Tối ưu hóa các điều kiện định lượng một số anthocyanidin trong rau củ quả bằng phương pháp sắc kí

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
….…………….

CHU THỊ THANH

TỐI ƯU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ
ANTHOCYANIDIN TRONG RAU CỦ QUẢ BẰNG PHƯƠNG
PHÁP SẮC KÍ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2017

i


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
….…………….

CHU THỊ THANH

TỐI ƯU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ
ANTHOCYANIDIN TRONG RAU CỦ QUẢ BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ
Chuyên ngành: Hóa học phân tích
Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. Nguyễn Xuân Trung

Hà Nội – 2017

ii


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy PGS.TS. Nguyễn Xuân
Trung đã tận tình hướng dẫn, giao đề tài, đóng góp những ý kiến quý báu, tạo mọi
điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ths. Vũ Thị Trang, người đã trực tiếp
hướng dẫn, chỉ bảo và động viên em trong suốt quá trình làm đề tài và cảm ơn các
anh chị đang làm việc, nghiên cứu tại Khoa chất lượng phụ gia và hỗ trợ chế biến
thực phẩm, Viện kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia.
Em xin được gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn Vệ
sinh Thực phẩm Quốc gia tạo mọi điều kiện cho em được thực hiện đề tài tại đây.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá học,
đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân Tích đã cho em những kiến thức quý
giá, tạo điều kiện cho em được học tập và nghiên cứu trong môi trường hiện đại.
Em xin trân trọng cảm ơn ban Giám Đốc, Ban chủ nhiệm khoa Môi Trường,
Bộ môn Hóa Học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện cho em được
học tập để nâng cao trình độ.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên,
chia sẻ mọi khó khăn cùng em.
Hà Nội, ngày tháng năm 2017
Tác giả luận văn

Chu Thị Thanh

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................i
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................iv
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... v
DANH MỤC BẢNG VIẾT TẮT ............................................................................vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN ................................................................................... 3
1.1. Tổng quan về anthocyanin và anthocyanidin .............................................3
1.1.1. Giới thiệu về anthocyanin.........................................................................3
1.1.2. Cấu trúc hóa học của anthocyanidin .........................................................4
1.1.3. Tính chất của anthocyanidin .....................................................................6
1.1.4. Tác dụng của anthocyanin ........................................................................8
1.1.5. Sự phân bố của anthocyanin trong thực vật .............................................9
1.2. Phương pháp xác định anthocyanidin .........................................................9
1.2.1. Phương pháp điện di mao quản ................................................................9
1.2.2. Phương pháp phổ hấp thụ phân tử UV - VIS .........................................11
1.2.3 Phương pháp sắc kí lỏng HPLC ..............................................................12
1.3. Qui hoạch hóa thực nghiệm tìm điều kiện tối ưu quá trình thủy phân ..15
CHƯƠNG 2 – THỰC NGHIỆM ........................................................................... 18
2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ......................................................................18
2.1.1. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................18
2.1.2. Hóa chất ..................................................................................................18
2.2. Mẫu phân tích ..............................................................................................21
2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu .......................................................22
2.3.1. Nội dung nghiên cứu ..............................................................................22
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................22

2.4. Đánh giá kết quả phương pháp phân tích .................................................25
2.4.1. Xây dựng khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng ..25
2.4.2. Xử lí số liệu thực nghiệm .......................................................................26
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 30

ii


3.1. Khảo sát các điều kiện tách và xác định anthocyanidin trên HPLC ......30
3.1.1. Lựa chọn cột tách sắc kí .........................................................................30
3.1.2. Chọn bước sóng phát hiện ......................................................................30
3.1.3. Khảo sát thành phần pha động................................................................32
3.1.4. Khảo sát chương trình gradient ..............................................................33
3.1.5. Khảo sát nồng độ axit trong pha động ....................................................36
3.1.6. Khảo sát tốc độ dòng ..............................................................................37
3.2. Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu theo phương pháp mặt mục tiêu ..........38
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng khối lượng mẫu......................................................39
3.2.2. Khảo sát đồng thời các yếu tố theo phương pháp RSM .........................40
3.2.3. Hiệu suất thủy phân ................................................................................53
3.2.4. Kết luận về điều kiện tối ưu để định lượng anthocyanidin ....................56
3.3 Đánh giá kết quả phương pháp phân tích ..................................................58
3.3.1. Đánh giá độ đặc hiệu/ chọn lọc của phương pháp ..................................58
3.3.2. Khảo sát khoảng tuyến tính lập đường chuẩn ........................................60
3.3.3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương
pháp ..................................................................................................................61
3.3.4. Độ lặp lại của phương pháp ...................................................................62
3.3.5. Hiệu suất thu hồi .....................................................................................65
3.3.6. Ứng dụng phân tích mẫu thực tế ............................................................67
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 70
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 71

iii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. 1.Một số điều kiện thủy phân anthocyanin ..................................................16
Bảng 2.1. Mức cơ sở các yếu tố ảnh hưởng ..............................................................24
Bảng 3.1. Chương trình gradient 1 ...........................................................................31
Bảng 3.2. Chương trình gradient 2 ............................................................................32
Bảng 3.3. Chương trình gradient 3 ............................................................................33
Bảng 3.4. Chương trình gradient 4 ............................................................................33
Bảng 3. 5. Độ phân giải và hệ số đối xứng pic .........................................................34
Bảng 3. 6. Ảnh hưởng tốc độ dòng đến diện tích pic và độ phân giải các
anthocyanidin ............................................................................................................36
Bảng 3.7. Mức cơ sở và khoảng biến thiên các yếu tố theo mô hình bậc hai tâm
xoay ...........................................................................................................................39
Bảng 3.8. Tổng hàm lượng anthocyanidin và cyanidin theo mô hình bậc hai tâm
xoay ...........................................................................................................................40
Bảng 3. 9. Kết quả phân tích ảnh hưởng các nhân tố khảo sát đến hàm lượng
anthocyanidin ............................................................................................................41
Bảng 3. 10. Bảng phân tích phương sai của hàm lượng anthocyanidin ....................42
Bảng 3. 11. Bảng phân tích phương sai sau khi bỏ yếu tố không có nghĩa ..............44
Bảng 3. 12. Bảng sai số giữa kết quả thực nghiệm và kết quả theo mô hình ...........45
Bảng 3.13. Hàm lượng anthocyanidin trong đỗ đen tại điều kiện tối ưu ..................48
Bảng 3. 14. Bảng phân tích phương sai cyanidin sau khi bỏ yếu tố không có nghĩa50
Bảng 3. 15. Sai số giữa kết quả thực nghiệm và mô hình hàm lượng cyanidin........51
Bảng 3. 16. Hiệu suất thủy phân chuẩn anthocyanin ................................................53
Bảng 3. 17. Phương trình hồi quy, khoảng tuyến tính của các anthocyanidin .........60
Bảng 3. 18. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng các anthocyanidin ..............60
Bảng 3. 19. Độ lặp lại của delphinidin ......................................................................61

Bảng 3. 20. Độ lặp lại petunidin ...............................................................................62
Bảng 3. 21. Độ lặp lại pelargonidin ..........................................................................62
Bảng 3. 22. Độ lặp lại malvidin ................................................................................62
Bảng 3.23. Độ lặp lại peonidin..................................................................................63
Bảng 3. 24. Độ lặp lại cyanidin .................................................................................63
Bảng 3. 25. Hiệu suất thu hồi anthocyanidin ............................................................65
Bảng 3. 26. Kết quả phân tích mẫu thực ...................................................................68

iv


DANH MỤC HÌNH
Hình 1. 1. Cấu trúc cơ bản của anthocyanin ...............................................................3
Hình 1.2. Cấu trúc cơ bản của anthocyanidin .............................................................4
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của 6 anthocyanidin ........................................................5
Hình 1.4. Sự thay đổi cấu trúc hóa học của anthocyanidin theo pH ...........................7
Hình 2.1. Sơ đồ xương cá tính độ không đảm bảo đo...............................................28
Hình 3. 1. Phổ hấp thụ phân tử của 6 anthocyanidin ................................................31
Hình 3. 2. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp 6 anthocyanidin khi sử dụng gradient 1 ..............32
Hình 3. 3. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp 6 anthocyanidin khi sử dụng gradient 2 ..............33
Hình 3. 4. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp 6 anthocyanidin khi sử dụng gradient 3 ..............34
Hình 3. 5 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp 6 anthocyanidin khi sử dụng gradient 4 ...............35
Hình 3. 6 Ảnh hưởng của nồng độ axit TFA đến tổng diện tích pic anthocyanidin 36
Hình 3. 7. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp 6 anthocyanidin tốc độ dòng 1 ml/phút ...............38
Hình 3. 8. Ảnh hưởng khối lượng cân đến hàm lượng anthocyanidin ......................39
Hình 3. 9. Mức độ ảnh hưởng các nhân tố khảo sát đến hàm lượng anthocyanidin .43
Hình 3. 10 . Tương quan giữa thực nghiệm và mô hình của hàm lượng
anthocyanidin ............................................................................................................47
Hình 3. 11. Đồ thị mặt mục tiêu hàm lượng anthocyanidin theo nhiệt độ và nồng độ
axit .............................................................................................................................48

Hình 3. 12. Đường đồng mức hàm lượng anthocyanidin theo nhiệt độ và nồng độ
axit .............................................................................................................................48
Hình 3. 13. Sắc đồ thủy phân mẫu chuẩn tại điều kiện tối ưu trên LC/MS/MS .......55
Hình 3. 14. Sắc đồ mẫu trắng không chứa anthocyanidin ........................................58
Hình 3. 15. Sắc đồ chất chuẩn hỗn hợp 6 anthocyanidin ..........................................58
Hình 3. 16. Sắc đồ thêm chuẩn hỗn hợp 6 anthocyanidin.........................................58
Hình 3. 17. Phổ tinh khiết 6 anthocyanidin ...............................................................59
Hình 3. 18. Khoảng tuyến tính của delphinidin từ 0,1 – 20ppm ...............................60
Hình 3. 19. Khoảng tuyến tính của Petunidin từ 0,1 – 20ppm..................................60

v


DANH MỤC BẢNG VIẾT TẮT
Viết tắt

Tên tiếng Anh

Tên tiếng Việt

ACN

Axetonitrile

Axetonitril

AOAC

Association

of

Official Hiệp hội các nhà hóa học

Analytical Community

phân tích

CCD

Centre composite design

Mô hình bậc hai tâm xoay

CE

Cappillary electrophoresis

Phương pháp điện di mao
quản

CTAB

Cetyltrimethylammonium

Xetyltrimetylammonium

bromide

bromit

Cya

Cyanidin

Cyanidin

CZE

Cappillary zone electrophoresis Điện di mao quản vùng

Del

Delphinidin

Delphinidin

HPLC

High-performance liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

chromatography
HPLC –

High-Performance Liquid

Sắc kí lỏng hiệu năng với

UV/VIS

Chromatography with

detector tử ngoại – khả

Ultraviolet -visible

kiến

High-Performance Liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chromatography with Photo

với detector diod quang

HPLC-PDA

Diode Array detecter
LC-MS/MS

Liquid chromatography–mass

Sắc ký lỏng ghép nối khối

spectrometry –mass

phổ.

spectrometry
LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantification

Giới hạn định lượng

Mal

Malvidin

Malvidin

vi


MEKC

Điện động học mixel

Micellar electrokinetic
chromatography

MeOH

Methanol

Metanol

Pelar

Pelargorindin

Pelargorindin

Peo

Peonidin

Peonidin

Petu

Petunidin

Petunidin

RSD (%)

The relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

RSM

Response Surface Methodology Phương pháp măt mục tiêu

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

SDS

Sodium dodecyl sulfate

Natri dodexyl sunphat

TFA

Trifluoroaxetic axit

Axit Trifluoroaxetic

UPLC

Ultra-Performance Liquid

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

Chromatography
UV – VIS

Phương pháp phổ hấp thụ

Ultraviolet–visible

phân tử

vii


ĐẶT VẤN ĐỀ
Anthocyanin là một họ chất màu tự nhiên thuộc nhóm flavonoid có hoạt tính
chống oxy hóa mạnh. Anthocyanin có màu đỏ, xanh, tím chứa trong rau, củ, quả, hoa
và lá của thực vật bậc cao. Anthocyanin được tìm thấy trong tự nhiên ở dạng aglycon
(anthocyanidin) liên kết với gốc đường (glycoside) [19]. Để xác định chính xác từng
anthocyanin gặp rất nhiều khó khăn vì thiếu chất chuẩn do có trên 600 anthocyanin
khác nhau đã được phát hiện, trong khi đó chỉ có 6 anthocyanidin phổ biến [9]. Do
vậy, để định lượng chính xác các anthocyanin cần phải có tác nhân cắt mạch gốc
đường chuyển từ dạng anthocyanin thành anthocyanidin.
Hiện nay, trên thế giới các nghiên cứu định lượng anthocyanidin đang được
quan tâm bởi các công trình công bố trước đây thường chỉ dừng lại ở tìm điều kiện
tối ưu để chiết anthocyanin ra khỏi mẫu, khi tách các anthocyanin trên sắc kí gặp
nhiều khó khăn, cần thời gian phân tích dài và cũng chỉ giới hạn trong việc định lượng
một số anthocyanin phổ biến. Số lượng công trình xác định anthocyanidin rất hạn
chế, do quá trình thủy phân cắt mạch gốc đường có nhiều yếu tố ảnh hưởng và cần
tìm được điều kiện tối ưu quá trình thủy phân để sự chuyển hóa hoàn toàn từ
anthocyanin thành anthocyanidin mà không bị phân hủy. Để tối ưu điều kiện thủy
phân các nghiên cứu thường khảo sát ảnh hưởng đồng thời các yếu tố ảnh hưởng đến
khả năng chiết cho hiệu quả cao[25][28].
Ở Việt Nam, các công trình đã công bố chủ yếu xác định anthocyanin dạng

tổng số bằng phương pháp UV-VIS [2],[3]. Xác định anthocyanidin bằng phương
pháp sắc kí còn hạn chế, các nghiên cứu tìm điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân
được tiến hành theo hướng đơn biến [6],[4]. Với mục tiêu nghiên cứu của đề tài là
tách và xác định đồng thời 6 anthocyanidin trong mẫu rau củ quả Việt Nam, chúng
tôi thực hiện đề tài: “Tối ưu hóa các điều kiện định lượng một số anthocyanidin trong
rau củ quả bằng phương pháp sắc kí” với nội dung nghiên cứu như sau:
-

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách và xác định các
anthocyanidin trên HPLC.

1


-

Tối ưu hóa điều kiện thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin theo
phương pháp mặt mục tiêu.

-

Ứng dụng quy trình để định lượng các anthocyanidin trong mẫu rau củ quả
tại Việt Nam.

2


CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về anthocyanin và anthocyanidin
1.1.1. Giới thiệu về anthocyanin

Anthocyanin thuộc nhóm chất màu tự nhiên tồn tại trong thực vật bậc cao.
Anthocyanin được sử dụng làm chất màu tự nhiên trong thực phẩm tạo màu sắc đẹp
mắt đồng thời chứa nhiều giá trị quý do có hoạt tính sinh học cao, có khả năng chống
oxy hóa mạnh giúp ngăn chặn và tiêu diệt các gốc tự do, giúp con người ngăn chặn
các bệnh lý về thần kinh, tim mạch, tiểu đường và đẩy lùi sự phát triển của tế bào ung
thư…[9],[23].
Trong tự nhiên, anthocyanin có trong thực vật nhằm tạo những màu sắc đặc
trưng từ màu đỏ, hồng, xanh, tím, cam, đen…Do vậy, con người có thể chiết các chất
màu từ thực vật để nhuộm màu cho thực phẩm rất an toàn và có giá trị dinh dưỡng
cao.
Anthocyanin là những glycosides do gốc đường glucose, galactose, rutinose...
kết hợp với gốc aglycon có màu (anthocyanidin). Các anthocyanin khi mất hết nhóm
đường được gọi là anthocyanidin hay aglycon. Mỗi anthocyanidin có thể bị glycosyl
hóa acylat bởi các loại đường và các axit khác tại các vị trí khác nhau. Do đó, số
lượng anthocyanin lớn hơn từ 15-20 lần so với anthocyanidin. Cấu trúc cơ bản của
anthocyanin được mô tả ở hình 1.1. Các gốc đường có thể gắn vào các vị trí 3,5,7
trong đó chủ yếu là vị trí 3 hoặc 5, vị trí 7 rất ít. Sự đa dạng của anthocyanin là do sự
gắn các nhóm H, OH, OCH3 và các nhóm đường vào các vị trí khác nhau.

Hình 1. 1. Cấu trúc cơ bản của anthocyanin

3


1.1.2. Cấu trúc hóa học của anthocyanidin
Anthocyanidins (aglycons) có dạng cấu trúc cơ bản của anthocyanin, cấu trúc
hóa học chứa vòng thơm A liên kết với dị vòng C chứa oxy và được liên kết bởi liên
kết cacbon – cacbon với vòng thơm B [21]. Anthocyanidin thuộc nhóm các hợp chất
flavonoid có khả năng tan trong dung môi phân cực như nước, metanol, ethanol…là
dạng hợp chất polyhidroxyl và polymethoxy của 2 - phenylbenzopyrylium hoặc muối

flavylium [19].
Hiện nay, có khoảng 17 anthocyanidin khác nhau đã được xác định nhưng chỉ
có 6 anthocyanidin phổ biến trong tự nhiên là cyanidin (Cya), delphinidin (Del),
malvidin (Mal), petunidin (Petu), pelargonidin (Pelar) và peonidin (Peo). Trong tự
nhiên, các anthocyanidin thường liên kết với các gốc đường khác nhau như glucose
(Glu), galactose (Gal), arabinose (Ara), rutinose (Rut), rhamnose (Rham), xylose
(Xyl) dưới dạng mono -, di - hoặc tri - glycoside [29] tạo thành 600 anthocyanin.
Dạng liên kết với gốc đường phổ biến nhất là 3 - monoside, 3 - bioside, 3,5 diglucoside và 3,5 - diglucoside. Dẫn xuất 3 - glucoside thường lớn hơn 2,5 lần dạng
diglucoside, trong đó phổ biến nhất là cyanin - 3 - glucoside [9].
Cấu trúc cơ bản của anthocyanidin được mô tả trong hình 1.2. Sự khác nhau
của các anthocyanidin do sự thay đổi nhóm H, OH và OCH3 gắn vào vị trí R1, R2
trong vòng thơm B.

Hình 1.2. Cấu trúc cơ bản của anthocyanidin
Trong tự nhiên, các anthocyanidin phổ biến tồn tại trong thực vật là delphinidin,
cyanidin, petunidin, pelargonidin, peonidin và malvidin. Trong đó sự phân bố trong

4


rau, củ và quả của cyanidin chiếm 50%, delphinidin 12%, pelargonidin 12%,
petunidin 7%, peonidin 12% và malvidin 7% [19].
Các anthocyanidin tồn tại dưới dạng cation flavylium có cấu trúc được mô tả
như trong hình 1.3.

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của 6 anthocyanidin

5

1.1.3. Tính chất của anthocyanidin
Anthocyanidin là hợp chất có cấu trúc phân cực nên có khả năng tan tốt trong
các dung môi phân cực như nước, metanol, etanol, không tan trong các dung môi
không phân cực. Dung môi chiết anthocyanidin được sử dụng phổ biến là metanol
hoặc etanol và để tăng tính bền màu của anthocyanidin, người ta thường bổ sung một
lượng nhỏ của axit hydrocloric, axit axetic, axit xitric, axit tartaic, axit trifluoroaxetic
vào dung môi chiết [25]. Do đó, hệ dung môi chiết thường dùng là CH3OH – HCl;
C2H5OH - HCl… Nhóm nghiên cứu Steven W. Lloyd và cộng sự [20] đã so sánh khả
năng chiết anthocyanin bằng hỗn hợp hệ dung môi của metanol được thêm các axit
axetic, axit focmic, axit chlorhydric, axit photphoric cho thấy khi chiết bằng dung
môi CH3OH - HCl có hiệu suất cao nhất.
Tại Việt Nam, tác giả Nguyễn Thị Lan [3] cùng cộng sự đã nghiên cứu ảnh
hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng và độ màu của anthocyanin. Các dung môi
nghiên cứu gồm metanol - nước - HCl (tỉ lệ 1: 1,1% HCl), etanol - nước - HCl (tỉ lệ
1:1,1% HCl), nước - axit clorhydric (1%), nước - axit focmic (5%), nước - axit axetic
(5%) trên đối tượng mẫu quả dâu Hội An thì hệ dung môi etanol - nước - HCl cho
hàm lượng tổng anthocyanin 1,046%, với dung môi chiết metanol - nước - HCl là
0,949%. Khả năng chiết bằng dung môi etanol - HCl và metanol - HCl cho hiệu quả
chiết là cao nhất.
Màu sắc của anthocyanidin thay đổi phụ thuộc vào pH môi trường, nhiệt độ,
cấu trúc hóa học, nồng độ, dung môi…Trong đó cấu trúc hóa học bị thay đổi mạnh
khi thay đổi pH dẫn tới sự thay đổi màu của anthocyanidin.
Tại môi trường pH thấp khoảng pH = 3 anthocyanindin tồn tại dưới dạng
cation flavylium có màu đỏ hoặc cam đậm. Khi tăng pH cơ chế cạnh tranh xảy ra
giữa phản ứng hydrat hóa của cation flavylium và phản ứng chuyển dịch proton trong
nhóm hydroxyl, do đó phản ứng tạo carbinol giả làm mất màu của anthocyanindin tại
pH = 4 - 5. Sau đó, phản ứng làm chuyển về dạng quinon có màu tím tại pH = 6 - 7
và dạng cộng hưởng anion quinon có màu xanh tại pH = 7 - 8. Sự thay đổi màu sắc
của anthocyanidin theo pH được thể hiện như hình 1.3.

6


Hình 1.4. Sự thay đổi cấu trúc hóa học của anthocyanidin theo pH
Theo nghiên cứu A. Castaneta – Ovando và cộng sự [9] khi thay đổi các dung
dịch (axetonitril : nước, etanol, propilen - glycol, dioxane và 2 - butanone) màu tự
nhiên của anthocyanindin bị thay đổi phụ thuộc vào nồng độ dạng muối flavylium.
Trong dung môi phân cực có màu đỏ nhưng trong dung môi ít phân cực tồn tại dạng
màu vàng là do sự mono hóa hoặc dime hóa. Do đó, khi nồng độ muối tăng màu đỏ
là màu nổi bật. Trạng thái bền của anthocyanidin bị ảnh hưởng bởi sự xuất hiện thêm
các nhóm OH hoặc OCH3 gắn vào vòng thơm B làm giảm tính bền của aglycon trong
môi trường trung hòa, vì thế Pelargonidin là anthocyanindin bền nhất vì chỉ có 1 nhóm
OH. Ngược lại, dạng anthocyanin có gắn các gốc đường monoglycoside và
diglycoside là những dẫn xuất bền trong điều kiện trung tính. Ngoài ra, mức độ metyl
hóa các nhóm – OH của vòng benzen càng cao thì màu càng đỏ.
Do khả năng phản ứng mạnh và dễ bị phân hủy, nên để bảo vệ độ bền màu và
tính chất của anthocyanidin, chúng phải được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 2 - 40C và
tránh ánh sáng. Sự phân hủy và mất màu tăng nhanh khi đun nóng ở nhiệt độ cao 65
- 900C trong vài giờ làm giảm 50% cường độ màu [35].
Các anthocyanidin có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng khả kiến, cực đại
hấp thụ trong khoảng bước sóng 510nm – 540nm. Anthocyanidin được chiết trong
môi trường axit mạnh có màu đỏ, cường độ màu phụ thuộc vào nồng độ và pH. Nồng

7


độ của anthocyanidin càng lớn độ hấp thụ quang càng cao, dung dịch có màu đỏ sậm.
do đó cực đại hấp thụ thường được thiết lập ở bước sóng 520nm.
1.1.4. Tác dụng của anthocyanin
Trong thực vật, anthocyanin có tính kháng khuẩn, kháng nấm giúp thực vật

tránh được một số bệnh nấm ở cây, do có màu sắc sặc sỡ thu hút động vật, chim và
côn trùng nên thúc đẩy quá trình thụ phấn và phát tán phấn hoa. Ngoài ra, anthocyanin
có khả năng hấp thụ mạnh tia tử ngoại nên có thể bảo vệ tế bào trong quá trình quang
tổng hợp, giúp bảo vệ bộ gen của thực vật.
Anthocyanin được chiết xuất từ tự nhiên được sử dụng làm các chất màu bổ
sung vào thực phẩm và đồ uống tạo nên màu đẹp mắt cho sản phẩm đồng thời mang
lại nhiều giá trị dinh dưỡng và các hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe.
Anthocyanin có nhiều hoạt tính sinh học quý như:
 Khả năng chống oxy hóa cao nên được sử dụng làm chất chống oxy hóa trong
thực phẩm. Các anthocyanidin được sử dụng để bảo quản thực phẩm làm bền
chất béo, chống nấm mốc, kháng khuẩn, chống viêm [35].
 Khả năng chống oxy hóa lớn hơn vitamin E, vitamin C và  - caroten nên được
sử dụng làm chất chống lão hóa, chống lại sự suy giảm miễn dịch, suy giảm
sức đề kháng [23].
 Anthocyanin được sử dụng rộng rãi trong y học do có khả năng giảm tính thấm
thành mạch và tế bào nên có khả năng chống chảy máu.
 Do có khả năng bắt các điện tử tự do nên anthocyanidin có khả năng chống lại
các tia bức xạ và các gốc tự do ·OH, ROO· … nên có khả năng ngăn cản sự
phát triển của một số tế bào ung thư, chống lại sự hủy hoại tế bào khi tiếp xúc
với môi trường bức xạ [9].
 Đối với hệ thần kinh: hoạt tính của pelargonidin giúp ngăn chặn quá trình nitro
hóa của tyrosin nên bảo vệ hệ thống thần kinh, chống xơ cứng động mạch.
 Anthocyanin có thể ngăn cản quá trình xơ vữa động mạch, ngăn cản quá trình
oxi hóa của lipoprotein mật độ thấp (low density lipoprotein, LDL, một loại

8


protein chứa cholesterol và chất béo trung tính trong huyết tương), giúp bảo
vệ tim mạch và chống stress oxy hóa.

 Ngoài ra, anthocyanin đóng vai trò quan trọng giúp phòng và điều trị các bệnh
về mắt, cải thiện khả năng nhìn trong bóng tối, các bệnh về phổi và tiểu đường.
1.1.5. Sự phân bố của anthocyanin trong thực vật
Trong tự nhiên, anthocyanin được tìm thấy chủ yếu trong thực vật bậc cao, tuy
nhiên có một lượng nhỏ được tìm thấy trong thực vật bậc thấp trong rêu và dương xỉ.
Anthocyanin tồn tại trong các bộ phận lá, hoa, quả làm cho thực vật có màu sặc sỡ,
trong đó 80% được tìm thấy trong lá có màu, 69% trong quả, 50% trong hoa là dẫn
xuất glucoside của cyanidin, delphinidin, pelargonidin [9].
Trong các chất màu được sử dụng trong thực phẩm thì anthocyanin là chất
màu được sử dụng phổ biến. Chất màu anthocyanin được chiết từ một số rau, củ, quả,
lá, hạt và hoa của một số loài như: quả họ berri, họ cherry, quả nho, quả nhiệt đới,
quả mận, đỗ đen, cà chua tím, bắp cải tím, cà tím, dâu tây, lá tía tô, ngô, cà rốt tím,
khoai tây, thanh mai…Hàm lượng anthocyanin trong rau, củ, quả từ 0,1% - 1,0% tính
theo khối lượng chất khô .
1.2. Phương pháp xác định anthocyanidin
Anthocyanidin có nhiều hoạt tính sinh học quí nên được các nhà nghiên cứu ở
Việt Nam và thế giới quan tâm. Định lượng các anthocyanidin trong thực phẩm, rau
củ, quả bằng nhiều phương pháp khác nhau. Dưới đây là một số phương pháp phổ
biến đã được nghiên cứu để định lượng anthocyanidin.
1.2.1. Phương pháp điện di mao quản
Nguyên tắc phương pháp điện di mao quản: các chất phân tích được đặt trong
ống mao quản hẹp trong điện trường, do sự linh động điện di của các ion khác nhau
nên các chất di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau. Ưu điểm của
phương pháp là độ phân giải cao, lượng mẫu tiêu tốn ít nên lượng dung môi thải ít,
do đó chi phí thấp.

9


Để phân tích các anthocyanin, mẫu được đưa vào mao quản phía anot và pha

động sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu hướng về phía catot trong khi các cấu tử
khác được giữ lại tại anot.
Phương pháp điện di mao quản thường sử dụng để tách anthocyanin, sự di
chuyển của các chất phụ thuộc vào tỉ lệ điện tích và kích thước, thời gian di chuyển
của các hạt điện tích dương và kích thước nhỏ nhiều hơn phân tử có điện tích nhỏ
kích thước lớn.
P. Bridle [26] đã xác định 6 anthocynin bằng phương pháp điện di mao quản
vùng (CZE) là malvidin - 3,5 - diglucoside, pelargonidin - 3 - glucoside, malvidin 3 - glucoside, cyanidin - 3 - rutinoside, cyanidin - 3 - glucoside, delphinidin - 3 glucoside. Anthocyanin được hòa tan trong hỗn hợp đệm phosphat pH = 2,5 và
metanol (3:1). Dung dịch được bơm vào mao quản silica dài 50cm đường kính 75µm
tại nhiệt độ 250C môi trường đệm natri tetraborat 150mM có pH = 8 sử dụng detector
diode – array tại bước sóng 580nm và áp điện thế cao 25kV các anthocynin được tách
trong thời gian 10 phút.
Phương pháp điện di mao quản vùng (CZE) được thực hiện trong môi trường
bazơ làm cho các anthocyanin kém bền vì vậy để tăng độ bền của chất phân tích cần
chuyển sang môi trường axit cho anthocyanin tồn tại dưới dạng cation flavylium.
Trong môi trường axit anthocyanin sẽ di chuyển về anot ngược với dòng điện di.
Caboni và Patrizia Comandini [13] đã xác định ba anthocyanin pelargonidin 3 - glucoside, pelargonidin - 3 - rutinoside và cyanidin - 3 - glucoside trong dịch chiết
quả dâu tây bằng phương pháp điện di mao quản vùng và so sánh kết quả với phương
pháp sắc kí lỏng. Trong nghiên cứu này tác giả sử dụng dung dịch đệm axit có pH =
1,4 để giữ màu bền của cation flavylium có bước sóng hấp thụ cực đại tại 280nm.
Điều kiện đo: điện thế 23 kV, nhiệt độ mao quản 250C, chiều dài mao quản 45cm,
thời gian phân tích nhanh 22 phút cả ba chất tách nhau hoàn toàn, lượng mẫu tiêu tốn
ít. Phương pháp sắc kí lỏng (HPLC) sử dụng detector mảng diod đặt bước sóng đo
520nm có thời gian phân tích 60 phút. Tuy nhiên, phương pháp điện di có giới hạn
phát hiện và giới hạn định lượng cao hơn 10 lần so với phương pháp sắc kí. Phương

10


pháp điện di mao quản vùng (CZE) có giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định

lượng (LOQ) của pelargonidin - 3- glucoside lần lượt là 2,06 và 6,87mg/L trong khi
phương pháp sắc kí lỏng có LOD và LOQ lần lượt là 0,04 và 0,13mg/L. Kết quả phân
tích mẫu dâu tây bằng hai phương pháp cho thấy hàm lượng pelargonidin - 3 glucoside theo phương pháp điện di là 11,41mg/L, phương pháp sắc kí là 11,37mg/L.
Một số nghiên cứu khác [35] tác giả sử dụng chất hoạt động bề mặt cation
cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) hoặc sodium dodecyl sulfate (SDS) trong
môi trường đệm phosphate hoặc đệm phosphate – borate để xác định anthocyanidin
theo phương pháp điện di điện động học micel (MEKC) với detector UV - VIS.
1.2.2. Phương pháp phổ hấp thụ phân tử UV - VIS
Nguyên lí của phương pháp dựa trên sự thay đổi độ màu của anthocyanin tại
các pH khác nhau. Tại pH = 1,0 các anthocyanin tồn tại ở trạng thái oxonium hoặc
flavylium có màu đỏ và cường độ màu là cực đại, tại pH = 4,5 chúng chuyển cấu trúc
và tồn tại dưới dạng carbinol không màu. Từ sự khác nhau về độ hấp thụ quang tại
bước sóng 520nm tại pH = 1 và pH = 4,5 tính được nồng độ của anthocyanin trong
mẫu
AOAC [8] đã ban hành tiêu chuẩn xác định tổng hàm lượng chất màu
anthocyanin trong nước uống, nước hoa quả, rượu và đồ uống theo phương pháp pH
vi sai trong khoảng nồng độ từ 20 – 3000mg/L tính theo cyanidin – 3 – glucoside, các
đối tượng mẫu được pha loãng trong các dung dịch đệm và đo quang trực tiếp tại
bước sóng 520nm.
Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Hiển [2] và cộng sự đã nghiên cứu chiết
chất màu anthocyanin trong đài bụp giấm bằng phương pháp so màu và phương pháp
pH vi sai, tìm được điều kiện tối ưu quá trình chiết chất màu là dung môi ethanol:nước
tỉ lệ 50:50 được axit hóa HCl 1%, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 14ml/1g, thời gian
chiết 6 ngày, ở nhiệt độ phòng. Chất màu thô anthocyanin từ dịch chiết đài bụp giấm
và xác định hàm lượng chất màu trong nguyên liệu khô là 15,2%, trong nguyên liệu
tươi là 1,06%.

11

Nhóm nghiên cứu Huỳnh Thị Kim Cúc [1] và cộng sự đã xác định hàm lượng
anthocyanin tổng trong một số nguyên liệu rau, quả (quả dâu, bắp cải tím, lá tía tô,
trà đỏ, vỏ quả nho, vỏ quả cà tím) bằng phương pháp pH vi sai. Hàm lượng
anthocyanin trong quả dâu là 1,188%, bắp cải tím 0,909%, lá tía tô 0,397%, trà đỏ
0,335%, vỏ quả nho 0,564%,vỏ cà tím 0,441%.
Tác giả Nguyễn Thị Lan [3] và cộng sự đã khảo sát hệ dung môi chiết axit
formic, axit acetic và axit hydrochloric trong metanol hoặc ethanol và tìm được dung
môi tối ưu để chiết là ethanol: nước tỉ lệ 1:1 (với 1% HCl) để tách chất màu
anthocyanin từ quả dâu Hội An. Hàm lượng anthocyanin thô được xác định bằng
phương pháp pH vi sai đo độ hấp thụ quang cực đại của mẫu ở pH = 1 và pH = 4,5
tại bước sóng có độ hấp thụ cực đại 515nm và so với độ hấp thụ tại bước sóng 700nm
(độ đục của mẫu). Hàm lượng anthocyanin thu được trong quả dâu là 1,047%.
1.2.3 Phương pháp sắc kí lỏng HPLC
Phương pháp sắc kí lỏng được sử dụng phổ biến để xác định anthocyanin hoặc
anthocyanidin với detector UV, PDA, DAD hoặc đầu dò khối phổ MS.
Bằng phương pháp sắc kí lỏng HPLC với detector PDA Vũ Thị Trang [4] và
cộng sự đã tách và xác định được 3 anthocyanidin là delphinidin, cyanidin và
pelargonidin trong 9 mẫu rau củ quả trên địa bàn Hà Nội. Phương pháp có giới hạn
phát hiện từ 0,10 – 0,24 µg/mL, giới hạn định lượng từ 0,30 – 0,71 µg/mL. Mẫu được
thủy phân trong dung môi CH3OH - HCl 2N (tỉ lệ 85: 15), thời gian thủy phân 120
phút ở nhiệt độ 800C. Kết quả phân tích một số mẫu thực bắp cải tím có cả 3
anthocyanidin, mẫu bắp cải ở chợ Hôm có hàm lượng delphinidin 0,42mg/100g,
cyanidin 58,79mg/100g, pelargonidin 3,92mg/100g, mẫu bắp cải chợ Long Biên có
hàm lượng delphinidin 0,21mg/100g, cyanidin 27,65mg/100g, pelargonidin
1,87mg/100g. Khoai lang tím có hàm lượng cyanidin 34,44mg/100g và pelargonidin
0,13mg/100g với mẫu mua tại chợ Hôm, tại chợ Long Biên hàm lượng cyanidin
3,05mg/100g và pelargonidin 0,11mg/100g. Trong củ rền đỏ và rau dền đỏ không
phát hiện anthocyanidin.

12

Tại Việt Nam, nhóm nghiên cứu Vũ Thị Trang [6] và cộng sự đã xác định
đồng thời 5 anthocyanidin phổ biến là cyanidin, delphinidin, pelargonidin, malvidin
và peonidin bằng phương pháp sắc kí lỏng ghép nối khối phổ hai lần (UPLC/MS/MS)
thời gian phân tích sắc kí 13 phút. Mẫu được thủy phân trong hỗn hợp MeOH/HCl
2,7M ở 800C trong 2 giờ. Hiệu suất thủy phân đạt 95% và độ chụm RSD < 4%.
Phương pháp được áp dụng phân tích mẫu trên thị trường cho hàm lượng
anthocyanidin từ 1 – 50mg/100g.
Steven W. Lloyd [20] và cộng sự đã cải tiến phương pháp phân tích
anthocyanidin trong quả việt quất bằng phương pháp mặt mục tiêu để tìm điều kiện
tối ưu của quá trình thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin. Thí nghiệm được
thiết kế theo mô hình bậc hai tâm xoay (central composite design CCD) dựa trên ba
yếu tố có ảnh hưởng lớn đến quá trình thủy phân là nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy
phân và nồng độ axit trong metanol. Để tìm được điều kiện biên cho quá trình tối ưu
hóa thực nghiệm, nhóm nghiên cứu đã khảo sát đơn biến các yếu tố bao gồm: phương
pháp thủy phân, loại axit trong dung môi chiết, thời gian thủy phân. Kết quả khảo sát
phương pháp thủy phân trong bình kín và phương pháp chưng cất hồi lưu cho hàm
lượng anthocyanidin khác nhau không có ý nghĩa. Trong 4 axit được khảo sát là axit
acetic, axit formic, axit hydrochloric và axit photphoric cho thấy axit hydrochloric
cho hiệu suất thủy phân là lớn nhất. Khi khảo sát thời gian thủy phân, nếu thủy phân
trên 100 phút xuất hiện hiện tượng giảm diện tích pic của Mavidin trong nước ép quả
việt quất. Qua thống kê kết quả báo cáo của 25 bài báo về điều kiện thủy phân
anthocyanidin trong rau, quả và nước uống, từ đó nhóm nghiên cứu đưa ra mô hình
thực nghiệm khảo sát đồng thời sự phụ thuộc của nhiệt độ từ 80 – 1200C, thời gian
20 – 60 phút và nồng độ HCl từ 1 – 3M, cánh tay đòn α = 1,68. Với 32 thí nghiệm
được thiết kế và thực nghiệm theo mô hình kết quả tối ưu điều kiện chiết mẫu ở nồng
độ axit HCl 3,7M trong metanol, nhiệt độ thủy phân ở 990C trong thời gian 6,4 phút.
Những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thủy phân bao gồm ảnh hưởng bậc nhất của
thời gian, nồng độ axit và ảnh hưởng bậc hai của nồng độ axit, nhiệt độ, ảnh hưởng

tương hỗ của nhiệt độ với thời gian, nhiệt độ với nồng độ axit. Mẫu sau thủy phân

13


được phân tích trên UPLC với detector UV hấp thụ bước sóng cực đại 525nm, pha
động axit photphoric 3% và acetonitril có 5 anthocyanidin là delphinidin, cyanidin,
petunidin, peonidin và malvidin được phát hiện trong quả berry.
N. Annika Nyman [25] đã xác định 6 anthocyanidin phổ biến có trong rượu
vang đỏ và quả họ berri như dâu tây, quả việt quất rừng, quả lí chua đen. Quá trình
thủy phân cắt các gốc đường của anthocyanin được thực hiện trong axit HCl 2M trong
metanol ở nhiệt độ 900C trong 50 phút, sau đó phân tích trên HPLC/DAD đã xác định
được hiệu suất thủy phân dạng aglycon từ 95 -102% và 69 – 104% từ dạng glucoside.
Hàm lượng anthocyanidin có chứa trong quả dâu tây 23,8 ± 0,4 mg/100g, quả lí chua
đen 135,0 ± 3,0 mg/100g, quả việt quất rừng 360,0 ± 3,0 mg/100g, rượu vang cabernet
26,1 ± 0,1 mg/100mL.
Carina Pinho [28] và cộng sự đã tối ưu hóa điều kiện thủy phân rượu vang đỏ
bằng phương pháp mặt mục tiêu. Dạng aglycon của anthocyanins được định lượng
bằng HPLC/DAD. Ba biến ảnh hưởng là nồng độ HCl, nhiệt độ và thời gian thủy
phân được thiết kế thí nghiệm theo mô hình bậc hai tâm xoay gồm 20 thí nghiệm.
Điều kiện tối ưu quá trình thủy phân tìm được ở nhiệt độ 166,20C, dung môi thủy
phân 9,8mL HCl 32% trong metanol với thời gian thủy phân 46,6 phút. Ảnh hưởng
đáng kể của bậc nhất các yếu tố, ảnh hưởng bậc hai của nhiệt độ, thời gian và ảnh
hưởng tương hỗ của nhiệt độ với thời gian đến quá trình thủy phân các anthocyanin
thành anthocyanidin. Trong mẫu rượu vang đỏ phát hiện 5 anthocyanidin là
delphinidin 23,4 ± 0,9mg/L, cyanidin 35,9 ± 2,1mg/L, petunidin 21,8 ± 0,8mg/L,
peonidin 29,0 ± 1,1mg/L và malvidin 112,8 ± 2,4mg/L. Độ thu hồi của phương pháp
từ 86 – 95%.
Jeremy S. Barnes [11] và cộng sự đã chiết và định lượng anthocyanin từ quả
việt quất bằng phương pháp sắc kí lỏng khối phổ chế độ phun điện tử theo thời gian

bay (HPLC – ESI – IT – TOF – MS) và HPLC – UV. Mẫu được chiết trong dung môi
metanol : nước : Trifluoroaxetic axit (70:30:1, v/v/v) và xác định hàm lượng bằng
phương pháp HPLC detector UV tại bước sóng 520nm. Anthocyanin được rửa giải
theo hai phương pháp, phương pháp 1 dùng dung môi pha động kênh A gồm hỗn hợp

14


nước: THF:TFA (98:2:0,1, v/v/v) kênh B là acetonitril trong 55 phút. Phương pháp 2
pha động kênh A là axit formic 10%, kênh B acetonitril thời gian phân tích 90 phút
đã xác định tổng 26 anthocyanin trong quả việt quất. Nhóm nghiên cứu xác nhận các
anthocyanin không cần sử dụng chuẩn bằng phương pháp HPLC – ESI – IT – TOF –
MS dựa trên khối lượng các mảnh được bắn phá m/z đã xác nhận được 26 anthocyanin
khác nhau có trong quả việt quất.
Gongjian Fan [15] và cộng sự đã tối ưu điều kiện chiết anthocyanin từ khoai
tây tím theo phương pháp mặt mục tiêu sử dụng dung môi chiết axit HCl trong
ethanol. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ từ 40 – 800C, thời gian chiết 60 – 120 phút
và tỉ lệ chất khô từ 1:15 – 1:35. Khảo sát ảnh hưởng đồng thời các yếu tố theo mô
hình Box – Behnken với 17 thí nghiệm đạt hiệu suất cao nhất 158mg/100g tại 800C,
thời gian chiết 60 phút tỉ lệ chất khô 1:32. Bằng phương pháp mặt mục tiêu nhận thấy
có sự ảnh hưởng tương hỗ của nhiệt độ chiết và tỉ lệ chất khô.
1.3. Qui hoạch hóa thực nghiệm tìm điều kiện tối ưu quá trình thủy phân
Anthocyanin bao gồm một cation flavylium (anthocyanidin) liên kết với một
hoặc nhiều phân tử đường khác nhau. Gần 600 anthocyanin đã được ghi nhận nên
việc phân tích sắc kí tạo ra số lượng lớn các píc và khó để định lượng riêng từng
anthocyanin. Để đơn giản hóa, người ta thường thủy phân các anthocyanin thành
anthocyanidin và phân tích 6 anthocyanidin phổ biến (gồm: cyanidin, delphinidin,
petunidin, peonidin, pelargonidin và malvidin).
Hiện nay, ở nước ta các công trình đã công bố thường tìm điều kiện tối ưu để
thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin theo phương pháp đơn biến. Nhược điểm

của phương pháp là chỉ biến đổi một biến trong khi giữ cố định giá trị các biến còn
lại nên số thí nghiệm cần thực hiện nhiều, trong nhiều trường hợp không phản ánh
đúng thực nghiệm khi có sự tương tác giữa các biến.
Các công trình nghiên cứu đã công bố về điều kiện thủy phân anthocyanin
thành anthocyanidin trong rau, hoa, quả và đồ uống được thực hiện theo hai phương
pháp là gia nhiệt hồi lưu hoặc gia nhiệt trong hệ kín. Trong đó có ba yếu tố chính ảnh
hưởng đến hiệu suất thủy phân là nhiệt độ, thời gian và nồng độ axit. Điều kiện tối

15


ưu của quá trình thủy phân được công bố rất khác nhau: nhiệt độ thủy phân trong
khoảng 75 – 1660C, thời gian thủy phân từ 30 phút – 5 giờ, nồng độ axit trong khoảng
1,1N – 3N. Bảng 1.1 trình bày các điều kiện khác nhau để thủy phân anthocyanin
trong một số đối tượng.
Bảng 1. 1. Một số điều kiện thủy phân anthocyanin

Nguồn tham khảo

HCl

Nhiệt

Thời gian

(M)

độ (0C)

(phút)

Nền mẫu

Vũ Thị Trang [6]

Rau, củ, quả

2,7

80

120

Aubin - Hynes [10]

Quả việt quất

1,1

150

30

Uddin [34]

Hoa

1,3

100

120

Gao and Mazza [16]

Quả việt quất

2

100

60

Wang [36]

Quả nho

2

100

30

Rodriguez [7]

Việt quất bụi

2,5

90

60

Fan –Chiang [18]

Quả mâm xôi

2

100

45

Pinho [28]

Rượu vang

2,87

166,2

46,6

Burdulis [12]

Quả việt quất

2,95

100

120

2

90

50

1,8

75

300

Nyman [25]
Merken [24]

Dâu tây, rượu vang, quả
mâm xôi
Việt quất, hành, dâu tây

Nhằm tránh các hạn chế của phương pháp đơn biến, một số công trình trên thế
giới đã sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm theo mô hình hồi quy đa biến
để tìm điều kiện tối ưu quá trình thủy phân [28],[22],[14],[17]…Các nghiên cứu chủ
yếu sử dụng phương pháp mặt mục tiêu (RSM) để mô hình hóa, tìm điều kiện tối ưu
và đánh giá ảnh hưởng các yếu tố. Phương pháp mặt mục tiêu có ưu điểm: đánh giá

16