đối chứng tiêm nước muối sinh lý NaCl 0,9%.

-

NT I: là nghiệm thức tiêm vi khuẩn với nồng độ 2,6 x 106 cfu/ml.

-

NT II: là nghiệm thức tiêm vi khuẩn với nồng độ 2,6 x 108 cfu/ml.

-

NT III: là nghiệm thức tiêm vi khuẩn với nồng độ 2,6 x 1010 cfu/ml.
Cá ở các nghiệm thức được tiêm với liều dung dịch 0,1 ml/10g cá.

Cá được theo dõi, ghi nhận tỷ lệ chết trong 14 ngày gây cảm nhiễm.
Tiến hành phân lập vi khuẩn đối với cá bệnh chết. Pseudomonas fluorescens ở
nghiệm thức tiêm nồng độ cao 2,6 x 1010 cfu/ml (NTIII) gây viêm cục bộ ở cơ tại vết
tiêm, sau đó gây loét cơ. Một số cá ở nghiệm thức tiêm nồng độ vi khuẩn thấp 2,6 x
106 cfu/ml (NTI) và 2,6 x 108 cfu/ml (NTII) không thấy loét vết tiêm nhưng thấy vi
khuẩn xuất hiện ở gan và thận.

v


Vì độc lực của vi khuẩn yếu nên đến ngày thứ 11 cá ở tất cả nghiệm thức mới
chết nhưng số lượng chết không nhiều và cá chết rải rác với triệu chứng không rõ ràng
ở các nghiệm thức tiêm nồng độ thấp (NTI và NTII).
 Phương pháp ngâm
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức và 3 lần lặp lại.
-

ĐC I: là nghiệm thức đối chứng trong đó cá không tạo trầy xước và không
ngâm vi khuẩn.

-

ĐC II; là nghiệm thức đối chứng trong đó cá bị gây trầy xước nhưng
không ngâm vi khuẩn.

-

NT I: là nghiệm thức trong đó cá không gây trầy xước và ngâm trong nước
có pha 100ml vi khuẩn tăng sinh.

-

NT II: là nghiệm thức trong đó cá bị gây trầy xước và ngâm trong nước có
pha 100ml vi khuẩn tăng sinh.

Sau khi theo dõi 14 ngày, tỉ lệ cá chết ở các nghiệm thức gây bệnh rất thấp cùng

với triệu chứng bệnh tích không rõ. Do đó, khả năng gây bệnh của Pseudomonas
fluorescens trên cá tra là rất thấp và vi khuẩn không đủ độc lực làm chết cá.

vi


MỤC LỤC
Đề Mục

Trang

Lời cảm ơn

ii

Tóm tắt

iii

Mục lục

v

Danh sách chữ viết tắt

vii

Danh sách các hình

viii

Danh sách các bảng

ix

Danh sách các sơ đồ và đồ thị

x

Chương 1: MỞ ĐẦU

1

1.1 Đặt Vấn Đề

1

1.2 Mục Tiêu Đề Tài

2

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

2.1 Đặc Điểm Sinh Học Của Cá Tra

3

2.1.1 Phân loại

3

2.1.3 Phân bố

3

2.1.4 Điều kiện sống

4

2.1.5 Đặc điểm sinh trưởng

4

2.1.6 Đặc điểm dinh dưỡng

4

2.1.7 Đặc điểm sinh sản

4

2.2 Một Số Quan Niệm Về Bệnh

5

2.3 Tổng Quan Về Các Phương Pháp Gây Bệnh Thực Nghiệm

5

2.4 Đặc điểm chung về vi khuẩn Pseudomonas

6

2.5 Pseudomonas Gây Bệnh Trên Cá Nuôi

7

2.6 Bệnh Nhiễm Khuẩn Do Vi Khuẩn Aeromonas

8

2.7 Phòng Và Trị Bệnh Do Vi Khuẩn Aeromonas Và Pseudomonas Gây Ra Trên Cá 9
Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

10

3.1 Thời Gian Và Địa Điểm Nghiên Cứu

10

3.2 Dụng Cụ Và Hóa Chất Nghiên Cứu

10

3.3 Phương Pháp Nghiên Cứu

12
vii

3.4 Phương Pháp Thu Mẫu Bệnh Phẩm

13

3.5 Phương Pháp Khám, Mổ Và Phân Lập Vi Khuẩn Từ Bệnh Phẩm

13

3.5.1 Phương pháp khám và mổ cá bệnh

13

3.5.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn từ bệnh phẩm

14

3.5.3 Phương pháp cố định mẫu

14

3.5.4 Phương pháp làm thuần vi khuẩn

14

3.5.5 Định danh vi khuẩn

15

3.6 Phương Pháp Gây Bệnh Thực Nghiệm

20

3.6.1 Đối tượng thí nghiệm

20

3.6.2 Vật liệu

20

3.6.3 Phương pháp thí nghiệm

21

3.6.3.1 Sơ đồ gây bệnh thực nghiệm

21

3.6.3.2 Hệ thống bố trí thí nghiệm

21

3.6.3.2 Gây bệnh thực nghiệm bằng phương pháp tiêm

22

3.6.3.3 Gây bệnh thực nghiệm bằng phương pháp ngâm

26

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

28

4.1 Phân Lập Và Định Danh Vi Khuẩn Pseudomonas sp.

28

4.2 Kết Quả Gây Bệnh Thực Nghiệm

32

4.2.1 Các chỉ tiêu môi trường

32

4.2.2 Kết quả kiểm tra kí sinh trùng

33

4.2.3 Số lượng vi khuẩn

33

4.2.4 Kết quả gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm

34

4.2.5 Kết quả gây cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm

40

4.2.6 Sự thay đổi về mô học của cá bệnh

44

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

46

5.1 Kết Luận

46

5.2 Đề Nghị

47

TÀI LIỆU THAM KHẢO

48

PHỤ LỤC

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BHIA

: Brain Heart Infusion Agar.

NB

: Nutrient Broth.

TSI

: Triple sugar iron Agar.

cfu

: Colony forming unit.

ctv

: Cộng tác viên.

DO

: Dissolved oxygen.

pH

: Potential of hydrogen.

MS 222 : Tricacine methanesulfonate.
ONPG

: O – Nitrophenyl – β – D – Galactopyranoside.

VP

: Voges Proskauer.

P.

: Pseudomonas

A.

: Aeromonas

NT

: Nghiệm thức

ĐC

: Đối chứng

XH

: Xuất huyết

NM

: Nhạt màu

SH

: Sung huyết

S

: Sưng

DANH SÁCH CÁC HÌNH
ix


Hình

Trang

Hình 3.1: Hóa chất nhuộm Gram

16

Hình 3.2: Hệ thống bể bố trí thí nghiệm

22

Hình 3.3: Cân khuẩn lạc

23

Hình 3.4: Tiêm ở cơ, dưới tia vây lưng

25

Hình 3.5: Gây trầy xước cho cá

27

Hình 3.6: Đong vi khuẩn ngâm cá

27

Hình 3.7: Ngâm cá với vi khuẩn trong xô có sục khí

27

Hình 4.1: Mẫu cá bệnh bị hoại tử cơ, cụt đuôi

28

Hình 4.2: Gan bị nhạt màu và thận sưng

28

Hình 4.3: Kết quả định danh P. fluorescens

31

Hình 4.4: Hình thái vi khuẩn Pseudomonas fluorescens Gram (-) dạng trực khuẩn

31

Hình 4.5: Sán lá đơn chủ kí sinh trên mang cá tra

33

Hình 4.6: Vết tiêm cá NT III.3 sau 1 ngày gây bệnh.

35

Hình 4.7: Vết tiêm bị loét cá NTIII.1, sau 2 ngày gây bệnh

35

Hình 4.8: Nội quan của cá chết ngày thứ 3 NT III.1

35

Hình 4.9: Vết tiêm bị loét nhưng cá ở nghiệm thức III.2 sau 16 ngày gây bệnh

36

Hình 4.10: Phân lập vi khuẩn từ cơ và gan cá NT III.1 ngày thứ 3 gây bệnh

39

Hình 4.11: Phân lập vi khuẩn từ gan và thận cá bệnh ngày thứ 10

39

Hình 4.12: Cá bị tưa vây đuôi ở NT II sau 5 ngày gây bệnh.

40

Hình 4.13: Cá NT II sau 5 ngày gây bệnh.

40

Hình 4.14: Cá chết NT II với đuôi và vây ngực bị ăn mòn sau 11 ngày gây bệnh

41

Hình 4.15: Phân lập vi khuẩn từ mẫu cấy gan cá bệnh NT II sau 10 ngày gây bệnh 43
Hình 4.16: Mô gan cá tra khỏe (H&E, x100)

44

Hình 4.17: Mô gan cá tra bệnh (H&E, x100)

44

Hình 4.18: Mô thận cá tra khỏe (H&E, x400)

45

Hình 4.19: Mô thận cá tra bệnh (H&E, x400)

45

Hình 4.20: Mô cơ cá tra khỏe (H&E, x400)

45

Hình 4.21: Mô cơ cá tra bệnh (H&E, x400)

45

DANH SÁCH CÁC BẢNG
x


Bảng

Trang

Bảng 2.1: Đặc điểm sinh hóa của một số loài Pseudomonas thường gặp.

7

Bảng 3.1: Đọc kết quả phản ứng O/F:

18

Bảng 3.2: Kết quả định danh vi khuẩn

19

Bảng 4.1: Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn từ mẫu cá

30

Bảng 4.2: Bảng theo dõi các chỉ tiêu chất lượng nước

32

Bảng 4.4: Tỷ lệ chết trung bình (%) của các nghiệm thức sau 16 ngày gây bệnh bằng
38

phương pháp tiêm

Bảng 4.5: Tỷ lệ chết trung bình (%) của các nghiệm thức sau 14 ngày gây bệnh bằng
42

phương pháp ngâm

xi


DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ
SƠ ĐỒ
Sơ đồ 3.1: Nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh trên cá

12

Sơ đồ 3.2: Bố trí thí nghiệm

22

Sơ đồ 3.3: Pha loãng vi khuẩn

24

Sơ đồ 3.4: Bố trí thí nghiệm

26

BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1: Tỉ lệ phân lập vi khuẩn.

31

Biểu đồ 4.2: Số cá chết từng ngày

37

Biểu đồ 4.3: Số cá chết của các nghiệm thức sau 16 ngày theo dõi.

37

Biểu đồ 4.4: Tỉ lệ chết của các nghiệm thức

38

Biểu đồ 4.5: Số cá chết từng ngày

42

Biểu đồ 4.6: Tỷ lệ cá chết tích lũy ở mỗi nghiệm thức qua 14 ngày theo dõi.

42

Biểu đồ 4.7: Tỷ lệ cá chết giữa các nghiệm thức

43

xii


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt Vấn Đề
Ở Việt Nam ngành nuôi trồng thủy sản đang trên đà phát triển và có vai trò
quan trọng trong ngành kinh tế quốc dân. Trong đó, cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) được coi là một trong những đối tượng nuôi thủy sản phát triển mạnh
và có giá trị xuất khẩu cao. Trước đây, cá tra được nuôi chủ yếu ở qui mô gia đình,
mật độ nuôi thấp và dựa vào nguồn giống tự nhiên là chính. Ngày nay, khi nghề nuôi
cá tra phát triển và có giá trị kinh tế cao, để nghề nuôi càng ổn định và phát triển vượt
bậc nước ta đã chủ động nghiên cứu thành công công nghệ sản xuất giống nhân tạo
trên cá tra. Đồng thời đáp ứng nhu cầu về sản lượng và chất lượng sản phẩm với sự mở
rộng thị trường, người nuôi trồng thủy sản đã từng bước chuyển đổi hình thức nuôi
thưa sang thâm canh nhằm tận dụng diện tích mặt nước ao nuôi trong sản xuất. Cá tra
được nuôi phổ biến tại các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long, tập trung chủ yếu ở các
tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long và Cần Thơ. Do đặc tính chịu đựng được môi
trường khắc nghiệt nên cá tra nuôi thâm canh cho năng suất cao.
Tuy nhiên, hình thức nuôi công nghiệp mặc dù đã đem lại một số thành công và
lợi nhuận đáng kể cho người nuôi nhưng do sự phát triển quá nhanh không theo quy
hoạch, mật độ nuôi cao nên dịch bệnh trên cá tra xảy ra càng nhiều đã gây thiệt hại
lớn. Hơn thế nữa, diện tích nuôi chật hẹp, lượng thức ăn thừa, quản lý chất lượng nước
chưa tốt dẫn đến ô nhiễm môi trường làm cho các vi khuẩn gây bệnh cơ hội phát triển
cao trong môi trường nuôi như Aeromonas, Pseudomonas. Khi sức khỏe cá trong ao
yếu đi những vi khuẩn cơ hội sẽ xâm nhập phát triển trong cơ thể gây bệnh cho cá

hoặc với mật độ vi khuẩn cao trong ao chúng sẽ tác động làm giảm sức đề kháng của
cá tạo điều kiện cho vi khuẩn nguy hiểm gây bệnh bắt buộc phát triển như
Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ, bệnh do ký sinh trùng. Đặc biệt trong
những cá bị bệnh do stress, sây sát, lở loét, xuất huyết do môi trường thường thấy
1


Pseudomonas và Aeromonas có tần số xuất hiện cao. Rất nhiều nghiên cứu về vi
khuẩn Aeromonas gây bệnh trên cá, còn Pseudomonas vẫn còn nghi ngờ và để lại
nhiều tranh cãi.
Do đó, được sự phân công và tạo điều kiện của khoa Thủy Sản – Đại học Nông
Lâm chúng tôi đã tiến hành đề tài “Tìm hiểu khả năng gây bệnh của vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)”.
1.2 Mục Tiêu Đề Tài
Phân lập và định danh vi khuẩn thuộc giống Pseudomonas hiện diện trên mẫu
cá tra bệnh được thu từ trại nuôi.
Làm thí nghiệm gây bệnh thực nghiệm bằng giống vi khuẩn Pseudomonas
phân lập từ cá bệnh bằng hai phương pháp tiêm và ngâm.
Phân lập và tái định danh vi khuẩn từ cá bệnh.
Do vi khuẩn nghiên cứu là vi khuẩn gây bệnh cơ hội nên việc phân lập và tìm ra
vi khuẩn có ý nghĩa nghiên cứu về mặt khoa học. Mục tiêu cuối cùng là quan sát,
nghiên cứu triệu chứng, bệnh tích khi vi khuẩn này có khả năng gây bệnh cho cá.

2


Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Đặc Điểm Sinh Học Của Cá Tra

2.1.1 Phân loại
Ngành: Chordata
Lớp: Osteichthyes
Bộ: Siluriformes
Họ: Pangasiidae
Giống: Pangasianodon
Loài: Pangasianodon hypophthalmus
2.1.2 Hình thái
Cá có thân dài, dẹp ngang, không có vảy. Thân cá có màu xanh trên lưng, màu
xanh nhạt dần ở hai bên hông, bụng cá có màu trắng bạc. Đầu cá nhỏ vừa phải, rộng,
dẹp bằng, mắt tương đối to, miệng rộng phần sau hơi dẹp bên. Có hai đôi râu, trong đó
râu hàm trên ngắn hơn ½ chiều dài đầu, râu hàm dưới ngắn hơn ¼ chiều dài đầu. Vây
lưng và vây ngực có gai cứng mang răng cưa ở mặt sau. Vây mỡ nhỏ, vây hậu môn
tương đối dài (Trần Thanh Xuân, 1994).
2.1.3 Phân bố
Cá tra sống ở nước ngọt, phân bố trong vùng địa lý hẹp ở lưu vực sông Mê
Kông và sông Chao Phraya (Campuchia, Lào, Thái Lan, Việt Nam). Cá thường sống ở
tầng đáy, thủy vực nước tĩnh hoặc nước chảy, cá có thể sống trong ao tù nước đọng,
nhiều chất hữu cơ, oxy hòa tan thấp. Ở Việt Nam, cá xuất hiện ở vùng Đồng Bằng
Sông Cửu Long (Nguyễn Tuân, 2000). Hiện nay, cá tra là loài nuôi phổ biến trong
nghề nuôi cá bè ở An Giang và Đồng Tháp.

3


2.1.4 Điều kiện sống
Nhiệt độ thích hợp cho cá tăng trưởng dao động từ 26 – 300C. Nhờ có cơ quan
hô hấp phụ nên cá có khả năng sống ở những nơi ao tù nước bẩn, hàm lượng oxy hòa
tan thấp.
Cá có khả năng chịu đựng pH từ 4 – 5 (Ngô Trọng Lư và Thái Bá Hồ, 2001).

pH thích hợp cho cá phát triển tốt là 7,0 – 8,5.
Cá có thể sống ở độ mặn 7 – 10‰.
2.1.5 Đặc điểm sinh trưởng
Cá tra sau khi tiêu hết noãn hoàng có chiều dài từ 1,0 – 1,1 cm. Sau 14 ngày
ương cá có thể đạt đến chiều dài 2,0 – 2,3 cm và có khối lượng trung bình là 0,52 g. Cá
ương 5 tuần tuổi có chiều dài 5,0 – 6,0 cm và trọng lượng là 1,28 – 1,50 g. Sau 1 năm
tuổi, cá có thể đạt đến trọng lượng 1,2 – 1,5 kg. Sau 3 – 4 năm tuổi có thể đạt 3 – 4 kg
(Trần Thanh Xuân, 1994).
Nhìn chung, cá tra có tốc độ tăng trưởng nhanh nhưng tốc độ tăng trưởng của cá
phụ thuộc vào mật độ nuôi, chất lượng thức ăn và chế độ chăm sóc.
2.1.6 Đặc điểm dinh dưỡng
Cá tra là loài ăn tạp thiên về động vật. Khi tiêu hết noãn hoàng thì thức ăn yêu
thích là động vật phù du (Cladocera, Copepoda, Chiromidae, ấu trùng nước). Ngoài ra,
cá còn có đặc điểm ăn nhau bắt đầu từ thời điểm 20 – 30 giờ sau khi nở và phát triển
mạnh vào thời điểm 2 – 4 ngày sau khi nở (Lê Thanh Hùng và ctv., 1998).
Khi cá lớn có xu hướng ăn mồi chết và có phổ thức ăn rộng: cá nhỏ, ốc, giun,
thức ăn tổng hợp.
2.1.7 Đặc điểm sinh sản
Tuổi thành thục của cá tra khoảng 3 – 4 tuổi, trọng lượng trung bình từ 6 – 5
kg/con với chiều dài tối thiểu là 60 cm.
Rất khó phân biệt cá tra đực và cái bằng mắt thường vì chúng không có cơ quan
sinh dục phụ.
Mùa vụ sinh sản của cá tra dao động từ cuối tháng 5 – 7 hàng năm.
Sức sinh sản của cá 139000 – 150000 trứng/kg cá cái.
4


2.2 Một Số Quan Niệm Về Bệnh
Bệnh là biểu hiện trạng thái bất thường của cơ thể sinh vật với sự biến đổi xấu
của môi trường xung quanh, cơ thể nào thích ứng thì tồn tại, không thích ứng thì mắc

bệnh và chết. Hay nói cách khác, bất cứ sự thay đổi trạng thái nào đó của cơ thể hoặc
một bộ phận cơ quan nào ảnh hưởng đến chức năng sinh lý của cơ thể sinh vật được
gọi là bệnh.
Căn cứ vào nguyên nhân gây bệnh có thể chia làm 2 loại bệnh: bệnh truyền
nhiễm và bệnh không truyền nhiễm.
Bệnh truyền nhiễm thường do vi khuẩn, nấm, virus gây ra. Tính chất lây truyền
mạnh và có thể thành những ổ dịch lớn gây chết hàng loạt và có thể nhầm lẫn với
nhiễm độc hóa học. Bệnh không truyền nhiễm do môi trường, dinh dưỡng, độc tố. (Từ
Thanh Dung, 2001).
2.3 Tổng Quan Về Các Phương Pháp Gây Bệnh Thực Nghiệm
 Phương pháp tiêm
Đây là phương pháp gây bệnh bằng cách đưa trực tiếp vi khuẩn vào cá qua
đường tiêm. Thông thường ta tiêm vi khuẩn vào xoang bụng hoặc cơ.
Ưu điểm:
-

Liều vi khuẩn giống nhau ở mỗi cá thể gây bệnh.

-

Tỉ lệ chết ở các nồng độ vi khuẩn khác nhau rất rõ.

-

Thời gian cá bệnh nhanh do vi khuẩn xâm nhập trực tiếp vào máu.

-

Tác nhân gây bệnh là thường do vi khuẩn được tiêm vào cơ thể.

Khuyết điểm:
-

Có thể gây sốc, gây stress, gây thương tổn cho cá do kỹ thuật tiêm không

đúng có khả năng ảnh hưởng đến tỷ lệ chết.
-

Không giống con đường vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể ngoài thực tế.

 Phương pháp ngâm
Vi khuẩn được pha với nước sau đó cá được cho vào ngâm. Thời gian ngâm cá
ngắn: từ 1 – 5 phút, thời gian ngâm dài từ 30 – 60 phút.
Ưu điểm:
-

Khả năng xâm nhập vi khuẩn gần giống với tự nhiên.
5


-

Ít gây stress cho hơn so với phương pháp tiêm.

Khuyết điểm:
-

Có thể gây stress khi ngâm cá trong bể có diện tích nhỏ.

-

Tỷ lệ cá chết giữa các nồng độ vi khuẩn khác nhau do lượng vi khuẩn xâm

nhập khác nhau giữa các cá thể cá khác nhau.
Cá yếu: vi khuẩn nhiều.
Cá khỏe: vi khuẩn ít.
Ngoài ra còn có một số trường hợp gây bệnh khác như:
-

Nuôi chung: đưa cá bệnh và cá khỏe nuôi chung bể để chúng lây nhiễm với
nhau.

-

Qua đường miệng: tẩm vi khuẩn vào thức ăn cho cá ăn.

-

Sử dụng ống chích bơm thức ăn có tẩm vi khuẩn vào dạ dày cá.

-

Gây mê cá sau đó nhỏ vi khuẩn vào mũi cá.

(Nguồn: Nguyễn Hữu Thịnh, 2007)
2.4 Đặc Điểm Chung Về Vi Khuẩn Pseudomonas
Pseudomonas là một giống vi khuẩn thuộc họ Pseudomonadaceae, vi khuẩn
Gram âm, có dạng hình que, không sinh bào tử, kích thước tế bào khoảng 0,5 – 1,0 x
1,5 – 5,0 µm, chuyển động bằng một hoặc nhiều tiên mao. Pseudomonas phát triển
trong môi trường đơn giản và hiếu khí, giới hạn nhiệt độ phát triển rộng từ 4 – 43oC.

Chúng phân bố rộng khắp trong môi trường đất và nước. Pseudomonads có thể gây
bệnh cho người, động vật và thực vật. Một số loài có khả năng gây nhiễm trùng cơ hội
ở cá nhưng không gây bệnh cho người (Buller, 2004). Vi khuẩn thường được phân lập
từ da, gan, thận của cá bệnh. Ngoại trừ P. fluorescens gây bệnh cả người và cá nhưng
chủ yếu được tìm thấy trong môi trường và trong những vết thương bị loét. Tác nhân
gây bệnh trên cá gồm một số loài như P. fluorescens, P. chlororaphis, P.
anguilliseptica, P. dermoalba và P. putida (Shuzd Egusa, 1978).
P. aeruginosa và P. fluorescens được tìm thấy trong môi trường nước và ở cá
khỏe lẫn cá bệnh (Daly, 1999).

6


Bảng 2.1: Đặc điểm sinh hóa của một số loài Pseudomonas thường gặp.
Đặc điểm sinh hóa

Pseudomonas

Pseudomonas

Pseudomonas

Pseudomonas

chlororaphis

fluorescens

putida

aeruginosa

Di động

+

+

+

+

Nhuộm gram

-

-

-

-

Sắc tố huỳnh quang

-

+

+

-

Xanh

-

-

-

Oxidase

+

+

+

+

Catalase

+

+

+

+

O/-

O/-

O/-

O/-

Phát triển 5oC

+

+

+

+

Phát triển 37oC

+

+

+

+

Phát triển 0% NaCl

+

+

+

+

Khử Nitrate

+

+

+

+

Arginine

+

+

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

Indol

-

-

-

-

Voges – Pros kauer

-

-

-

-

Gelatine

+

+

-

+

Sắc tố khác

Phản

ứng

O/F

glusoce

Decarboxylase

Lysine
Decarboxylase
Orthinine
Decarboxylase

(Nguồn: Bùi Quang Tề, 2006)
2.5 Pseudomonas Gây Bệnh Trên Cá Nuôi
Pseudomonas có thể gây xuất huyết cho một số cá, nhưng chủ yếu ở cá nước
ngọt như cá trắm cỏ, cá chép, ... Bệnh có dấu hiệu cục bộ hoắc đại bộ phận như da cá
xuất huyết, vẩy rụng, gốc vây hoặc toàn bộ vây bị xuất huyết, các tia vây rách nát và
cụt dần, ... Có khi ruột xuất huyết và viêm nên gọi là bệnh xuất huyết, bệnh xảy ra có
thể làm cá chết hàng loạt nếu ở dạng cấp tính. Bệnh thường do loài vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens, P. putida gây ra (Bùi Quang Tề, 2006).
7


Theo Từ Thanh Dung (1994), Pseudomonas gây bệnh xuất huyết thường kèm
theo các triệu chứng sau: xuất hiện những vết thương nhỏ trên da, đường kính khoảng
3 – 5 mm. Cá mắc bệnh sẽ mất khả năng vận động do vây bị tưa rách, có thể xuất hiện
những vết thương bên dưới biểu bì, cơ. Các vết thương này sẽ gây hoại tử các vùng cơ
chung quanh. Bệnh xuất hiện khi môi trường nước bị ô nhiễm, nuôi với mật độ dầy,
nhiệt độ thích hợp cho bệnh bùng phát khoảng 30oC .
Pseudomonas gây bệnh nhiễm trùng máu cho cá nuôi đã xuất hiện ở Trung
Quốc, Nhật Bản, Châu Âu, Thái Lan,... Ở Indonesia, bệnh do vi khuẩn gây ra trên cá
tai tượng và được gọi là bệnh “giang mai” ở cá. Ở Việt Nam, một số nhà nghiên cứu
bệnh học Thủy Sản Việt Nam phân lập được Pseudomonas fluorescens gây bệnh
nhiễm trùng máu ở nhiều loài cá nước ngọt.
Ngoài ra, thường xuyên thấy vi khuẩn Pseudomonas dermoalba gây bệnh trắng
đuôi trên cá giống nước ở trên nước ta.
(Nguồn: Đỗ Thị Hoài và ctv., 2000).
2.6 Bệnh Nhiễm Khuẩn Do Vi Khuẩn Aeromonas
Nhóm vi khuẩn gây bệnh chủ yếu thuộc giống Aeromomas là A.hydrophila, A.
caviae, A.sobria. Vi khuẩn thường xuất hiện trong nước, nhất là trong nước có nhiều
chất hữu cơ. Cả cá tra và cá basa đều dễ nhiễm các loài vi khuẩn trên. Cá nhỏ dễ mẫn

cảm với bệnh hơn cá trưởng thành và bệnh có thể gây tỷ lệ chết đến 80%. Chủng
Aeromonas từ cá bệnh có độc lực cao hơn từ môi trường tự nhiên.
Cá bệnh thường thể hiện một số dấu hiệu sau:
Bệnh tích đại thể: Loét da, tưa vây, loét mắt, viêm da xuất huyết, đỏ thân, đỏ
vây, vẩy dựng ngược.
Cấp tính: nhiễm trùng gây chết cá. Cá chết nhiều, xuất huyết ngoài da, khắp cơ
thể và nội quan. Mắt cá bệnh mờ, lồi, mù, mang xuất huyết, bụng trướng to do tích
dịch trong xoang bụng, gan nhạt màu, thận sưng. Ruột sau sưng đỏ lồi ra ngoài hậu
môn. Vi khuẩn phát triển mạnh gây nhiễm trùng toàn cơ thể và hoại tử lan rộng nhiều
nội quan chủ yếu là gan và thận.
Mãn tính: Ổ viêm nhiễm xuất huyết trên da, cá chết mỗi ngày, thượng bì và hạ
bì bị tồn thương, cơ bị viêm loét. Ngoài ra, còn thấy xuất huyết điểm giác mạc và cơ
nhưng nội quan không bị hoại tử.
8


(Nguồn: Nguyễn Hữu Thịnh, 2008).
2.7 Phòng Và Trị Bệnh Do Vi Khuẩn Aeromonas Và Pseudomonas Gây Ra Trên
Cá.
Chúng ta cần hạn chế làm cá bị sây sát, phải vệ sinh ao nuôi đúng qui định để
môi trường nuôi luôn trong sạch. Bên cạnh đó không nên nuôi mật độ quá dày để
tránh gây stress cho cá. Đặc biệt cần quản lí tốt các chỉ tiêu nước như nhiệt độ, pH,
NH3, DO tạo điều kiện thích hợp để cá phát triển khỏe mạnh.
Có thể phòng bệnh bằng cách dùng thuốc tím KMnO4 tắm cá, liều dùng là 4
ppm (4 g/m3 nước) đối với cá nuôi trong ao và 10 ppm đối với cá nuôi trong bè. Xử lý
trong 3 ngày liên tục. Định kì tắm cho cá 1-2 tuần/lần hay 1 tháng/lần tùy tình trạng
sức khỏe của cá.
Khi bệnh xảy ra chúng ta giảm hoặc ngưng cho ăn để hạn chế đến mức tối đa ô
nhiễm nước. Cần vớt bỏ cá bệnh nhằm tránh lây lan bệnh. Tránh lây lan bệnh từ các
dụng cụ nuôi, chim cò, …

Dùng thuốc trộn vào thức ăn:
Oxytetracyline: 55 – 57 mg/1kg thể trọng, cho ăn 5 - 7ngày.
Streptomycin: 50 – 75 mg/kg thể trọng, cho ăn 5 - 7 ngày.
Kanamycin: 50 mg/kg thể trọng, cho ăn 7 ngày.
Nhóm sulfamid: 150 - 200mg/kg thể trọng, cho ăn 7 - 10 ngày.
Khi cá bắt đầu bắt mồi mạnh hơn, cấp kháng sinh sẽ có hiệu quả hơn nhiều.
(Nguồn: Nguyễn Hữu Thịnh (2008) và Bùi Quang Tề (2006))

9


Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 Thời Gian Và Địa Điểm Nghiên Cứu
Đề tài được tiến hành trong thời gian từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2009.
Địa điểm thu mẫu: Trại sản xuất cá giống Bình Thạnh, An Giang.
Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm Bệnh Học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản,
Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM.
3.2 Dụng Cụ Và Hóa Chất Nghiên Cứu
3.2.1 Dụng cụ
Tủ cấy vi sinh, tủ sấy, tủ ủ, nồi hấp Autoclave, máy lắc, máy Vortex.
Kính hiển vi, bộ dụng cụ tiểu phẫu, máy chụp hình.
Ống nghiệm, đĩa Petri, que cấy tròn, que cấy đâm, que trang, pippet các loại,
đầu cool, cốc thủy tinh, bình tam giác, ống đong, đèn cồn, lame, lamelle, kim tiêm 1
mL.
Bể composite 70 L, chậu, xô, ống siphon, vợt, máy sục khí, máy bơm nước,
nhiệt kế và một số dụng cụ cần thiết khác.
3.2.2 Hóa chất
Hóa chất nhuộm Gram: thuốc nhuộm Crystal Violet, dung dịch Lugol, Acool,
dung dịch Fuschin.

Hóa chất thử phản ứng Oxidase: đĩa giấy oxidase của công ty Nam Khoa hoặc
đĩa giấy có tẩm Tetramethyl – p – phenylenediamine dihydrochlorid 1% (dung dịch
không màu).
Hóa chất thử phản ứng Catalase: H2O2 30%, dung dịch đệm phosphate.
Dầu soi kính, cồn 90o, cồn 70o, thuốc mê MS 222, glycerol, …
Dung dịch nước muối sinh lý 0.9%.
Hóa chất dùng để cố định mẫu.
10


3.2.3 Hệ thống định danh
Test sinh hóa định danh vi khuẩn API 20E của công ty BioMérieux.
3.2.4 Môi trường
Môi trường BHIA (Brain Heart Infusion Agar) hoặc NA (Nutrient Agar): dùng
để phân lập vi khuẩn.
Môi trường NB (Nutrient Broth): dùng để tăng sinh vi khuẩn.
Môi trường chọn lọc Cetrimide Agar Base (Ps): dùng để phân lập Pseudomonas
sp.
Môi trường TSI (Triple sugar iron Agar): dùng để thử khả năng sử dụng đường
Glucose, Succrose, Lactose của vi khuẩn.
Môi trường O/F Basal Medium: dùng để phân biệt các vi khuẩn Gram âm
không thuộc họ vi khuẩn đường ruột với các vi khuẩn Gram âm thuộc họ
Enterobacteriaceae.

11


3.3 Phương Pháp Nghiên Cứu
Sơ đồ 3.1: Nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh trên cá
Thu mẫu cá bệnh

Giải phẫu
Gan, thận, ruột, mang, cơ
Phân lập vi khuẩn

o

24h, 30 C

Cetrimide Agar Base
(Ps)

Chọn khuẩn lạc điển hình
(tròn, trắng đục, phát quang dưới tia UV)
Cấy thuần trên môi trường NA hoặc BHIA

Nhuộm Gram

TSI

Oxidase test

Định danh test Api-20E hoặc IDS 14GNR

Gây bệnh thực nghiệm
Tái phân lập và định danh
Kết luận
12

Catalase

Di động


3.4 Phương Pháp Thu Mẫu Bệnh Phẩm
Thu thập thông tin tại vùng thu mẫu, kiểm tra chất lượng nước, nguồn nước
cấp, cống thoát, bờ ao, mật độ nuôi, thức ăn, …
Đánh giá cảm quan tình trạng sức khỏe vật nuôi, ghi lại các tập tính, biểu hiện
bất thường của cá bệnh trước khi thu mẫu.
Thu mẫu cá bệnh có biểu hiện lờ đờ, tấp bờ, sắp chết có biểu hiện bệnh lý.
3.5 Phương Pháp Khám, Mổ Và Phân Lập Vi Khuẩn Từ Bệnh Phẩm
3.5.1 Phương pháp khám và mổ cá bệnh
a/ Chuẩn bị:
Khay mổ, bộ dụng cụ mổ, đèn cồn, bông tẩm cồn 70o, đĩa thạch, que cấy vòng.
b/ Quan sát bên ngoài
Quan sát các triệu chứng lâm sàng: dị dạng thân, tiết chấy nhày, thay đổi màu
sắc bên ngoài, các vết thương trên cơ thể. Các dấu hiệu thường thấy của cá bệnh như:
mang bị nhạt màu, hoại tử, tiết nhiều nhớt, vành mắt đục, vây bị rách, bị gãy, da bị mất
nhớt, trầy xước, lở loét, ...
c/ Quan sát bên trong
Trước tiên, khử trùng dụng cụ mổ bằng cồn 90o hoặc hơ trên ngọn lửa đèn cồn.
Tiếp đến, khử trùng bề mặt cơ thể cá bằng cồn 70o dùng bông gòn lau sạch. Sau đó
tiến hành mổ cá.
Đưa mũi nhọn của kéo trước hậu môn 0,3 – 0,5 cm cắt ngược lên theo sát xoang
bụng song song với đường bên, vòng theo rìa nắp mang. Tách rời một bên xoang bụng
cho thấy nội tạng bên trong. Chú ý nâng nhẹ mũi kéo để tránh làm hỏng các cơ quan
bên trong.
Quan sát màu sắc và các dấu hiệu bất thường của cơ quan bên trong như:
-

Gan, thận, lách sưng, biến màu, viêm, loét, xuất huyết hoặc xung huyết, hoại

-

Mật sưng, tích dịch trong xoang bụng.

-

Đường ruột có màu trắng đục.

tử, …

Ghi nhận kết quả và chụp hình.

13