Ảnh hưởng của vật liệu AgNPs-CPDs đến sinh trưởng của dòng tế bào Escherichira Coli, Agrobacterium Rhizogenes và cây cẩm chướng in vitro

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

NGUYỄN THỊ PHI

ẢNH HƢỞNG CỦA VẬT LIỆU AgNPs-CPDs ĐẾN
SINH TRƢỞNG CỦA DÒNG TẾ BÀO
ESCHERICHIRA COLI, AGROBACTERIUM
RHIZOGENES VÀ CÂY CẨM CHƢỚNG IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

HÀ NỘI, 2018


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN

======

NGUYỄN THỊ PHI

ẢNH HƢỞNG CỦA VẬT LIỆU AgNPs-CPDs ĐẾN

SINH TRƢỞNG CỦA DÒNG TẾ BÀO
ESCHERICHIRA COLI, AGROBACTERIUM
RHIZOGENES VÀ CÂY CẨM CHƢỚNG IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

TS. La Việt Hồng

HÀ NỘI - 2018


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. La Việt Hồng - Khoa Sinh KTNN Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn tới các Ban Giám hiệu trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, Ban
Chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN, trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện
để tôi hoàn thành khóa luận này.
Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình
của cô Mai Thị Hồng - Phòng thí nghiệm Sinh lý học thực vật và TS. Mai
Xuân Dũng - Khoa Hóa học Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ,
đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành đề tài khóa luận, nhân đây tôi cũng xin gửi
lời cảm ơn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm Sinh
lý học thực vật trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 và Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng
dụng trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi về thiết bị, phƣơng
tiện để tôi có thể hoàn thành khóa luận này.
Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong qua
trình học tập và hoàn thành đề tài.
Hà Nội, ngày tháng năm 2018
Sinh viên

Nguyễn Thị Phi


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dƣới sự
hƣớng dẫn của TS. La Việt Hồng - Khoa Sinh - KTNN Trƣờng Đại học Sƣ
phạm Hà Nội 2. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực
và chƣa đƣợc ai công bố.
Hà Nội, ngày tháng năm 2018
Sinh viên

Nguyễn Thị Phi


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ...............................................................................................................1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 3
3. Nhiệm vụ nghiên cứu .................................................................................... 3
4. Ý nghĩa lí luận và ý nghĩa thực tiễn.............................................................. 3
NỘI DUNG............................................................................................................4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.............................................................. 4
1.1. Tổng quan về vật liệu .................................................................................4
1.1.1. Vật liệu Compozit ................................................................................4
1.1.2. Vật liệu nano Bạc .................................................................................4
1.1.3. Dòng vi khuẩn Escherichira Coli DH5α ............................................5
1.1.4. Dòng vi khuẩn Agrobacterium Rhizogenes ........................................5
1.1.5. Cây Cẩm chƣớng in vitro.....................................................................6
1.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật .................................................7

1.2.1. Khử trùng mẫu và cấy khởi động ........................................................ 7
1.2.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy ..........................................................................8
1.2.3. Giai đoạn nhân nhanh chồi ..................................................................8
1.2.4. Tạo cây hoàn chỉnh ..............................................................................8
1.2.5. Giai đoạn đƣa cây ra đất ......................................................................9
1.3. Tình hình nghiên cứu và sử dụng nano bạc ở Việt Nam và thế giới. ......9
1.3.1. Tình hình nghiên cứu và sử dụng nano bạc ở Việt Nam ...................9
1.3.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng nano bạc trên thế giới.................10
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........................11
2.1. Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................11


2.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu ............................................................... 11
2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ................................................................ 11
2.3.1. Thiết bị ................................................................................................ 11
2.3.2. Dụng cụ ............................................................................................... 12
2.4. Môi trƣờng nuôi cấy .................................................................................12
2.5. Điều kiện nuôi cấy ....................................................................................12
2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu..........................................................................13
2.7. Phƣơng pháp thống kê ..............................................................................16
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .........................17
3.1. Ảnh hƣởng của vật liệu AgNPs-CPDs (M1, M2 và M 3) đến sinh trƣởng
của Escherichira Coli DH5α ...........................................................................17
3.2. Ảnh hƣởng của vật liệu AgNPs-CPDs (M1, M2 và M 3) đến sinh trƣởng
của Agrobacterium Rhizogenes.......................................................................22
3.3. Ảnh hƣởng của vật liệu AgNPs-CPDs (M2) đến sinh trƣởng của cây
Cẩm chƣớng in vitro ........................................................................................25
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................28
1. Kết luận ........................................................................................................28
2. Kiến nghị ......................................................................................................28

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................29
PHỤ LỤC ............................................................................................................33


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Công thức thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của vật liệu AgNPsCPDs đến sinh trƣởng của Escherichira Coli DH5α và Agrobacterium
Rhizogenes trong môi trƣờng lỏng.....................................................................13
Bảng 2.2. Công thức thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của vật liệu AgNPsCPDs đến sinh trƣởng của Escherichira Coli DH5α và Agrobacterium
Rhizogenes trong môi trƣờng thạch đĩa ............................................................. 14
Bảng 2.3. Công thức thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của vật liệu AgNPsCPDs đến sinh trƣởng của cây Cẩm chƣớng in vitro........................................15
Bảng 3.1. Kết quả đo chỉ số OD 600nm đánh giá khả năng kháng khuẩn của
vật liệu AgNPs-CPDs .........................................................................................17
Bảng 3.2. Kết quả đo đƣờng kính vòng kháng khuẩn đánh giá khả năng kháng
khuẩn của vật liệu AgNPs-CPDs .......................................................................19


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1. Vật liệu tổng hợp AgNPs-CPDs dùng trong các thí nghiệm .........20
Hình 3.2. Ảnh TEM chụp trên mẫu M 3 ........................................................... 20
Hình 3.3. Hình ảnh vòng kháng khuẩn Escherichira Coli DH5α của vật liệu
AgNPs-CPDs (M1_250, M 2_250, M3_250).....................................................20
Hình 3.4. Hình ảnh vòng kháng khuẩn Escherichira Coli DH5α của vật liệu
AgNPs-CPDs (M1_500, M 2_500, M3_500).....................................................21
Hình 3.5. Hình ảnh vòng kháng khuẩn Escherichira Coli DH5α của vật liệu
AgNPs-CPDs (M1_1000, M2_1000, M3_1000) ..............................................21
Bảng 3.3. Kết quả đo chỉ số OD 600nm đánh giá khả năng kháng khuẩn của
vật liệu AgNPs-CPDs .......................................................................................22
Bảng 3.4. Kết quả đo đƣờng kính vòng kháng khuẩn đánh giá khả năng
kháng khuẩn của vật liệu AgNPs-CPDs ..........................................................23

Hình 3.6. Hình ảnh vòng kháng khuẩn Agrobacterium Rhizogenes của vật
liệu AgNPs-CPDs (M 1_250, M 2_250, M3_250) .............................................24
Hình 3.8. Hình ảnh vòng kháng khuẩn Agrobacterium Rhizogenes của vật
liệu AgNPs-CPDs (M 1_1000, M2_1000, M3_1000) .......................................25
Hình 3.9. Sự phân bố của vật liệu nanocomposite trong cây in vitro sau 3
ngày nuôi cấy ....................................................................................................26
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của vật liệu AgNPs-CPDs (M 2) đến sinh trƣởng của
cây Cẩm chƣớng in vitro sau 5 tuần nuôi cấy .................................................26
Hình 3.10. Kết quả ảnh hƣởng của AgNPs-CPDs (mẫu M 2) đến sinh trƣởng
của cây cẩm chƣớng. a. Đối chứng; b, c, d: CT1, CT2, CT3 ........................... 27


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

LB:

Luria Bertani

MS:

Murashige và Skoog

AgNPs-CQDs

Silver nanoparticles-Carbon quantum dots

M1, M2, M3

Mẫu số 1, mẫu số 2, mẫu số 3

NXB

Nhà xuất bản


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Mối đe dọa của vi khuẩn kháng mọi loại kháng sinh buộc chúng ta phải
nhanh chóng tìm ra những loại vật liệu mới có khả năng tiêu diệt và ngăn
chặn sự sinh sôi của những vi khuẩn có hại. Trong những năm gần đây việc
nghiên cứu hạt nano rất đƣợc quan tâm bởi những tính chất đặc biệt và lý thú
của nó. Trong số các loại hạt nano đƣợc nghiên cứu, ứng dụng thì hạt nano
bạc đã gây đƣợc sự chú ý đặc biệt bởi tính chất kháng khuẩn vƣợt trội. Trên
thế giới nano bạc đã đƣợc nghiên cứu, chế tạo và ứng dụng trong rất nhiều các
sản phẩm gần gũi với đời sống nhƣ: tẩm trên băng cứu thƣơng, phủ lên
các loại sợi vải, sử dụng để chống nhiễm khuẩn nƣớc sinh hoạt, các đồ dùng
cho trẻ em... Ở Việt Nam, việc nghiên cứu, chế tạo vật liệu nano nói chung,
nano bạc nói riêng vẫn còn khá mới mẻ vàmới đƣợc tiến hành trong thời gian
gần đây [28].
Tác dụng diệt khuẩn của ion bạc đƣợc thể hiện ở chỗ ion bạc có khả
năng biến đổi cấu trúc tế bào. Các ion bạc sẽ kết hợp và tác dụng với nhóm
sulfate của enzym có trong màng tế bào và làm biến đổi hình thái của màng
dẫn đến việc cố định enzym từ đó gây tổn thƣơng cho màng tế bào của vi
khuẩn giúp ion bạc xâm nhập vào trong cơ thể của vi khuẩn dễ hơn. Bên trong
cơ thể của vi khuẩn các hạt ion bạc sẽ tiếp tục tác dụng với các bộ phận khác
của tế bào bằng việc tác dụng với nhóm sulfate và các vị trí hoạt động của
enzym. Chính sự tƣơng tác đó là nguyên nhân để khử hoạt tính của enzyme
dẫn đến giết dần vi khuẩn [28].
Ngoài ra, còn có cơ chế khác là lý thuyết hấp phụ: tế bào vi khuẩn bị vô
hiệu hóa là do kết quả của quá trình tƣơng tác tĩnh điện giữa bề mặt mang

điện tích âm của tế bào và ion bạc đƣợc hấp phụ lên đó, các ion này sau đó

1


xâm nhập vào bên trong tế bào vi khuẩn và vô hiệu hóa chúng. Khả năng diệt
khuẩn của nano bạc là kết quả của quá trình chuyển đổi các nguyên tử bạc
kim loại thành dạng ion tự do và các ion này sau đó tác dụng lên các vị trí
mang điện tích âm trên vi khuẩn [29].
Nuôi cấy mô thực vật đã trở nên phổ biến và đem lại nhiều lợi ích trong
nông nghiệp, lâm nghiệp và nhân giống cây trồng. Có rất nhiều yếu tố làm
hạn chế kỹ thuật này trong nhân giống ở thực vật bậc cao [21], một trong
những yếu tố nghiêm trọng nhất là sự lây nhiễm liên quan đến tác nhân sinh
học và phổ biến là vi khuẩn, nấm, nhện, virus [17]. Các hóa chất nhƣ cồn,
natri hypoclorit, canxi hypoclorit, thủy ngân clorua đƣợc dùng phổ biến nhất
để loại bỏ các tác nhân lây nhiễm ngoại sinh trên vật liệu khởi đầu. Tuy nhiên,
các hóa chất này cũng thƣờng gây hại cho mô thực vật [12]. Sử dụng tinh dầu
từ cây dƣợc liệu bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy nhằm loại bỏ tác nhân lây
nhiễm mà không cần khử trùng môi trƣờng nuôi cấy cũng cho kết quả khả
quan. Tuy nhiên, nồng độ cao của các loại tinh dầu này lại ức chế sinh trƣởng
của chồi [13].
Nhiều nghiên cứu cho thấy vật liệu nano có ảnh hƣởng tích cực tới sự
cảm ứng callus, sự phát sinh cơ quan, sự phát sinh phôi sô ma… trong quá
trình nuôi cấy mô [15]. Trong số đó, nano bạc là một loại vật liệu mới, đƣợc
nghiên cứu rộng rãi, loại vật liệu này không độc, có khả năng gây hại cho hơn
600 vi sinh vật [7]. Tuy nhiên, các hạt nano bạc (AgNPs) có xu hƣớng tập
trung trong môi trƣờng, làm giảm hoạt tính kháng khuẩn do giảm diện tích bề
mặt [10]. Vật liệu nanocomposite chứa Ag (Ag-dsDNA-GO), ở nồng độ
20µg/ml có tác dụng giết chết trên 95% tế bào X. perforans [22]. Cần có
những nghiên cứu đƣợc tiến hành trên không chỉ đơn lẻ vật liệu nano bạc,

2


TiO2, ZnO mà cần có những đột phá liên quan tới vật liệu graphene, ống
nanocarbon, SiO2, chấm lƣợng tử và dendrimers [15].
Xuất phát từ những lý do trên, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Ảnh
hƣởng của vật liệu AgNPs-CPDs đến sinh trƣởng của dòng tế bào
Escherichira Coli, Agrobacterium Rhizogenes và cây Cẩm chƣớng in
vitro”
2. Mục đích nghiên cứu
Sử dụng vật liệu nano bạc đã đƣợc sinh tổng hợp để thử nghiệm hoạt
tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn gây bệnh nhƣ Escherichira Coli,
Agrobacterium Rhizogenes và tác động đến cây Cẩm chƣớng in vitro
(Caryophyllaceae).
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Nghiên cứu khả năng diệt khuẩn của vật liệu AgNPs-CPDs ở các nồng độ
thí nghiệm khác nhau đối với dòng vi khuẩn Escherichira Coli DH5α,
Agrobacterium Rhizogenes.
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của vật liệu AgNPs-CPDs đối với sinh trƣởng của
cây Cẩm chƣớng in vitro.
4. Ý nghĩa lí luận và ý nghĩa thực tiễn.
- Ý nghĩa lí luận: Kết quả nghiên cứu sẽ tìm ra đƣợc loại vật liệu có
khả năng diệt khuẩn tối ƣu từ đó vận dụng để tạo ra những sản phẩm
chống lại các bệnh do vi khuẩn gây ra.
- Ý nghĩa thực tiễn: Đề xuất các vật liệu có khả năng diêt khuẩn cao từ
đó ứng dụng vào trong thực tế đời sống.

3

NỘI DUNG
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về vật liệu
1.1.1. Vật liệu Compozit
Vật liệu compozit là vật liệu tổng hợp từ hai hay nhiều vật liệu khác
nhau tạo nên vật liệu mới có tính năng hơn hẳn các vật liệu ban đầu, khi
những vật liệu này làm việc riêng rẽ. Vật liệu composite có nhiều tính năng
tốt là nhẹ, bền, cơ tính cao, chịu nhiệt, chịu hóa chất và giá thành phù hợp nên
đƣợc sử dụng rất rộng rãi [6].
Nanocompozit Kim loại/polyme Nano kim loại/polyme: là loại vật liệu
mà trong đó polyme đóng vai trò nhƣ một chất bao bọc bên ngoài và ổn định
hạt kim loại bên trong, thể hiện nhiều tính năng khác nhau (thể hiện tính năng
cơ tính: bền nhiệt hay không bền nhiệt; tính năng ƣa nƣớc hay kỵ nƣớc, thể
hiện tính năng điện tính: dẫn điện hay không dẫn điện [20].
1.1.2. Vật liệu nano Bạc
Vật liệu nano Bạc là vật liệu co kích thƣớc nano mét. Ngƣời ta chia
trạng thái của vật liệu thành ba trạng thái chính rắn, lỏng, khí. Hiện nay vật
liệu đƣợc nghiên cứu chủ yếu là vật liệu ở trạng thái rắn [30].
Những tính chất của hạt nano xuất hiện là hệ quả của nguyên lí giam
cầm lƣợng tử và sự cân xứng cáo của bề mặt các nguyên tử, những điều này
phụ thuộc trực tiếp vào kích thƣớc hạt nano. Sự điều chỉnh kích thƣớc của hạt
nano có thể dẫn tới những thay đổi về tính chất của các hạt. Không giống với
vật liệu khối có những tính chất vật lý không thay đổi theo khối lƣợng [4],
hạt nano cho thấy khả năng thay đổi những tính chất nhƣ điện, từ và quang
học theo kích thƣớc hạt. Sự xuất hiện những hiệu ứng này là bởi những mức
năng lƣợng không giống nhau của các hạt nhỏ trong vật liệu khối, nhƣng

4

riêng rẽ, bởi hiệu ứng giam cầm điện tử. Vì thế, tính chất vật lý của hạt nano
đƣợc xác định bởi kích thƣớc của các hạt [3].
1.1.3. Dòng vi khuẩn Escherichira Coli DH5α
Escherichira Coli là vi khuẩn bacillus gram âm. Chúng sinh sản bằng
phân hạch nhị phân kế tiếp với thời gian tạo ra khoảng 30 phút với sự tăng
trƣởng tối ƣu xảy ra ở 37oC. Escherichira Coli là vi khuẩn hiếu khí thuận lợi
và có khả năng tổng hợp ATP qua cả hô hấp hiếu khí và, nếu không có oxy,
lên men [32].
Escherichira Coli là một trog những vi khuẩn phổ biến trong hệ tiêu
hóa của ngƣời và động vật máu nóng. Hầu hết chúng tồn tại một cách tự nhiên
và vô hại nhƣng trong một số trƣờng hợp khi sinh lý cơ thể thay đổi, stress…
một số dòng Escherichira Coli độc có thể gây bệnh trên ngƣời và một số loài
động vật [31].
Escherichira Coli có thể phân lập một cách dễ dàng từ những vùng
nƣớc ấm, không bị ô nhiễm hữu cơ, chúng có thể tồn tại và phát triển rất lâu
trong môi trƣờng. Vì vậy, chúng rất dễ lây nhiễm vào nguyên liệu thức ăn hay
nguồn nƣớc nếu quy trình sản xuất không đảm bảo vệ sinh nghiêm ngặt. Từ
đó, có thể gây nên các bệnh rối loạn đƣờng tiêu hóa và nhiễm trùng đƣờng tiết
niệu, có trƣờng hợp gây tử vong cho ngƣời và gia súc [31].
Vi khuẩn Escherichira Coli đƣợc nuôi trong phòng thí nghiệm, sử dụng
cho các quy trình nhân bản trong phòng thí nghiệm, và không có môi trƣờng
sống tự nhiên hoặc môi trƣờng sống vì nó không tồn tại trong tự nhiên [32].
1.1.4. Dòng vi khuẩn Agrobacterium Rhizogenes
Agrobacterium Rhizogenes lần đầu tiên đƣợc phân lập bởi Riker và
cộng sự vào năm 1930 và thƣờng đƣợc tìm thấy trong các nốt của cây họ đậu.
Agrobacterium rhizogenes là một vi khuẩn gram âm, hình que (0,6-1,0 x 1,5-

5

3,0 µm), hô hấp hiếu khí. Agrobacterium Rhizogenes là một vi khuẩn hiếu khí
sử dụng oxy làm chất nhận điện tử đầu cuối của nó tại plasmid, pArA4, là một
plasmid catabolic cung cấp vi khuẩn với khả năng sử dụng MOP, axit
mannopinic và axit agropinic là nguồn carbon duy nhất. Các điều kiện yêu
cầu nuôi cấy rhizogenes thành công trong môi trƣờng phòng thí nghiệm nhƣ
sau: nhiệt độ tăng trƣởng tối ƣu 25-28C, mức pH 5-9 và biotin là yếu tố tăng
trƣởng. Điều đáng nói là vi khuẩn này sẽ không phát triển ở 35C, trong môi
trƣờng có chứa 2% NaCl và nó không tạo ra 3-ketolactose. Các sản phẩm phụ
đƣợc tạo ra bởi tác động của vi khuẩn này là các opines, gây ra bởi plasmid Ri
và là nguồn nitơ và năng lƣợng quan trọng [33].
Agrobacterium Rhizogenes là mục tiêu của nghiên cứu gần đây do khả
năng sử dụng plasmid Ri của nó, chứa t-DNA, để đƣa DNA plasmid của nó
vào cây chủ. Do đó, nó đã đƣợc sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau nhƣ,
sản xuất các loài thực vật có nguy cơ tuyệt chủng, sản xuất protein tái tổ hợp
và kỹ thuật di truyền [33].
1.1.5. Cây Cẩm chƣớng in vitro
Cây cẩm chƣớng (Dianthus carrryophyllus) thuộc họ cẩm chƣớng,
nguyên sản ở bờ Bắc Địa Trung Hải, Nam châu Âu. Hiện nay đƣợc trồng chủ
yếu ở các nƣớc Italia, Mêhicô, Hà Lan, Colombia, Nhật Bản, Ixraen, Mỹ và
Trung Quốc [14].
Cẩm chƣớng có nguồn gốc từ vùng Địa Trung Hải, bắt đầu đƣợc nuôi
trồng để thƣởng ngoạn từ thế kỷ XVI. Lần đầu tiên vào năm 1750, các nhà
làm vƣờn Pháp đã tạo ra giống cẩm chƣớng Remontant, cây cao, ra hoa nhiều
lần trong năm. Năm 1846, họ đã trồng đƣợc rất nhiều giống cẩm chƣớng
hoang dại và điều khiển cho chúng ra hoa quanh năm [1].

6

Cẩm chƣớng là loài ƣa sáng, cƣờng độ thấp nhất là 2,15x104Lux, cho
nên phải đủ ánh sáng mới sinh trƣởng tốt. Cẩm chƣớng ƣa sống nơi mát mẻ,
không chịu nóng, nhiệt độ thích hợp từ 12-20oC. Những loài có màu hoa khác
nhau thì yêu cầu nhiệt độ khác nhau [14].
Cẩm chƣớng là loại hoa đang đƣợc ƣa chuộng ở Việt Nam và là cây
hoa có hiệu quả kinh tế cao. Vì vậy, việc nhân nhanh giống Cẩm chƣớng in
vitro trong phòng thí nghiệm đang đƣợc phát triển nhằm tạo ra số lƣợng cây
giống lớn và đảm bảo chất lƣợng giống tốt.
1.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm 5 bƣớc:
Bƣớc 1: Khử trùng mẫu và cấy khởi động
Bƣớc 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy
Bƣớc 3: Giai đoạn nhân nhanh chồi
Bƣớc 4: Tạo cây hoàn chỉnh
Bƣớc 5: Giai đoạn đƣa cây ra đất
1.2.1. Khử trùng mẫu và cấy khởi động
Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in
vitro. Mục đích của giai đoạn này là tạo đƣợc nguyên liệu thực vật vô trùng
để đƣa vào nuôi cấy.
Mẫu sau khi đƣợc vô trùng đảm bảo các yêu cầu sau: tỉ lệ nhiễm thấp,
tỷ lệ sống cao và tốc độ sinh trƣởng nhanh.
Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ và thời
gian xử lý diệt khuẩn. Vật liệu thƣờng đƣợc chọn và đƣa vào nuôi cấy là: đỉnh

7


sinh trƣởng, chồi nách, hoa, đoạn thân, mảnh, lá, rễ [2]. Chọn đúng phƣơng
pháp khử trùng sẽ đƣa lại tỉ lệ mẫu sống cao, môi trƣờng thích hợp sẽ đạt tốc
độ nhân nhanh cao [2].

1.2.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy
Đây là giai đoạn tái sinh một cách có định hƣớng sự phát triển của mô
nuôi cấy. Quá trình đƣợc điều khiển bằng các chất kích thích sinh trƣởng
(auxin/cytokinin), các chất bổ sung khác nhƣ là nƣớc dừa, dịch chiết nấm
men.. .vào môi trƣờng kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp
nhằm tạo ra tỷ lệ tái sinh cao nhất. Tuổi mẫu đem vào nuôi cấy cần đƣợc chú
ý, thƣờng các mô non chƣa phân hóa có khả năng tái sinh cao hơn những mô
đã chuyển hóa [2].
1.2.3. Giai đoạn nhân nhanh chồi
Giai đoạn này là giai đoạn tạo ra hệ số nhân nhanh cao nhất, đƣợc coi là
then chốt của quá trình. Điều khiển quá trình này bằng cách bổ sung vào môi
trƣờng nuôi cấy các chất kích thích sinh trƣởng, các chất bổ sung khác nhƣ:
nƣớc dừa, dịch chiết nấm men,.. kết hợp với yếu tố nhiệt độ và ánh sáng [2].
Tùy thuộc vào vào đối tƣợng nuôi cấy, có thể tiến hành nhân nhanh bằng cách
kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát
triển cuả các chồi nách hoặc thông qua việc tạo thành cây từ phôi vô tính.
1.2.4. Tạo cây hoàn chỉnh
Khi các chồi đạt đƣợc kích thƣớc nhất định sẽ đƣợc chuyển sang môi
trƣờng ra rễ. Thƣờng sau 2 - 3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thành
cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này ngƣời ta bổ sung các vào môi trƣờng nuôi
cấy các chất kích thích sinh trƣởng thuộc nhóm auxin là nhóm hoocmon thực
vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Trong nhóm này các
chất IAA, IBA, NAA, 2,4-D thƣờng sử dụng để tạo rễ cho chồi.

8


1.2.5. Giai đoạn đƣa cây ra đất
Đây là giai đoạn cuối cùng quyết định khả năng ứng dụng của quá trình
nhân giống in vitro trong thực tiễn sản xuất. Trong giai đoạn này cây con

đƣợc chuyển từ môi trƣờng nhân tạo sang môi trƣờng tự nhiên, do đó cần đảm
bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp (nhiệt độ và độ ẩm) để cây có thể đạt
tỷ lệ sống cao trong vƣờn ƣơm cũng nhƣ trong sản xuất.
1.3. Tình hình nghiên cứu và sử dụng nano bạc ở Việt Nam và thế giới.
1.3.1. Tình hình nghiên cứu và sử dụng nano bạc ở Việt Nam
Năm 2017, một nhóm chuyên gia tại phòng nghiên cứu và phát triển
Karofi đã cải tiến và nâng cấp công nghệ này thành công nghệ Nano Bạc tƣơi
giúp cho việc diệt khuẩn trở nên an toàn, hiệu quả hơn và thậm chí sau thời
gian dài sử dụng. Thiết bị diệt khuẩn sử dụng công nghệ bạc tƣơi nguyên chất
đƣợc ứng dụng rất đa dạng. Ngƣời dùng dung dịch Nano Bạc từ vòi để ngâm
rửa (rau, củ, quả thực phẩm…), lau rửa vết thƣơng (đau mắt, vết xƣớc), vệ
sinh (súc miệng, rửa tay, vệ sinh phụ nữ, tắm, rửa chén bát…. ), diệt khuẩn đồ
cho trẻ em (bình sữa, máy hút sữa, đồ ăn dặm, quần áo..), khử mùi (quần áo,
giầy dép…) [24].
Nghiên cứu ứng dụng của nano bạc trong y học: năm 2017, TS. Trần
Thị Ngọc Dung - Trƣởng phòng Công nghệ thân môi trƣờng - Viện Công
nghệ môi trƣờng (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã chế
tạo thành công băng gạc chứa nano bạc để điều trị các vết thƣơng và vết loét
khó lành trên ngƣời. [35], ngoài ra còn có rất nhiều các công trình nghiên cứu
tạo ra các sản phẩm bảo vệ sức khỏe con ngƣời nhƣ: dung dịch về sinh nano
bạc, bình sữa nano bạc…
Nghiên cứu ứng dụng của nano bạc trong nông nghiệp: Nhiều nhà sản
xuất cùng các chuyên gia nghiên cứu, các nhà khoa học đã ứng dụng nano bạc

9


trong nông nghiệp và tìm ra giải pháp hoàn hảo cho cây trồng, vật nuôi sinh
trƣởng và phát triển khỏe mạnh, an toàn với ngƣời, động vật, cây trồng và môi
trƣờng sống [26].

1.3.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng nano bạc trên thế giới
Ngày nay, công nghệ nano bạc đã trở thành một trong những công nghệ
tiên tiến hàng đầu trên thế giới đƣợc sử dụng tại nhiều quốc gia trong việc bảo
về sức khỏe con ngƣời bởi khả năng làm sạch khuẩn và ngăn các vi khuẩn gây
hại phát triển.
Tại Mỹ và Nhật Bản công nghệ nano bạc đƣợc ứng dụng rộng rãi trong
việc sản xuất hàng tiêu dùng có chứa nano bạc đảm bảo sức khỏe cho con
ngƣời nhƣ: tử lạnh, máy giặt, đồ chơi… Ngoài ra, nano bạc còn ứng dụng để
sản xuất sợi nhân tạo dùng dệt vải, khăn quần áo có chức năng kháng khuẩn,
chống hôi [27].

10


CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Sử dụng nguồn vật liệu là vật liệu nanocomposite bạc-chấm lƣợng tử
chứa bạc và cacbon (AgNPs-CQDs: Silver nanoparticles-Carbon quantum
dots) dạng bột màu đen (Nguồn: Tiến sĩ Mai Xuân Dũng, Khoa Hóa học,
Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2) ở 3 mẫu M 1- AgNPs-CQDs 1%; M2AgNPs-CQDs 0,25%; M3- AgNPs-CQDs 0,5%, dòng vi khuẩn Escherichira
Coli DH5α, Agrobacterium Rhizogenes đƣợc nuôi giữ giống tại Phòng thí
nghiệm Sinh lý thực vật - trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà nội 2 và cây Cẩm
chƣớng in vitro đƣợc nhân giữ giống tại Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật trƣờng Đại học Sƣ Phạm Hà Nội 2.
2.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm đƣợc tiến hành từ tháng 10/2017 đến tháng 02/2018 tại
Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật - trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.
2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
2.3.1. Thiết bị
Các thiết bị sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật : Cân kĩ thuật
(Sartorius, Đức), tủ lạnh sâu (FRIGO), máy đo pH (HM30G/TOA, Đức), Nồi

hấp khử trùng (HV - 110/HIRAYAMA, Nhật), Tủ lạnh Hitachi (31AG5D,
Thái lan), Máy cất nƣớc hai lần (Hamilton, Mỹ), Buồng cấy vô trùng (AV 110/TELSTAR), Máy lắc, Cân phân tích (Sartorius, Đức), Máy đo OD
Spectrophotometer UV-Vis 2450 (Shimadzu, Nhật Bản)…

11


2.3.2. Dụng cụ
Dao cấy, khay cấy, kéo, túi nilon, bình tam giác, đĩa petri, que cấy,
bông, chang thủy tinh, pipet bán tự động, đèn cồn, bình xịt cồn, vỉ xốp nuôi
cấy,…
2.4. Môi trƣờng nuôi cấy
pH môi trƣờng: 5,8.
Môi trƣờng đƣợc khử trùng trong nồi khử trùng ở nhiệt độ 117oC trong
15 phút.
- Thí nghiệm nuôi cấy in vitro sử dụng môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản MS
(Murashige và Skoog, 1962) bổ sung 30g/l saccharose , 7g/l agar.
- Thí nghiệm nuôi cấy vi khuẩn sử dụng môi trƣờng dinh dƣỡng LB (Luria
Bertani) (Samrook J 2001) lỏng và LB đặc bổ sung
2.5. Điều kiện nuôi cấy
Các thí nghiệm đều đƣợc thực hiện trong điều kiện nhân tạo.
- Đối với thí nghiệm trên cây Cẩm chƣớng in vitro:
Ánh sáng: các mẫu đều đƣợc nuôi cấy với cƣờng độ chiếu sáng 2000 lux.
Quang kì: 16 giờ/ngày.
Nhiệt độ phòng: 25oC - 27oC.
Độ ẩm trung bình: 70% - 74%.
- Đối với thí nghiệm trên vi khuẩn Escherichira Coli DH5α và Agrobacterium
Rhizogenes
Thời gian: 16 - 18h
Nhiệt độ: 37oC

Tốc độ lắc: 110 vòng/ phút

12


2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu
Các thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công
thức thí nghiệm đƣợc tiến hành 3 lần nhắc lại.
Ảnh hưởng của vật liệu AgNPs-CPDs (M1, M2 và M3) đến sinh trưởng của
Escherichira Coli DH5α và Agrobacterium Rhizogenes
Thí nghiệm 1: Phƣơng pháp đo mật độ hấp thụ-OD 600
Nuôi cấy vi khuẩn Escherichira Coli DH5α và Agrobacterium Rhizogenes
trong môi trƣờng LB (Luria Bertani) (Samrook J 2001). Lấy 100 µl dịch
khuẩn nuôi vào 20 ml các bình chứa môi trƣờng LB mới có bổ sung lần lƣợt
vật liệu nano bạc-chấm lƣợng tử cacbon ở 3 nồng độ: 0 µL, 250 µL, 500 µL
và 1000 µL. Nuôi qua đêm 16-18 giờ ở điều kiện 37oC, lắc. Sau đó đo OD
600 nm trên máy Spectrophotometer UV-Vis 2450 (Shimadzu, Nhật Bản).
Môi trƣờng nuôi cấy: sử dụng môi trƣờng dinh dƣỡng LB (Luria
Bertani) (Samrook J 2001)
Nhiệt độ buồng nuôi cấy đƣợc duy trì ở 37oC đối với vi khuẩn Escherichira
Coli DH5α và nuôi cấy ở 28oC đối với vi khuẩn Agrobacterium Rhizogenes,
thời gian nuôi cấy 16-18 giờ, tốc độ lắc 110 vòng/ phút, không có ánh sáng.
Bảng 2.1. Công thức thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của vật liệu AgNPsCPDs đến sinh trƣởng của Escherichira Coli DH5α và Agrobacterium
Rhizogenes trong môi trƣờng lỏng
Công thức
Chất
ĐC

LB + 0µL nano bạc

CT1

LB + 250µL nano bạc

CT2

LB + 500µL nano bạc

CT3

LB + 1000µL nano bạc

13


Đánh giá thí nghiệm sau 16-18 giờ nuôi cấy dựa trên chỉ số đo OD
600nm trên máy Spectrophotometer UV-Vis 2450 (Shimadzu, Nhật Bản).
Thí nghiệm 2: Phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch (Bauer A. W. et
al., 1966)
Nuôi cấy vi khuẩn Escherichira Coli DH5α và Agrobacterium Rhizogenes
trong môi trƣờng LB (Luria Bertani) (Samrook J 2001). Lấy 100 µl dịch
khuẩn nuôi vào các đĩa thạch sau đó dàn đều khuẩn trên bề mặt đĩa thạch, tiến
hành đục lỗ tròn trên đĩa thạch sau đó nhỏ vào mỗi lỗ tròn 50 µl vật liệu nano
bạc-chấm lƣợng tử cacbon ở 3 nồng độ: 250 µL, 500 µL và 1000 µL. Nuôi
qua đêm 16-18 giờ ở điều kiện 37oC đối với vi khuẩn Escherichira Coli
DH5α và 28oC đối với vi khuẩn Agrobacterium Rhizogenes, không lắc. Sau
đó đo đƣờng kính vòng kháng khuẩn đƣợc tạo thành để đánh giá khả năng
kháng khuẩn của từng mẫu ở các nồng độ khác nhau.
Môi trƣờng nuôi cấy: sử dụng môi trƣờng dinh dƣỡng LB (Luria
Bertani) (Samrook J 2001) có bổ sung 15g/l agar

Nhiệt độ buồng nuôi cấy đƣợc duy trì ở 37oC, thời gian nuôi cấy 16-18
giờ, không có ánh sáng.
Bảng 2.2. Công thức thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của vật liệu AgNPsCPDs đến sinh trƣởng của Escherichira Coli DH5α và Agrobacterium
Rhizogenes trong môi trƣờng thạch đĩa
Công thức
Chất
ĐC

LB + 0µL nano bạc

CT1

LB + 250µL nano bạc

CT2

LB + 500µL nano bạc

CT3

LB + 1000µL nano bạc

Xác định đƣờng kính vòng tròn kháng khuẩn (D) bằng thƣớc có độ
chính xác milimet (mm) sau 16-18 giờ nuôi cấy.

14


Ảnh hưởng của vật liệu AgNPs-CPDs (M2) đến sinh trưởng của cây
Cẩm chướng in vitro

Thí nghiệm 3: Nuôi cấy Cẩm chƣớng in vitro trong môi trƣờng có bổ
sung AgNPs-CPDs (mẫu M2)
Chuẩn bị các bình tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trƣờng nuôi cấy
thực vật MS (Murashige, Skoog 1962), 30 g/l saccarozơ, 7 g/l agar có bổ sung
AgNPs-CPDs (mẫu M 2) lần lƣợt: 0; 250; 500; 1000 µl/l. Cấy các đốt thân
cây cẩm chƣớng in vitro dài 2-3 (cm). Theo dõi các chỉ tiêu: số chồi/mẫu, số
lá/mẫu, chiều dài rễ (cm), chiều cao chồi (cm), đặc điểm hình thái mẫu sau 5
tuần nuôi cấy.
Môi trƣờng nuôi cấy: sử dụng môi trƣờng cơ bản là MS( Murashige và
Skoog, 1962), dung dịch nano bạc-chấm lƣợng tử ở các nồng độ khác nhau
tùy thuộc vào từng thí nghiệm, pH môi trƣờng là 5,8.
Nhiệt độ phòng nuôi cấy đƣợc duy trì ở 24- 26°C, cƣờng độ chiếu sáng
là 1.800- 2000 lux.
Bảng 2.3. Công thức thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của vật liệu AgNPsCPDs đến sinh trƣởng của cây Cẩm chƣớng in vitro
Công thức
Chất
ĐC

MS cơ bản

CT1

MS + 250µL nano bạc

CT2

MS + 500µL nano bạc

CT3

MS + 1000µL nano bạc

Đánh giá thí nghiệm sau 5 tuần nuôi cấy dựa trên các chỉ tiêu: số
chồi/mẫu, số lá/mẫu, chiều dài rễ (cm), chiều cao chồi (cm), đặc điểm hình
thái mẫu sau 5 tuần nuôi cấy.

15


2.7. Phƣơng pháp thống kê
Các số liệu thực nghiệm đƣợc phân tích thống kê bằng chƣơng trình
Excel 2010 [5]. Sự sai khác giữa giá trị trung bình đƣợc kiểm tra bằng giới
hạn sai khác nhỏ nhất LSD ở mức ý nghĩa α=0,05. Ở các bảng số liệu, trong
cùng một cột, ký tự theo sau khác nhau thể hiện sự sai khác ở mức ý nghĩa
α=0,05.

16