Nghiên cứu tinh sạch và xác định một số tính chất của catalase từ bacillus subtilis PY79

ĐẠI HỌC QUỐCGIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------

Phạm Thu Hƣơng

NGHIÊN CỨU TINH SẠCH
VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT
CỦA CATALASE TỪ Bacillus subtilis PY79

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội, 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Phạm Thu Hƣơng

NGHIÊN CỨU TINH SẠCH
VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT
CỦA CATALASE TỪ Bacillus subtilisPY79

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
TS. Nguyễn Thị Hồng Loan

TS. Đinh Nho Thái

Hà Nội, 2017


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng cảm ơn và kính trọng sâu sắc đối với
TS. Nguyễn Thị Hồng Loan và TS. Đinh Nho Thái đã tận tình hướng dẫn và t ạo
điều kiện thuận lợi nhấ t cho tôi trong su ốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực
hiện luận văn này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhấ t đ ến các thầy giáo, cô giáo
của Khoa Sinh h ọc cũng như các thầy, cô thuộc Bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa
sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt cho tôi
nhiều kiến thức nền tảng bổ ích.
Lời cảm ơn tiếp theo tôi xin gửi tới các cán bộ, học viên sau đại học và sinh
viên Phòng Protein tái tổ hợp, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và
Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã chia sẻ và tạo những điều kiện tốt
nhất để tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đin
̀ h và ba ̣n bè đã luôn dành tình c ảm, động
viên và khích lệ tôi trong suố t quá trình ho ̣c tâ ̣p và hoàn thành luâ ̣n văn.
Luậnvănđượcthựchiệntrongphạmvinội

dung

vàkinhphícủađềtàicấpĐạihọcQuốcgiaHàNội, mãsố QG.16.82.

Hà Nội, ngày

tháng năm 2017

Học viên

Phạm Thu Hương


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ CATALASE ................................................................. 3
1.1.1. Giới thiệu và lịch sử phát hiện catalase ...................................................... 3
1.1.2. Cấu trúc và phân loại catalase .................................................................... 4
1.1.3. Cơ chế hoạt động phân tử của catalase ...................................................... 8
1.1.4. Vai trò và ứng dụng của catalase................................................................ 9
1.1.5. Tình hình nghiên cứu catalase ở trong và ngoài nước ............................. 12
2.2. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN Bacillus subtilis ..................................... 14
2.2.1. Lịch sử phát hiện, đặc điểm và phân loại ................................................. 14
2.2.2. Đặc điểm hình thái và sự phân bố ............................................................ 15
1.2.3. Đặc điểm sinh hóa và ảnh hưởng của các yếu tố đến sự tổng hợp catalase
của B. subtilis ..................................................................................................... 17
2.2.4. Tính an toàn và ứng dụng của B. subtilis ................................................. 18
Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 21
2.1. NGUYÊN LIỆU ......................................................................................... 21
2.2. MÁY MÓC VÀ CÁC TRANG THIẾT BỊ .............................................. 21
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 21
2.3.1. Nuôi cấy, thu dịch chiết tổng số của vi khuẩn B. subtilis PY79 .............. 21
2.3.2. Tinh sạch catalase từ dịch chiết vi khuẩn B. subtilis bằng kết tủa thuận
nghịch và sắc kí trao đổi ion ............................................................................... 22
2.3.3. Định lượng protein bằng đo quang phổ ở bước sóng A280 nm ................. 23
2.3.4. Kiểm tra độ sạch của protein bằng điện di trên gel polyacrylamide có
SDS (SDS-PAGE) .............................................................................................. 23

2.3.5. Xác định hoạt độ của catalase dựa trên khả năng phân giải H2O2 ở bước
sóng A240 nm bằng quang phổ kế ....................................................................... 25
2.3.6. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và một số ion đến hoạt tính của
catalase ............................................................................................................... 26
2.3.7. Xác định các hằng số động học của catalase ............................................ 26


Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 27
3.1. CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƢU CHO NUÔI CẤY VI KHUẨN B. subtilis
PY79 SINH CATALASE .................................................................................... 27
3.1.1. Môi trƣờng nuôi cấy thích hợp cho B. subtilis PY79 ........................... 27
3.1.2. Nồng độ H2O2 dùng để cảm ứng B. subtilis PY79 sinh catalase ............. 29
3.1.3. Thời điểm cảm ứng B. subtilis PY79 bằng H2O2 ..................................... 31
3.1.4. Thời điểm thu sinh khối tế bào B. subtilis PY79...................................... 32
3.2. TINH SẠCH CATALASE TỪ DỊCH CHIẾT VI KHUẨN B. subtilis
PY79 ...................................................................................................................... 35
3.2.1. Sắc ký trao đổi anion Q-sepharose ........................................................... 35
3.2.2. Sắc ký trao đổi cation CM-Sepharose ...................................................... 37
3.3. MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA CATALASE TINH SẠCH TỪ B. subtilis
PY79 ...................................................................................................................... 41
3.3.1. Nhiệt độ tối thích và độ bền nhiệt độ của catalase ................................... 41
3.3.2. pH tối thích và độ bền pH của catalase .................................................... 42
3.3.3. Thông số động học của catalase tinh sạch từ B. subtilis PY79 ................ 43
3.3.4. Ảnh hưởng của một số chất lên hoạt độ của catalase tinh sạch từ B.
subtilis PY79 ...................................................................................................... 44
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 46
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 47

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Thành phần gel cô và gel tách trong polyacrylamide SDS-PAGE........... 24
Bảng 2.2: Thành phần của một phản ứng xác định hoạt tính.................................... 25
Bảng 3.1: Thành phần các môi trường nuôi cấy ....................................................... 27
Bảng 3.2: Bảng tóm tắt tinh sạch catalase từ dịch chiết B. subtilis PY79 ................ 39


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc nhân heme của catalase ................................................................ 4
Hình 1.2: Cấu trúc monomer của catalase heme đơn chức năng ............................... 6
Hình 1.3: Cấu trúc đơn phân của catalase-peroxidases từ Synechococcus elongates
PCC7942 ..................................................................................................................... 7
Hình 1.4: Cấu trúc đơn phân tử của mangan catalase từ Lactobacillus plantarum .... 8
Hình 1.6: Hình ảnh B. subtilis ................................................................................... 16
Hình 1.5: Các phản ứng phân giải H2O2 bởi catalase .................................................. 9
Hình 3.1: Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh catalase của vi
khuẩn B. subtilis ........................................................................................................ 28
Hình 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ H2O2 cảm ứng đến khả năng sinh catalase của B.
subtilis ....................................................................................................................... 30
Hình 3.3: Ảnh hưởng của thời điểm cảm ứng H2O2 đến khả năng sinh catalase của
B. subtilis PY79 ......................................................................................................... 31
Hình 3.4: Ảnh hưởng của thời điểm thu sinh khối tế bào đến khả năng sinh catalase
của B. Subtilis PY79 .................................................................................................. 33
Hình 3.5: Hoạt độ phân giải H2O2 của catalase trong dịch chiết protein tổng số ..... 34
Hình 3.6: Sắc ký đồ tinh sạch catalase từ dịch chiết B. subtilis bằng sắc ký cột Qsepharose ................................................................................................................... 36
Hình 3.7: SDS-PAGE các phân đoạn chạy qua cột Q-Sepharose ............................. 36
Hình 3.8: Sắc ký đồ tinh sạch catalase từ dịch chiết B. subtilis bằng sắc ký cột CMSepharose .................................................................................................................. 38
Hình 3.9: SDS-PAGE các phân đoạn tinh sạch qua cột CM-Sepharose .................. 38
Hình 3.10: SDS-PAGE các phân đoạn tinh sạch ...................................................... 39
Hình 3.11: Nhiệt độ tối thích và độ bền nhiệt độ của catalase tinh sạch từ B. subtilis

PY79 .......................................................................................................................... 41
Hình 3.12: pH tối thích và độ bền pH của catalase tinh sạch từ B. subtilis PY79 .... 42
Hình 3.13: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng thuỷ phân H2O2 của catalase ở các
nồng độ H2O2 khác nhau theo phương trình Lineweaver-Burk ................................ 43
Hình 3.14: Ảnh hưởng của các chất đến hoạt độ của catalase tinh sạch từ B. subtilis.45


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ATP

Adenosine triphosphate

B. subtilis

Bacillus subtilis

dd H2O

Nước cất loại ion, khử trùng (deionnized distilled H2O)

Đệm A

Kali phosphate 50 mM pH 7

Đệm B

Tris-HCl 20 mM pH 8

Đệm C

Natri acetate 10 mM pH 4,8

FAO

Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc
(Food and Agriculture Organization)

FDA

Cục an toàn Thực phẩm và Thuốc của Mỹ (Food and
Drug Administration)

kDa

Kilodalton

KLPT

Khối lượng phân tử

LB

Luria Bertani

NADPH

Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

OD

Mật độ quang học (Optical Density)

PAGE

Điện

di

gel

polyacrylamide

(Polyarylamide

Gel

Electrophoresis)
ROS

Các dạng oxi hóa hoạt tính (ReactiveOxidative Species)

SDS

Sodium Dodecylsulphate

TEMED

N, N, N’, N’- Tetramethyl-Ethylenediamine

MỞ ĐẦU
Catalase (E.C. 1.11.1.6) là enzyme có ở hầu hết các vi khuẩn hiếu khí và là
một trong những thành phần trung tâm của các quá trình khử độc, ngăn chặn cực
nhanh sự hình thành phản ứng hydroxyl bằng cách xúc tác sự phân giảihydrogen
peroxide (H2O2) thành nước và oxy [43, 52]. Catalase điển hình hoạt động trong
khoảng pH 5 - 10, tối ưu tại pH 6 - 8 và ổn định ở nhiệt độ 10 - 30oC [5].
Catalase đã được ứng dụng trong nhiều quy trình công nghệ sinh học khác
nhau. Do có hoạt tính phân giải nhanh H2O2 nên catalase có khả năng ức chế sự
phân giải của tế bào viêm, một loạt các khối u, apoptosis, tế bào thần kinh và lão
hóa [12, 18, 33, 57, 58]. Enzyme cũng được chứng minh là tác nhân có thể hỗ trợ
dẫn truyền thuốc nội bào [53] và sử dụng trong định lượng cholesterol [42]. Theo
một số công bố gần đây, sự giảm của catalase có thể đóng vai trò trong quá trình
bạc tóc sớm ở người. H2O2 tự nhiên được tạo ra bởi các hoạt động trao đổi của cơ
thể và catalase có vai trò phân giải chúng rất nhanh. Do vậy, nếu hàm lượng
catalase giảm đi, nó sẽ không thể phân giải hết H2O2, dẫn đến tóc bị tẩy trắng từ bên
trong. Nhận định này vẫn đang được làm sáng tỏ với hy vọng phát triển các phương
pháp chữa bạc tóc dựa trên việc bổ sung catalase [20, 62].
Catalase từ các sinh vật khác nhau cũng đã được tinh sạch và nghiên cứu tính
chất

như:

B.subtilis

[30],Vibrio

rumoiensis

S-1T[59],Comamonas

terrigena[64],chủng Rhizobiumradiobacter 2-1 [23]. Hầu hết các nghiên cứu
thường tinh sạch enzyme bằng cách sử dụng muối amoni sulfate kết tủa chọn lọc
protein và các loại sắc ký như lọc gel [23, 30], trao đổi ion (DEAE Sephadex hoặc
DEAE cellulose[23, 30], Q Sepharose FF [59]). Trong đó,B. subtilis được xem như
là một chủng vi khuẩn có lợi cho con người và đã được sử dụng để sản xuất nhiều
chế phẩm sinh học như: men vi sinh; men Natto – một thực phẩm chức năng rất bổ
dưỡng cho sức khỏeở Nhật Bản [61]. Ngoài ra, B. subtilis còn được biết đến với khả
năng sinh ra nhiều enzyme, trong đó có catalase với hoạt tính cao, an toàn khi thao
tác [46]. Cho đến nay, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về tinh sạch và xác định

1


các tính chất của catalase từ nguồn gốc tự nhiên. Các nghiên cứu chủ yếu là định
tính và định lượng hoạt tính của catalase có trong mẫu dịch chiết [1]. Từ thực tế
trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tinh sạch và xác định một
số tính chất của catalase từ Bacilus subtilisPY79” với mục tiêu tạo được chế
phẩm enzyme có độ tinh sạch, độ bền và hoạt tính tốt để phục vụ cho các nghiên
cứu sau này.

2


Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ CATALASE
1.1.1. Giới thiệu và lịch sử phát hiện catalase
Hydrogen peroxide (H2O2) là một trong những gốc oxy hoạt tính (ROS) phổ
biến nhất trong khí quyển. H2O2 xuất hiện do có trong môi trường, là sản phẩm phụ
của chuỗi vận chuyển điện tử trong quá trình hô hấp hiếu khí, quang hợp hoặc sản
phẩm của sự hoạt động enzyme (chủ yếu là oxidase) [63]. Trong tế bào, các gốc oxi

hóa tự do tấn công hầu hết các hợp chất quan trọng như DNA, protein, màng lipid
kép và thậm chí phá hủy cả tế bào. Do đó, các sinh vật đã tiến hóa để có một hệ
thống enzyme phức tạp và hiệu quả bao gồm: catalase, peroxidase và superoxide
dismutase nhằm loại bỏ nhanh chóng và hiệu quả các gốc ROS này [41, 50, 63].
Catalase (EC 1.11.1.6) thuộc lớp oxidoreductase, có mặt trong hầu hết các
sinh vật hiếu khí (bao gồm thực vật, động vật và vi sinh vật), có vai trò quan trọng
chống lại các stress oxy hóa bằng cách xúc tác cho phản ứng phân giải H2O2 thành
H2O và O2. Trong tế bào, catalase chủ yếu được sinh ra trong peroxisome của các
sinh vật nhân thực và trong tế bào chất của sinh vật nhân sơ. Đây là một trong
những enzyme hoạt động nhanh nhất, một phân tử catalase có thể phân giải hàng
triệu phân tử H2O2 trong mỗi giây [50, 55].
Catalase là một trong những enzyme có lịch sử phát hiện sớm và có nhiều
nghiên cứu chi tiết về đặc điểm và tính chất của enzyme. Enzyme lần đầu tiên được
phát hiện bởinhà bác học Thénarad(1818), được gọi tên lần đầu là catalase bởi nhà
bác học Loew (1900) [29], được chứng minh trong trung tâm hoạt động có chứa sắt
bởi Warburg (1923) và được xác định chức năng trong tế bào là tác nhân xúc tác
phân giải H2O2 thành H2O và O2bởi Wieland và tập thể (1927) [65]. Năm 1937, hai
nhà bác học Sumner và Dounce [56] lần đầu tiên đã kết tinh được catalase từ gan bò
và xác định được khối lượng phân tử (KLPT) là 232 kDa; tiếp theo là những công
bố về trình tự amino acid và cấu trúc không gian ba chiều của enzyme [35, 47, 65].
Cho đến nay, đặc điểm cấu trúc, cơ chế hoạt động và tính chất của enzyme đã được

3


làm sáng tỏ; hơn 300 công trình tinh sạch enzyme đã được công bố; catalase được
xem là một trong những enzyme có nhiều đặc điểm hóa sinh hấp dẫn các nhà khoa
học nghiên cứu và có tiềm năng ứng dụng vô cùng to lớn trong các ngành công
nghiệp và lĩnh vực y dược [9, 24].
1.1.2. Cấu trúc và phân loại catalase

Cấu trúc của catalase rất đa dạng và phụ thuộc vào nguồn phân lập, tuy nhiên
nhìn chung có một số đặc điểm chung cơ bản. Một phân tử catalase hoạt động chức
năng thường có cấu trúc dimer hoặc tetramer hoặc hexamer. Mỗi monomer là một
chuỗi polypeptide có khoảng 500-700 amino acid và một nhóm heme có chứa
nguyên tử Fe ở trung tâm, một số trường hợp Fe được thay bằng Mn hoặc NADPH
với vai trò bảo vệ nhân heme khỏi sự oxi hóa [31].

Hình1.1: Cấutrúcnhânhemecủa catalase [69]

Khác với cấu trúc nhân heme trong hồng cầu, nhóm heme trong catalase bao
gồm một nguyên tử Fe ở trung tâm và được bao bọc phía ngoài bởi thành phần hữu
cơ là nhóm protoporphyrin, cấu trúc được tạo ra bởi sự liên kết của các cầu metan
hình thành nên một vòng tetrapyrrole. Nguyên tử Fe sẽ tạo thành sáu liên kết phối
trí với bốn nguyên tử N của vòng pyrol, một liên kết với phân tử H2O2 và một với
amino acid tyrosine của protein [9]. Nhóm heme là vị trí xảy ra sự phân giải H2O2,
nằm tách khỏi phần bề mặt và phía sâu trong phân tử catalase (Hình 1.1) [69].

4


Về phân loại, có hơn 300 catalase đã được biết đến, chúng được tinh sạch từ
các chủng khác nhau, có thể có nhân heme hoặc không có nhân heme. Dựa trên sự
khác nhau về kích thước của các phần dưới đơn vị cấu tạo nên enzyme và có hay
không có nhân heme chúng được chia ra làm ba loại khác nhau. Nhóm một là các
catalase đơn chức năng (monofunctional catalase) có chứa nhân heme, được tìm
thấy nhiều nhất ở trong tự nhiên. Nhóm thứ hai là catalase hai chức năng
(Bifunctional catalase-peroxydase), có chứa nhân heme, ít phổ biến hơn, có mối liên
quan chặt chẽ đến các peroxidase ở thực vật về cấu trúc và trình tự amino acid. Cuối
cùng là nhóm manganese catalase, không chứa nhân heme, tìm thấy ở các vi khuẩn
có khả năng chịu các điều kiện khắc nghiệt của môi trường như nhiệt độ, nồng độ

muối cao…[39].
Nhóm catalase đơn chức (monofunctional catalase): Đây là nhóm phổ biến
nhất, có mặt ở hầu hết các đại diện của động vật, thực vật và vi sinh vật với số
lượng hơn 225 catalase trong số hơn 300 catalase được phát hiện đến nay; có chức
năng chính là phân giải H2O2và chức năng phụ là peroxy hóa [9]. Catalase thường
có hoạt tính khi ở dạng tetramer, nhưng một số dạng như dimer, hexamer hay thậm
chí dạng hiếm gặp như heteromer cũng được tìm thấy (Pseudomonas aeruginosa)
[31].KLPT của catalase dao động khoảng từ 200-340 kDa với một nhóm heme ở
vùng trung tâm hoạt động. Dựa trên kích thước của mỗi monomer, catalase được
chia ra loại có monomer kích thước nhỏ (55-69 kDa) và loại có kích thước lớn (7584 kDa) [31, 38, 56, 65].

5


Hình1.2:Cấutrúc monomer của catalase hemeđơnchứcnăng [54]

Bên cạnh đó, cũng có sự khác nhau ở loại nhân heme, nhân heme loại b hay
tồn tại trong các catalase có monomer kích thước nhỏ (catalase từ gan bò) và nhân
heme loại d hay tồn tại trong những catalase có monomer kích thước lớn (catalase
của E. coli).Cấu trúc bậc 4 của catalase có vùngbảo thủ bao gồm: đầu N-terminal
với 70 amino acid đầu tiên, vùng gấp nếp β từ vị trí amino acid thứ 72-318, vùng
domain kết nối hay còn gọi là vùng kết nốivà vùng xoắn α (vị trí 444-503). Một số
catalase thuộc nhóm này cũng có vùng bảo thủ là đầu C-terminal dài khoảng 150
amino acid (Hình 1.2)[54]. Theo nghiên cứu gần đây, catalase điển hình ở cả sinh
vật nhân sơ và sinh vật nhân thực đều có vùng β-barrel là vùng có tính bảo thủ cao
nhất, vùng kết nối và α-helical vẫn có một số biến đổi [31, 54].
Nhóm hai chức năng (Bifunctional catalase- peroxydase)
Nhóm catalase hai chức năng thường ít gặp, chỉ có chủ yếu ở các vi sinh vật
hiếu khí, chưa được phát hiện ở những đại diện như thực vật và động vật. Catalase
thuộc nhóm này có KLPT dao động trong khoảng 120-340 kDa. Nhóm enzyme này

thể hiện cả hoạt tính catalase và hoạt tính peroxidase, thường rất nhạy cảm với nhiệt
độ và pH phụ thuộc vào điều kiện phân lập. Enzyme tồn tại chủ yếu ở dạng dimer
có khoảng 750 amino acid trong mỗi monomer (Hình 1.3), ngoài ra dạng tetramer

6


cũng được tìm thấy ở E. coli. Mỗi monomer được chia ra 2 vùng chủ yếu là vùng N
và C được sắp xếp dọc theo chiều dài của phân tử, nhân heme nằm ở vùng Nterminal. Một đặc điểm bảo thủ ở hầu hết các catalase thuộc nhóm 2 là sự có mặt
của một covalent adduct- cấu trúc mà vị trí ortho của tyrosine sẽ liên kết với
methionine ở một bên và bên đối diện sẽ liên kết với tryptophan [54].

Hình1.3:Cấutrúcđơnphâncủa catalase-peroxidases từSynechococcus elongates
PCC7942 [73]

Nhóm pseudocatalase (Manganese catalase)
Nhóm non-hemecatalase còn gọi là pseudocatalase,là nhóm catalase đặc
biệt, có 2 nguyên tử Mn ở vùng trung tâm hoạt động thay cho Fe, thường được tìm
thấy ở vi khuẩn và vi khuẩn cổ. Những enzyme này có KLPT trong khoảng 170-210
kDa (Hình 1.4) [11, 54]. Catalase thuộc nhóm này là một homohexamer, mỗi tiểu
đơn vị có khối lượng khoảng 30 kDa. Cơ chế thủy phân H2O2 của catalase thuộc
nhóm này khác biệt lớn so với các catalase có nhân heme: quá trình xúc tác phản
ứng thủy phân không có những phản ứng trung gian, hai phân tử H2O được hình
thành trong một bước xúc tác và không có các gốc tự do trong quá trình xúc tác
[39].

7


Hình 1.4:Cấutrúcđơnphântửcủamangan catalase từLactobacillus plantarum[63]

1.1.3. Cơ chế hoạt động phân tử của catalase
Chức năng chính của catalase là xúc tác cho sự phân giải H2O2 thành H2O và
O2, phản ứng xúc tác có thể khác nhau tùy thuộc vào nhóm catalase, tuy nhiên
chúng thường diễn ra theo 2 giai đoạn: giai đoạn 1, sự oxy hóa của nguyên tử Fe bởi
1 phân tử H2O2 hình thành nên phức hệ A, trong giai đoạn này sự liên kết O-O trong
phân tử sẽ bị phân cắt một cách nhanh chóng dẫn đến một nguyên tử O liên kết
trong phân tử H2O và một nguyên tử O sẽ gắn với nguyên tử Fe trong nhân heme
hình thành phức hệ A và một phân tử H2O (phản ứng 1) (Hình 1.5). Giai đoạn 2, với
nhóm catalase điển hình, phức hệ A là một loại gốc cation (*+Por Fe (IV) =O) bị
khử bởi phân tử H2O2 thứ 2 dẫn đến sự hình thành thêm một phân tử H2O và 1 phân
tử O2 (phản ứng 2) (Hình 1.5). Còn với nhóm catalase-peroxidase, ban đầu enzyme
sẽ thể hiện hoạt tính peroxidase liên quan đến việc sử dụng chất cho e hữu cơ (AH2)
cho sự khử của phức hệ A (phản ứng 3) (Hình 1.5). Chu trình xúc tác sẽ gồm 3
bước: phức hệ A được hình thành ở phản ứng 1, sau đó là sự khử phức hệ A tạo
thành phức hệ C (Por Fe (IV) =O) (phản ứng 4), cuối cùng là sự khử của phức hệ C
và kết thúc quá trình xúc (phản ứng 5) (Hình 1.5). Một số nghiên cứu cũng chỉ ra
rằng phức hệ A có thể bị khử một cách trực tiếp trong phản ứng thể hiện hoạt tính
peroxidase để tạo enzyme tự do như phản ứng (phản ứng 6) [54].

8


Hình1.5:CácphảnứngphângiảiH2O2bởi catalase [54]

Cơ chế phản ứng phân giảiH2O2 của Manganese catalase khác với hai nhóm
còn lại. Cả giai đoạn oxy hóa của cụm dimangan là ổn định, cân bằng và thường có
trong enzyme cô lập. Trong những phản ứng xúc tác Mn+2-Mn+2 sẽ bị oxi hóa thành
Mn+3- Mn+3 bởi phân tử O2 và sự khử diễn ra bởi hydroxyamine. Vị trí hoạt động
của enzyme trong cả giai đoạn này là cốt lõi của phản ứng xúc tác [54].

1.1.4. Vai trò và ứng dụng của catalase
Vai trò của catalase với cơ thể sinh vật
Các gốc ROS và đặc biệt H2O2 được xem là sản phẩm sinh học gây hại, sản
sinh trong quá trình trao đổi chất trong tế bào, chúng có thể phá hủy các đại phân tử
như DNA, các protein, thậm chí có thể phá hủy tế bào và mô. Catalase có khả năng
làm giảm H2O2 trong tế bào bằng cách thủy phân chúng thành H2O và O2
[30].Ngoài chức năng phân giải và cân bằng lượng H2O2,catalase cũng có khả năng
sử dụng H2O2 để oxi hóa các chất độc như methanol, ethanol, formic acid,
formaldehydevà nitrate [30]. Catalase là enzyme tìm thấy ở tất cả các tế bào của cơ

9


thể người và nhiều nhất trong tế bào gan. Ở tế bào hồng cầu người, hemoglobin
được bảo vệ bởi sự sắp xếp catalase. H2O2 được tạo ra với nồng độ khá cao trong
quá trình trao đổi chất. Do vậy nếu trong hồng cầu thiếu catalase, hemoglobin bị
oxy hóa bởi H2O2 tạo thành methamoglobin (Por Fe (III)) và cuối cùng là oxoiron
(IV). Hậu quả làm tan máu hồng cầu, trùng hợp hemoglobin và sự kết tủa của hồng
cầu bị sai hỏng [63]. Catalase còn được chứng minh là ngăn cản yếu tố phiên mã
NF-kB nhạy cảm với các oxy hóa. Bên cạnh đó, tế bào ung thư tạo ra mức H2O2 cao
bất thường do hoạt động của catalase rất thấp so với tế bào bình thường. Sau khi
phát hiện ra sự hình thành phức hợp giữa Grb2 – một protein gắn với yếu tố tăng
trưởng và trình tự

447

Tyr-Val-Asn-Val trong catalase của người, người ta đã cho

rằng catalase tham gia vào tín hiệu integrin. Những kết quả trên đề xuất sự tham gia
gián tiếp của catalase trong việc điều hòa sự tăng sinh tế bào [63]. Các nghiên cứu

cũng cho thấy có sự liên quan giữa sự thiếu hụt catalase và bệnh đái tháo đường ở
những bệnh nhân tiểu đường týp I. Các đột biến chèn và thay thế trong gen catalase
làm giảm đáng kể hoạt tính của catalase trong máu dẫn đến tăng nồng độ H2O2
trong huyết thanh và mô; hậu quả là các tế bào β của tụy sản sinh ra insulin bị sai
hỏng. Các đột biến ác tính khác trong gen catalase cũng có thể ảnh hưởng đến
chuyển hóa lipid, homocysteine, làm tăng huyết áp và bạch biến [63].
Một số nghiên cứu khác còn cho thấy, catalase có khả năng chống lại sự
thoái hóa và sự già hóa, có vai trò trong kéo dài tuổi thọ và sức sống[70].
Màu tóc được quyết định bởi hàm lượng sắc tố melanin [25]. Tuy nhiên, theo
nghiên cứu của Kauser và tập thể (2006) [26], catalase biểu hiện kém ở nang tóc
của người cao tuổi, do vậy lượng H2O2 dư sẽ ngăn cản các tế bào sắc tố sản sinh ra
melanin dẫn đến tóc bạc. Nghiên cứu của Wood và tập thể (2009) [64] cũng chỉ ra
rằng ở phần nang tóc của sợi tóc bạc tích lũy đến mM H2O2 và làm phân giải
melanin dẫn đến tế bào thiếu hắc tố, góp phần gây nên chứng bạc tóc. Ở người bình
thường, catalase được biểu hiện đủ giúp phân giải hiệu quả H2O2 giúp ngăn cản quá
trình hình thành tóc bạc và lão hóa [74].

10


Ứng dụng của catalase
Catalase đã và đang được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như môi
trường, y học, dược phẩm, công nghiệp thực phẩm, dệt may [54].
Ứng dụng trong môi trường: Trong công nghiệp dệt may, việc rửa vải đã tẩy
dẫn đến tạo ra một lượng lớn nước thải có tính kiềm, bước loại bỏ H2O2 bằng những
chất hóa học thường dẫn đến sự hình thành lượng muối cao. Nhiều nhà khoa học đã
ứng dụng thành công catalase trong việc loại bỏ H2O2 khỏi vải sợi, nước thải và làm
tăng chất lượng vải sợi. Atrazine là một trong những chất có mặt trong thuốc trừ
sâu, gây nguy hại cho hệ sinh thái, ảnh hưởng đến hoạt tính catalase trong các cơ
quan của cơ thể các sinh vật dưới nước, do đó sự thay đổi về hoạt tính của enzyme

được coi như một biomarker chỉ thị atrazine có trong môi trường [54].
Trong các ngành công nghiệp: catalase đã được cấp phép bởi nhiều nhãn hiệu
như fermcolase, CAT_IG, Enzeco và Terminox. Trong ngành công nghiệp sản xuất
và chế biến sữa, H2O2 được dùng ở bước thanh trùng sữa, do đó catalase được sử
dụng để loại bỏ H2O2 trước khi sản phẩm được cung cấp ra thị trường [44]. Sử dụng
catalase để xây dựng các thiết bị cảm ứng điện hóa đã được nghiên cứu để ứng dụng
trong: ước lượng hàm lượng H2O2, fluoride và cyanide, phát hiện mức độ phân giải
của H2O2 trong sữa [54]. H2O2cũng thường được sử dụng làm chất tẩy trắng trong
ngành công nghiệp dệt may và bột giấy, loại bỏ chất này sau khi tẩy trắng là một
bước quan trọng để không ảnh hưởng đến những bước nhuộm tiếp theo [45].
Trong lĩnh vực y học: Catalase đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa
lượng H2O2 trong tế bào hồng cầu, một nửa lượng H2O2 sinh ra sẽ được catalase
phân giải [54]. Enzyme này cũng được ứng dụng trong việc ngăn ngừa ung thư, ức
chế khả năng di căn ra các phần khác nhau của cơ thể. Qua các nghiên cứu trên
bệnh nhân đái tháo đường, tình trạng thiếu hụt catalase dẫn đến tăng nguy cơ mắc
bệnh cao hơn những trường hợp bình thường, những tế bào β ở đảo Langerhans của
tuyến tụy rất nhạy cảm với H2O2, nên tình trạng thiếu catalase làm cho các tế bào
này có thể bị ảnh hưởng hoặc thậm chí bị phá hủy [54]. Một phức hệ bao gồm các

11


enzyme như catalase, superoxide dismutase, carbonic anhydrase polyhemoglobin
được phát triển để thay thế các tế bào máu vận chuyển oxy và khí cacbonic đến các
cơ quan, phức hợp này cũng hoạt động như một chất chống oxy hóa chống lại
những tổn thương ischemia-reperfusion [54]. Bên cạnh những ứng dụng liên quan
đến y học và dược phẩm, enzyme cũng được ứng dụng để loại bỏ H2O2 trong kính
áp tròng [54].
Theo những nghiên cứu gần đây, sự thiếu hụt catalase là nguyên nhân gây ra
bạc tóc sớm ở người. Tóc bạc sớm là do sự hình thành của H2O2 thường có trong

thuốc nhuộm tóc hoặc được sinh ra từ nang tóc; do vậy việc thiếu hụt catalase làm
cho phân giải không hết H2O2 dẫn đến tóc bị tẩy trắng từ trong. Nhận định này đang
được làm sáng tỏ với hi vọng sản xuất ra các sản phẩm ngăn ngừa và chữa trị bạc
tóc sớm [26].
1.1.5. Tình hình nghiên cứu catalase ở trong và ngoài nƣớc
Catalase là enzyme có mặt trong hầu hết các sinh vật từ thực vật, động vật và
vi sinh vật [36]. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về tinh sạch và xác định tính
chất của catalase từ nhiều nguồn sinh vật khác nhau: ở thực vật như mầm lúa mì,
phèn đen, táo [8, 16, 60]; gan của nhiều động vật như gan ễnh ương [24], gan trâu
[34]; vi khuẩn như B. subtilis [30],

Vibrio rumoiensis S-1T[59], Comamonas

terrigena[65], chủng Rhizobium radiobacter 2-1 [23].
Tony và tập thể(1972) [49] đã nghiên cứu tinh sạch và xác định một số tính
chất của enzyme catalase từ nấm men bánh mỳ. Kết quả nghiên cứu cho thấy,
catalase được tinh sạch có hoạt độ riêng 62000 U/mgvới hiệu suất thu hồi10% và độ
sạch tăng 77 lần so với dịch protein ban đầu. Tuy nhiên, quy trình tinh sạch catalase
khá phức tạp và được thực hiện qua 5 bước như: i) hòa tan tế bào nấm men khô
trong đệm veronal-HCl 3 mM pH 8,2, phá vỡ tế bào bằng cách lắc va đập với các
hạt thủy tinh và ly tâm lấy dịch protein; ii) chiết catalase sử dụng hỗn hợp dung dịch
ethanol và CHCl3 (1:1. v/v); iii) tủa protein bằng (NH4)2SO4 40%, hòa tan tủa
protein trong đệm phosphate 5 mM pH 7,0; iv) bước iii) được lặp lại hai lần nhưng

12


với (NH4)2SO4 45%, nhằm loại bớt một số protein không mong muốn; và bước cuối
cùng là tinh sạch protein bằng sắc kí lọc gel Sephadex G-75.
Yumoto vàtập thể(2000) [59] đã nghiên cứu tinh sạch và xác định một số

tính chất của catalase từ vi khuẩn Vibrio rumoiensis S-1T. Catalase được tinh sạch
bằng 2 bước sắc kí trao đổi anion Q Sepharose FF và bước 3 là sắc kí lọc gel
Sephacryl S-300 cùng với các bước thẩm tách. Kết quả cho thấy, catalase tinh sạch
có hoạt độ riêng 395000 U/mg, với hiệu suất tinh sạch 20% và độ sạch gấp 54 lần
so với mẫu protein ban đầu.
Hossain và tập thể(2008) [23] đã nghiên cứu tinh sạch và nhân dòng catalase
bền nhiệt từ chủng vi khuẩn Rhizobium radiobacter 2-1. Catalase được tinh sạch
theo quy trình gồm 3 bước: biến tính protein ở nhiệt độ 50oC sau đó làm lạnh tại
4oC để loại bỏ các protein không bền nhiệt bị kết tủa; tinh sạch catalase bằng sắc kí
trao đổi anion và sắc kí lọc gel superose-12. Kết quả cho thấy, catalase tinh sạch có
hoạt độ riêng 764500 U/mg với hiệu suất thu hồi 12%, tuy nhiên, độ sạch của chế
phẩm catalase tinh sạch chỉ gấp 14 lần so với dịch protein ban đầu.
Haiyong và tập thể (2008) [19] đã nghiên cứu tinh sạch và mô tả đặc tính của
catalase từ vi khuẩn B. subtilis WSHDZ-01. Catalase được tinh sạch theo quy trình
gồm 3 bước: kết tủa protein tổng số bằng ethanol, sắc kí trao đổi anion DEAE
sepharose, và sắc kí tương tác kị nước Phenyl sepharose cùng với các bước thẩm
tách loại muối. Kết quả cho thấy, catalase tinh sạch từ B. subtilis WSHDZ-01 có
hoạt độ riêng 13568 U/mg, hiệu suất thu hồi 32,5% và có độ tinh sạch thấp, chỉ cao
hơn 6,8 lần so với dịch protein tổng số ban đầu.
Hussein (2012) [24] đã nghiên cứu tinh sạch và mô tả đặc tính của catalase từ
vi sinh vật kiềm Bacillus sp. Quá trình tinh sạch catalase từ Bacillus sp được thực
hiện qua 3 bước: kết tủa protein bằng (NH4)2SO4 55%; sắc kí trao đổi anion DEAE
cellulose và sắc kí lọc gel Sephacryl S-300 cùng với các bước thẩm tách loại muối.
Kết quả cho thấy, catalase được tinh sạch từ Bacillus sp có hoạt độ riêng khá thấp

13


566.6 U/mg, hiệu suất thu hồi 56% và có độ tinh sạch thấp, chỉ cao hơn 6,2 lần so
với dịch protein ban đầu.

Nhìn chung, các nghiên cứu về tinh sạch và xác định tính chất của catalase từ
vi khuẩn cho thấy: i) quy trình tinh sạch catalase còn khá phức tạp, qua nhiều bước
[48]; ii) hàm lượng và độ sạch của catalase chưa cao, cho băng protein chưa rõ nét
trên điện di gel polyacrylamid [23, 24].
Hiện nay, ở Việt Nam các nghiên cứu về catalase chủ yếu là định tính và
định lượng enzyme từ các dịch chiết thô [1]; chưa có nghiên cứu nào về tinh sạch và
xác định tính chất của enzyme từ các nguồn tự nhiên. Theo các nghiên cứu trước đó,
catalase được tinh sạch từ các chủng B. subtilis có hoạt tính cao, khả năng hoạt
động trong khoảng nhiệt độ và pH khá rộng [15, 30]. Thêm nữa, chủng B. subtilis
PY79 là chủng vi sinh vật được nghiên cứu khá nhiều trong phòng thí nghiệm [48].
Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thiết lập một quy trình tinh sạch
hiệu quả và xác định một số tính chất của catalase từ B. subtilis.
2.2. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN Bacillus subtilis
2.2.1. Lịch sử phát hiện,đặc điểm và phân loại
Bacillus là một trong những vi sinh vật đầu tiên được phát hiện và mô tả
trong giai đoạn đầu tiên của tiến trình phát triển ngành vi sinh vật học ở cuối thế kỉ
19 [3]. Năm 1835, Ehrenberg đã phát hiện ra vi khuẩn B. subtilis và đặt tên là
Vibrio subtilis[67, 68]. Gần 30 năm sau, Davaine đặt tên là Bacteridium. Đến năm
1872, Cohn xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đổi tên thành B.
subtilis. Năm 1941, tổ chức y học Nazi của Đức đã phát hiện B. subtilis trong phân
ngựa. Năm 1949 – 1957, Henry và tập thể đã phân lập được chủng B. subtilis thuần
khiết [68].
B. subtilisphân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái tự nhiên: từ trên cạn đến
dưới nước, từ nước ngọt đến nước mặn và từ vùng ven bờ đến đáy các Đại Dương;
là những vi khuẩn gram dương có hình que và có khả năng hình thành nên bào tử

14


[3]. Gần đây, B. subtilis đã được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi trên thế giới.

Chúng được sử dụng ngày càng phổ biến và được xem như sinh vật phòng và trị các
bệnh về rối loạn đường tiêu hóa, chứng viêm ruột, viêm đại tràng, tiêu chảy và đang
được nghiên cứu rộng rãi với nhiều tiềm năng ứng dụng hiệu quả trong chăn nuôi,
công nghiệp, xử lí môi trường [68]. Vì vậy, B. subtilis đã được quan tâm nghiên cứu
ở mọi cấp độ trong tế bào như giải mã trình tự hệ gen, nghiên cứu cơ chế điều hòa
gen, biểu hiện enzyme và protein, sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học từ các sản
phẩm trao đổi bậc hai, cũng như ứng dụng các kỹ thuật sinh học hiện đại trong phân
loại vi sinh vật ở cấp độ loài và dưới loài [3, 55]. Hệ gen của B. subtilis có kích
thước 4,2 Mb gồm 4100 gen mã hóa protein, trong số những gen mã hóa này
khoảng 53% là những gen đơn bản chỉ mã hóa cho một loại protein duy nhất,
khoảng 25% là các họ gen được tạo ra do sự lặp gen, họ gen lớn nhất liên quan đến
sự tổng hợp ATP [67].B.subtiliskhông gây hại cho con người, động vật; về mặt
thương mại, nó như một nhà máy sản xuất nhiều sản phẩm bậc hai quan trọng như
các kháng sinh, enzyme, protein dị hợp, kháng nguyên và vacxin [40].
Về phân loại: Theo hệ thống phân loại của Bergey (1994), B. subtilis thuộc:
Giới (regnum): Bacteria
Ngành (divisio): Firmicutes
Lớp (class): Bacilli
Bộ (ordo): Bacillales
Họ (familia): Bacillaceae
Chi (genus): Bacillus
Loài : Bacillus subtilis
2.2.2. Đặc điểm hình thái và sự phân bố
B. subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tímgram dương, kích
thước 0,5 – 0,8 µm x 1,5 – 3 µm, đơn lẻ hoặc hình chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả
năng di động, có 8 – 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ nằm giữa hoặc lệch tâm
tế bào, kích thước từ 0,8 – 1,8 µm. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt

15

của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt (ở 100oC trong 180 phút),
chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất, chất sát trùng, thời gian sống có thể vài
năm đến vài chục năm [67].
Vi khuẩn B. subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy tiện.
Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất và rơm
rạ, cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”. Thông thường, số lượng B. subtilis
trong đất trồng trọt có khoảng 106 – 107CFU/g; đất nghèo dinh dưỡng ở sa mạc, đất
hoang thì sự hiện diện của chúng rất hiếm [68]. Nhiệt độ tối ưu để chúng phát triển
là 25oC đến 35oC. Khi gặp điều kiện môi trường khắc nghiệt, B. subtilis có khả năng
hình thành bào tử,thông thường đến 60% B. subtilis tìm thấy tồn tại ở dạng bào tử
[55].

Hình1.6:HìnhảnhB. subtilis [71]

Vi khuẩn B. subtilis được coi là vi khuẩn hiếu khí. Tuy nhiên, một số nghiên
cứu cho thấy chúng có thể phát triển trong điều kiện yếm khí nhờ khả năng tạo ra
ATP thông qua quá trình lên men butanediol cũng như amoni nitrat. B. subtilis khác
với các sinh vật yếm khí khác khi trải qua quá trình lên men mà không có chất nhận
điện tử từ bên ngoài. Trong quá trình lên men, việc tái tạo NAD+ chủ yếu là do
lactate dehydrogenase có chức năng chuyển hóa pyruvate thành lactate, được tìm
thấy trong tế bào chất[67].

16


1.2.3. Đặc điểm sinh hóa và ảnh hƣởng của các yếu tố đến sự tổng hợp catalase
của B. subtilis
B. subtilis có khả năng sản xuất enzyme với hiệu suất cao khoảng 20 – 25 g
trên lít môi trường [4]. Vi khuẩn có thể phát triển trong điều kiện môi trường có

nguồn nitơ và carbon thấp do có khả năng phân giải nhiều loại protein, cacbohydate
và lipid có nguồn gốc từ động vật, thực vật thành những thành phần đơn giản hơn
để sử dụng. B. subtilis có thể sử dụng các loại monosaccharide như glucose,
fructose, các disaccaride như maltose, saccarose, đường 5C như pentose, các
polysacchride như tinh bột, nhưng nguồn tốt nhất cho sự đồng hóa của chúng là
glucose; chính vì vậy trong quá trình nghiên cứu glucose thường được sử dụng
chính cho sự phát triển sinh khối cũng như quá trình chuyển hóa thành các sản
phẩm trao đổi chất của vi khuẩn. Nitơ cũng là một nguyên tố quan trọng đối với sự
phát triển của vi khuẩn, xây dựng các amino acid cần thiết cho việc tạo nên protein
của tế bào. Nguồn Nitơ thường sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn là peptone, cao nấm
men, casein. Các nguyên tố khoáng cũng rất cần thiết cho sự phát triển của B.
subtilis. Ngoài ra, B. subtilis hầu như không có khả năng tổng hợp ra các vitamin và
phải lấy vào từ cao nấm men, cao thịt, dịch chiết khoai tây [4].
Nhiệt độ có vai trò quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát
triển của B. subtilis. Khoảng nhiệt độ phù hợp cho vi khuẩn tối đa là 45 – 55oC, tối
thiểu 5 – 20oC và tối thích 35 – 37oC. Khi vượt ra khỏi dải nhiệt độ cho phép, quá
trình phát triển của B. subtilisbị ức chế, số lượng tế bào giảm, vi khuẩn có xu hướng
hình thành bào tử với khả năng chịu nhiệt cao 80 - 100oC.
B. subtilis có thể phát triển được trong môi trường có pH4,5 – 8,5, tuy nhiên
còn tùy thuộc vào đặc điểm của từng chủng và điều kiện phân lập. Khi gặp điều
kiện pH không thuận lợi chúng cũng phát triển thành dạng bào tử và trở lại dạng tế
bào sinh dưỡng khi môi trường thuận lợi [2].
Những hiểu biết toàn diện về điều kiệnsinh trưởng của vi khuẩn cho phép
đơn giản quá trình tối ưu các điều kiện nuôi cấy và sản xuất ở quy mô công nghiệp,
từ đó ảnh hưởng trực tiếp tới lượng enzyme mà vi khuẩn sản xuất ra[54]. Trong quá

17