Phân lập, khảo sát đặc điểm sinh học và tìm hiểu khả năng sinh Enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis để sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học

iii
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
  





KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP




PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM
HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN
BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ
NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC






Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khoá: 2003 - 2007
Sinh viên thực hiện: BÙI THỊ PHI

Thành phố Hồ Chí Minh
- 2007 -

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
  





KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP




PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM
HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN
BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ
NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC

Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện
TS. NGUYỄN NGỌC HẢI BÙI THỊ PHI













Thành phố Hồ Chí Minh
- 2007 -

iii
LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến:

Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, Ban chủ nhiệm Bộ môn
Công nghệ Sinh học, cùng tất cả Qúy thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá
trình học tại trường.

TS Nguyễn Ngọc Hải, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tôi
trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này.

TS Lê Anh Phụng, BSTY Nguyễn Thị Kim Loan đã giúp đỡ và tạo mọi điều
kiện để tôi hoàn thành quá trình thực tập trong thời gian vừa qua.

Phòng Vi sinh truyền nhiễm khoa Chăn nuôi thú y đã cho phép và tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu tại phòng.

Các bạn lớp CNSH 29 đã luôn bên tôi, giúp đỡ, động viên, chia sẻ cùng tôi
trong thời gian thực tập cũng như trong suốt những năm học vừa qua.

Cha mẹ, bậc sinh thành đã sinh ra và nuôi dưỡng tôi, các anh chị em trong gia
đình luôn quan tâm, ủng hộ tôi học tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này.

Sinh viên thực hiện

Bùi Thị Phi








iv
TÓM TẮT
BÙI THỊ PHI, Đại học Nông Lâm TP.HCM. Tháng 9/2007. "PHÂN LẬP,

KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH
ENZYME (AMYLASE, PROTEASE) CỦA VI KHUẨN BACILLUS
SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC"
Giáo viên hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI
Nhằm nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm chăn nuôi và để chế
phẩm sinh học được ứng dụng rộng rãi hơn và có tác dụng tốt hơn trong chăn nuôi,
chúng tôi tiến hành các thí nghiệm về điều kiện nuôi cấy (sục khí liên tục và không
sục khí), thời gian nuôi cấy (24 giờ, 48 giờ), ảnh hưởng của các loại môi trường
nuôi cấy, ảnh hưởng của pH và thời gian nuôi cấy vi khuẩn, nhiệt độ và thời gian
bảo quản chế phẩm để khảo sát khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus
subtilis. Kết quả chúng tôi có được:
Phân lập, xác định được 10 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis.
Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy (sục khí liên tục và không sục
khí), thời gian nuôi cấy (nuôi ở 24 giờ và 48 giờ) đến khả năng sinh enzyme
(amylase, protease) của vi khuẩn Bacillus subtilis thì chế độ sục khí liên tục và nuôi
ở 48 giờ vi khuẩn sẽ phát triển và sản sinh enzyme tốt hơn.
Khảo sát ảnh hưởng của các môi trường (rỉ đường + 2% tinh bột, rỉ
đuờng + 1% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton, TSB + 1% tinh bột)
đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn thì ở môi trường rỉ đường + 2% tinh bột cho hoạt
độ enzyme tốt nhất so với 3 loại môi trường còn lại.
Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của
các chủng Bacillus subtilis thì ở pH = 7 và thời gian nuôi cấy là 48 giờ, hoạt độ
enzyme của vi khuẩn tốt nhất.
Nhiệt độ 4 - 10
0
C giữ được hoạt độ enzyme tốt hơn ở nhiệt độ 30 - 37
0
C
trong khảo sát về nhiệt độ và thời gian bảo quản chế phẩm.

v
ABSTRACT

A survey to define some culture conditions that affect on enzyme (amylase,
protease) productivity of Bacillus subtilis isolated strains was carried out and the
results had showed:
We subdivided and definned 10 strains Bacillus subtilis.
Bacillus subtilis isolated strains could produce more enzyme (amylase,
protease) in oxygen continuous supply conditions at 48 hours incubation.
The best result obtained for enzyme (amylase, protease) production with
sugar rust + 2% starch culture medium in comparing with the others (sugar rust +
1% starch, sugar rust + 1% starch + 0,5% peptone, TSB + 1% starch) and at pH = 7
for 48 hours culture.
Enzyme activity conserved better in 4 – 10
0
C than in 30 – 37
0
C.

vi
MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... iii
TÓM TẮT ................................................................................................................ iv
ABSTRACT ............................................................................................................... v
MỤC LỤC ................................................................................................................ vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG ..................................................................................... ix
DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................. x
DANH SÁCH SƠ ĐỒ .............................................................................................. xi
Chƣơng 1: MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1
1.2. Mục đích đề tài ............................................................................................. 2
1.3. Yêu cầu đề tài ............................................................................................... 2
Chƣơng 2: TỔNG QUAN ......................................................................................... 3
2.1. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis ........................................................... 3
2.1.1. Lịch sử phát hiện ................................................................................... 3
2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis ........ 3
2.1.3. Đặc điểm hình thái ................................................................................ 4
2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy ................................................................................ 4
2.1.5. Đặc điểm sinh hoá ................................................................................. 5
2.1.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis .............. 6
2.1.6.1. Cấu tạo bào tử ................................................................................ 6
2.1.6.2. Khả năng tạo bào tử ....................................................................... 6
2.1.7. Tính chất đối kháng .............................................................................. 6
2.2. Giới thiệu về enzyme amylase và enzyme protease ..................................... 7
2.3.1. Enzyme amylase ................................................................................... 7
2.3.1.1. Lịch sử nghiên cứu ........................................................................ 7
2.3.1.2. Vi sinh vật tạo amylase .................................................................. 7
2.3.1.3. Đặc tính của amylase ..................................................................... 8

vii
2.3.1.4. Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật ............................................ 10
2.3.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase ....... 10
2.3.1.6. Ứng dụng amylase vi sinh vật ..................................................... 11
2.3.2. Enzyme protease ................................................................................. 11
2.3.2.1. Nguồn thu nhận enzyme protease ................................................ 11
2.3.2.2. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật ........................... 12
2.3.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật ............................... 13
2.3.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của
vi sinh vật ..................................................................................................... 14
2.3.2.5. Ứng dụng protease vi sinh vật .................................................... 14
2.3. Giới thiệu về probiotic................................................................................ 15
2.4.1. Định nghĩa ........................................................................................... 15
2.4.2. Chức năng sinh học ............................................................................. 15
2.4.3. Một số chế phẩm probiotic thông dụng .............................................. 15
2.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm có vi khuẩn
Bacillus subtilis ..................................................................................................... 16
Chƣơng 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 18
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ....................................................... 18
3.1.1. Thời gian ............................................................................................. 18
3.1.2. Địa điểm .............................................................................................. 18
3.2. Vật liệu thí nghiệm ..................................................................................... 18
3.2.1. Đối tượng khảo sát .............................................................................. 18
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ........................................................... 18
3.2.2.1. Thiết bị ......................................................................................... 18
3.2.2.2. Dụng cụ: ...................................................................................... 18
3.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 19
3.4. Phương pháp thực hiện đề tài ..................................................................... 19
3.4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất ........................................... 19

3.4.1.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn ....................................... 19

viii
3.4.1.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis........................ 19
3.4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập được ............ 20
3.4.2. Các thí nghiệm về vi khuẩn Bacillus subtilis ...................................... 21
3.4.2.1. Ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả
năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis .......................................... 21
3.4.2.2. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn
Bacillus subtilis ............................................................................................. 22
3.4.2.3. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất
enzyme của các chủng Bacillus subtilis. ...................................................... 23
3.4.3. Thử nghiệm thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm từ Bacillus
subtilis ............................................................................................................. 25
3.4.3.1. Quy trình thực hiện ...................................................................... 25
3.4.3.2. Kiểm tra chế phẩm trong thời gian bảo quản .............................. 25
Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 26
4.1. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis ...................................... 26
4.1.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis ................ 26
4.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis .......... 26
4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa ................................................................ 27
4.2. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến
khả năng sinh enzyme amylase và protease của các chủng vi khuẩn. .................. 29
4.3. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi
khuẩn Bacillus subtilis .......................................................................................... 31
4.4. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất enzyme của các
chủng Bacillus subtilis .......................................................................................... 33
4.5. Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm sau khi sản xuất ......... 34
Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 36
5.1. Kết luận ...................................................................................................... 36

5.2. Đề nghị ....................................................................................................... 36
PHỤ LỤC .................................................................................................................. 40

ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3. 1: Bố trí thí nghiệm 1 ................................................................................... 21
Bảng 3. 2: Bố trí thí nghiệm 2 ................................................................................... 23
Bảng 3. 3: Bố trí thí nghiệm 3 ................................................................................... 24
Bảng 4.1: Kết quả thử phản ứng sinh hoá ................................................................ 29
Bảng 4.2: Kết quả thí nghiệm 1 (Bảng phụ lục 1 và 2)............................................. 29
Bảng 4. 3: Kết quả hoạt độ enzyme trung bình của 9 chủng vi khuẩn thí nghiệm ... 31
Bảng 4. 4. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn. .............. 32
Bảng 4. 5. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất .................... 33
Bảng 4.6. Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm .................................. 34

x
DANH SÁCH HÌNH

Hình 2. 1. Vi khuẩn Bacillus subtilis ......................................................................... 3
Hình 4. 1. Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus subtilis ....................................................... 26
Hình 4. 2: Đặc điểm hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis ......................................... 27

xi
DANH SÁCH SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1: Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất ................................................ 20
Sơ đồ 3.2: Định danh vi khuẩn Bacillus subtilis (theo Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006). .. 21










1
Chƣơng 1
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Ngày nay, nền kinh tế ngày càng phát triển cùng với những tiến bộ khoa
học đã làm cho cuộc sống con người có nhiều thay đổi lớn. Càng ngày đời sống tinh
thần vật chất càng cao, do đó nhu cầu về chất lượng sản phẩm cũng tăng cao đòi hỏi
những nhà sản xuất phải nâng cao chất lượng sản phẩm của mình để đáp ứng nhu
cầu của người tiêu dùng.
Với mục đích bảo vệ sức khỏe cho người sử dụng sản phẩm chăn nuôi, bảo
vệ môi trường sống không bị ô nhiễm bởi các hoá chất độc hại, người ta hạn chế
hoặc cấm sử dụng một số loại thuốc, đặc biệt là thuốc kháng sinh và thay thế thuốc
kháng sinh bằng các chế phẩm sinh học. Chế phẩm sinh học hay còn gọi là
“probiotic” bao gồm các vi sinh vật sống có lợi, có tính đối kháng cao khi
được đưa vào đường ruột sẽ tạo sự cân bằng có lợi của hệ sinh vật đường
ruột, ức chế vi sinh vật có hại, phòng bệnh tiêu chảy cho thú đặc biệt là heo
con. Ngoài ra, những chế phẩm sinh học còn cải thiện tốt quá trình tiêu hoá
(nhờ những enzyme vi sinh vật, hoặc những sản phẩm do quá trình lên men
của chúng), giúp nâng cao sức đề kháng, tăng trọng nhanh.
Từ những thực tế trên, dưới sự hướng dẫn của Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hải,
chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Phân lập, khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis và tìm hiểu
khả năng sinh enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn để sản xuất thử nghiệm chế
phẩm sinh học”.

2
1.2. Mục đích đề tài
Tìm hiểu đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis nhằm ứng dụng sản xuất
chế phẩm sinh học (probiotic), với mục đích nâng cao năng suất và tăng hiệu quả
kinh tế trong chăn nuôi.
1.3. Yêu cầu đề tài
Phân lập được loài vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất, hoặc từ chế phẩm.
Khảo sát khả năng sinh hai loại enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn
và các yếu tố ảnh hưởng.

Xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học.
Khảo sát sự thay đổi hoạt độ của enzyme chế phẩm trong thời gian
bảo quản.















3
Chƣơng 2
TỔNG QUAN
2.1. Sơ lƣợc về vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.1. Lịch sử phát hiện
Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ
chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho
các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Việc điều trị phải đợi đến những năm
1949 - 1957, khi Henrry và các cộng sự tách được chủng thuần khiết của Bacillus
subtilis. Từ đó “subtilis therapy” có nghĩa là "thuốc subtilis" ra đời trị các chứng
viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hoá. Ngày nay, vi
khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi,

thực phẩm (trích Lý Kim Hữu, 2005).
2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis
 Đặc điểm phân loại:
Theo phân loại của Bergy (1994) Bacillus subtilis thuộc:
Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
Hình 2. 1. Vi khuẩn Bacillus subtilis
www.microscopyconsulting.com/ Gallery/pages/Ba...



4
 Đặc điểm phân bố:
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc, chúng được
phân bố hầu hết trong tự nhiên. Phần lớn chúng cư trú trong đất, thông thường đất
trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc,
vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm. Nước và bùn cửa sông cũng
như ở nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus subtilis (Vũ Thị Thứ, 1996).
2.1.3. Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, G
+
, kích thước
0,5 - 0,8 m x 1,5 – 3 m, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động,
có 8 - 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế
bào, kích thước từ 0,8 - 1,8 m. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của
bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng
xạ (Tô Minh Châu, 2000).
2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy

 Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu là 37
0
C
 Nhu cầu O
2
: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả năng
phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy.
 Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0 - 7,4.
 Môi trường
Môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều,
có tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm. Sau 1 - 4 ngày bề mặt nhăn
nheo, màu hơi nâu.
Môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa nhăn gợn sóng.
Môi trường gelatin: phát triển và làm tan chảy gelatin.
Thạch khoai tây: phát triển đều, màu vàng lấm tấm hạt.
5
Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo
màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, lắc lên khó tan đều.
2.1.5. Đặc điểm sinh hoá
Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, mannitol,
saccharose, xylose, arabinose.
Indol (-), VP (+), Nitrat (+), H
2
S (-), NH
3
(+), catalase (+), amylase (+),
casein (+), citrat (+), di động (+), hiếu khí (+).
Phản ứng sinh hoá Kết quả
Hoạt tính catalase +
Sinh indol -

MR +
VP +
Sử dụng citrate +
Khử nitrate +
Tan chảy gelatin +
Di động +
Phân giải tinh bột +
Arabinose +
Xylose +
Saccharose +
Mannitol +
Glucose +
Lactose -
Maltose +

(Theo Holt, 1992) (trích Lý Kim Hữu, 2005).
6
2.1.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.6.1. Cấu tạo bào tử
Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, dưới lớp màng là vỏ. Vỏ bào tử có
nhiều lớp. Đây là những lớp có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các
chất hoà tan trong nước. Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là
một khối tế bào chất đồng nhất. Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi
chất, vì vậy có thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm (Lê Đỗ Mai Phương, 2004).
Bào tử khác tế bào dinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hoá học và tính chất sinh lý.
2.1.6.2. Khả năng tạo bào tử
Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo
bào tử trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis có khả năng hình thành
bào tử theo chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi
(dinh dưỡng trong môi trường bị kiệt quệ) (Tô Minh Châu, 2000).

Sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất.
Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập
trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc lại và tạo
thành tiền bào tử (Prospore). Tiền bào tử bắt đầu được bao bọc dần bởi các lớp
màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào
dinh dưỡng tự phân giải và bào tử được giải phóng khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều
kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nước và bị trương ra. Sau đó, vỏ của chúng bị phá huỷ
và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ tạo ra
một bào tử (Lê Đỗ Mai Phương, 2004).
2.1.7. Tính chất đối kháng
Với vi sinh vật gây bệnh, mỗi loài sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều
kiện môi trường khác nhau, sinh khuẩn lạc khác nhau. Thay đổi môi trường hoặc
các yếu tố môi trường bất lợi là làm thay đổi điều kiện sống, làm hạn chế hoặc ức
chế sự phát triển của vi sinh vật. Thực tế khi môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự
hiện diện của Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ xảy ra sự cạnh tranh dinh

7
dưỡng. Cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát
triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi
trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức
chế (Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Thuận, 1976).
2.2. Giới thiệu về enzyme amylase và enzyme protease
2.3.1. Enzyme amylase
2.3.1.1. Lịch sử nghiên cứu
Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzyme nói chung và về enzyme
amylase nói riêng được bắt đầu vào những năm 1811 – 1814. Những nghiên cứu
này gắn liền với tên tuổi của nhà bác học người Nga – Viện sĩ K.S Kirhof. Ông
nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết đại mạch nảy mầm
(malt) và nhận thấy rằng trong malt có chứa các chất phân giải tinh bột thành đường.
Các enzyme amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật,

trong hạt nẩy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Theo tính chất và phương
pháp tác dụng lên tinh bột người ta phân biệt α-amylase, β-amylase, gluco-amylase
(γ-amylase), oligo- 1,6 -glucoxydase (dextrinase).
2.3.1.2. Vi sinh vật tạo amylase
Vi sinh vật tạo amylase được dùng nhiều hơn cả đó là nấm mốc, nấm men
và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn. Để thu amylase người ta thường dùng các
giống vi sinh vật sau:
Nấm mốc: Aspergillus, Rhizopus.
Nấm men: Candida, Saccharomyces, Endomycopsis, Endomyces (Gratrova, 1975;
Conovalov, 1972; Fukumoto, 1962; Hattori, 1961).
Vi khuẩn: Bacillus mesentericus, B. subtilis, B. macecassavanum, Clostridium
acetobutylium, Penicillium saccharophila,… Các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh
trưởng nhanh (4 – 6 lần so với vi khuẩn ưa ẩm) và phát triển tốt ở nhiệt độ tương
đối cao, nên khi nuôi chúng ở nhiệt độ cao ít bị nhiễm vi sinh vật khác.
Trong số vi khuẩn ưa ấm tạo amylase mạnh, thì Bacillus subtilis được nghiên cứu

8
và sử dụng rộng rãi nhất. Riêng ở Nhật, hàng năm người ta sản xuất tới hàng chục
nghìn tấn chế phẩm amylase và protease từ loài vi khuẩn ưa ấm và hiếu khí này.
Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của Bacillus subtilis là 37
0
C.
2.3.1.3. Đặc tính của amylase
Hiện nay người ta đã biết rõ có 6 loại enzyme amylase trong đó α-amylase,
β-amylase, gluco-amylase (γ-amylase) thủy phân các liên kết α – 1,4 - glucoside của
tinh bột và các polysaccharide; 3 amylase còn lại (dextrine – 6 - glucanhidrolase,
amilopectin - 6 - glucanhidrolase, oligodexin - 6 - glucanhidrolase hay dextrinase)
thuỷ phân các liên kết α – 1,6 - glucoside trong polysaccharide và các dextrin cuối.
Các enzyme amylase có nguồn gốc khác nhau thì thường khác nhau về tính
chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thuỷ phân.

 α-amylase:
α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α – 1,4 - glucoside nằm ở phía
bên trong phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen và polysaccharide) một cách ngẫu
nhiên, không theo một trật tự nào. Khi tác dụng lên tinh bột, enzyme này giải phóng
ra glucose ở dạng α- mutamer, nên năm 1924 Kuhn gọi nó là α-amylase.
α-amylase không chỉ thuỷ phân hồ tinh bột mà nó thuỷ phân cả hạt tinh bột
còn nguyên, song với tốc độ rất chậm. Dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể
chuyển thành maltotrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên,
α-amylase thường thuỷ phân tinh bột thành dextrin phân tử thấp không cho màu với
iod và một ít maltose, do đó α-amylase có tác dụng làm giảm độ nhớt của hồ tinh
bột rất mạnh (dịch hoá).
Tinh bột α-amylase α- dextrin + maltose + glucose
(hoặc glucogen) (nhiều) (ít)
α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng,
α -amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác. Tất cả các α-amylase đều bị
kiềm hãm bởi kim loại nặng như: Cu
2+
, Ag
+
, Hg
2+
. So với α-amylase của nấm mốc,
amylase của vi khuẩn có hoạt lực dextrin hoá trội hơn hoạt lực đường hóa.

9
α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị vỡ, còn
α-amylase vi khuẩn lại có khả năng phân huỷ các hạt tinh bột còn nguyên lẫn hồ
tinh bột (Popadicts và cộng sự, 1971). Amylase của Bacillus subtilis phân giải tinh
bột còn nguyên 2 – 2,5 lần nhanh hơn so với α-amylase của nấm mốc (Lixiuk và
Popadicts, 1969) (trích Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005).

Vận tốc phân hủy tinh bột bởi α amylase vi khuẩn ở giai đoạn đầu cao hơn
α–amylase của Aspergillus oryzae tới 25%.
pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm mốc là 4,5 – 4,8; của
vi khuẩn là 5,8 – 6,0 (hoạt động tốt trong vùng pH: 5,8 – 7,0).
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α–amylase là 50
0
C.
Amylase của vi khuẩn có thể chịu được nhiệt độ 92
0
C, trong khi đó amylase
của nấm mốc bị vô hoạt ở 70
0
C. Tính bền nhiệt cao của α–amylase vi khuẩn là một ưu
điểm lớn: được sử dụng để xử lý nguyên liệu ở các công đoạn phải dùng nhiệt cao.
 β-amylase
β-amylase không thủy phân hạt tinh bột nguyên mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột.
β-amylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết α – 1,4 - glucan trong tế bào.
β-amylase chỉ phổ biến trong giới thực vật (có nhiều trong các hạt nảy
mầm). Vi khuẩn không có β-amylase.
 Glucoamylase
Glucoamylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết α – 1,4 và α – 1,6 - glucan
trong polysaccharide.
Glucoamylase có khả năng thuỷ phân hòan toàn tinh bột, glucogen,
amylopeptin, panose, isomantose và mantose tới glucose.
Đa số glucoamylase đều thuộc loại enzyme acid, thể hiện hoạt lực tối đa ở
vùng pH 3,5 – 5.
Glucoamylase bền với acid nhưng lại kém bền với tác dụng của rượu
etylic, aceton.

10

2.3.1.4. Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật
Khi nuôi vi sinh vật tạo amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với
nhau: quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích tụ enzyme trong tế
bào hay ngoài môi trường.
Amylase của Bacillus subtilis được tạo thành ở vi khuẩn trong giai đoạn đã
hoặc đang kết thúc quá trình sinh trưởng. Cả trong môi trường nuôi cấy lẫn trong
bản thân tế bào vi khuẩn “ trẻ ” đều không tìm thấy amylase. Amylase ngoại bào
được tổng hợp ở tế bào đang chuyển sang thời kỳ tự phân.
2.3.1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase
 Ảnh hưởng của thành phần môi trường:
Ảnh hưởng của nguồn cacbon dinh dưỡng: Các nguồn cacbon và năng
lượng dễ hấp thu có tác dụng kiềm hãm sinh tổng hợp amylase (nồng độ tinh bột tối
thích trong nuôi cấy chìm là 0,5 – 0,7%). Để có hoạt lực α–amylase cao cần 6% tinh
bột, oligo – 1,6 – glucozidase cần 2% tinh bột.
Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng: Cho nguồn nitơ nhất định vào môi
trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác.
Nguồn nitơ hữu cơ: gelatin, casein, nước chiết ngô.
Ảnh hưởng của acid amin: Acid amin có ảnh hưởng tốt tới sinh lí của vi
sinh vật tạo enzyme amylase do: acid amin có thể đồng thời vừa là nguồn cacbon,
nitơ, vừa là nguồn năng lượng; một số acid amin riêng rẽ đóng vai trò quan trọng
trong sinh tổng hợp nhiều acid amin khác và trong quá trình chuyển hoá amin.
Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng: Các nguyên tố đa lượng và vi
lượng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và tổng hợp các enzyme amylase của vi
sinh vật.
Mg
2+
ảnh hưởng đến độ bền của enzyme.
Photpho ảnh hưởng trực tiếp đến sinh sản của nấm mốc và của vi sinh vật khác.
Ca
2+

cần cho tổng hợp và ổn định α–amylase hoạt động bảo vệ amylase
khỏi tác động của protease.

11
Lưu huỳnh kích thích sự tạo amylase.
Coban kích thích tổng hợp amylase.
Mangan, đồng, thuỷ ngân kiềm hãm sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật.
 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp amylase:
Ảnh hưởng của pH môi trường: pH ban đầu của môi trường có ảnh hưởng
không nhỏ tới sự tạo thành amylase. Việc lựa chọn giá trị pH ban đầu căn cứ vào
đặc tính của chủng vi sinh vật. pH môi trường để nuôi Bacillus subtilis nhằm thu α–
amylase thích hợp nhất là 6,8 – 7,5 còn để tổng hợp protease là 7,0 – 7,8.
Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ nuôi cũng là yếu tố quan trọng đối với
sinh trưởng của vi sinh vật và tạo thành các enzyme amylase.
Độ thông khí: việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt tới sự
sinh trưởng và tích lũy sinh khối cũng như tổng hợp các enzyme của vi sinh vật.
2.3.1.6. Ứng dụng amylase vi sinh vật
Các amylase vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác
nhau như: công nghiệp rượu bia (thay thế một phần mầm đại mạch), công nghiệp
nước chấm, công nghiệp sản xuất glucose, thuốc hỗ trợ tiêu hoá tinh bột, công
nghiệp bánh mì (nâng cao chất lượng bánh), công nghiệp chế biến rau quả, bổ sung
vào khẩu phần chăn nuôi.
2.3.2. Enzyme protease
2.3.2.1. Nguồn thu nhận enzyme protease
Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này có
thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc tiết vào môi trường nuôi cấy (protease
ngoại bào). Cho đến nay protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn nhiều so với
protease nội bào. Một số protease ngoại bào được sản xuất trong quy mô công
nghiệp và sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, trong nông
nghiệp, y học.

Các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease như: Bacillus subtilis,
Bacillus cereus, xạ khuẩn: Streptomyces griseus, Streptomyces rimosus,…và một số
loài nấm mốc: Aspergillus oryzae, Aspergillus niger… (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

12
2.3.2.2. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật
Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nòi vi
sinh vật cũng có thể khác nhau về tính chất. Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt
động thích hợp, … các nhà khoa học đã phân loại các protease vi sinh vật thành bốn
nhóm như sau:
Protease – xerin
Protease – tiol
Protease – kim loại
Protease – acid
Một số tác giả khác chia protease ra làm ba nhóm dựa vào pH hoạt động của
chúng bao gồm:
Protease acid: pH < 3 được ứng dụng trong sản xuất bia và công nghiệp
bánh kẹo.
Protease trung tính: protease trung tính là metalloenzyme, chúng có pH
hoạt động 6 – 7, chúng thường được sản xuất từ Bacillus subtilis, Bacillus
thermoproteolyticus.
Protease kiềm: chúng có khoảng pH hoạt động 9 – 11, trong trung tâm
hoạt động của chúng có serin.
Trong bốn nhóm kể trên, các protease - serin và protease – tiol có khả năng
phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của amino acid.
Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase
và amidase đối với dẫn xuất của aminoacid.
Các protease – serin có trọng lượng phân tử vào khoảng 20000 – 27000
dalton, trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với protease –serin
vào khoảng 33800 – 48400 dalton. Protease – tiol và nhiều protease – acid cũng có

trọng lượng phân tử vào khoảng 30000 – 40000 dalton.
Trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật ngoài gốc amino acid đặc
trưng cho từng nhóm còn có một gốc amino acid khác. Ví dụ histidin thường tham
gia trong trung tâm hoạt động của các protease – serin, protease – tiol còn tyrosin là

13
trung tâm hoạt động của các protease kim loại. Mặc dù trung tâm hoạt động của các
protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng
thuỷ phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau:
E + S E – S E – S
*
+ P
1
E + P
2

Trong đó:
E – là enzyme, S – là cơ chất.
E – S : là phức chất enzyme – cơ chất
E – S
*
: là phức chất trung gian enzyme – cơ chất hoá (axilenzyme)
P
1
: là sản phẩm đầu tiên của phản ứng (với nhóm amin tự do mới
được tạo thành)
P
2
: là sản phẩm thứ hai của phản ứng (với nhóm carboxyl tự do mới
được tạo thành).

2.3.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật
Theo nhiều tác giả protease ngoại bào và protease nội bào của vi sinh vật có
thể có những vai trò khác nhau đối với hoạt động sống của vi sinh vật.
Protease ngoại bào: phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác có
trong nhiều dung dịch thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật dễ dàng hấp thụ.
Protease nội bào : cho đến nay các protease nội bào còn đang được nghiên
cứu và cũng chưa biết rõ vai trò của chúng trong tế bào. Theo Hiroishi (1976), các
protease nội bào có thể có vai trò quan trọng hơn protease ngoại bào, chúng có thể
hoàn thành một số chức năng sau:
Phân giải các peptide được đưa từ môi trường ngoài vào thành các acid
amin để tổng hợp protein trong tế bào hoặc đôi khi dùng làm nguồn C, N, S.
Tham gia trong quá trình cải tiến một số phân tử protein, enzyme, điều này
có thể có ‎ nghĩa đối với việc hình thành và nảy mầm của bào tử vi sinh vật.
Protease nội bào cũng có thể tham gia trong việc hoàn thiện chuỗi
polypeptide đã được tổng hợp (Waller, 1963 ; Pine, 1969). Ngoài ra, protease nội
bào cũng có thể có tác dụng phân huỷ các protein vô dụng tổng hợp sai do đột biến,

14
hoặc cũng có thể tham gia vào quá trình sinh trưởng của vi sinh vật (trích Lê Minh
Cẩm Ngọc, 2005).
2.3.2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi
sinh vật
Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh
vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như : ẩm độ, nhiệt độ, pH, độ thông
thoáng, thành phần môi trường...
Ảnh hưởng của nhiệt độ : nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng
sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật cũng như tính chất của enzyme được tổng
hợp. Mỗi loại vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp có khác nhau. Tuy nhiên, đa số các
vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme không bền với nhiệt độ và bị kiềm hãm nhanh
chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp.

Ảnh hưởng của pH môi trường : khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt,
pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp enzyme ở vi sinh vật, hơn nữa
pH môi trường hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật.
Ngược lại, trong phương pháp bề sâu pH môi trường ảng hưởng rất lớn đến sự tích
luỹ protease trong môi trường.
Độ thông khí : độ thông khí trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá
trình sinh tổng hợp protease. Tuy nhiên, ảnh hưởng này có khác nhau tuỳ theo giống
vi sinh vật.
Ảnh hưởng thành phần môi trường : thành phần môi trường có ảnh hưởng
rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Để tăng lượng enzyme trong môi
trường cần lựa chọn nguồn C, N, muối khoáng thích hợp.
2.3.2.5. Ứng dụng protease vi sinh vật
 Trong công nghiệp: protease được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp
thực phẩm khác nhau và một số ngành công nghiệp nhẹ như : ngành chế biến cá,
thịt, sữa, làm bánh mì, nước giải khát, thuộc gia, dệt, phim ảnh.... Ngoài ra protease
còn được sử dụng bổ sung vào các loại xà phòng, kem đánh răng, kem bôi mặt, ...