Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắcxin phòng bệnh cho cá mú (Epinephelus spp (Luận án tiến sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
---------------

NGUYỄN THỊ THANH

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT GÂY
HOẠI TỬ THẦN KINH VÀ TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP
LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT VẮC- XIN PHÒNG BỆNH CHO
CÁ MÚ (Epinephelus spp.)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Hà Nội, năm 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
---------------

NGUYỄN THỊ THANH

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT
GÂY HOẠI TỬ THẦN KINH VÀ TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ
HỢP LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT VẮC-XIN PHÒNG BỆNH

CHO CÁ MÚ (Epinephelus spp.)
Chuyên ngành:

Cơng nghệ sinh học

Mã số:

9420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NƠNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. Phạm Công Hoạt
PGS.TS. Lê Văn Năm

Hà Nội, năm 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu do tơi thực hiện. Tồn
bộ số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng
được sử dụng để công bố trong các cơng trình nghiên cứu để nhận học vị, các
thơng tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2018
Tác giả luận án

Nguyễn Thị Thanh

i

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài luận án này tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ
từ các tổ chức và cá nhân.
Trước hết tôi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Phạm Cơng
Hoạt (Bộ Khoa học và Công nghệ), PGS. TS. Lê Văn Năm (Hội đồng chức
danh giáo sư nhà nước), PGS.TS Phạm Thị Tâm (Phòng Khoa học và Hợp tác
quốc tế, Viện Đại học Mở Hà Nội) đã định hướng, tận tình hướng dẫn, giúp
đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu này.
Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới sự hỗ trợ về tài chính, cơ sở vật chất,
trang thiết bị từ đề tài cấp Nhà nước mã số KC04.03/11- 15. Tôi xin cảm ơn
tập thể cán bộ, kỹ thuật viên, học viên của Khoa Công nghệ sinh học, Viện
Đại học Mở Hà Nội nơi tôi thực hiện các nội dung trong đề tài luận án, đã hỗ
trợ về mọi mặt để tôi có thể hồn thành luận án này.
Để hồn thành luận án này, tơi cịn nhận được sự động viên, khuyến
khích giúp đỡ của các bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Tất cả những sự giúp
đỡ và tình cảm quý báu đó là nguồn động lực lớn giúp tơi có thể hồn thành
cơng trình nghiên cứu này.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng 10 năm 2018

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Thanh

ii

MỤC LỤC
Lời cam đoan ...................................................................................................... i
Lời cảm ơn ........................................................................................................ ii
Mục lục ............................................................................................................. iii
Danh mục chữ viết tắt ..................................................................................... vii
Danh mục bảng................................................................................................. ix
Danh mục hình .................................................................................................. x
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4
1.1. Một số đặc điểm sinh học của cá mú ....................................................... 4
1.1.1. Hệ thống phân loại cá mú ....................................................................... 4
1.1.2. Đặc điểm phân bố.................................................................................... 4
1.1.3. Đặc điểm sinh trưởng .............................................................................. 5
1.1.4. Đặc điểm sinh sản ................................................................................... 6
1.1.5. Đặc điểm về hệ miễn dịch ở cá mú ......................................................... 6
1.2. Ýnghĩa kinh tế và tình hình ni cá mú ..................................................... 7
1.3. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới và Việt Nam10
1.3.1. Đặc điểm của bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển....................................10
1.3.2. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới ................ 12
1.3.3. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam .......... 15
1.3.4. Các phương pháp chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh trên cá ................ 17
1.4. Tổng quan về vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh ...................................... 21
1.5. Một số biện pháp phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú .................... 25
1.6. Kháng nguyên tái tổ hợp và tình hình sử dụng vắc-xin phịng bệnh cho cá27
1.6.1. Kháng nguyên tái tổ hợp của tác nhân gây bệnh .................................. 27
1.6.2. Tình hình sử dụng vắc-xin phịng bệnh cho cá trên thế giới ................ 30
1.6.3. Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá tại Việt Nam ............... 34
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 37
2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ............................................................ 37
iii

2.2. Nội dung nghiên cứu ...............................................................................38
2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 38
2.3.1. Nhóm các phương pháp cho nội dung xác định vi rút gây hoại tử thần
kinh trên cá mú ................................................................................................ 38
2.3.1.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu ........................................................... 38
2.3.1.2 Phương pháp mô bệnh học ................................................................. 38
2.3.1.3. Phương pháp phân lập vi rút bằng kỹ thuật nuôi cấy trên tế bào....... 39
2.3.1.4 Phương pháp tách chiết RNA tổng số ................................................. 40
2.3.1.5. Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)..............................41
2.3.1.6 Điện di axit nucleic trên gel agarose ................................................... 41
2.3.1.7 Phương pháp tách dịng gen: ............................................................... 41
2.3.2. Phương pháp xác định đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh
(NNV).............................................................................................................. 45
2.3.2.1. Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên tế bào GS1................ 45
2.3.2.2. Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên cá mú ......................... 46
2.3.2.3 Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi rút
trên tế bào GS1 ................................................................................................ 47
2.3.2.4. Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi
rút trên cá mú................................................................................................... 48
2.3.3. Nhóm các phương pháp biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên và đánh
giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp ............................... 48
2.3.3.1 Chuẩn bị vector pET32a+ để thực hiện phản ứng nối gen ................. 48
2.3.3.2 Nối gen T4 vào vector pET32a+.......................................................... 49
2.3.3.3 Chuyển gen vào E. coliJM109 ............................................................ 49
2.3.3.4. Tách chiết plasmid từ các khuẩn lạc sau biến nạp chuẩn bị cho kiểm
tra bằng PCR và enzyme giới hạn. .................................................................. 50
2.3.3.5 Nuôi cấy E. coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET32a+-T4............ 51
2.3.3.6 Phương pháp điện di SDS-PAGE ...................................................... 51

2.3.3.7. Phương pháp Western blot ................................................................. 52
iv


2.3.3.8. Phương pháp đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hòa của kháng
nguyên tái tổ hợp ............................................................................................. 53
2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu..................................................................... 56
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................. 57
3.1. Xác định vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam ..... 57
3.1.1. Sàng lọc mẫu nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương
pháp mô bệnh học ........................................................................................... 57
3.1.2. Xác định mẫu cá nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương
pháp RT-PCR .................................................................................................. 59
3.1.3. Xác định vi rút gây bệnh trên tế bào ..................................................... 62
3.1.4. Giải trình tự gen mã hóa kháng ngun T4 của NNV. ......................... 67
3.2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh
trên cá mú ........................................................................................................ 72
3.2.1. Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào mẫn cảm72
3.2.2. Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú ............ 73
3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh của vi rút gây hoại tử
thần kinh trên tế bào GS1. ............................................................................ 75
3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh của vi rút gây hoại tử
thần kinh trên cá mú ........................................................................................ 77
3.3. Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin
phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú. ....................................................... 80
3.3.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a+- T4 ................................................ 80
3.3.2. Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên T4 của vi rút gây hoại tử thần kinh85
3.3.2.1 Tạo chủng vi khuẩn E.coliBL21(DE3) mang gen mã hóa kháng
nguyên của NNV ............................................................................................. 85
3.3.2.2. Biểu hiện gen T4 trong tế bào vi khuẩn tái tổ hợp ............................. 87

3.3.2.3. Đánh giá các điều kiện biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên T4 của vi
rút gây bệnh hoại tử thần kinh......................................................................... 92
3.3.3. Tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp ....................................................... 95
v


3.3.4. Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp ........... 97
3.3.4.1. Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp trên
thỏ .................................................................................................................... 97
3.3.4.2. Đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ
hợp trên cá mú ............................................................................................... 100
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 104
DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
LUẬN ÁN TIẾN SĨ ...........................................................................................
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................

vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Giải thích

aa

Amino axit

BFNNV

Barfin flounder nervous necrosis virus (vi rút gây hoại tử
thần kinh trên cá bơn)

bp

Base pair (cặp bazơ)

BSA

Bovine Serum Albumin (Albumin huyết thanh bị)

cDNA

Complementary

Deoxyribonucleic

acid

(Chuỗi

Axit

Deoxyribonucleic acid bổ sung)
CPE

Cytopathogenic effect (Hiệu ứng bệnh tích tế bào)

CNS

Central nervous system (Hệ thần kinh trung ương)

cs

Cộng sự

Da

Dalton

DAB

Diamino bezidine (kit làm hiện màu)

DNA

Deoxyribonucleic acid

EDTA

Ethyllene diamine tetra acetic acid

ELISA

Enzyme linked immunosorbent assay (phản ứng miễn dịch
liên kết enzyme)

EtBr

Ethidium Bromide

FCS

fetal calf serum (Huyết thanh bào thai bê)

HRP

Horseradish peroxidase (Enzyme Horseradish Peroxidase)

kb

kilobase

KDa

Kilodalton

GAA

Global Aquaculture Alliance (Liên minh ni trồng thủy sản
tồn cầu)

GS

Grouper spleen (tế bào lách cá mú)

IPTG

isopropyl β-D- thiogalactoside

Ig

Immunoglobulin (kháng thể)

vii


LB

Leibovitz’s (môi trường nuôi tế bào)

LD50

Lethal Dose 50% (liều gây chết 50% động vật thí nghiệm)

NCR

Non coding region

ND

Not done (khơng đánh giá)

NNV

Nervous Necrosis Virus (vi rút gây hoại tử thần kinh)

nt

nucleotid

OD

Optical Density (mật độ quang)

ORF

Open Reading Frame (Khung đọc mở)

PAGE

Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Điện di trên gel
polyacrylamide)

PCR

Polemerase Chain Reaction (chuỗi phản ứng polime)

PVDF

Polyvinylidene Fluoride

RGNNV

Red - spotted grouper nervous necrosis virus (vi rút gây hoại
tử thần kinh trên cá mú chấm đỏ)

RNA

Ribonucleic acid

RT-PCR

Reverse Transcription PCR (PCR phiên mã ngược)

SDS

Sodium dodecyl sulphase

SJNNV

Striped jack nervous necrosis virus (vi rút gây hoại tử thần
kinh trên cá măng sọc)

TAE

Tris - acetate - EDTA

TBS

Tris Buffer Saline

TBST

TBS - Tween

TCID50

Tissue culture infective dose 50% (liều gây chết 50% tế bào)

TPNNV

Tiger puffer nervous necrosis virus (vi rút gây hoại tử thần
kinh trên cá nóc hổ)

UV

Ultraviolet light

VLPs

Virus-like particles (Tạo hạt giả vi rút)

VNN

Viral Nervous Necrosis (Bệnh hoại tử thần kinh)

viii


DANH MỤC BẢNG
Thứ tự

Tên bảng

bảng
1.1

Vùng địa lý và sự phân bố một số lồi cá mú có biểu hiện
bệnh hoại tử thần kinh

Trang

13

1.2

Các kiểu gen của Betanodavirus

23

1.3

Thuận lợi và tồn tại của vắc-xin DNA

33

1.4

Một số vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú

34

3.1

Kiểm tra vi rút bằng phương pháp mô bệnh học

58

3.2

3.3
3.4

3.5

Kiểm tra vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp
RT-PCR
Xác định vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào GS1
So sánh mức độ đồng nhất của trình tự đoạn gen T4 thu được
với các trình tự của GenBank
Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào
GS1

60
65
70

73

3.6

Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú

74

3.7

Phát hiện gen mã hoá kháng nguyên T4 của NNV trên cá mú

75

3.8

3.9

3.10

3.11

3.12

Khả năng gây bệnh của NNV trên cá mú ở nhiệt độ 28oC cả
ngày và đêm
Khả năng gây bệnh của NNV trên cá mú ở 28oC ban ngày và
24oC ban đêm
Hiệu giá kháng thể trung hịa vi rút gây bệnh hoại tử thần
kinh ở mơ hình in vitro
Hiệu giá kháng thể trung hịa vi rút gây bệnh hoại tử thần
kinh ở mơ hình in vivo
Hiệu giá sinh đáp ứng miễn dịch của cá mú chống lại NNV
trên mơ hình in vitro

ix

78

79

97

99

101


DANH MỤC HÌNH
Thứ tự

Tên hình

hình

Trang

1.1

Hình thái ngồi cá mú chấm nâu (Epinephelus coioides)

4

1.2

Sản lượng cá mú nuôi ở một số quốc gia trên thế giới

8

1.3

Dấu hiệu bệnh lý của cá mú bị VNN

11

1.4

Cấu trúc không gian của Betanodavirus

22

1.5

Cấu trúc gen của Betanodavirus

22

2.1

Quy trình thực hiện phương pháp mơ bệnh học

39

2.2
2.3
3.1
3.2
3.3
3.4

Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây
nhiễm của vi rút trên tế bào
Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây

nhiễm của vi rút trên cá mú
Bệnh tích tế bào ở mơ não và mơ mắt cá
Điện di đồ sản phẩm RT-PCR của một số mẫu bệnh phẩm
nghi nhiễm NNV
Bệnh tích của tế bào GS1 sau khi gây nhiễm NNV
Mức độ gây hiệu ứng bệnh tích tế bào (CPE) khi gây
nhiễm NNV trên tế bào GS1

47
48
57
61
63
66

3.5

Thiết kế vector tái tổ hợp pGEM-T-T4

68

3.6

Điện di kiểm tra sản phẩm T4 tái tổ hợp

69

3.7

So sánh độ tương đồng của đoạn gen giải trình tự với

đoạn gen T4 của Betanodavirus mã số HM017077.1

71

3.8

Mật độ tế bào sống sót sau khi gây nhiễm NNV

76

3.9

Sơ đồ quy trình tạo vector tái tổ hợp pET32a+-T4

81

3.10
3.11

Cắt vector pGEM-T-T4 (A) và cắt vector pET32a+(B)
bằng enzyme EcoRI
Tinh sạch sản phẩm cắt plasmid pGEM-T-T4 và vector
pET32a+

x

82
83

3.12
3.13
3.14
3.15
3.16

Đĩa khuẩn lạc thu được sau khi chuyển gen pET32a+-T4
vào E. coliJM109
Kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp pET32a+-T4 trong vi
khuẩn E. coliJM109
Điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt gen T4 trong
vector tái tổ hợp
Đĩa khuẩn lạc sau khi biến nạp pET32a+-T4 vào E.
coliBL21
Điện di đồ plasmid tái tổ hợp tách từ chủng E.
coliBL21(DE3) mang vector pET32a+-T4

84
84
85
86
86

Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra khả năng biến nạp
3.17

vector

tái

tổ

hợp

pET32a+-T4

vào

chủng

E.

87

coliBL21(DE3)
3.18
3.19

Điện di SDS-PAGE gel polyacrylamide 15% dòng vi
khuẩn số 1 và 2
Điện di SDS-PAGE gel polyacrylamide 15% dòng vi
khuẩn số 3 và số 4

89
90

3.20

Kết quả Westen blot của protein T4 tái tổ hợp

91

3.21

Lượng protein T4 tái tổ hợp được tổng hợp theo thời gian

93

3.22
3.23
3.24

Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi đến khả năng biểu hiện
protein T4 tái tổ hợp
Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến mức độ biểu hiện
protein T4 tái tổ hợp
Điện di protein T4 tinh sạch trên gel SDS-PAGE

xi

94
95
96


MỞ ĐẦU
Ngành thủy sản trong những năm gần đây đã và đang phát triển nhanh
chóng, dần khẳng định vị trí của mình và trở thành một trong những ngành
kinh tế mũi nhọn của Việt Nam. Nghề nuôi cá biển được đánh giá là nghề
mang lại hiệu quả kinh tế cao và cá mú được xem là một trong những lồi

ni chủ lực. Cá mú (Epinephelus spp.) có giá trị kinh tế rất cao do hàm
lượng dinh dưỡng giàu axit béo không no, thịt cá thơm ngon bổ dưỡng cho
nên được thị trường trong và ngoài nước rất ưa chuộng. Tuy nhiên, khi nghề
ni cá mú phát triển thì người ni cũng gặp khơng ít khó khăn bởi dịch
bệnh gây ra trên cá. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng những tác nhân gây bệnh
chủ yếu trên cá mú thường là vi rút, nấm và vi khuẩn trong đó nguy hiểm nhất
là bệnh hoại tử thần kinh (Viral Nervous Necrosis-VNN) hay bệnh não và
võng mạc (Viral Encephalopathy and Retinopathy -VER) do Betanodavirus
gây ra. Vi rút có thể tấn cơng và gây bệnh trên cá mú ở tất cả các giai đoạn
phát triển từ ấu trùng, cá giống đến cá thương phẩm. Khi bị bệnh cá có biểu
hiện rối loạn thần kinh như bơi mất thăng bằng, bơi xoay tròn, đầu chúc
xuống dưới hoặc treo trên mặt nước hay nằm dưới đáy bể, đáy lồng. Cá bệnh
có thể chết sau 3-5 ngày với tỷ lệ chết cao từ 80-100%. Ở Việt Nam, bệnh
phân bố ở hầu hết các vùng nuôi cá trên cả nước. Mùa vụ xuất hiện bệnh từ
tháng 5 đến tháng 10 khi nhiệt độ nước từ 24 đến 30ºC. Tỷ lệ chết do VNN
gây ra dao động từ 50 - 100% tùy thuộc theo loài và giai đoạn xuất hiện bệnh
(Đỗ Thị Hoà và cs, 2004) [2].
Hiện tại, ở Việt Nam mặc dù chưa có báo cáo tổng quát về bệnh hoại
tử thần kinh gây ra cho cá mú nuôi, nhưng các số liệu từ nghiên cứu của
trường Đại học Nha Trang, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I, Viện
Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II cho thấy, tỷ lệ cá mú nhiễm vi rút hoại tử
thần kinh cao lên tới 82% mẫu cá bệnh thu thập (Nguyễn Ngọc Du và cs,

1


Luận án đủ ở file: Luận án full