ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN CỦA VACCINE THỬ NGHIỆM PHÒNG BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN CỦA VACCINE THỬ NGHIỆM
PHÒNG BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus)

Họ và tên sinh viên: ĐẶNG KHOA NGUYÊN
Ngành: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
Chuyên ngành: NGƯ Y
Niên khóa: 2005-2009

Tháng 9/2009


ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN CỦA VACCINE THỬ NGHIỆM PHÒNG BỆNH
GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus)
Tác giả

ĐẶNG KHOA NGUYÊN

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư
ngành Nuôi Trồng Thủy Sản, chuyên ngành Ngư Y

Giáo viên hướng dẫn:
TS. NGUYỄN HỮU THỊNH

Tháng 9 năm 2009

i


CẢM TẠ

Tôi xin cảm ơn:
Gia đình và những người thân đã luôn ủng hộ và động viên tôi cả về vật chất và
tinh thần trong suốt quá trình học tập.
Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM.
Ban chủ nhiệm khoa thủy sản cùng toàn thể quý thầy cô đã giảng dạy và cung
cấp kiến thức cho tôi trong quá trình học tập.
Và đặc biệt là thầy Nguyễn Hữu Thịnh người đã cung cấp kiến thức và trực tiếp
hướng dẫn để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Thầy Trần Hữu Lộc, anh Nguyễn Viết Phương và bạn Vũ Thị Mộng Huyền
những người đã giúp tôi hoàn thành đề tài.
Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn đến các bạn lớp DH05NY và các bạn khóa 31
đã động viên và giúp đỡ chúng tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Dù đã cố gắng nhưng do hạn chế về thời gian cũng như về mặt kiến thức nên
luận văn này không tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong nhận được những ý kiến
đóng góp của quý thầy cô và các bạn để luận văn được hoàn chỉnh hơn.

ii


TÓM TẮT
Đề tài “Đánh giá độ an toàn của vaccine thử nghiệm phòng bệnh gan thận mủ
trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” được thực hiện từ ngày 10/04/2009 10/08/2009 tại trại thực nghiệm Khoa Thủy Sản và phòng thí nghiệm Bệnh Học Thủy
Sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
Đề tài được thực hiện để đánh giá độ an toàn của vaccine thử nghiệm đối với cá
tra bột và cá tra giống bằng phương pháp ngâm ở các nồng độ khác nhau kết hợp với

cho ăn và đánh giá khả năng bảo hộ miễn dịch đối với bệnh gan thận mủ trên cá tra
Chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm 2 lần.
Lần 1: để xác định nồng độ an toàn của vaccine thử nghiệm đối với cá bột 4
và 5 ngày tuổi. Cá tra bột 4 và 5 ngày tuổi sẽ được ngâm vaccine pha loãng trong nước
với tỉ lệ 1:9 ở mỗi nghiệm thức có 300 cá tra bột và được lập lại 3 lần. Cá ở nghiệm
thức cấp vaccine sẽ được ngâm vaccine trong 3 giờ, theo dõi và quan sát biểu hiện của
cá thử nghiệm liên tục trong 3 giờ và ghi nhận kết quả và so sánh với cá ở nghiệm thức
đối chứng. Kết quả cho thấy ngâm ở tỉ lệ 1 : 9 trong 3 giờ vaccine thử nghiệm có ảnh
hưởng tới cá bột 4 và 5 ngày tuổi với tỉ lệ chết cao 86,5% và 93,8 % trong khi ở
nghiệm thức đối chứng tỉ lệ chết là 0,9% và 0% trong cùng điều kiện.
Lần 2: xác định độ an toàn của vacccine thử nghiệm trên cá tra giống 5g.
Cá tra giống 5g sẽ được ngâm vaccine pha loãng trong nước với tỉ lệ 1 : 90 ở mỗi
nghiệm thức có 100 con với 3 lần lập lại. Cá được ngâm trong 15 phút và thực hiện
liên tục trong 3 ngày. Sau đó cá ở các nghiệm thức ngâm vaccine sẽ được cho ăn thức
ăn có trộn vaccine thử nghiệm dạng cho ăn liên tục trong 4 tuần rồi ngưng trộn
vaccine, cho cá ăn thức ăn bình thường thêm 2 tuần. Tiến hành gây bệnh để đánh giá
khả năng bảo hộ miễn dịch của vaccine thử nghiệm. Kết quả cho thấy vaccine thử
nghiệm hoàn toàn an toàn với cá 5g và khả năng bảo hộ miễn dịch trung bình là
45,7%.

iii


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa..................................................................................................................i
Cảm tạ.....................................................................................................................ii
Tóm tắt...................................................................................................................iii
Mục lục ..................................................................................................................iv
Danh sách các chữ viết tắt .....................................................................................ix

Danh sách các bảng ................................................................................................ x
Danh sách các hình ................................................................................................xi
Danh sách các sơ đồ và đồ thị ..............................................................................xii
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU ........................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề......................................................................................................... 1
1.2 Mục Tiêu Đề Tài .............................................................................................. 2
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN ................................................................................ 3
2.1 Tổng quan về việc sử dụng vaccine trong nuôi trồng thủy sản........................ 3
2.1.1 Định nghĩa về vaccine ................................................................................... 3
2.1.2 Lịch sử phát triển của vaccine trong nuôi trồng thủy sản ............................. 3
2.1.3 Phân loại vaccine ........................................................................................... 4
2.1.3.1 Vaccine vô hoạt (Inactivated)..................................................................... 4
2.1.3.2 Vaccine hỗn hợp......................................................................................... 4
2.1.3.3 Vaccine sống (Live Attenuated)................................................................. 4
2.1.3.4 Vaccine tiểu phần (recombinant)................................................................ 4
iv


2.1.3.5 DNA vaccine .............................................................................................. 5
2.1.4 Phương pháp sử dụng vaccine....................................................................... 5
2.1.4.1 Phương pháp ngâm .................................................................................... 5
2.1.4.2 Phương pháp tiêm....................................................................................... 6
2.1.4.3 Phương pháp cho ăn .................................................................................. 6
2.1.4.4 Phương pháp nhúng ................................................................................... 6
2.1.4.5 Bơm cao áp ................................................................................................ 6
2.1.4.6 Bơm vào đường ruột .................................................................................. 6
2.1.5 Vai trò của việc sử dụng vaccine trong nuôi trồng thủy sản ......................... 7
2.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của vaccine dùng trong thủy sản.......... 8
2.1.6.1 Yếu tố di truyền .......................................................................................... 8
2.1.6.2 Tình trạng của đối tượng được cấp vaccine ............................................... 8

2.1.6.3 Các yếu tố môi trường ................................................................................ 8
2.1.6.4 Trình độ kỹ thuật của người sử dụng ......................................................... 8
2.1.7 Nguyên tắc sử dụng vaccine ......................................................................... 8
2.1.8 Đánh giá hiệu quả của sử dụng vaccine ........................................................ 9
2.2 Bệnh Gan Thận Mủ Trên Cá Tra...................................................................... 9
2.2.1 Lịch sử bệnh do Edwardsiella ictaluri ........................................................ 10
2.2.2 Tác nhân gây bệnh....................................................................................... 10
2.2.2.1 phân loại ................................................................................................... 10
2.2.2.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri................ 11
2.2.2.3 Đặc điểm gây bệnh .................................................................................. 11
2.2.3 Đường lây truyền của E. ictaluri ................................................................ 12
2.2.4 Chẩn đoán .................................................................................................... 12
2.2.5 Triệu chứng.................................................................................................. 12
v


2.2.6 Bệnh tích...................................................................................................... 13
2.2.7 Phòng và trị bệnh......................................................................................... 13
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................... 14
3.1 Thời Gian và Địa Điểm Thực Hiện ................................................................ 14
3.2 Vật Liệu Nghiên Cứu ..................................................................................... 14
3.2.1 Dụng cụ........................................................................................................ 14
3.2.2 Hóa chất và môi trường ............................................................................... 14
3.3 Đối Tượng Nghiên Cứu.................................................................................. 14
3.3.1 Chế phẩm..................................................................................................... 14
3.3.2 Cá thí nghiệm .............................................................................................. 15
3.3.3 Vi khuẩn thí nghiệm .................................................................................... 15
3.4 Phương Pháp Nghiên Cứu .............................................................................. 15
3.4.1Phương pháp chuẩn bị để đánh giá độ an toàn của vaccine thử nghiệm ..... 15
3.4.2 Phương pháp chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn ............................................... 16

3.4.3 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn sống ................................ 17
3.4.4 Phương pháp gây nhiễm thực nghiệm......................................................... 17
3.4.5 Phương pháp theo dõi cá sau khi gây nhiễm ............................................... 18
3.4.6 Phương pháp cấy phân lập vi khuẩn từ cá bệnh .......................................... 18
3.4.7 Phương pháp cấy thuần ............................................................................... 19
3.4.8 Phương pháp định danh ............................................................................... 19
3.4.8.1 Phương pháp nhuộm Gram....................................................................... 20
3.4.8.2 Thử nghiệm về khả năng di động của vi khuẩn bằng cách xem trực tiếp
dưới kính hiển vi ........................................................................................ 21
3.4.8.3 Thử nghiệm catalase................................................................................ 21
3.4.8.4 Thử nghiệm Oxidase ................................................................................ 21
vi


3.4.8.5 Thử nghiệm LDC và di động bằng kit định danh IDS 14 GNR............... 21
3.4.9 Phương pháp kiểm tra kí sinh trùng của cá ................................................. 22
3.4.10 Phương pháp thí nghiệm ........................................................................... 23
3.4.10.1 Đánh giá độ an toàn của vaccine thử nghiệm ........................................ 23
3.4.10.2 Đánh giá khả năng bảo hộ miễn dịch của vaccine thử nghiệm đối với
vi khuẩn Edwardsiela ictaluri ................................................................. 25
3.4.11 Phương pháp xử lí số liệu........................................................................ 26
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................... 27
4.1. Các chỉ tiêu môi trường ................................................................................. 27
4.1.1 Đối với cá bột .............................................................................................. 27
4.1.2 Đối với cá 5g ............................................................................................... 28
4.2 Kết quả kiểm tra để đánh giá độ an của vaccine thử nghiệm......................... 29
4.2.1 Kết quả kiểm tra sức khỏe cá nuôi trong quá trình thí nghiệm ................... 29
4.2.2 Kết quả tỷ lệ sống của cá trong quá trình cấp vaccine thử nghiệm ............ 31
4.2.2.1 Đối với cá bột ........................................................................................... 31
4.2.2.2 Đối với cá 5g ............................................................................................ 33

4.2.3 Kết quả kiểm tra tăng trọng ......................................................................... 34
4.2.4 Kết quả kiểm tra về lượng thức ăn .............................................................. 34
4.3 Kết quả đánh giá khả năng bảo hộ miễn dịch của vaccine thử nghiệm đối với
bệnh gan thận mủ trên cá tra. ....................................................................... 35
4.3.1 Số lượng vi khuẩn có trong bình tăng sinh gốc và lượng vi khuẩn sống
có trong dung dịch gây nhiễm cho cá........................................................... 35
4.3.2 Kết quả quá trình phân lập và định danh vi khuẩn .................................... 35
4.3.3 Tỷ lệ cá chết ở các nghiệm thức .................................................................. 37

vii


4.3.4 Hiệu quả bảo hộ miễn dịch của vaccine thử nghiệm ở các lô
nghiệm thức ............................................................................................... 42
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................... 44
5.1 Kết Luận ......................................................................................................... 44
5.2 Đề Nghị........................................................................................................... 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BHIA

Brain Heart Infusion Agar

BHIB

Brain Heart Infusion Broth

CFU

Colony forming unit

ctv

Cộng tác viên

DO

Dissolve Oxygen

FAO

Food and Agriculture Organization

FKC

Formaline Killed Cell

Ig

Immunoglobulin

ImP

Immersion protein

LDC

Lysin decarboxylase

NTTS

Nuôi trồng thủy sản

ONPG

O-Nitrophenyl β – D Galactopyrannoside

OrP

Oral protein

PAD

Phenyl Alanin Deaminnase

PCA

plate count Agar

RPS

Relative Percent Survival

VP

Voges – Poskauer

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng
Bảng 3.1: Số thứ tự các đĩa giấy trong các giếng................................................. 20
Bảng 4.1: Các chỉ tiêu môi trường trong bể ương................................................ 27
Bảng 4.2: Các chỉ tiêu môi trường trong quá trình nuôi thí nghiệm. ................... 28
Bảng 4.3: Các chỉ tiêu môi trường trong quá trình gây bệnh thực nghiệm trong
phòng lạnh. .................................................................................................. 29
Bảng 4.4: Bảng kiểm tra sức khỏe cá nuôi trong suốt quá trình thí nghiệm. ....... 30
Bảng 4.5: Số lượng và tỉ lệ cá chết trong quá trình cấp vaccine thử nghiệm ở
cá bột 4 ngày tuổi. ....................................................................................... 31
Bảng 4.6: Số lượng và tỉ lệ cá chết trong quá trình cấp vaccine thử nghiệm ở
cá bột 5 ngày tuổi. ....................................................................................... 31
Bảng 4.7 Số lượng cá chết trung bình trong quá trình cấp vaccine thử nghiệm
dạng cho ăn.................................................................................................. 33
Bảng 4.8 Trọng lượng trung bình của cá trước và sau khi tiến hành
thí nghiệm..................................................................................................... 34
Bảng 4.9: Lượng thức ăn trung bình của cá ở các lô nghiệm thức
và đối chứng. ............................................................................................... 34
Bảng 4.10: Kết quả các phản ứng sinh hóa của E. ictaluri................................... 37
Bảng 4.11: Tỷ lệ chết trung bình của các lô thí nghiệm khi gây nhiễm............... 41
Bảng 4.12: Khả năng bảo hộ miễn dịch RPS (%) của các nghiệm thức khi
gây nhiễm. .................................................................................................. 43
x

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình
Hình 3.1: Đếm số lượng cá bột cho vào các vèo.................................................. 16
Hình 3.2: Số lượng khuẩn lạc trên đĩa cấy phù hợp ở độ pha loãng 10-7 .................... 17
Hình 3.3: Gây bệnh cho cá bằng phương pháp ngâm .......................................... 18
Hình 3.4: Vèo chứa cá bột 4 ngày tuổi................................................................. 24
Hình 3.5: Cá được bố trí để chuẩn bị gây bệnh.................................................... 26
Hình 4.1: Quá trình ngâm cá bột trong phòng lạnh.............................................. 27
Hình 4.2: Hệ thống bể composite bố trí thí nghiệm. ............................................ 28
Hình 4.3: Sán lá đơn chủ kí sinh trên mang cá..................................................... 29
Hình 4.4: Cá bột 4 ngày tuổi đang ngâm trong vaccine ....................................... 32
Hình 4.5: Cấp vaccine thử nghiệm dạng ngâm cho cá 5g .................................... 33
Hình 4.6: Số lượng khuẩn lạc ở độ pha loãng 10-7 ............................................... 35
Hình 4.7: Khuẩn lạc Edwardsiella ictaluri trên môi trường BHIA sau 48 giờ
ở 30oC.......................................................................................................... 36
Hình 4.8: Gan, thận bị hoại tử của cá ở lô đối chứng vào ngày thứ 5
gây bệnh ....................................................................................................... 39
Hình 4.9: Kết quả định danh vi khuẩn từ cá bệnh ................................................ 39
Hình 4.10: Thận, gan của cá tra thí nghiệm bị hoại tử vào ngày thứ 7 ở
lô NT2. ......................................................................................................... 40
Hình 4.11: Gan, thận, lách và tụy tạng cá tra bị hoại tử nặng vào ngày thứ 8 ở
lô ĐC3. ........................................................................................................ 41

xi


DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ
Sơ đồ

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ tóm tắc bố trí thí nghiệm........................................................... 23
Đồ thị
Đồ thị 4.1: Tỉ lệ cá chết tích lũy trung bình ở các nghiệm thức qua 14 ngày
gây nhiễm. ................................................................................................... 38
Đồ thị 4.2: Tỷ lệ % trung bình cá chết của các lô thí nghiệm trong quá trình
gây nhiễm. ................................................................................................. 42

xii


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề.
Thủy sản là ngành có nhiều thế mạnh ở nước ta hiện nay, và là một trong ba
ngành có đóng góp lớn nhất cho kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam. Cùng với sự phát
triển của ngành thủy sản, đóng góp của nuôi trồng thủy sản ngày càng tăng do sản
lượng khai thác thủy sản trong những năm gần đây không tăng đáng kể. Với các đối
tượng xuất khẩu chính của nghề NTTS thì tôm sú vẫn là đối tượng có đóng góp cao
nhất cho tổng giá trị xuất khẩu của Việt Nam, tiếp theo đó là cá tra và cá Basa với sản
lượng 1,452 tỷ USD, chiếm 32,2 % tổng giá trị xuất khẩu thuỷ sản (4,509 tỷ USD)
năm 2008.
Bên cạnh sự phát triển nhanh chóng của nghề nuôi ven biển và nghề nuôi biển thì
nghề nuôi cá nước ngọt vẫn khẳng định được vai trò của mình. Với lịch sử lâu đời của
nghề nuôi cá nước ngọt và những đối tượng nuôi có giá trị cao và nhu cầu lớn trên thị
trường như cá tra và basa, nghề nuôi thủy sản nước ngọt vẫn là một trong những nghề
mũi nhọn của NTTS tại Việt Nam.
Cùng với sự phát triển của nhiều hình thức nuôi thì vấn đề dịch bệnh đã trở thành
một trong những trở ngại chính cho sự phát triển bền vững của NTTS nước ngọt Việt
Nam. Ví dụ như bệnh gan thận mủ trên cá tra và basa đã gây thiệt hại không nhỏ cho
sự phát triển của đối tượng này. Hiện nay việc phòng trị bệnh trên cá nước ngọt ở nước

ta vẫn chủ yếu dựa vào sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất. Hiện chưa có một loại
vaccine phòng bệnh cho cá được đưa vào sử dụng tại Việt Nam. Việc phòng trị bệnh
phụ thuộc vào các loại thuốc kháng sinh và hóa chất gần đây đã khiến cho việc xuất
khẩu thủy sản của Việt Nam gặp nhiều khó khăn. Ví dụ cụ thể đó là việc cấm sử dụng
chloramphenicol, flomequine và xanh malachite đã ảnh hưởng lớn cho nghề xuất khẩu
cá tra và basa của Việt Nam. Vì vậy việc nghiên cứu, phát triển các phương pháp

1


phòng bệnh có hiệu quả như sử dụng các loại thảo dược và vaccine cho cá nước ngọt
là cần thiết nhằm đảm bảo cho sự phát triển bền vững của nghề.
Vì cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) là đối tượng có sản lượng lớn nên
đã thu hút được nhiêu công ty sản xuất vaccine trên thế giới đầu tư nghiên cứu vào
lĩnh vực này. Nhưng ngoài việc đánh giá hiểu quả bảo hộ miễn dịch thì vaccine cần
được đánh giá mức độ an toàn khi sử dụng. Do đó chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên
cứu “Đánh giá độ an toàn của vaccine thử nghiệm phòng bệnh gan thận mủ trên
cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” để phát triển và ứng dụng trong sản xuất.
1.2 Mục Tiêu Đề Tài
Đánh giá độ an toàn của vaccine thử nghiệm phòng bệnh gan thận mủ trên cá tra
(Pangasianodon hypophthalmus).

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng Quan Về Việc Sử Dụng Vaccine Trong Nuôi Trồng Thủy Sản
2.1.1 Định nghĩa về vaccine
“Vaccine là những chế phẩm kháng nguyên có nguồn gốc từ mầm bệnh, đã được

chuyển thành vô hại bằng nhiều cách khác nhau, có tác dụng kích hoạt hệ miễn dịch
sao cho tính kháng bệnh tốt hơn khi tiếp xúc với mầm bệnh lần sau.” (Ellis, 1988).
2.1.2 Lịch sử phát triển của vaccine trong nuôi trồng thủy sản
1936, Nybelin đã công bố nghiên cứu của mình về đáp ứng miễn dịch của cá đối
với vi khuẩn Vibrio angullarum. Đến năm 1939, ông nghiên cứu đáp ứng miễn dịch
của cá đối với Pseudomonas punctada.
1940, Smith công bố nghiên cứu của mình về đáp ứng miễn dịch của cá đối với
Bacterium salmonicida (Aeromonas salmonicida).
1942, Duff chứng minh một cách rõ ràng cá có thể tạo ra kháng thể chống lại vi
khuẩn Bacterium salmonicida.
Từ 1942 – 1946, các công trình nghiên cứu này bị gián đoạn bởi sự bùng nổ của
chiến tranh thế giới.
1966, khi nền công nghiệp nuôi cá hồi phát triển mạnh nhưng cá nuôi thường bị
bệnh đỏ miệng do vi khuẩn Vibrio anugillarum và V. ordalli gây ra nên đã kích thích
sự phát triển vaccine phòng bệnh. Và vaccine phòng bệnh trong nuôi trồng thủy sản
được bắt đầu nghiên cứu và phát triển mạnh từ năm 1973 nhưng mãi đến cuối những
năm 1987 mới được đưa vào sử dụng (Newman, 1993). Cho đến tháng 7 năm 2005, đã
có 35 loại vaccine phòng bệnh vi khuẩn và 2 loại vaccine phòng bệnh vi rút được đăng
ký bản quyền và sử dụng cho 6 đối tượng nuôi phổ biến trên 41 quốc gia trên thế giới
bao gồm cá hồi, cá chẽm châu âu, cá chẽm châu á, cá rô phi và cá bơn đuôi vàng
(Hastain và ctc, 2005).
3


2.1.3 Phân loại vaccine
2.1.3.1 Vaccine vô hoạt (Inactivated)
Vaccine vô hoạt là vaccine được sản xuất trực tiếp từ chủng vi khuẩn gây bệnh,
sau khi nuôi cấy tăng sinh và diệt vi khuẩn bằng nhiệt hoặc hóa chất (formalin,
glutaraldehyde). Loại vaccine này rẻ, công nghệ sản xuất đơn giản và có thể sản xuất
với quy mô lớn phù hợp với điều kiện Việt Nam. Tuy nhiên trong một số trường hợp

hiệu quả của vaccine vô hoạt thấp nên các loại vaccine khác được phát triển và ứng
dụng vào sản suất.
2.1.3.2 Vaccine hỗn hợp
Vaccine hỗn hợp là loại vaccine có chứa nhiều hơn một chủng vi khuẩn gây bệnh
đã được bất hoạt nhằm gia tăng khả năng phòng cho một hoặc nhiều bệnh khác nhau.
2.1.3.3 Vaccine sống (Live Attenuated)
Vaccine sống là loại vaccine được sản xuất dựa vào biến đổi gene của chủng vi
khuẩn gây bệnh. Công việc quan trọng nhất của việc sản xuất được loại vaccine này là
xác định được gen độc lực và loại bỏ gene độc lực trước khi sử dụng vi khuẩn vẫn còn
sống. Đây là loại vaccine đòi hỏi công nghệ cao để sản xuất và nguy cơ vi khuẩn
không độc lực trở thành chủng gây bệnh do biến đổi gen hoặc thu nhập gen độc từ
chủng vi khuẩn gây bệnh.
2.1.3.4 Vaccine tiểu phần (recombinant)
Là loại vaccine được sản xuất từ tiểu phần kháng nguyên của tác nhân gây bệnh.
Thông thường tiểu phần kháng nguyên của vi khuẩn chiếm tỉ lệ rất nhỏ trong cấu trúc
tế bào như thành tế bào ở vi khuẩn hoặc một phần vỏ, protein, nội hoặc ngoại bào của
vi khuẩn cũng như vi rút.
Vaccine có thể được sản suất theo 3 phương pháp dưới đây.
Sản xuất vaccine tiểu phần bằng cách tách chiết trực tiếp tiểu phần kháng
nguyên từ vi khuẩn sau khi nuôi cấy tăng sinh như làm vỡ tế bào, tách lọc protein nội
hoặc ngoại bào tùy vào thành phần của kháng nguyên.

4


Vaccine tiểu phần có thể sản xuất được bằng cách xác định gene độc lực của vi
khuẩn sau đó đưa gene độc lực vào plasmid hoặc bacteriophage, trước khi đưa vào vi
khuẩn E.coli và nuôi cấy vi khuẩn này trong điều kiện đặc biệt nhằm sản suất ra tiểu
phần kháng nguyên cần thiết. Sau đó tách lọc kháng nguyên và sử dụng như vaccine
tiểu phần .

Sau khi xác định được gene độc lực của chúng ta có thể tổng hợp protein
nhân tạo bằng phương pháp phòng thí nghiệm. Việc nghiên cứu và sản xuất loại
vaccine này rất tốn kém, giá thành cao nên ít loại vaccine tiểu phần được sử dụng
trong NTTS.
2.1.3.5 DNA vaccine
Là loại vaccine có thành phần chính là gen độc lực của chủng vi khuẩn gây bệnh
được tổng hợp và đưa trực tiếp vào cơ thể cá hoặc được nhân lên trong vi sinh vật
mang nước trước khi đưa vào cơ thể cần được bảo vệ. Đây là công nghệ sản xuất
vaccine mới nhất và thường được áp dụng trong việc sản xuất vaccine phòng bệnh do
virut gây ra. Một nhược điểm lớn nhất của loại vaccine này đó là chi phí sản xuất rất
cao vì vậy ít được áp dụng trong nuôi trồng thủy sản.
2.1.4 Phương pháp sử dụng vaccine.
Việc sử dụng vaccine trong thủy sản cũng có nhiều phương pháp khác nhau.
Tùy từng loại vaccine khác nhau mà phương pháp sử dụng cũng khác nhau. Vì vậy tùy
từng loại vaccine và khẳ năng áp dụng mà chúng ta có thể sử dụng bằng các phương
pháp dưới đây.
2.1.4.1 Phương pháp ngâm
Sử dụng vaccine theo phương pháp này bằng cách ngâm cá trực tiếp trong
vaccine. Nồng độ và thời gian xử lý phụ thuộc vào loại vaccine và dùng theo chỉ dẫn
của nhà sản xuất. Tuy nhiên để tăng hiệu quả sử dụng của vaccine thì tùy từng đối
tượng nuôi và kích thước cá mà ta có thể thay đổi nồng độ ngâm nhằm gia tăng hiệu
quả của vaccine. Đây là phương pháp dễ áp dụng và có chi phí thấp.

5


2.1.4.2 Phương pháp tiêm
Vaccine có thể được tiêm vào trong xoang bụng hay tiêm vào cơ. Kích thước cá
và liều sử dụng theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.
Đây là phương pháp sử dụng cho hiệu quả vaccine cao nhất. Tuy nhiên chi phí sử

dụng và thời gian sử dụng là tốn kém nhất.
2.1.4.3 Phương pháp cho ăn
Đây là phương pháp sử dụng vaccine đơn giản nhất và có chi phí sử dụng thấp
nhất. Tuy nhiên chỉ có vaccine tiểu phần mới áp dụng theo phương pháp này vì các
loại vaccine khác khi sử dụng theo phương pháp này có hiệu quả rất thấp.
Ngoài ra còn có thể cấp vaccine theo các cách sau như:
2.1.4.4 Phương pháp nhúng
Đây là phương pháp sử dụng vaccine với nồng độ cao và ngâm trực tiếp cá vào
trong vaccine. Đây là phương pháp sử dụng đơn giản và thời gian xử lý ngắn nhưng
hiệu quả hạn chế và tốn nhiều vaccine.
2.1.4.5 Bơm cao áp
Đây là phương pháp sử dụng vaccine giống với phương pháp tiêm, tuy nhiên
chúng ta không sử dụng mũi kim thông thường mà sử dụng xilanh có áp xuất cao để
đưa vaccine vào vật chủ mà không gây ra vết thương bên ngoài. Chi phí sử dụng
vaccine cao phương pháp này cũng rất cao và đòi hỏi có trang thiết bị chuyên dụng
2.1.4.6 Bơm vào đường ruột
Tương tự với việc sử dụng vaccine bằng phương pháp tiêm nhưng thay vì tiêm
cơ hoặc tiêm xoang bụng phương pháp này sử dụng bằng cách tiêm vào đường ruột
thông qua hậu môn. Mặc dù việc sử dụng vaccine theo phương pháp này có hiệu quả
tốt và không gây thương tổn cho cá tuy nhiên chi phí cao vì tốn nhiều công lao động.
2.1.5 Vai trò của việc sử dụng vaccine trong nuôi trồng thủy sản
Trong nuôi trồng thủy sản một khi bệnh đã xảy ra thường gây hậu quả rất
nghiêm trọng nên phòng bệnh bao giờ cũng tốt hơn chữa bệnh.
6


Một trong những lợi thế lớn khác của việc sử dụng vaccine trong nuôi trồng thủy
sản đó là làm giảm thiểu việc sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất, vừa tiết kiệm
được tiền của vừa không làm ảnh hưởng xấu đến môi trường ao nuôi, vừa tăng năng
suất cá nuôi nhưng vẫn đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm.

Ta có thể lấy một ví dụ điển hình là ngành công nghiệp nuôi cá hồi trên thế
giới. Ngành công nghiệp nuôi cá hồi mới phát triển đầu những năm 1980 đến năm
2003 sản lượng trên thế giới đạt khoảng 700.000 tấn. Tuy nhiên bệnh do vi khuẩn là
một trong những trở ngại cho ngành công nghiệp này. Lượng kháng sinh sử dụng
trong nghề nuôi cá hồi tăng dần từ 0,3 - 0,9 kg/tấn sản phẩm vào năm 1987 (FAO,
2006). Sau đó lượng kháng sinh sử dụng giảm dần từ khi xuất hiện các loại vaccine có
hiệu quả trong việc phòng bệnh do vi khuẩn gây ra trên đối tượng này từ những năm
90 của thế kỷ trước và cho đến nay hầu như không còn sử dụng kháng sinh trong nghề
nuôi cá hồi thương phẩm. Việc sử dụng vaccine không chỉ thay thế thuốc kháng sinh
trong nghề nuôi cá hồi mà còn làm giảm chi phí sản xuất cá hồi trên thế giới. Theo số
liệu thống kê của FAO vào năm 2006 thì chi phí để sản xuất ra 1 kg cá hồi năm 1987
là 7 Euro, đến năm 2003 đã giảm xuống còn dưới 2 Euro/kg. Có nhiều nguyên nhân
giúp cho chi phí sản xuất cá hồi giảm như: cải tiến công nghệ nuôi, hoàn thiện thức ăn
công nghiệp và đặc biệt là tăng tỉ lệ sống của cá nhờ vào việc sử dụng các loại vaccine
phòng bệnh vi khuẩn trên đối tượng này. Cũng theo FAO cho đến năm 2005 có đến
95% tổng số cá được tiêm vaccine trước khi đưa vào nuôi thương phẩm và tỉ lệ sống
của cá nuôi thương phẩm đạt trên 90%.
Một ưu điểm khác của việc sử dụng vaccine là giúp tránh được tình trạng kháng
thuốc của vi khuẩn. Đây là một trong những vấn đề đáng lo ngại.
2.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của vaccine dùng trong thủy sản
2.1.6.1 Yếu tố di truyền
Đây là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả của vaccine
vì mỗi loài cá khác nhau sẽ có khả năng đáp ứng miễn dịch khác nhau. Do đó trước khi
tiến hành sản xuất một loại vaccine nào đó cần nghiên cứu thật kỹ khả năng đáp ứng
miễn dịch của đối tượng đó.

7


2.1.6.2 Tình trạng của đối tượng được cấp vaccine

Cỡ cá (cá lớn sẽ có sức đề kháng tốt hơn cá nhỏ). Cá khỏe mạnh sẽ cho đáp ứng
miễn dịch tốt hơn cá yếu. Cá có điều kiện dinh dưỡng tốt sẽ cho đáp ứng miễn dịch tốt
hơn những cá được nuôi trong điều kiện dinh dưỡng kém.
2.1.6.3 Các yếu tố môi trường
Cá được nuôi trong điều kiện môi trường nước tốt, có các chỉ tiêu môi trường
như pH, nhiệt độ, ôxy hòa tan, NH3 trong khoảng thích hợp sẽ cho đáp ứng tốt so với
cá sống trong môi trường bất lợi.
2.1.6.4 Trình độ kỹ thuật của người sử dụng
Các thao tác trong quá trình cấp vaccine cần phải được chuẩn bị tốt, thao tác phải
chính xác và đúng. Tránh gây shock cho cá nuôi. Phải có kiến thức trong việc bảo
quản vaccine.
Việc sử dụng các loại thuốc và hóa chất khác: các loại thuốc và kháng sinh sẽ
ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch của cá từ đó sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả
của vaccine. Khi tiêm hồng cầu thỏ vào cơ của cá chép, đáp ứng miễn dịch dịch thể
thứ phát có thể được phát hiện vào ngày thứ 9. Tuy nhiên nếu xử lí cá thí nghiệm với
Oxytetracycline bằng cách tiêm (3 ngày tiêm một lần, trong 15 ngày trước khi tiêm
hồng cầu thỏ hoặc cho ăn trong suốt thời gian thí nghiệm thì mức độ đáp ứng miễn
dịch dịch thể của cá sẽ bị sụt giảm 90% so với cá đối chứng (Rijkers, 1980).
2.1.7 Nguyên tắc sử dụng vaccine
Chỉ sử dụng vaccine theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Sẽ đạt được hiệu quả bảo hộ cao nếu ta cấp vaccine nhiều lần.
Nên cấp vaccine cho cá trước khi sử dụng con giống nuôi thương phẩm.
Chỉ nên cấp vaccine vào những khoảng thời gian có nhiệt độ, thời tiết ít thay đổi.
Không cấp vaccine khi cá đang bệnh.
Tránh gây stress cho cá khi tiêm vaccine (3 tuần sau khi vận chuyển phân cỡ cá
mới nên tiêm vaccine).
8


Những người có kỹ thuật và được huấn luyện mới đủ khả năng cấp vaccine cho

cá.
Khi đang cấp vaccine mà cá chết thì ngưng ngay.
Chỉ nên sử dụng vaccine có nguồn gốc xuất xứ rõ ràng.
2.1.8 Đánh giá hiệu quả sử dụng vaccine
Muốn đánh giá hiệu quả của một loại vaccine người ta thường bố trí gây nhiễm
trên hai nhóm cá. Nhóm cá được gây miễn dịch bằng loại vaccine cần xác định và
nhóm cá đối chứng không được gây miễn dịch rồi theo dõi tỉ lệ sống của các nhóm cá
trong một khoảng thời gian định trước. Thường là 14 ngày hoặc theo dõi cho đến khi
không còn cá chết. Đòi hỏi có một số tiêu chuẩn cơ bản như: mỗi nhóm phải có tối
thiểu 25 cá thể với độ lặp lại tối thiểu là 2. Việc gây nhiễm với tác nhân gây bệnh phải
đạt được tỉ lệ chết hoặc mắc bệnh trên 50% nhưng nhỏ hơn 90% đối với nhóm cá đối
chứng. Nguyên nhân tử vong của mọi cá thể trong thí nghiệm phải được xác minh với
số cá chết do nguyên nhân khác ngoài tác nhân gây bệnh không được vượt quá 10%
đối với tất cả các nhóm.
Khi đó hiệu quả bảo hộ RPS (Relative Percent Survival) sẽ được tính theo công
thức sau:
RPS (%) = 100 x (1 – Tỷ lệ chết của lô cấp vaccine/ Tỷ lệ chết của lô không cấp
vaccine)
Vaccine được xem là có hiệu quả bảo hộ cho cá, có thể đưa vào ứng dụng trong
thực tế khi RPS ≥ 60% (Bader và ctv, 2004).
2.2 Bệnh Gan Thận Mủ Trên Cá Tra
2.2.1 Lịch sử bệnh do Edwardsiella ictaluri
1976 bệnh được ghi nhận trên cá da nheo (Ictalurus punctatus) là một loại cá da
trơn của Mỹ. 1979 bệnh bắt đầu được mô tả.
1981 lần đầu tiên mô tả nguyên nhân do vi khuẩn gây bệnh và được định danh với
tên bệnh là bệnh nhiễm trùng huyết và viêm ruột (Enteric Septicemia of catfish: ECS).

9

Tên gọi khác: bệnh lỗ đầu (hole in the head disease) vì sau khi sống sót cá chuyển
sang mãn tính và trên đầu có một vết loét.
Là một trong những bệnh nguy hiểm nhất ảnh hưởng ảnh đến công nghiệp nuôi cá
da trơn tại Mỹ. Tại khu vực Đông Nam Á bệnh được phát hiện trên cá da trơn Thái Lan
vào năm 1987. Bệnh xuất hiện trên cá Tra và Ba Sa nuôi ao bè ở Việt Nam vào năm
1992 đến năm 2001 thì bệnh được gọi là bệnh mủ gan và bệnh bắt đầu được lưu ý khi
nghề nuôi cá tra và basa phát triển. Năm 2002 bệnh được định danh chính xác là do
Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra nuôi tại Việt Nam. Bệnh xảy ra trên mô hình
nuôi cá bè, ao đất, bể xi măng và kể cả cá nuôi trên bể kính.
Những khu vực bị ảnh hưởng chủ yếu là những vùng có nghề nuôi cá tra phát
triển mạnh, mang tính chất công nghiệp như: An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ và Vĩnh
Long, sau đó lây lan sang các vùng lân cận. Đặc biệt những năm gần đây bệnh này
cũng xuất hiện ở một số tỉnh mới phát triển nghề nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre và
Sóc Trăng (Từ Thanh Dung và ctv, 2004).
2.2.2 Tác nhân gây bệnh
2.2.2.1 phân loại
Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri thuộc
Ngành : Proteobacterri
Lớp: Gammaproteobaterria
Bộ : Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Giống: Edwardsiella
Loài: Edwardsiella ictaluri (Bùi Quang Tề, 2006).
2.2.2.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
+ Edwardsiella ictaluri thuộc họ vi khuẩn Enterobacteriaceae, là trực khuẩn
gram âm kích thước 1 x 2 – 3 μm, không sinh bào tử, là vi khuẩn yếm khí tùy nghi,
phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, không oxy hoá, lên men trong môi
trường glucose. E. ictaluri có từ 1 - 3 plasmid (Speyerer và Boyle 1987, Newton và
ctv, 1988). Chức năng của chúng vẫn chưa được làm rõ, nhưng có giả thuyết cho rằng
10

chúng quan trọng trong việc nâng cao tính kháng đối với kháng sinh của E. ictaluri. Vi
khuẩn phát triển chậm trên môi trường nuôi cấy, cần mất 36 - 48 giờ để hình thành
những khuẩn lạc nhỏ li ti trên thạch BHIA tại 28 – 300C (Valerie và ctv, 1994), phát
triển yếu hoặc không phát triển ở 370C. Khi trong môi trường nuôi cấy có sự hiện diện
của một loài vi khuẩn phát triển nhanh hơn E. ictaluri (như Aeromonas) thì khi đó
chúng sẽ ức chế hoặc làm cho E. ictaluri phát triển rất chậm (Shotts và Walman,
1990).
2.2.2.3 Đặc điểm gây bệnh
Vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn gây bệnh bắt buộc, chỉ tồn tại trong nước được
trong một thời gian ngắn khoảng 8 ngày (Hawke, 1979), tuy nhiên chúng có thể tồn tại
trong bùn đến 95 ngày ở 25oC (Plumb và Quinlan, 1986).
Vi khuẩn có khả năng tồn tại trong gan, thận, não vài tháng sau khi cá khỏi bệnh.
Vì cá luôn ở trạng thái mang trùng và bài thải vi khuẩn ra môi trường nước nên có thể
sẽ gây bệnh cho các cá khác ở điều kiện môi trường thuận lợi cho sự phát triển của vi
khuẩn. Vi khuẩn có thể xâm nhập trực tiếp từ ruột, mũi, mang vào cơ thể cá. Vi khuẩn
trong nước có thể qua đường mũi của cá xâm nhập vào cơ quan khứu giác và di
chuyển vào dây thần kinh khứu giác, sau đó vào não (Miyazaki và Plumb, 1985; Shott
và ctv, 1986) E. ictaluri cũng có thể theo thức ăn vào bên trong cơ thể cá qua niêm
mạc ruột vào máu gây nhiễm trùng máu (Shott và ctv, 1986). Bằng đường này thì vi
khuẩn vào mao mạch trong biểu bì gây hoại tử và mất sắc tố da. Vi khuẩn được bài
thải từ phân xác cá chết vào nước.
Bệnh bộc phát mạnh ở nhiệt độ 20-28oC đặc biệt trong khoảng 24-28oC vi khuẩn
có độc lực mạnh nhất. Khi nhiệt độ trên 30oC tỉ lệ cá chết giảm dần.
2.2.3 Đường lây truyền của E. ictaluri
Bệnh do Edwardsiella ictaluri có khả năng lây lan mạnh với tỉ lệ chết cao bệnh
có thể lây lan trực tiếp từ cá này sang cá khác trong môi trường nước qua chất thải như
phân cá bệnh hoặc do cá khỏe ăn cá bệnh chết.

11


Chim và các dụng cụ như: lưới, vợt … dùng chung cho các ao có thể làm lây lan
mầm bệnh. Tuy nhiên dụng cụ dùng chung giữa các ao nếu được khử trùng hoặc phơi
nắng thì có thể giết được vi khuẩn.
2.2.4 Chẩn đoán
Khó quan sát dưới kính hiển vi quang học vì vi khuẩn là trực khuẩn.
Vi khuẩn được phân lập ở gan, thận, lách vi khuẩn gây bệnh với độc lực mạnh
nhất ở 20-28oC gây chết cấp tính chết nhanh và nhiều. Nên lấy mẫu cá lúc này để định
danh vi khuẩn được chính xác.
Phân lập nên sử dụng môi trường thạch không nên sử dụng môi trường canh vì
vi khuẩn khác sẽ phát triển lấn át vi khuẩn mục tiêu. Sử dụng môi trường BHIA là tốt
nhất hoặc TSA+5% máu.
Đĩa cấy nên giữ ở nhiệt độ 28-30oC trong 48 giờ. Có thể dùng kit API 20E để
định danh vi khuẩn.
Chuẩn đoán bằng miễn dịch: phản ứng ngưng kết trên phiết kính (slide
aglutination), phản ứng ELISA cho kết quả nhanh chính xác.
Kỹ thuật PCR ít được sử dụng vì đòi hỏi kỹ thuật cao, máy móc phức tạp cũng
như tay nghề cao.
2.2.5 Triệu chứng
Cá bệnh có biểu hiện bỏ ăn, bơi lờ đờ trên mặt nước sau khi bị nhiễm khuẩn. Cá
thường treo lơ lửng cơ thể ở trên mặt nước và tụ tập thành một đám do cá yếu. Cá bệnh
cũng xuất hiện triệu chứng thần kinh thường là nhào lộn và bơi xoay tròn. Khi bệnh
nặng cá không phản ứng với tiếng động.
Cá bệnh thường thấy xuất huyết quanh hậu môn, miệng, bụng, vây và gốc vây.
Cá có thể xuất huyết điểm trên thân hoặc xuất huyết toàn thân. Cá bị nhiễm E. ictaluri
thường bị phù đầu do tích dịch ở dưới da vùng sọ. Khi dịch quá nhiều sẽ chảy xuống
hốc mắt gây lồi mắt. Quan sát mang cá thấy màu sắc nhợt nhạt do E. ictaluri có khả
năng gây dung huyết làm mất máu.

12