Nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) tối ưu hóa các điều kiện phân tích một số axit amin trong cá

Bộ y tế
Viện dinh dỡng
===== =====



Báo cáo nghiệm thu đề tài nghiên cứu cấp Viện






Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC) tối u hoá các điều kiện
phân tích một số acid amin trong cá





Cơ sở quản lý: Cấp cơ sở
Chủ nhiệm đề tài: Thạc sỹ Lê Thị Hồng Hảo
Nơi thực hiện: Khoa Hóa - ATVSTP




5750
05/4/2006

Hà Nội, tháng 12 - 2005
I. Đặt vấn đề
Acid amin là một thành phần quan trọng của cơ thể. Acid amin tạo nên
tế bào, phục hồi mô, tạo nên các kháng thể chống lại vi khuẩn và virut. Acid
amin là một phần của ezim và hệ thống hocmon. Nó tạo nên ARN (acid ribo
nucleic), AND (acid deoxi nucleic) vận chuyển oxi đi khắp cơ thể và tham gia
vào hoạt động của các cơ. Acid amin đợc cung cấp cho cơ thể từ thực phẩm
dầu protein. Protein khi vào cơ thể đợc chuyển hoá thành 22 acid amin, trong
đó có 8 acid amin thiết yếu không đợc tạo ra từ cơ thể, isoleucine, leucine,
lysine, methionine, phenyllalanine, threonine, tryptophan và valine. Sự thiếu
hụt acid amin dẫn đến cơ thể mệt mỏi, hạ đờng huyết, dị ứng [9].
Giá trị của một loại thức ăn không những phụ thuộc vào số lợng chất
đạm có trong thức ăn ấy mà còn phụ thuộc vào số lợng và tỷ lệ cân đối các
acid amin, nghĩa là chất lợng của protein thức ăn. Ngoài ra đối với các nớc
đang trên đà phát triển, thức ăn động vật mà protein có chất lợng tốt còn
cha đủ, thì việc phân tích các acid amin cần thiết trong thức ăn thực vật lại
càng cần thiết. Nó giúp ta phơng hớng phối hợp các thức ăn với nhau để
nâng cao chất lợng của protein trong khẩu phần. Vì vậy xác định các acid
amin trong thực phẩm là rất cần thiết.
Sự cần thiết của protein với cơ thể ngời đã đợc nghiên cứu hàng thập
kỷ qua. Nhu cầu protein và acid amin cần thiết cho cơ thể đợc công bố đầu
tiên vào năm 1973 và liên tục đợc bổ sung vào năm 1975 và sau đó là 1977
bởi FAO (Tổ chức lơng thực và thực phẩm thế giới), WHO (Tổ chức Y tế thế
giới) và NRC (Hội đồng nghiên cứu quốc tế) [5]. Để liên tục có đợc các công
bố về nhu cầu protein và acid amin cho cơ thể từ lâu trên thế giới đã áp dụng
nhiều phơng pháp phân tích hàm lợng protein và acid amin trong thực phẩm
nh: sắc ký giấy, sắc ký lỏng, sắc ký khí, định lợng vi sinh, quy trình ngày
càng hoàn thiện và đợc áp dụng nhiều kỹ thuật mới.

1

II. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Tìm các điều kiện tối u để phân tích acid amin trong cá bằng
phơng pháp sắc ký lỏng cao áp.
2.2. áp dụng và ổn định phơng pháp phân tích một số acid amin trên 5
loại cá nớc biển và 5 loại cá nớc ngọt thông dụng trên thị trờng phục vụ
cho khảo sát nguồn thực phẩm dầu acid amin, đặc biệt trong cá của Việt Nam.
III. Phơng pháp nghiên cứu
3.1. Hoá chất thuốc thử
Tất cả các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại hoá chất tinh khiết phân
tích. Acetonitril, natri borat, acid clohydric của hãng Merk (Đức), chất dẫn
suất 6-aminoquinoline, hỗn hợp chuẩn 17 acid amin của hãng Waters (Mỹ),
chất chuẩn đơn từng acid amin của hãng Prolabo (Pháp).
3.2. Hệ thống sắc ký lỏng
Hệ thống sắc ký lỏng đợc sử dụng trong nghiên cứu của chúng tôi là
hệ thống acid amin với các detector PAD 2996, huỳnh quang 2475 và bộ bơm
mẫu tự động của hãng Water (Mỹ). Cột sắc ký sử dụng là Symmetry acid
amin RP18 (150mm x 4,6mm x 3,5àm) và cột Symmetry Shield RP18
(150mm x 4,6mm x 5àm) của hãng Water. Thành phần pha động gồm đệm
borat, acetonitril, nớc cất tinh khiết chạy theo gradie. Tốc độ dòng là
1ml/phút và nhiệt độ cột là 35
o
C. Các acid amin đợc định lợng bằng
detector huỳnh quang với bớc sóng kích thích 340nm và bớc sóng phát xạ
450nm.
3.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Chuẩn hỗn hợp (17 acid amin) đợc pha từ dung dịch có chứa 2,5
mmol/àl cho tất cả các amino acid và 1,25 mmol/àl đối với cystine trong HCl
20 mmol để đợc dung dịch chuẩn làm việc có chứa 100pmol/àl đối với 17
acid amin và 50 pmol/àl đối với cystein. Dung dịch chuẩn làm việc đợc bảo
quản trong lọ màu sẫm bảo quản bằng tủ lạnh âm sâu -20

0
C dùng đợc trong
vòng 1 tháng. Các chuẩn đơn đợc hoà tan trong nớc và bảo quản trong môi
trờng acid với các điều kiện tơng tự nh chuẩn hỗn hợp.
3.4. Chuẩn bị mẫu cá

2
Mẫu nghiên cứu gồm 10 loại cá đại diện cho 50 mẫu cá: 5 loại cá nớc
ngọt (trắm, trôi, cá quả, rofi, chép); 5 loại cá nớc mặn (thu, nục, cá chim
trắng, cá hồng, cá cam). Mẫu đợc lấy ngẫu nhiên bằng cách mua tại 5 chợ
lớn tại Hà Nội, mỗi mẫu mua ít nhất 3 con, đa về phòng thí nghiệm trong
thời gian không quá hai giờ. ở phòng thí nghiệm mẫu đợc phân loại, lọc lấy
phần ăn đợc (loại bỏ phủ tạng, vẩy, vây, xơng), sau đó mẫu đợc xay nhiễn,
làm đồng nhất và tiến hành thuỷ phân ngay trong ngày lấy mẫu, phần mẫu lu
cho vào hộp sạch bảo quản trong tủ lạnh âm sâu -20
o
C.
3.5. Thuỷ phân mẫu
Theo một số tác giả [3, 4, 7] phơng pháp chủ yếu dùng để thuỷ phân
tách các acid min ra khỏi thực phẩm là thuỷ phân trong môi trờng acid
clohydric có nồng độ cao.
Quy trình thuỷ phân và phân tích mẫu nh sau:
Loại không khí bằng
nitơ, hàn kín ống
Tạo dẫn suất
Xác định bằng sắc ký lỏng pha
ngợc, Detector huỳnh quang và
PDA
Định mức bằn
g

HCl 20 mmol
Để n
g
uội, đuổi HCl d tron
g
môi
trờng chân không
ủ ở nhiệt độ thích hợp
125
o
C
Cho vào ống nghiệm thành dày
+ HCL 15%
Cân chính xác 1g mẫu đã xử lý


3
IV. Kết quả và bàn luận
4.1. Khảo sát các điều kiện phân tích
4.1.1. Khảo sát các loại dẫn suất acid amin
Để xác định đợc một số acid amin trong thực phẩm dựa trên những
điều kiện thí nghiệm sẵn có của phòng thí nghiệm Viện Dinh dỡng, chúng tôi
đã tiến hành dẫn suất các acid amin chuẩn bằng OPA (ortho-phtalaldehyt)
[hình 1] và dẫn suất bằng AMQ (6-aminoquinolin) [hình 2], qua khảo sát
chúng tôi thấy dẫn suất bằng OPA chỉ tách đợc 15 acid amin, còn dẫn suất
bằng AMQ tách đợc 17 acid amin và NH
3
với độ ổn định cao, nên trong
nghiên cứu chúng tôi chỉ tiến hành dẫn suất bằng AMQ.
Hình 1: Tách 15 acid amin bằng dẫn suất OPA

Hình 2: Tách 17 acid amin bằng dẫn suất AMQ

4.1.2. Khảo sát các điều kiện trên sắc ký lỏng
Để thực hiện một trong những nhiệm vụ quan trọng nhất của đề tài là
tách và xác định đợc acid amin, kỹ thuật đợc lựa chọn là HPLC. Kỹ thuật

4
này đang là những kỹ thuật đợc phát triển nhất hiện nay trên thế giới có hiệu
quả tách cao, độ chính xác cao cũng nh có thể tự động hoá đợc trong trờng
hợp phân tích hàng loạt.
Trong kỹ thuật HPLC ba vấn đề lớn cần tối u hoá là:
Chọn cột tách: sử dụng cột pha ngợc.
Cột sắc ký sử dụng là Symmetry acid amin RP18 (150mm x 4,6mm x
3,5àm) và cột Symmetry Shield RP18 (150mm x 4,6mm x 5àm) của hãng
Water. Qua kết quả chạy thử mẫu chuẩn cho thấy pic chạy ra với cột
Symmetry Shield RP18 không tách đợc các acid amin nên chúng tôi chọn cột
Symmetry acid amin RP18 để tiến hành phân tích mẫu.
Nghiên cứu tối u hoá pha động.
Sau khi đã tham khảo các tài liệu và chạy thử, pha động chúng tôi lựa
chọn là đệm borat, acetonitril, nớc với tỉ lệ chạy theo bảng gradien nh sau:
Bảng 1: Tỷ lệ thành phần pha động
Thời gian
(Phút)
Tốc độ dòng
(ml/phút)
% Borat % Acetonitril % H
2
O
Nền 1,0 100 0 0

0,5 1,0 99 1 0
18,0 1,0 95 5 0
19,0 1,0 91 9 0
29,5 1,0 83 17 0
33,0 1,0 0 60 40
36,0 1,0 100 0 0
65,0 1,0 0 60 40
100,0 1,0 0 60 40
Detector:
Sử dụng detector PDA và huỳnh quang là hai loại detector phổ biến, có
độ nhạy cao.
Qua khảo sát độ phát hiện của các acid amin bằng detecto huỳnh quang
nhạy hơn nhiều so với detector PAD, nên chúng tôi chọn sử dụng detector
PAD để định tính (kiểm tra lại từng dạng phổ của từng pic acid amin đơn lẻ)
còn để định lợng chúng tôi sử dụng detector huỳnh quang với bớc sóng kích
thích 340nm và bớc sóng phát xạ 450nm.
4.1.3. Các điều kiện thuỷ phân mẫu
Để thuỷ phân các sản phẩm chứa acid amin có nhiều phơng pháp, tuỳ
theo đặc tính của từng mẫu thử, tuỳ theo mục đích định tính hay định lợng.

5
+ Thuỷ phân bằng acid
+ Thuỷ phân bằng kiềm
+ Thuỷ phân bằng acid mạnh có mặt chất trao đổi ion
+ Thuỷ phân bằng men.
Trong đề tài nghiên cứu này, của chúng tôi sử dụng phơng pháp thuỷ
phân bằng acid. Trong quá trình thuỷ phân, yếu tố ảnh hởng nhiều nhất đến
kết quả của mẫu phân tích là nhiệt độ thuỷ phân và thời gian thuỷ phân.
* Khảo sát nhiệt độ ảnh hởng đến quá trình thuỷ phân:
+ Chuẩn bị dung dịch để khảo sát: Chuẩn bị một hỗn hợp chuẩn các

acid amin (gồm 17 loại acid amin) bao gồm bảy dung dịch chuẩn có cùng
nồng độ; với nền là một loại cá: 7 mẫu cá không thêm chuẩn và 7 mẫu cá
thêm chuẩn.
+ Tiến hành khảo sát:
Để khảo sát nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân acid amin chúng tôi khảo
sát trên một dãy mẫu với nồng độ hỗn hợp chuẩn acid amin và mẫu cá đợc
thêm chuẩn nh nhau, môi trờng HCl 6N, nhng nhiệt độ thuỷ phân khác
nhau (110, 115, 120, 125, 130, 135, 140
o
C) sau mỗi điều kiện nhiệt độ khác
nhau mẫu đợc đem đo.
Theo khảo sát của chúng tôi, nhiệt độ có ảnh hởng rõ rệt đến quá trình
thuỷ phân mẫu. Không chỉ ảnh hởng đến hiệu suất thu hồi (Kết quả khảo sát
yếu tố này đợc trình bầy ở bảng 2). Với điều kiện nhiệt độ cha đủ để phá vỡ
các chuỗi peptit thì chúng ta còn không thể tách đợc riêng biệt từng acid
amin (ví dụ hình 3).
Hình 3: ảnh hởng của nhiệt độ thuỷ phân đến tách các acid amin

6


Bảng 2: ảnh hởng của nhiệt độ đến hiệu suất thuỷ phân của acid amin
(Lysine) trong cá
Các điều kiện 1 2 3 4 5 6 7
Nhiệt độ (
o
C) 110 115 120 125 130 135 140
Hàm lợng biết
trớc (
àg/ml)

5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468
Hàm lợng tính
đợc (
àg/ml)
4,0946 4,532 5,3170 5,3008 5,2799 5,2997 5,3093
Hiệu suất 76,58 84,76 99,45 99,14 98,75 99,12 99,32
Kết quả bảng 2 cho thấy nhiệt độ từ 120
O
C hiệu suất phản ứng đã đạt
đợc là cao nhất. Nên chúng tôi chọn 125
O
C để làm nhiệt độ thuỷ phân mẫu.
* Khảo sát thời gian ảnh hởng đến quá trình thuỷ phân:
Để khảo sát ảnh hởng của thời gian đến khả năng thuỷ phân acid amin,
chúng tôi khảo sát trên một dãy chuẩn acid amin và mẫu cá đợc thêm chuẩn
nh nhau, môi trờng HCl 6N, nhiệt độ thuỷ phân nh nhau 125
o
C, nhng thời
gian thuỷ phân khác nhau (16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 giờ). Kết quả khảo sát chỉ
ra ở bảng 3.
Bảng 3: ảnh hởng của thời gian thuỷ phân đến hiệu suất thuỷ phân của
acid amin (Lysine) trong cá.

7
Các điều kiện 1 2 3 4 5 6 7
Thời gian (giờ) 16 18 20 22 24 26 28
Hàm lợng biết
trớc (
àg/ml)
5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468

Hàm lợng tính
đợc (
àg/ml)
5,859 4,365 4,685 5,312 5,3083 5,3152 5,2938
Hiệu suất
109,58
81,64 87,63 99,35 99,28 99,41 99,01
Kết quả bảng 3 cho thấy thời gian thuỷ phân 22 giờ trở lên hiệu suất
phản ứng thu đợc là tốt nhất. Chúng tôi đã chọn 24 giờ để tiến hành thuỷ
phân mẫu.
Khi thời gian thuỷ phân cha đủ, các acid amin trong mẫu cũng không
tách đợc ra khỏi nhau (ví dụ hình 4).
Hình 4: ảnh hởng của nhiệt độ thuỷ phân đến tách các acid amin

4.2. Đánh giá phơng pháp
4.2.1. Xác định khoảng tuyến tính
Để tiến hành xác định khoảng tuyến tính của phơng pháp phân tích,
chúng tôi pha một dãy chuẩn có nồng độ từ 0,1 đến 100(àg/ml) cho 17 acid
amin, từ 0,05 đến 50(àg/ml) đối cystine và tiến hành đo cho tất cả các acid
amin. Kết quả cho thấy đồ thị tuyến tính trong khoảng 0,5 đến 100 (àg/ml)
cho 17 acid amin, còn 0,1 đến 50(àg/ml) đối cystine với hệ số tơng quan đạt
đợc từ 0,997 đến 0,9998 cho tất cả các acid amin.
4.2.2. Độ lặp lại của phơng pháp

8
Để khảo sát độ lặp lại của phơng pháp, chúng tôi tiến hành các thí
nghiệm trên 2 loại cá. Mỗi loại cá tiến hành phân tích trên 6 mẫu.
1
)(
1

2
2


=

=
n
mtbmi
S
n
i
Độ lệch chuẩn đợc tính theo công thức sau:
Độ lệch chuẩn tơng đối đợc tính theo công thức sau:
RSD = s*100/X
TB

9
B¶ng 4: KÕt qu¶ vÒ ®é lÆp l¹i hµm l−îng trong mÉu c¸ qu¶
C¸c th«ng sè
1 2 3 4 5 6 N x
TB
S RSD
C¸c acid amin
% % % % % % % (%)
Aspartic acid 0,721 0,693 0,724 0,695 0,737 0,742 6 0,719 0,021 2,878
Serine 0,795 0,774 0,786 0,772 0,783 0,799 6 0,785 0,011 1,387
Glutamic acid 1,234 1,425 1,243 1,229 1,354 1,343 6 1,305 0,081 6,219
Glycine 1,860 1,778 1,693 1,689 1,723 1,892 6 1,772 0,087 4,892
Histidine 0,656 0,697 0,621 0,637 0,656 0,672 6 0,657 0,027 4,042

NH3 0,865 0,835 0,856 0,821 0,862 0,821 6 0,843 0,020 2,398
Arginine 1,870 1,875 1,912 1,923 1,869 1,924 6 1,896 0,027 1,418
Threonine 0,873 0,829 0,859 0,875 0,864 0,862 6 0,860 0,017 1,928
Alanine 0,628 0,597 0,625 0,598 0,635 0,673 6 0,626 0,028 4,473
Proline 0,734 0,742 0,753 0,768 0,759 0,762 6 0,753 0,013 1,705
Cysteine 0,239 0,251 0,245 0,249 0,251 0,246 6 0,247 0,005 1,855
Tyrosine 0,939 0,927 0,896 0,917 0,879 0,953 6 0,919 0,027 2,982
Valine 0,453 0,397 0,512 0,437 0,456 0,473 6 0,455 0,038 8,384
Methionine 0,672 0,712 0,689 0,702 0,705 0,691 6 0,695 0,014 2,053
Lysine 0,298 0,321 0,297 0,352 0,319 0,327 6 0,319 0,020 6,375
Isoleucine 0,421 0,398 0,425 0,396 0,431 0,433 6 0,417 0,016 3,913
Leucine 0,842 0,839 0,843 0,851 0,799 0,798 6 0,829 0,024 2,860
Phenylalanine 1,256 1,227 1,123 1,214 1,125 1,121 6 1,178 0,061 5,216
B¶ng 5: KÕt qu¶ ®é lÆp l¹i thêi gian l−u trong mÉu c¸ qu¶
C¸c th«ng sè
1 2 3 4 5 6 N x
TB
S RSD
C¸c acid amin
% % % % % % % (%)
Aspartic acid 13,819 13,691 13,634 13,747 13,661 13,652 6 13,70 0,070 0,510
Serine 15,336 15,144 15,109 15,262 15,12 15,123 6 15,18 0,094 0,621
Glutamic acid 16,177 16,356 15,931 16,111 15,935 15,942 6 16,07 0,173 1,078
Glycine 17,470 17,219 17,199 17,395 17,194 17,221 6 17,28 0,121 0,700
Histidine 18,119 17,837 17,800 18,020 18,294 17,821 6 17,98 0,199 1,107
NH3 19,821 19,571 19,521 19,709 19,533 19,553 6 19,62 0,120 0,613
Arginine 21,184 21,09 21,08 21,153 21,085 21,092 6 21,11 0,044 0,209
Threonine 21,395 21,312 21,314 21,387 21,308 21,311 6 21,34 0,041 0,194
Alanine 22,022 21,932 21,923 21,982 21,928 21,931 6 21,95 0,040 0,182
Proline 23,346 23,253 23,229 23,275 23,250 23,263 6 23,27 0,041 0,175

Cysteine 26,467 26,634 26,600 26,467 26,647 26,652 6 26,58 0,088 0,330
Tyrosine 26,743 27,117 27,087 26,632 27,132 27,133 6 26,97 0,225 0,836
Valine 27,916 27,891 27,783 27,816 27,816 27,822 6 27,84 0,051 0,184
Methionine 28,466 28,351 28,333 28,366 28,368 28,372 6 28,38 0,046 0,164
Lysine 31,124 30,999 30,991 31,024 31,018 31,023 6 31,03 0,048 0,155
Isoleucine 31,951 31,82 31,818 31,854 31,842 31,845 6 31,86 0,049 0,154
Leucine 32,561 32,416 32,414 32,454 32,439 32,450 6 32,45 0,054 0,168
Phenylalanine 34,026 33,845 33,836 33,886 33,872 33,891 6 33,89 0,069 0,203

10
B¶ng 6: KÕt qu¶ ®é lÆp l¹i hµm l−îng ®èi víi mÉu c¸ thu
C¸c th«ng sè
1 2 3 4 5 6 N x
TB
S RSD
C¸c acid amin
% % % % % % % (%)
Aspartic acid 0,926 0,918 0,897 0,889 0,918 0,931 6 0,913 0,017 1,816
Serine 0,865 0,859 0,837 0,871 0,902 0,856 6 0,865 0,021 2,483
Glutamic acid 1,652 1,598 1,701 1,689 1,634 1,657 6 1,655 0,037 2,257
Glycine 1,298 1,386 1,357 1,403 1,387 1,279 6 1,352 0,051 3,809
Histidine 1,125 0,987 1,131 0,989 0,984 1,024 6 1,040 0,070 6,704
NH3 0,122 0,109 0,123 0,115 0,128 0,132 6 0,122 0,008 6,920
Arginine 1,787 1,902 1,783 1,856 1,798 1,905 6 1,839 0,057 3,090
Threonine 1,105 1,231 1,304 1,098 1,159 1,236 6 1,189 0,082 6,878
Alanine 0,762 0,756 0,802 0,812 0,789 0,745 6 0,778 0,027 3,489
Proline 0,598 0,612 0,631 0,597 0,689 0,587 6 0,619 0,038 6,063
Cysteine 2,639 2,574 2,702 2,564 2,316 2,655 6 2,575 0,137 5,320
Tyrosine 0,112 0,131 0,135 0,132 0,121 0,121 6 0,125 0,009 7,004
Valine 0,658 0,678 0,598 0,654 0,702 0,579 6 0,645 0,047 7,324

Methionine 0,823 0,798 0,857 0,779 0,802 0,812 6 0,812 0,027 3,273
Lysine 0,546 0,498 0,578 0,581 0,605 0,535 6 0,557 0,038 6,908
Isoleucine 0,623 0,587 0,621 0,606 0,613 0,600 6 0,608 0,014 2,239
Leucine 1,116 1,206 1,215 1,033 1,234 1,158 6 1,160 0,076 6,528
Phenylalanine 1,322 1,302 1,401 1,189 1,298 1,325 6 1,306 0,068 5,239
B¶ng 7: KÕt qu¶ ®é lÆp l¹i thêi gian l−u ®èi víi mÉu c¸ thu
C¸c th«ng sè
1 2 3 4 5 6 N x
TB
S RSD
C¸c acid amin
% % % % % % % (%)
Aspartic acid 13,717 13,626 13,793 13,76 13,768 13,692 6 13,73 0,061 0,445
Serine 15,184 15,089 15,275 15,212 15,241 15,345 6 15,22 0,087 0,569
Glutamic acid 16,012 15,902 16,116 16,074 16,076 15,937 6 16,02 0,085 0,531
Glycine 17,280 17,171 17,385 17,324 17,346 17,202 6 17,28 0,288 1,796
Histidine 17,904 17,79 18,026 17,954 17,979 17,820 6 17,91 0,732 4,448
NH3 19,622 19,52 19,73 19,682 19,688 19,554 6 19,63 0,622 3,446
Arginine 21,113 21,066 21,156 21,135 21,149 21,087 6 21,12 0,102 0,515
Threonine 21,336 21,288 21,379 21,348 21,368 21,311 6 21,34 0,263 1,344
Alanine 21,955 21,907 22,001 21,975 21,988 21,933 6 21,96 0,549 2,732
Proline 23,277 23,225 23,327 23,299 23,306 23,258 6 23,28 1,289 6,058
Cysteine 26,671 26,608 26,467 26,435 26,705 26,651 6 26,59 0,090 0,386
Tyrosine 27,156 27,094 26,735 26,706 27,191 27,134 6 27,00 0,374 1,598
Valine 27,849 27,78 27,914 27,883 27,882 27,821 6 27,85 0,243 0,943
Methionine 28,398 28,331 28,466 28,433 28,431 28,371 6 28,41 1,321 5,085
Lysine 31,05 30,98 31,129 31,633 31,089 31,021 6 31,15 0,362 1,175
Isoleucine 31,873 31,805 31,954 31,931 31,913 31,845 6 31,89 0,259 0,876
Leucine 32,475 32,401 32,563 32,500 32,519 32,445 6 32,48 0,481 1,615
Phenylalanine 33,920 33,828 34,025 33,650 33,970 33,842 6 33,87 0,847 0,257

11
4.2.3. Xác định độ thu hồi của phơng pháp
Dựa vào việc thêm mẫu chuẩn vào mẫu thực, cùng với việc tiến hành
làm mẫu thực không có mẫu chuẩn song song chúng tôi tiến hành tính độ thu
hồi nh sau.
M
2
Độ thu hồi = x 100%
M
1
M
1
: acid amin (àg) biết trớc (thêm vào).
M
2
: acid amin (àg) xác định đợc.
Dựa vào đờng chuẩn làm song song với mẫu thực chúng tôi thu đợc
kết quả của mẫu thêm chuẩn và đem so với giá trị cho vào, mỗi nồng độ làm
3 mẫu và lấy kết quả trung bình. Ta có kết quả ở bảng 8.
Bảng 8: Độ thu hồi của Lysine trong mẫu cá quả
Mẫu số
1 2 3 4 5 6 7
M
1
((àg)
0,2035 0,407 0,168 0,337 1,687 2,361 3,036
M
2
(àg)

0,2084 0,4121 0,1695 0,3396 1,6953 2,3752 3,0574
Độ thu hồi (%)
97,63 98,76 99,12 99,23 99,51 99,4 99,3
Qua kết quả trên với hàm lợng Lysinee < 0,407mg/ml chúng tôi thu
đợc hiệu suất thu hồi thấp. Do đó có thể kết luận, phơng pháp này cho phép
xác định hàm lợng Lysinee từ 0,5(àg) trở lên. Nên khi tiến hành phân tích
nên lấy lợng mẫu sao cho hàm lợng acid amin lớn hơn 0,5(àg) để có sai số
thấp.
4.3. Kết quả phân tích 18 acid amin trên các loại cá
Bảng 9 và bảng 10 thể hiện hàm lợng trung bình các acid amin trong
mẫu cá nớc ngọt và cá nớc mặn n=5.
Hình 5: Sắc đồ các acid amin trong mẫu cá quả

12

Bảng 9: Kết quả phân tích acid amin trong cá nớc ngọt (g/100g)
TT Tên đầy đủ Viết tắt Cá trôi Cá trắm Cá quả Cá rofi Cá chép
1 Aspartic acid ASP 0,00 0,28 0,72 1,05 0,75
2 Serine Ser 0,00 0,34 0,79 1,00 0,57
3 Glutamic acid Glu 0,38 0,52 1,30 1,85 1,30
4 Glycine Gly 0,00 0,58 1,77 1,83 1,07
5 Histidine His 0,24 0,36 0,66 0,86 0,52
6 NH3 NH3 0,07 0,04 0,84 0,12 0,10
7 Arginine Arg 1,31 0,83 1,90 2,09 1,20
8 Threonine Thr 0,70 0,43 0,86 1,12 0,66
9 Alanine Ala 0,26 0,25 0,63 0,84 0.59
10 Proline Pro 1,03 0,23 0,75 0,75 0,51
11 Cysteine Cys 1,69 0,00 0,25 2,50 1,40
12 Tyrosine Tyr 0,08 0,46 0,92 0,11 0,05
13 Valine Val 0,30 0,22 0,45 0,68 0,46

14 Methionine Met 0,44 0,29 0,70 0,83 0,50
15 Lysine Lys 0,11 0,16 0,32 0,58 0,52
16 Isoleucine lle 0,25 0,20 0,42 0,62 0,40
17 Leucine Leu 0,49 0,39 0,83 1,27 0,81
18 Phenylalanine Phe 0,84 0,52 1,18 1,42 0,77
Tổng 8,20 6,12 14,61 19,52 12,18
Kết quả tại Bảng 9 cho thấy, trong thành phần của cá có đủ các acid
amin cần thiết cho cơ thể. Trong 5 loại cá nớc ngọt cá Rôfi cho thấy có tổng
hàm lợng các acid amin cao nhất 19,52 g%, thấp nhất là cá trắm 6,12 g%.
Trong cá trôi acid aspartic, Serine, Glycine, hàm lợng quá nhỏ không xác
định đợc.
Hình 6: Sắc đồ các acid amin trong mẫu cá thu

13

Bảng 10: Kết quả phân tích acid amin trong cá nớc mặn (g/100g)
TT Tên đầy đủ Viết tắt Cá thu Cá nục Cá chim trắng Cá hồng Cá cam
1 Aspartic acid ASP 0,91 1,00 0,77 0,97 0,81
2 Serine Ser 0,87 0,94 0,75 0,82 0,76
3 Glutamic acid Glu 1,66 1,71 1,40 1,67 1,35
4 Glycine Gly 1,35 1,40 1,40 1,08 1,36
5 Histidine His 1,04 2,18 0,65 0,05 1,05
6 NH3 NH3 0,12 0,13 0,09 0,12 0,11
7 Arginine Arg 1,84 1,99 1,72 1,62 1,63
8 Threonine Thr 1,19 1,14 0,88 0,89 0,90
9 Alanine Ala 0,78 0,78 0,65 0,68 0,68
10 Proline Pro 0,62 0,63 0,57 0,53 0,60
11 Cysteine Cys 2,58 3,03 0,17 2,22 2,19
12 Tyrosine Tyr 0,13 0,12 0,87 0,09 0,11
13 Valine Val 0,64 0,76 0,51 0,60 0,57

14 Methionine Met 0,81 0,92 0,62 0,70 0,72
15 Lysine Lys 0,56 0,54 0,44 0,60 0,46
16 Isoleucine Lle 0,61 0,66 0,46 0,54 0,50
17 Leucine Leu 1,16 1,27 0,94 1,10 0,99
18 Phenylalanine Phe 1,31 1,52 1,04 1,10 1,11
Tổng 18,20 20,74 13,94 15,40 15,89

Kết quả tại Bảng 10 cho thấy, hàm lợng tổng các acid amin trong cá

14
nớc mặn nằm trong khoảng 13-21g%, không có loại acid amin nào không
xác định thấy. Trong 5 loại cá nớc mặn đợc nghiên cứu, cá nục cho hàm
lợng amino acid cao nhất 20,74 g%, sau đó là cá thu 18,20 g%, thấp nhất là
cá chim trắng 13,94 g%. So sánh bảng 2 với bảng 1 cho thấy hàm lợng amino
acid trong cá nớc mặn cao hơn trong cá nớc ngọt.

15
V. Kết luận
5.1.
Kết quả nghiên cứu đã lựa chọn đợc các điều kiện phân tích phù hợp để
định lợng các acid amin trong cá nh sau:
Quy trình thuỷ phân sử dụng phơng pháp thuỷ phân trong môi trờng
acid.
Chạy gradien với hỗn hợp dung môi là đệm borat:acetonitril:nớc.
Tốc độ dòng: 1ml/phút; nhiệt độ buồng cột 35
O
C.
Detector huỳnh quang với bớc sóng kích thích 340nm và bớc sóng
phát xạ 450nm.
5.2. Hàm lợng các acid amin trong cá

Qua kết quả phân tích acid amin trong 10 loại cá (5 loại nớc ngọt, 5 loại
nớc mặn) cho thấy:
Trong cá nớc ngọt hàm lợng tổng acid amin từ 6,12- 19,52 g/100g, cá
Rôfi có tổng hàm lợng các acid amin cao nhất (19,52 g%), thấp nhất là cá
trôi 8,2 g%.
Hàm lợng tổng các acid amin trong cá nớc mặn nằm trong khoảng 13-
21g%, không có loại acid amin nào không xác định thấy. Cá nục cho hàm
lợng acid amin cao nhất 20,74 g%, sau đó là cá thu 18,20 g%, thấp nhất là cá
chim trắng 13,94 g%.
Nhìn chung hàm lợng acid amin trong cá nớc mặn cao hơn trong cá
nớc ngọt. Nh vậy ăn cá là rất tốt cho cơ thể, không chỉ là một nguồn thực
phẩm cung cấp hàm lợng protein cao mà chất lợng của protit trong thịt cá là
rất tốt. Đặc biệt hàm lợng cholesterol trong cá là không đáng kể, mỡ cá giúp
ngăn ngừa đợc rất nhiều bệnh tật.
VI. khuyến nghị
Nhằm nâng cao chất lợng dinh dỡng của cuộc sống góp phần đảm bảo
sức khoẻ ngời tiêu dùng chúng tôi có một vài kiến nghị sau:
Tiếp tục phân tích xác định hàm lợng các acid amin trong các đối tợng
thực phẩm khác để cung cấp số liệu hoàn thiện Bảng thành phần Việt Nam.
Giúp tuyên truyền các loại thực phẩm chất lợng cho ngời tiêu dùng.


Khoa Hoá - ATVSTP



TS. Hà Thị Anh Đào
Hà nội, ngày 26 tháng 12 năm 2005
Chủ nhiệm đề tài

Lê Thị Hồng Hảo

16
Tài liệu tham khảo
1. Giáo trình Sinh hoá - Đại học y Hà Nội (1990) tr. 294-303.
2. Phạm Văn Sổ, Bùi Thị Nh Thuận (1978) Kiểm nghiệm Lơng thực
Thực phẩm, Nhà suất bản Khoa Học và Kỹ Thuật - Hà Nội.
3. AOAC. Sixteenth edition,3
rd
revision, (1997).
4. Dany Heems, Genevieve Luck, Christophe Fraudeau, Eric Verette
(1998), Fully automated precolumn derivatization, on-line dialysis
and high-performance liquid chromatographic analysis of acid amins
in food, beverages and feedstuff, Journal of Chromatography A, 798, p.
9-17.
5. H. L. A. Tarr, (1958), Biochemistry of Fishes, Ann. Rev. Biochem.,
27: 223-244 .
6. I. Molnar-Per (2000) Role of chromatography in the analysis of
sugars, carboxylic acids and acid amins in food, Journal of
Chromatography A, 891, p. 1-32.
7. Kang-Lyung Woo, Que-Chung Hwang, Hyung-Su Kim (1996),
Determination of acid amins in the foods by reversed-phase high-
performance liquid chromatography with a new precolumn
derivative, butylthiocarbamyl acid amin, compare to the convention
phenylthiocarbamyl derivatives and ion-exchange chromatography,
Journal of Chromatography A, 740, p. 31-40.
8. R. Draisci, L. Giannetti, P. Boria, L. Lucentini, L. Palleschi, S. Cavalli
(1998), Improved ion chromatography-integrated pulsed

amperometric detection method for the evaluation of biogenic in food
of vegetable or animal origin and in fermented foods, Journal of
Chromatography A, 798, p. 109-116
9. Tyson, Don (1999), Metabolism and Analysis acid amins, Interpretation
Guide.