Nghiên cứu hệ gen của virus cúm AH5N1 phân lập từ gà nuôi tại Hậu Giang (Luận án tiến sĩ)
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (374.76 KB, 127 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
TRẦN QUANG VUI
LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP
Ng êi
Hà Nội - 2012
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
TRẦN QUANG VUI
Chuyên ngành: Vi sinh vật học thú y
Mã số: 62 62 50 10
LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. LÊ THANH HOÀ
2. TS. NGUYỄN BÁ HIÊN
Hà Nội - 2012
I
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân do chính tôi
thực hiện. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng
được ai công bố trong bất kỳ công trình luận án nào trước đây. Mọi sự giúp đỡ đã
được cảm ơn. Các thông tin, tài liệu trích trong luận án đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Nghiên cứu sinh
Trần Quang Vui
II
LỜI CẢM ƠN
Hoàn thành luận án này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
- PGS.TS. Lê Thanh Hòa và TS. Nguyễn Bá Hiên - những người thầy đã
dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và tận tình giúp đỡ tôi
hoàn thành luận án này.
- Bộ Khoa học và Công nghệ về Nhiệm vụ Nghị định thư Việt Nam - Thái
Lan và Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen (Viện Công nghệ sinh học) đã
hỗ trợ kinh phí và trang thiết bị để chúng tôi thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn:
- Phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học (Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam) đã t ạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình
thực hiện đề tài.
- Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú Y, Viện Đào tạo Sau Đại học,
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình
nghiên cứu.
- Khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế đã cho
phép và tạo điều kiện thuận lợi để tôi có đủ thời gian thực hiện luận án.
- Th.S. Nguyễn Thị Bích Nga, các anh chị Phòng Miễn dịch học thuộc Viện
Công nghệ Sinh học và các bạn đồng nghiệp đã tận tình giúp đỡ, hỗ trợ về kỹ thuật
trong quá trình nghiên cứu.
Góp công sức không nhỏ trong việc hoàn thành luận án là người vợ thân yêu
- đã đ ộng viên giúp đỡ, gánh vác mọi công việc gia đình đ ể tôi dành thời gian cho
nghiên cứu và hoàn thành luận án.
Nghiên cứu sinh
Trần Quang Vui
III
MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGHĨA .
VI
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................... VIII
DANH MỤC CÁC HÌNH .....................................................................
XI
MỞ ĐẦU ................................................................................................
1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................
4
1.1. Đại cương về bệnh cúm gia cầm ...........................................................
4
1.1.1. Lịch sử bệnh cúm gia cầm .............................................................
4
1.1.2. Tình hình dịch cúm gia cầm A/H5N1 trên thế giới ......................
5
1.1.3. Tình hình dịch cúm gia cầm A/H5N1 ở Việt Nam ........................
7
1.1.4. Nguyên nhân gây bệnh ...................................................................
9
1.1.5. Cơ chế sinh bệnh ............................................................................
13
1.1.6. Triệu chứng lâm sàng .....................................................................
15
1.1.7. Bệnh tích ........................................................................................
16
1.1.8. Chẩn đoán bệnh..............................................................................
18
1.1.9. Phòng chống bệnh cúm gia cầm ....................................................
20
1.2. Sinh học phân tử virus cúm A ........................................................................
24
1.2.1. Hệ gen của virus cúm A ..................................................................
24
1.2.2. Protein của virus - cấu trúc và chức năng ......................................
26
1.2.3. Cơ chế phân tử quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A
36
1.2.4. Các phương thức biến đổi kháng nguyên của virus cúm A ...........
38
1.3. Tiến hóa hệ gen virus cúm A/H5N1 .....................................................
42
1.3.1. Sự tiến hóa của virus cúm A/H5N1 ..............................................
42
1.3.2. Sự xâm nhập các genotype của virus cúm A/H5N1
vào Việt Nam...............................................................................
44
1.3.3. Sự biến đổi thành phần hemagglutinin (HA) tạo nên các nhóm
kháng nguyên (clade) của virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam...........
47
IV
1.4. Phản ứng RT-PCR trong nghiên cứu virus cúm A ............................
49
1.5. Một số nghiên cứu về sinh học phân tử virus cúm A/H5N1 tại Việt
1.6.
Nam ......................................................................................................................
50
Tầm quan trọng của việc giải mã hệ gen virus cúm A/H5N1 ..............
54
CHƯƠNG 2: NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ........................................................................................
56
2.1.
Đối tượng nghiên cứu ............................................................................
56
2.2.
Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................
56
2.3.
Nội dung nghiên cứu .............................................................................
56
2.3.1. Giải trình tự toàn b ộ hệ gen chủng virus cúm A/H5N1 (CkHG4)
phân lập từ gà Hậu Giang ............................................................
56
2.3.2. Phân tích so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả
2.4.
2.5.
3.1.
hệ chủng CkHG4 với các chủng của Việt Nam và thế giới ........
56
Vật liệu nghiên cứu ...............................................................................
56
2.4.1. Nguyên liệu ...................................................................................
56
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị .........................................................................
57
2.4.3. Hóa chất .........................................................................................
57
2.4.4. Các dung dịch và môi trường ........................................................
57
Phương pháp nghiên cứu ......................................................................
58
2.5.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số ...........................................
58
2.5.2. Phương pháp RT-PCR ...................................................................
59
2.5.3. Phương pháp kiểm tra sản phẩm RT -PCR .......................................
63
2.5.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR ...................................
63
2.5.5. Phương pháp dòng hóa...................................................................
64
2.5.6. Phương pháp giải trình tự ...............................................................
67
2.5.7. Phương pháp xử lý số liệu ..............................................................
69
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................
70
Kết quả giải mã hệ gen virus cúm A/H5 N1 chủng CkHG4 ...............
70
3.1.1. Kết quả tách RNA tổng số .............................................................
70
V
3.1.2. Kết quả giải trình tự các gen kháng nguyên HA (H5)
3.2.
và NA (N1) ...................................................................................
71
3.1.2.1. Giải trình tự gen H5 (HA) ........................................................
71
3.1.2.2. Giải trình tự gen N1 (NA) ........................................................
73
3.1.3. Kết quả giải trình tự cá c gen polymerase ...................................
75
3.1.3.1. Giải trình tự gen PB2 ..............................................................
75
3.1.3.2. Giải trình tự gen PB1 ...............................................................
76
3.1.3.3. Giải trình tự gen PA .................................................................
77
3.1.4. Kết quả giải trình tự các gen NP, M và NS .................................
79
3.1.4.1. Giải trình tự gen NP .................................................................
79
3.1.4.2. Giải trình tự gen M...................................................................
79
3.1.4.3. Giải trình tự gen NS .................................................................
80
Phân tích so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của
chủng CkHG4 với các chủng của Việt Nam và thế giới ...............................
83
3.2.1. Phân tích gen H5 ............................................................................
84
3.2.2. Phân tích gen N1 ............................................................................
93
3.2.3. Phân tích gen PB2 .......................................................................... 102
3.2.4. Phân tích gen PB1 và PB1-F2........................................................ 106
3.2.5. Phân tích gen PA............................................................................ 112
3.2.6. Phân tích gen NP ........................................................................... 117
3.2.7. Phân tích gen M ............................................................................. 120
3.2.8. Phân tích gen NS............................................................................ 124
3.3.
Thảo luận chung .................................................................................... 131
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................... 136
CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG B Ố LIÊN QUAN ĐẾN
LUẬN ÁN...............................................................................................
138
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................... 139
PHỤ LỤC
VI
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGHĨA
Ký hiệu
Tiếng Anh
Aa
Amino acid
Thuật từ/Cách dùng hoặc nghĩa
tiếng Việt
Axit amin
Bp
Base pair
Cặp bazơ
Ck
Chicken
Gà
CkHG4
A/Chicken/Vietnam/HG4/05(H5N1) Chủng virus cúm A/H5N1 phân
lập từ gà Hậu Giang năm 2005
Da
Dalton
Đơn vị tính trọng lượng phân tử
protein
Dk
Duck
Vịt
DNA
Deoxyribonucleic Acid
Axit deoxyribonucleic
dNTP
deoxy Nucleotide Triphosphate
Tiền chất dNTP cho phản ứng PCR
ddNTP
dideoxy Nucleotide Triphosphate
Tiền chất dNTP cho phản ứng giải
trình tự
Enzyme-Linked Immunosorbent
Phản ứng miễn dịch đánh dấu
Assay
enzym
FAO
Food and Agricultural Organization
Tổ chức nông lương thế giới
Gs
Goose
Ngỗng
HA
Haemagglutinin
Ngưng kết hồng cầu
HI
Hemagglutination Inhibition
Ngăn trở ngưng kết hồng cầu
HPAI
Highly Pathogenic Avian Influenza
Cúm gia cầm thể độc lực cao
Kb
Kilo base
Kilo bazơ
LB
Luria-Bertani
Môi trường Luria-Bertani nuôi cấy
ELISA
vi khuẩn
LPAI
Low Pathogenic Avian Influenza
Cúm gia cầm thể độc lực thấp
M
Matrix
Protein đệm
MDk
Muscovy duck
Ngan
MEGA
Molecular Evolutionary Genetics
Chương trình p hân tích tiến hóa
VII
Analysis
gen
NA
Neuraminidase
Enzym phân giải sialic
NEP
Nuclear Export Protein
Protein vận chuyển
NP
Nucleoprotein
Protein nhân
NS
Non structural protein
Protein không cấu trúc
OIE
Office International des Epizooties
Tổ chức Thú y thế giới
PA
Polymerase acidic protein
Enzym polymerase có tính axit
PB1
Polymerase basic protein 1
Enzym polymerase có tính bazơ 1
PB2
Polymerase basic protein 2
Enzym polymerase có tính bazơ 2
PCR
Polymerase Chain Reaction
Phản ứng PCR
RNA
Ribonucleic Acid
Axit ribonucleic
RNP
Ribonucleoprotein
Tổ hợp protein liên kết ribonucleic
RT-PCR
Reverse Transcription-Polymerase
Phản ứng PCR ngược
Chain Reaction
SPF
Specific Pathogen Free
(-)ssRNA Negative single-strand Ribonucleic
Không chứa mầm bệnh (siêu sạch)
ARN sợi đơn âm
Acid
TAE
Tris-Acetate-EDTA
Tris-Acetate-EDTA
TNF-α
Tumor Necrosis Factor-α
Yếu tố α gây hoại tử khối u
WHO
World Health Organization
Tổ chức Y tế thế giới
VIII
DANH MỤC CÁC BẢNG
TT
Tên bảng
1.1
Tổng số trường hợp nhiễm cúm gia cầm A/H5N1 ở người báo
Trang
cáo cho WHO từ tháng 12/2003 đến 6/7/2012
6
2.1
Thành phần phản ứng RT -PCR
59
2.2
Chu trình nhiệt sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử virus
cúm A/H5N1
60
2.3
Danh sách mồi sử dụng để thu nhận hệ gen virus cúm gia cầm
61
2.4
Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt giải trình tự
68
3.1
Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế
giới sử dụng gen H5 trong phân tích so sánh thành phần gen và
mối quan hệ nguồn gốc phả hệ
3.2
So sánh vị trí sai khác nucleotide của gen H5 chủng CkHG4 với
26 chủng virus cúm khác
3.3
86
So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide H5
giữa 27 chủng virus cúm
3.4
85
87
Tỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide (trên đường chéo) và tương
đồng về amino acid (dưới đường chéo) gen H5 giữa các chủng
cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới
3.5
90
Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế
giới được sử dụng gen N1 trong phân tích so sánh thành phần gen
và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ
3.6
So sánh vị trí sai khác nucleotide của gen N1 chủng CkHG4 với
26 chủng virus cúm khác
3.7
95
So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide N1
giữa 27 chủng virus cúm
3.8
94
96
Tỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide (trên đường chéo) và tương
đồng về amino acid (dưới đường chéo) của gen N1 giữa các
chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới
100
IX
3.9
Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế
giới được sử dụng gen PB2 trong phân tích so sánh thành phần
gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ
3.10
So sánh vị trí sai khác nucleotide của gen PB2 chủng CkHG4
với 26 chủng virus cúm khác
3.11
103
So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide PB2
giữa 27 chủng virus cúm
3.12
102
104
Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế
giới được sử dụn g gen PB1 và PB1-F2 trong phân tích so sánh
thành phần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ
3.13
So sánh vị trí sai khác nucleotide của gen PB1 chủng CkHG4
với 26 chủng virus cúm khác
3.14
110
So sánh vị trí sai khác nucleotide và amino acid của gen PB1 -F2
chủng CkHG4 với 26 chủng virus cúm khác
3.16
109
So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptid e PB1
giữa 27 chủng virus cúm
3.15
107
111
Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế
giới được sử dụng gen PA trong phân tích so sánh thành phần
gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ
3.17
So sánh vị trí sai khác nucleotide của gen PA chủng CkHG4 với
26 chủng virus cúm khác
3.18
115
So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide PA
giữa 27 chủng virus cúm
3.19
113
116
Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế
giới được sử dụng gen NP trong phân tích so sánh thành phần
gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ
3.20
117
Vị trí sai khác nucleotide và amino acid của gen NP chủng
CkHG4 so với 26 chủng virus cúm khác
119
X
3.21
Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế
giới được sử dụng gen M trong phân tích so sánh thành phần gen
và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ
3.22
121
Vị trí sai khác nucleotide và amino acid của gen M1 và M2
chủng CkHG4 so với 26 chủng virus cúm khác
3.23
122
Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế
giới được sử dụng gen NS trong phân tích so sánh thành phần
gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ
3.24
125
Vị trí sai khác nucleotide của gen NS1 chủng CkHG4 so với 26
chủng virus cúm khác
3.25
126
Vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide NS1 giữa 27
chủng so sánh
3.26
Vị trí sai khác nucleotide và amino acid
CkHG4 so với 26 chủng virus cúm khác
127
gen NS2 chủng
128
XI
DANH MỤC CÁC HÌNH
TT
Tên hình
1.1
Sơ đồ danh pháp quốc tế các chủng virus cúm A
1.2
Ảnh chụp kính hiển vi điện tử, mô hình và phức hợp
Trang
10
ribonucleoprotein RNP của virus cúm A
11
1.3
Sinh bệnh học của virus cúm A/H5N1 ở người
14
1.4
Triệu chứng lâm sàng ở gà m ắc bệnh cúm gia cầm
15
1.5
Bệnh tích ở gà mắc bệnh cúm gia cầm
17
1.6
Mô hình cấu trúc Hemagglutinin
27
1.7
Sự biến đổi amino acid chuỗi nối HA 1 và HA2 (điểm cắt của
protease) quy định độc lực của virus cúm A
1.8
Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế
bào chủ
1.9
39
Sơ đồ minh họa đột biến tái tổ hợp của hiện tượng “trộn kháng
nguyên” (antigenic shift) ở virus cúm A
1.11
37
Sơ đồ minh họa đột biến điểm của hiện tượng “lệch kháng
nguyên”
1.10
29
40
Sự xâm nhập của virus cúm A/H5N1 độc lực cao vào Việt Nam
giai đoạn 2001-2007
45
2.1
Sơ đồ nghiên cứu tổng quát để thu nhận các chuỗi gen
58
2.2
Sơ đồ bố trí các mồi để thu nhận các phân đoạn gen của virus
cúm A/H5N1
62
2.3
Cấu trúc vector pCR ®2.1TOPO (Invitrogen)
64
3.1
Kết quả điện di kiểm tra RNA tổng số, sản phẩm RT-PCR và
DNA plasmid tái tổ hợp gen H5 trên thạch agarose 1%
3.2
Phân tích diễn giải thành phần nucleotide và amino acid của gen
H5 (HA) chủng CkHG4
3.3
70
72
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR và DNA plasmid
tái tổ hợp
73
XII
3.4
Phân tích diễn giải thành phần nucleotide và amino acid của gen
N1 (NA) chủng CkHG4
3.5
Kết quả điện di sản phẩm RT -PCR và DNA plasmid tái tổ hợp
phân đoạn 1 (gen PB2)
3.6
78
Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR và DNA plasmid tái tổ hợp
phân đoạn 5 (gen NP)
3.9
77
Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR và DNA plasmid tái tổ hợp
phân đoạn 3 (gen PA)
3.8
76
Kết quả điện di sản phẩm RT -PCR và DNA plasmid tái tổ hợp
phân đoạn 2 (gen PB1)
3.7
74
79
Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR và DNA plasmid tái tổ hợp
phân đoạn 7 (gen M)
80
3.10
Phân tích diễn giải thành phần nucleotide và amino acid của gen M
81
3.11
Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR và DNA plasmid tái tổ hợp
phân đoạn 8 (gen NS)
3.12
Phân tích diễn giải thành phần nucleoti de và amino acid của gen
NS
3.13
82
82
Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa chủng CkHG4 với các
chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới trên cơ sở gen
kháng nguyên H5 về thành phần nucleotide và amino acid bằng
chương trình MEGA4.0
3.14
92
Mối quan hệ ng uồn gốc phả hệ giữa chủng CkHG4 với các
chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới trên cơ sở gen
N1 về thành phần nucleotide và amino acid bằng chương trình
MEGA4.0
101
Luận án đủ ở file: Luận án full
