Phân tích cấu trúc của một số hợp chất giữa betulin với 1,2 diaminobenzene

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯƠNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ HƯƠNG

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC
CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT GIỮA BETULIN
VỚI 1,2-DIAMINOBENZENE

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Thái Nguyên – 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯƠNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ HƯƠNG

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC
CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT GIỮA BETULIN
VỚI 1,2-DIAMINOBENZENE
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 8440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. ĐẶNG THỊ TUYẾT ANH

Thái Nguyên - 2018

LƠI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn
GS.TS. Nguyễn Văn Tuyến và TS. Đặng Thị Tuyết Anh đã giao đề tài và tận
tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn cán bộ phòng Hóa Dược và các em sinh
viên phòng Hóa Dược đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực nghiệm và
hoàn thành luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô khoa Hóa học – Trường Đại học
Khoa học Thái Nguyên đã trang bị cho em kiến thức để tiếp cận với các vấn
đề nghiên cứu khoa học, và các anh chị, các bạn học viên lớp K10B1 – lớp
Cao học Hóa đã trao đổi và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình tôi, bạn bè
đồng nghiệp của tôi – những người đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hương

a


MỤC LỤC
LƠI CẢM ƠN .................................................................................................................a
MỤC LỤC ..................................................................................................................... b
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ................................................. d
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................................e
DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................................ f
DANH MỤC SƠ ĐỒ ..................................................................................................... g

PHỤ LỤC ....................................................................................................................... h
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1
Chương 1. TỔNG QUAN .............................................................................................2
1.1. Giới thiệu về Betulin .......................................................................................... 2
1.2. Một số chuyển hóa của betulin............................................................................. 3
1.3. Histon deacetylase và dẫn chất benzamide .......................................................... 7
1.4. Phương pháp phân tách và phân lập các hợp chất ............................................... 8
1.4.1. Phương pháp chiết hai pha lỏng...................................................................... 9
1.4.2. Sắc ký lớp mỏng (TLC) .................................................................................. 9
1.4.3. Sắc ký cột thường.......................................................................................... 10
1.4.4. Phương pháp kết tinh lại ............................................................................... 11
1.5. Phương pháp phân tích cấu trúc các hợp chất.................................................... 11
Chương 2. THỰC NGHIỆM ...................................................................................... 12
2.1. Hóa chất và thiết bị............................................................................................. 12
2.1.1. Hóa chất và dung môi ................................................................................... 12
2.1.2. Thiết bị xác định cấu trúc.............................................................................. 12
2.1.3. Xác định cấu trúc của các sản phẩm tổng hợp được..................................... 13
2.2. Chuẩn bị mẫu và xác định cấu trúc một số sản phẩm chuyển hóa của betulin.. 13
2.2.1. Chuẩn bị mẫu và xác định cấu trúc chất 25a-b ............................................. 13
2.2.2. Chuẩn bị mẫu và xác định cấu trúc chất 26a-b ............................................. 15

b


Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................. 17
3.1. Phân tích và xác định cấu trúc các hợp chất 25a-b ............................................ 18
3.2. Phân tích và xác định cấu trúc các hợp chất 26a-b ............................................ 22
KẾT LUẬN .................................................................................................................. 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 29
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 1-PL

c


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt
13

C-NMR

Tên đầy đủ
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13 (13C Nuclear Magnetic
Resonance)

1

H-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H Nuclear Magnetic
Resonance)

IR

Phổ hồng ngoại (Infraed Spectroscopy)

MS

Phổ khối lượng va chạm điện từ (Electron Impact-Mass
Spectrometry)

δ H, δ C
Ppm

Độ dịch chuyển hóa học của proton và cacbon
Phần triệu (parts per million)

s

Singlet

dd

Double doulet

m

Multiplet

t

Triplet

DMF

Dimetyl formamide

TMS

Tetrametyl Silan (chất chuẩn)

EtOAc
h
DMAP
BOP

Etylaxetat
Giờ
4-dimetylaminopyridine
Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimetylamino)phosphoniumhexafluorophosphat

Et3N

Trietylamin

DCM

Diclometan

d


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Một số dẫn xuất este của betulin có hoạt tính gây độc tế bào ......................... 3
Hình 1.2. Cấu trúc của các hợp chất CI-994, MS-275 và MGCD-103 ........................... 8
Hình 3.1. Cấu trúc của một số dẫn xuất este của betulin ................................................ 17
Hình 3.2. Cấu trúc hóa học và một số đặc trưng vật lí của các hợp chất 25a-b ........... 20
Hình 3.3. Cấu trúc hóa học và một số đặc trưng vật lí của các hợp chất 26a-b ........... 23
Hình 3.4. Phổ 1H-NMR của hợp chất 26a ........................................................................ 24
Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của hợp chất 26b ........................................................................ 24
Hình 3.6. Phổ 13C-NMR của hợp chất 26a ....................................................................... 26

Hình 3.7. Phổ 13C-NMR của hợp chất 26b ....................................................................... 26

e


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 3.1. Một số tín hiệu đặc trưng khung lupan trong các hợp chất 25a-b .............. 21
Bảng 3.2. Một số tín hiệu đặc trưng phổ 1H-NMR của hợp chất 26a-b ..................... 23
Bảng 3.3. Một số tín hiệu đặc trưng phổ 13C-NMR của các hợp chất 26a-b .............. 25

f


DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1. 1. Phản ứng betulin và anhydrit 2,2-dimethylsuccinic ..................................... 4
Sơ đồ 1. 2. Tổng hợp một số este của betulin và axit nicotinic ......................................... 5
Sơ đồ 1. 3. Tổng hợp một số este của betulin với các axit cacboxylic thơm ................... 6
Sơ đồ 1. 4. Tổng hợp một số dẫn xuất amit-este-C-28 của betulin ................................... 7
Sơ đồ 3.1. Chuyển hóa nhóm OH của C-28 của betulin thành chức este ....................... 18
Sơ đồ 3.2. Tổng hợp các hợp chất lai của betulin với 1,2-diaminobenzene ................... 18
Sơ đồ 3.3. Tổng hợp các dẫn xuất của betulin với các anhydride axit ......................... ...19
Sơ đồ 3.4. Tổng hợp các dẫn xuất của của betulin với 1,2-diaminobenzene ................ 22

g


PHỤ LỤC PHỔ
PHỤ LỤC PHỔ ......................................................................................................... 1-PL
PL1: Phổ IR của Betulin.......................................................................................... 1-PL
PL2: Phổ 1H-NMR của Betulin ............................................................................... 2-PL

PL3: Phổ 1H-NMR của chất 26a ............................................................................. 3-PL
PL4: Phổ

13

C-NMR của chất 26a .......................................................................... 4-PL

PL5: Phổ MS của chất 26a ..................................................................................... 5-PL
PL6: Phổ 1H-NMR của chất 26b ............................................................................. 6-PL
PL7: Phổ giãn 1H-NMR của chất 26b ..................................................................... 7-PL
PL8: Phổ

13

C-NMR của chất 26b ........................................................................... 8-PL

PL9: Phổ MS của chất 26b ...................................................................................... 9-PL
PL10: Phổ IR của chất 26a .................................................................................... 10-PL
PL11: Phổ IR của chất 26b.................................................................................... 11-PL

h


MỞ ĐẦU
Chúng ta đều biết ung thư là căn bệnh nguy hiểm, gây tỉ lệ tử vong cao.
Các thuốc điều trị ung thư thường hướng tới đích là các protein như các protein
kinase phụ thuộc cyclin, protein gây ung thư Bcl-2, P53, histon deacetylase
(HDAC), STAT.....[1]. Một trong những đích tác dụng phân tử đang được chú ý
hiện nay là các histon deacetylase (HDAC). Nghiên cứu về HDAC đã xác định
hoạt động bất thường của HDAC liên quan đến nhiều bệnh unh thư. Vì vậy các

chất ức chế HDAC đang là các tác nhân đầy triển vọng. Dẫn chất benzamide là
chất ức chế HDAC tốt được các nhà nghiên cứu trên thế giới tập trung nghiên
cứu nhiều do cấu trúc phức tạp, hoạt tính ức chế HDAC mạnh.
Phương pháp phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ là một trong số các
nhiệm vụ quan trọng của Hóa học vì chỉ khi biết chính xác cấu trúc, chúng ta
mới có câu trả lời chính xác cho việc định tính, định lượng và phân tích chúng
trong các mẫu nghiên cứu thực cũng như trong đời sống và công nghệ. Để phân
tích cấu trúc của các hợp chất hữu cơ có thể sử dụng các phương pháp phổ như
phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại khả kiến, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối
lượng. Mỗi phương pháp cho phép xác định một số thông tin khác nhau của cấu
trúc phân tử và hô trợ lẫn nhau trong việc xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ.
Hợp chất betulin và các sản phẩm chuyển hóa của chúng có cấu trúc phức tạp
trong không gian do chứa nhiều nhóm chức và các đồng phân khác nhau.
Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành lựa chọn đề tài: “Phân tích cấu trúc của
một số hợp chất giữa betulin với 1,2-diaminobenzene”. Đây là đề tài có ý
nghĩa khoa học và thực tiễn.

1


Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về Betulin

2


Betulin hay 20(29)-lupene-3β,28-diol (1), lần đầu tiên được phân lập vào
năm 1788 từ loài Betula alba (Betulaceae), là một trong các hợp chất thiên nhiên
phổ biến thuộc nhóm tritecpenoit khung lupan. Trong tự nhiên, betulin được tìm

thấy ở nhiều loài thực vật, nhiều nhất là trong thành phần vỏ cây bạch dương
(chiếm tới 30% trọng lượng khô của dịch chiết từ vỏ của loài B. verrucosa). Một
lượng betulin cũng được tìm thấy ở nhựa của loài cây này [2] và được phát hiện
có nhiều hoạt tính như hoạt tính gây độc tế bào đối với tế bào ung thư da, ung
thư não và nhiều dòng tế bào ung thư ở người [6-8] và hoạt tính chống HIV [911]. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng betulin có khả năng ức chế sự
trưởng thành của các Protein điều tiết sterol (SREBPs) [3]. Sự ức chế SREBPs
của betulin làm giảm sinh tổng hợp cholesterol và axit béo. Trong thử nghiệm
lâm sàng, betulin cải thiện tình trạng béo phì do chế độ ăn uống gây ra, làm
giảm lượng lipid trong huyết thanh và các mô, và làm tăng độ nhạy của insulin
[24-27]. Hơn nữa, betulin giảm kích thước và cải thiện sự ổn định của mảng xơ
vữa động mạch. Do tính sẵn có và là một tritecpenoit thiên nhiên có hoạt tính
sinh học tốt nên betulin được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Đến nay
đã có nhiều công trình nghiên cứu các dẫn xuất của betulin trong đó có nhiều
dẫn xuất mới có hoạt tính sinh học cao, nhiều hợp chất được nghiên cứu lâm
sàng [6-8,23].

3


Hình 1.1. Một số dẫn xuất este của betulin có hoạt tính gây độc tế bào
Rất nhiều dẫn xuất của betulin được tổng hợp và kết quả nghiên cứu hoạt
tính sinh học của chúng cho thấy nhiều dẫn xuất este của betulin có hoạt tính gây
độc tế bào rất tốt (hợp chất 1, 2). Nghiên cứu trên nhiều dẫn xuất este của betulin,
Kommera và các cộng sự nhận thấy nếu giữ nhóm OH tự do ở C-3 và este hóa
nhóm OH ở C-28 (1 và 2) thì hoạt tính chống ung thư của các dẫn xuất có xu
hướng tăng mạnh. Bên cạnh đó, các dẫn xuất este hóa nhóm OH ở C-3 và giữ
nhóm OH tự do ở C-28 có hoạt tính tốt hơn betulin nhưng giảm mạnh so với các
dẫn xuất C-28 (hợp chất 3 và 4) [5]. Việc nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất có
hoạt tính gây độc tế bào của betulin vẫn đang là mối quan tâm của các nhà khoa
học.

1.2. Một số chuyển hóa của betulin
Phân tử betulin có hai nhóm chức OH liên kết với C-3 và C-28 và một nối
đôi ∆ 20(29) của nhánh isopropylenyl tại C-19. Đây là các trung tâm hoạt động rất
dễ bị chuyển hóa hoặc thay thế trong các phản ứng hóa học mà vẫn giữ được
4


khung tritecpen, do vậy khả năng chuyển hóa của betulin rất phong phú. Việc
chuyển hóa nhóm chức OH ở C-3 hoặc C-28 của hợp chất betulin đem lại các
dẫn xuất có hoạt tính sinh học.

Sơ đồ 1. 1. Phản ứng betulin và anhydrit 2,2-dimethylsuccinic
Các chuyển hóa chính của betulin thu được dẫn xuất có hoạt tính sinh học
tốt như chuyển hóa nhóm chức OH ở C-3 hoặc OH ở C-28. Điển hình là các
chuyển hóa nhóm chức OH ở C-3 thành các este với một số diaxit cacboxylic
như hợp chất 6-9. Bốn đồng phân của 3,28-di-O-(dimethylsuccinyl)-betulin đã
được tổng hợp và thử hoạt tính chống HIV với dòng HIV-1 trong các tế bào
lympho H9. Trong đó đồng phân 3-O-(3',3'-dimethylsuccinyl)-28-O-(2",2"dimethylsuccinyl)-betulin (hợp chất 6) là hợp chất có hoạt tính chống HIV mạnh
nhất với giá trị EC50 là 0,00087 μM và giá trË TI là 42.400 (sơ đồ 1.1) [11].
Năm 2010, nhà khoa học người Nga Oxana B. Kazakova và các cộng sự
đã nghiên cứu chuyển hóa hai nhóm OH ở vị trí C-3 và C-28 của betulin qua
5


một loạt các phản ứng để tạo thành các dẫn xuất este, trong đó các dẫn xuất este
với axit nicotinic 12 và 13 có hoạt tính kháng lại chủng virut ung thư cổ tử cung
HPV-11. Riêng hợp chất 12 còn thể hiện hoạt tính bảo vệ gan, chống loét, chống
viêm, hoạt tính điều hòa miễn dịch và hoạt tính kháng HIV (sơ đồ 1.2) [15].

Sơ đồ 1. 2. Tổng hợp một số este của betulin và axit nicotinic

Một số dẫn xuất este của betulin và các axit cacboxylic thơm tương ứng
được tổng hợp và thử hoạt tính kháng khuẩn. Trong đó hợp chất 17 và 20 thể

6


hiện hoạt tính kháng khuẩn trên nhiều dòng vi khuẩn với đường kính vô khuẩn
từ 10 – 13 mm (sơ đồ 1.3) [16].

Sơ đồ 1. 3. Tổng hợp một số este của betulin với các axit cacboxylic thơm
Nhiều dẫn xuất amit-este-C-28 của betulin được tổng hợp và nghiên cứu
thử hoạt tính chống ung thư trên các dòng tế bào ung thư ở người như MGC-803
(ung thư dạ dày), PC3 (ung thư tiền liệt tuyến), Bcap-37 (ung thư biểu mô cổ tử
cung), A375 (ung thư da), và MCF-7 (ung thư vú). Kết quả cho thấy, một số dẫn
xuất (hợp chất 22 và 24a-d) thể hiện hoạt tính tốt với giá trị IC50 từ 4-18 μM.
Hợp chất 24c chứa nhóm piperidin trong nhóm chức amit thể hiện hoạt tính tốt
nhất tương ứng các giá trị IC50 đối với 5 dòng tế bào kể trên lần lượt là 4,3 μM;
4,5 μM; 5,2 μM; 7,5 μM, và 5,2 μM (sơ đồ 1.4) [6].

7


Sơ đồ 1. 4. Tổng hợp một số dẫn xuất amit-este-C-28 của betulin
1.3. Histon deacetylase và dẫn chất benzamide
Trong cơ thể, histon deaxetylase (HDAC) là nhóm các enzym xúc tác
cho quá trình deaxetyl hoá nhóm ε-N axetyl lysine amino axit ở phần đuôi
của histon. Người ta đã chứng minh được trong nhiều tế bào ung thư có sự
huy động quá mức các enzym HDAC, gây nên hiện tượng giảm sự axetyl
hoá của histon. Kết quả của quá trình này là ngăn cản quá trình phiên mã
8

thông qua việc đóng xoắn nhiễm sắc thể. Những năm gần đây, các
chất ức chế enzym HDAC đang trở thành các tác nhân chống ung thư
đầy triển vọng. Dẫn chất benzamide có tác dụng ức chế HDAC in vitro và
vivo được công bố năm 1999 bởi suzuki và cộng sự thuộc công ty dược
Mitsui [35]. Nhóm này bao gồm một số chất MS-275, CI-994, MGCD-103
(hình 1.2). MS-275 và CI-994 [37-40] đang được thử nghiệm lâm sàng ở
pha 2. MS275 làm giảm sự acetyl hóa quá mức của histon trong nhiều loại ung thư,
giảm sự biểu thị quá múc của p21WAFI/CIPI và gelsolin. CI-994 là 4acetylamino-N-(2’–aminophenyl ) benzamide, đã được chứng minh có tác
dụng trên tế bào ung thư ở người và chuột. Nghiên cứu in vitro cho thấy CI994 có tác dụng thúc đẩy sự chết tế bào theo chương trình trên các tế bào
lympho chuột. Ưu điểm lớn của CI-994 là thuốc chống phân bào đường
uống [18-20, 36]

Hình 1.2. Cấu trúc của các hợp chất CI-994, MS-275 và MGCD-103
1.4. Phương pháp phân tách và phân lập các hợp chất
Để phân tích, phân tách các phần chiết và phân lập các hợp chất đã sử dụng
các phương pháp chiết, các phương pháp chiết hai pha rắn – lỏng, chiết hai pha
lỏng – lỏng, các phương pháp sắc ký phân tích như sắc ký lớp mỏng (TLC), các
phương pháp sắc ký điều chế như sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột nhanh
(FC), sắc ký cột tinh chế (Mini-C), sắc ký cột pha đảo (RP-CC) và các phương
pháp kết tinh chọn lọc.

9


1.4.1. Phương pháp chiết hai pha lỏng
Phương pháp dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha lỏng
không hòa trộn (một pha nước và một pha hữu cơ). Các hợp chất hữu cơ sẽ được
chuyển từ một pha nước sang một pha hữu cơ còn các chất nền phân cực sẽ ở lại

trong pha nước. Quá trình chiết có thể được thực hiện ở các điều kiện được kiểm
soát ví dụ như pH, độ phân cực của dung môi chiết, tỷ lệ thể tích pha hữu cơ/pha
nước, nhiệt độ,…
1.4.2. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng trên silicagel là phương pháp thích hợp cho phân tích các
hợp chất hữu cơ. Vì sự phân tích TLC trên silicagel là một quá trình hấp phụ các
hợp chất được phân tách theo độ phân cực theo cách tương tự như trong sự phân
tách sắc ký cột. Sắc ký lớp mỏng là phương pháp phân tích để lựa chọn các hệ
dung môi rửa giải cho sắc ký cột. Để định tính các hợp chất, các giá trị Rf và
màu sắc của các vệt chất được phát hiện trên bản mỏng TLC cần được mô tả.
Dựa vào sắc ký đồ TLC có thể đánh giá định tính số lượng các hợp chất có trong
hỗn hợp. Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silicagel tráng sẵn DCAlufolien 60 F254 (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với chiều dày lớp silicagel là
0,2 mm. Đưa mẫu phân tích lên bản mỏng. Hòa tan mẫu thử trong dung môi
thích hợp (1 mg/ml), sau đó dùng capilla đưa dung dịch mẫu thử lên bản mỏng
(10 μl).
Dung môi triển khai: Các dung môi dùng trong TLC đều được làm khan
và chưng cất lại trước khi sử dụng. Các hệ dung môi được trộn theo tỷ lệ phù
hợp với từng mẫu phân tích. Sau khi pha phải lắc kỹ cho các dung môi trong hệ
trộn đều nhau rồi cho vào bình triển khai sắc ký đáy bằng, có nút nhám kín đến
chiều cao 0,5 cm. Để yên đến khi bình được bão hòa dung môi mới tiến hành
triển khai bản mỏng.
Triển khai bản mỏng: Bản mỏng được cắt với kích thước phù hợp với
tuyến xuất phát của dung môi, dung môi có chiều cao 1 cm. Dùng kẹp sắt đưa
1
0


nhanh bản mỏng đã được tẩm mẫu vào bình triển khai sắc ký, đậy kín nắp, để
yên và quan sát. Khi quan sát thấy dung môi đã chạy đến tuyến dung môi trên,
dùng kẹp sắt lấy bản mỏng ra khỏi bình và tiến hành phát hiện vệt chất trên bản

mỏng.
Phát hiện vệt chất trên bản mỏng: Bản mỏng được phun các thuốc hiện
FeCl3/EtOH 5% và vanillin/H2SO4 đặc 1%, sau đó được hơ nóng ở 1200C, đánh
dấu vệt chất trên bản mỏng, tính giá trị Rf và ghi màu sắc của các vệt chất.
1.4.3. Sắc ký cột thường
Sắc ký cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi. Cột
sắc ký được thiết kế với khóa dưới và nhám trên có đường kính trong và chiều
cao tùy theo lượng mẫu cần phân tách. Chấp hấp phụ dùng cho CC là silicagel
(Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với các cỡ hạt 63-200 m và 40-63 m. Dung môi
hữu cơ dùng cho sắc ký cột được làm khan, chưng cất lại và bảo quản trong bình
kín trước khi sử dụng.
Nhồi cột sắc ký: Phương pháp nhồi cột ướt: Một lượng silicagel ứng với
cột sắc ký có đường kính thích hợp, có chiều cao là 30 cm được khuấy đều thành
bột nhão trong một lượng vừa đủ n-hexan khan. Bột nhão này được đuổi hết bọt
khí và được nhồi vào cột sắc ký. Có thể dùng bơm nén hoặc trọng lực dung môi
n-hexan đi qua cột nhiều lần cho đến khi lớp silicagel hoàn toàn ổn định.
Đưa mẫu lên cột sắc ký: Phương pháp tẩm mẫu trên silicagel: Mẫu được
hòa tan trong một lượng vừa đủ dung môi dễ bay hơi thích hợp. Trộn dung dịch
thu được với silicagel (cỡ hạt 40-63 m) với tỷ lệ là 1 g chất /1,2 g đến 1,5 g
silicagel. Hỗn hợp này được làm bay hơi dung môi đến khi khô kiệt thu được bột
mịn của mẫu chất hấp phụ trên silicagel. Bột này được đưa lên cột sắc ký phía
trên lớp chất hấp phụ silicagel.
Triển khai sắc ký cột: Mở khóa dưới cột sắc ký để cho dung môi chảy ra
khỏi cột sắc ký, cho đến khi bề mặt dung môi cách bề mặt silicagel khoảng 2
mm. Cho từ từ mẫu tẩm trên silicagel lên cột. Khi đưa mẫu lên cột cần phải chú
1
0


ý đảm bảo cho bề mặt của lớp chất phía trên cột sắc ký tạo thành mặt phẳng

ngang. Rắc một lớp cát lên phía trên để tránh các chất bột bị hòa tan ngược. Tiến
hành rửa giải bằng hệ dung môi được xác định nhờ vào các khảo sát thăm dò
TLC, tốc độ rửa giải 20 giọt/phút, thu các phân đoạn theo thể tích 150 ml, 50 ml
và 20 ml (CC, FC). Với cột sắc ký tinh chế (Mini-C) các phân đoạn được thu
theo thể tích 3-5 ml.
Khảo sát sắc ký các phân đoạn: Tiến hành khảo sát các phân đoạn nhận
được bằng TLC, gộp các phân đoạn cho sắc ký đồ TLC giống nhau lại, sau đó
cất loại kiệt dung môi để thu được các nhóm phân đoạn.
1.4.4. Phương pháp kết tinh lại
Phương pháp này chủ yếu được sử dụng để phân lập và tinh chế chất rắn.
Việc làm sạch chất rắn bằng kết tinh là dựa trên sự khác nhau về độ tan của chất
và tạp chất trong dung môi hoặc hệ dung môi đã chọn và độ tan của chất ở các
nhiệt độ khác nhau.
1.5. Phương pháp phân tích cấu trúc các hợp chất.
Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là kết
hợp giữa việc xác định các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại.
Tuy nhiên, phương pháp phổ biến nhất là các phương pháp đo phổ như: phổ
hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1H-NMR,
NMR, DEPT,…) [41-42].

1
1

13

C-


Chương 2
THỰC NGHIỆM

2.1. Hóa chất và thiết bị
2.1.1. Hóa chất và dung môi

1
2


Các hóa chất dùng cho tổng hợp hữu cơ và dung môi được mua của hãng
Merck, hãng Sigma Aldrich và hãng Fluka và thuộc loại phân tích dùng cho
phân tích.
Bột silicagel cho sắc ký cột 100 – 200 mesh (Merck), bản mỏng sắc ký
silicagel đế nhôm Art. 5554 DC – Alufolien Kiesel 60F254 (Merk).
2.1.2. Thiết bị xác định cấu trúc
Để xác định cấu trúc các chất hữu cơ tổng hợp được, chúng tôi tiến hành
các phương pháp sau:
- Phương pháp sắc kí lớp mỏng
Sắc kí lớp mỏng (SKLM) được sử dụng để định tính chất đầu và sản
phẩm. Thông thường chất đầu và sản phẩm có giá trị Rf khác nhau, màu sắc và
sự phát quang khác nhau. Dùng sắc kí lớp mỏng để biết được phản ứng đã xảy
ra hay không xảy ra, phản ứng đã kết thúc hay chưa kết thúc là dựa vào các vết
trên bản mỏng, cùng các giá trị Rf tương ứng. Giá trị Rf của các chất phụ thuộc
vào bản chất và phụ thuộc vào dung môi làm pha động. Dựa trên tính chất đó, có
thể tìm được dung môi hay hỗn hợp dung môi để tách các chất ra xa nhau (Rf
khác xa nhau) hay tìm được hệ dung môi cần thiết để tinh chế các chất.
- Xác định nhiệt độ nóng chảy
Nhiệt độ nóng chảy của các chất tổng hợp được đo trên máy đo trên máy
Gallenkeamp của Anh tại phòng thí nghiệm Tổng hợp hữu cơ – Viện hóa học –
Viện Hàn Lâm khoa học & Công nghệ Việt Nam.

1

3


- Phổ hồng ngoại (IR)
Phổ IR của các chất nghiên cứu được ghi trên máy Perkin Elmer –
Spectrum two, tại Viện Hóa học – Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt
Nam, đo ở dạng ép viên với KBr rắn.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ 1H-NRM (500MHz) và 13C–NMR (125MHz) của các chất nghiên cứu
được đo trên máy Bruker XL–500 tần số 500MHz với TMS là chất chuẩn, tại
Viện Hóa học – Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.
- Phổ khối lượng (MS)
Phổ khối của các chất nghiên cứu được ghi trên LC – MS/MS Q –
Exactive focus tại Viện Hóa học – Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt
Nam.
2.1.3. Xác định cấu trúc của các sản phẩm tổng hợp được
Cấu trúc của các sản phẩm phản ứng được xác định nhờ các phương pháp
phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, phổ hồng
ngoại (IR).
2.2. Chuẩn bị mẫu và xác định cấu trúc một số sản phẩm chuyển hóa của
betulin
2.2.1. Chuẩn bị mẫu và xác định cấu trúc chất 25a-b

* Chuẩn bị mẫu: Hỗn hợp gồm 1,0 mmol betulin (5) và 1,2 mmol Et3N
trong 5ml diclometan được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Thêm 4,0
mmol anhidrit axit dicacboxylic tương ứng vào bình phản ứng và tiếp tục khuấy
trong 12 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau khi phản ứng kết thúc, dung môi được loại
1
4