Chọn tạo giống lúa tính trạng hàm lượng amylose thấp bằng chỉ thị phân tử SSR trên quần thể lai hồi giao FILE gốc
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (4.19 MB, 184 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
HỒ VĂN ĐƯỢC
CHỌN TẠO GIỐNG LÚA HÀM LƯỢNG
AMYLOSE THẤP BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ
SSR TRÊN QUẦN THỂ LAI HỒI GIAO
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ NGÀNH: 9 42 02 01
CẦN THƠ, 2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
HỒ VĂN ĐƯỢC
CHỌN TẠO GIỐNG LÚA HÀM LƯỢNG
AMYLOSE THẤP BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ
SSR TRÊN QUẦN THỂ LAI HỒI GIAO
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ NGÀNH: 9 42 02 01
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
GS.TS. NGUYỄN THỊ LANG
CẦN THƠ, 2018
i
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin trân thành cảm ơn sâu sắc đến:
Giáo viên hướng dẫn đã dành nhiều thời gian quý báu, công sức và tận
tình chỉ dẫn tôi trong thời gian thực hiện luận án và theo học tại trường.
Quý Thầy Viện NC&PT Công nghệ Sinh học đã tư vấn, động viên, hỗ trợ
chuyên môn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho việc nghiên cứu và
học tập tại Viện.
Xin được gửi lời biết ơn sâu sắc đến Ban Lãnh đạo, Quý thầy cô, anh chị
em Bộ môn Di Truyền Chọn giống cây trồng Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu
Long; Ban lãnh đạo Viện NC&PT Công nghệ Sinh học trường Đại học Cần
Thơ; đã sắp xếp công việc cũng như tạo điều kiện thuận lợi về thời gian và cơ
sở vật chất để tôi có thể hoàn thành chương trình học tập và luận án đúng tiến
độ.
Cuối cùng, sự thành công của luận án không thể không kể đến sự đóng
góp không nhỏ của các thành viên trong gia đình, sự tạo điều kiện thuận lợi
của Lãnh đạo cơ quan và các đồng nghiệp cơ quan, những người luôn ủng hộ,
động viên và giúp tôi vượt qua rất nhiều khó khăn trong thời gian học tập.
Chân thành cám ơn./.
ii
TÓM TẮT
Gạo chất lượng cao đang là nhu cầu cấp thiết cho nội tiêu và xuất khẩu
của vùng đồng bằng Sông Cửu Long. Hàm lượng amylose là một tính trạng
quan trọng liên quan trực tiếp đến phẩm chất của hạt gạo. Nghiên cứu giống
lúa có hàm lượng amylose thấp thông qua sự kết hợp giữa phương pháp lai tạo
truyền thống và chọn lọc hiện đại bằng chỉ thị phân tử cho phép rút ngắn thời
gian và tăng hiệu quả tạo chọn giống lúa có chất lượng ngon dẻo. Trong
nghiên cứu này, vật liệu bố mẹ được đánh giá đầu tiên sử dụng phương pháp
phân tích kiểu hình dựa trên hàm lượng amylose và năng suất kết hợp đánh giá
kiểu gen với gen mục tiêu waxy. Các quần thể lai hồi giao được tạo ra từ các
bố mẹ được lựa chọn. Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) được ứng dụng
trong chọn lọc các tổ hợp lai với chỉ thị Wx cho gen mục tiêu, RM240,
RM162, RM256 và RM257 cho gen được đánh dấu trên các cá thể mẹ (gen tái
tổ hợp). Các cá thể/dòng phù hợp sẽ được chọn cho tự thụ đến thế hệ thứ hai
(F2). Ở thế hệ này, bản đồ GGT được thiết lập trên 12 nhiễm sắc thể để đánh
giá mối quan hệ di truyền của các cá thể chọn và qua đó tuyển lựa các cá thể
có nền tảng di truyền thích hợp nhất với mục tiêu chọn giống. Các cá thể triển
vọng nhất cuối cùng được chọn lọc dựa vào hàm lượng amylose thấp (~20%)
và năng suất cao (~7,0 tấn/ha) trên đồng ruộng. Kết quả chọn lọc vật liêu lai
cho thấy các giống bố cho gen (donor) thích hợp là Jasmine85, KDML105 và
OM7347, và các giống mẹ nhận gen (recipient) bao gồm OM6976, OM5930
2
và OM6073. Khi phân tích hệ số di truyền (h BS) cũng như hiệu quả chọn lọc
(GA) ở thế hệ F2, chỉ có 3 tổ hợp lai OM6976/Jasmine85, OM6976/KDML105
và OM5930/OM7347 được đánh giá là có tiềm năng nhất để tiếp tục phát triển.
Ba
tổ
hợp
lai
hồi
giao
(OM6976/Jasmine85//OM6976,
OM6976/KDML105//OM6976 và OM5930/OM7347//OM5930) được chọn
lọc
đến thế
hệ
BC4. Ở
thế hệ
BC4F1,
10
cá
thể
của tổ
hợp OM6976/Jasmine85//OM6976, 2 cá thể của tổ hợp
OM6976/KDML105//OM6976
và
1 cá
thểcủa
tổ
hợp
OM5930/OM7347//OM5930 được chọn vì các dòng này vừa mang gen waxy
dị hợp tử và vừa mang 4 gen tái tổ hợp đồng hợp tử. Phân tích bản đồ GGT ở
thế hệ BC4F2 cho thấy tổ hợp OM6976/Jasmine85//OM6976 có 4 dòng
(BC4F2-1,
BC4F2-3,
BC4F2-20
và
BC4F2-25),
tổ
hợp
OM6976/KDML105//OM6976 có 1 dòng (BC4F2-44) và tổ hợp
OM5930/OM7347//OM5930 có 2 dòng (BC4F2-16 và BC4F2-40) mang gen
waxy đồng hợp và 100% đồng hợp tử gen tái tổ hợp trên cả 12 nhiễm sắc thể.
Ở thế hệ BC4F3, các dòng lúa trên tiếp tục được lựa chọn trên đồng ruộng,
iii
trong đó, các dòng lúa D75, D131, D142, D150, D296, D233, D230 và D397
là triển vọng nhất. Các dòng này có tiềm năng phát triển ở vùng đồng bằng
Sông Cửu Long cũng như là nguồn vật liệu quý cho các nghiên cứu tiếp theo.
Từ khóa: quần thể lai hồi giao, chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS), gen
waxy, hàm lượng amylose, năng suất
iv
SUMMARY
High quality rice is an imperative demand for domestic consumption and
export of the Mekong Delta. Amylose content is an important trait that directly
relates to the quality of rice grains. Research on the low amylose content in
rice through a combination of traditional crossing and modern selection
methods by molecular markers to shorten the time and increase the efficiency
of selecting good quality rice varieties. In this study, parent materials were
firstly evaluated through phenotypic analysis based on amylose content and
yield combined with genotypic analysis of the target gene “waxy”. Backcross
populations were generated from selected parents. Marker-assisted selection
(MAS) was applied in choosing individuals with Wx marker for the waxy
gene, and 4 markers, RM240, RM162, RM256 and RM257, for recombinant
genes. Selected individuals were selfed to the second generation (F 2). In this
generation, the GGT map was established on 12 chromosomes to assess the
genetic relationships among selected individuals, and thereby candidating
individuals with the most genetic background to match the breeding objective.
Finally, the most elite individuals were selected based on low amylose content
(~ 20%) and high yield (~ 7.0 tons/ha) in the field. As a result, the suitable
donor genotypes were Jasmine85, KDML105 and OM7347, and recipient
genotypes included OM6976, OM5930 and OM6073. Based on heritability
2
(h BS) as well as genetic advance (GA) in the F2 generation, three
hybridizations,
OM6976/Jasmine85,
OM6976/KDML105
and
OM5930/OM7347, were most potential to grow. The three backcross
populations (OM6976/Jasmine85//OM6976, OM6976/KDML105//OM6976
and OM5930/OM7347//OM5930) were selected untill to BC 4 generation. In
the BC4F1 generation, 10 individuals of OM6976/Jasmine85/OM6976, 2
individuals of OM6976/KDML105//OM6976 and 1 individual of
OM5930/OM7347//OM5930 were selected because these lines carried the
heterozygote waxy gene and four homozygous recombinant genes. The
analysis of the GGT map at BC 4F2 showed that the population of OM6976/
Jasmine85//OM6976 with 4 lines (BC4F2-1, BC4F2-3, BC4F2-20 and BC4F225), the population of OM6976/KDML105//OM6976 with 1 line (BC4F2-44),
and the population of OM5930/OM7347//OM5930 with (BC4F2-16 and
BC4F2-40) carried both of the target gene and 100% homozygous recombinant
genes in all 12 chromosomes. In the BC 4F3 generation, the rice lines were
selected on the field, in which, the eight best lines were D75, D131, D142,
D150, D296, D233, D230 and D397. These rice lines were considered to be
v
ability to develop in the Mekong Delta as well as a valuable resource for
further research.
Key word: backcross population, MAS, waxy gene, amylose content, yield.
vi
MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN…………………………………………………………..
i
LỜI CẢM ƠN………………………………………………………...
ii
TÓM TẮT…………………………………………………………….
iii
SUMMARY…………………………………………………………..
v
MỤC LỤC…………………………………………………………….
vii
DANH SÁCH BẢNG………………………………………………...
xii
DANH SÁCH HÌNH…………………………………………………
xiii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT………………………………….
xvi
Chương 1: GIỚI THIỆU…………………………………………….
1
1.1 Đặt vấn đề ………………………………………………………………
1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu ……………………………………………………
2
1.2.1 Mục tiêu tổng quát …………………………………………………………..
2
1.2.2 Mục tiêu nghiên cứu cụ thể ……………………………………………….
2
1.3 Nội dung nghiên cứu ……………………………………………………
3
1.3.1 Nội dung 1: Đánh giá vật liệu bố mẹ sử dụng trong nghiên cứu chọn
tạo giống lúa phẩm chất cao có hàm lượng amylose
thấp…………………………………………………………………………………
…
3
3
1.3.2 Nội dung 2: Đánh giá hiệu quả di truyền của các tổ hợp lai…………..
1.3.3 Nội dung 3: Chọn tạo quần thể lai hồi giao có hàm lượng amylose
thấp thông qua MAS………………………………………………………………..
3
1.3.4 Nội dung 4: Chọn lọc các quần thể hồi giao BC nF2 thông qua lập bản
đồ GGT……………………………………………………………………………….
3
1.3.5 Nội dung 5: Đánh giá và chọn lọc cá thể có hàm lượng amylose và
năng suất cao trên các quần thể lai hồi giao BCnF3 ……………….................
3
1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ……………………………….
1.4.1 Ý nghĩa khoa học ……………………………………………......................
1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn ……………………………………………......................
vii
4
4
4
1.5 Tính khoa học của đề tài …………………………………………..........
4
1.6 Những đóng góp mới của đề tài …………………………………...........
5
1.7 Tính ứng dụng của đề tài ………………………………………………..
5
1.8 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ………………………………………
5
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ………………………………
6
2.1 Các chỉ tiêu phẩm chất của hạt gạo ……………………………………..
6
2.1.1 Hàm lượng amylose (AC) …………………………………………………..
6
2.1.2 Độ bền gel (GC) ……………………………………………………………..
7
2.1.3 Độ trở hồ (GT) ………………………………………………………………
8
2.2 Sơ lược về hàm lượng amylose …………………………………………
9
2.2.1 Sự hình thành tinh bột ở cây lúa ………………………………………….
9
2.2.2 Amylose và amylopectin……………………….. ………………………….
9
2.2.3 Cơ sở di truyền tính trạng hàm lượng amylose …………………………
11
2.3. Phương pháp lai hồi giao trong chọn tạo giống lúa……………………...
14
2.3.1 Một số khái niệm trong phương pháp lai hồi giao ……………………...
14
2.3.2 Ưu điểm của phương pháp lai hồi giao …………………………..........
16
2.3.3 Ưu điểm của phương pháp lai hồi giao ………………………….............
16
2.4 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa …………………….
17
2.4.1 Sơ lược về phương pháp chọn lọc bằng chỉ thị phân tử ………….........
17
2.4.2 Một số thành tựu của chỉ thị SSR trong chọn giống lúa ……………......
18
2.5 Chọn tạo giống bằng phương pháp lai hồi giao kết hợp với chỉ thị phân
tử…………………………………………………………………………….
19
2.5.1 Các giả thuyết mô hình MAS ………………………………………………
19
2.5.2 Điều kiện để ứng dụng MAS ………………………………………………
20
2.5.3 Đối với các tính kháng sinh học.................................................................................. 22
2.5.4 Đối với các tính kháng phi sinh học........................................................................... 23
2.5.5 Đối với các đặc tính nông học...................................................................................... 23
2.6 Các kết quả nghiên cứu giống phẩm chất cao trong và ngoài nước..................23
viii
Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………..
26
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu …………………………………………... 26
3.2 Vật liệu nghiên cứu …………………………………………………………. 26
3.3 Phương pháp nghiên cứu ……………………………………………………. 27
3.3.1 Nội dung 1: Đánh giá vật liệu bố mẹ sử dụng trong nghiên cứu chọn tạo
giống lúa phẩm chất cao có hàm lượng amylose thấp …………………………..
27
3.3.1.1 Đánh giá hàm lượng amylose ………………………………………………… 27
3.3.1.2 Đánh giá các đặc tính nông học, các thành phần năng suất và năng suất 27
3.3.1.3 Phân nhóm đa dạng di truyền kiểu hình ……………………….........................28
3.3.1.4 Đa dạng nguồn gen trên các giống lúa bố mẹ ………………………................29
3.3.2 Nội dung 2: Đánh giá hiệu quả di truyền của các tổ hợp lai ……………… 31
3.3.2.1 Lai tạo lúa trong nhà lưới ………………………………………..........................31
3.3.2.2 Đánh giá hiệu quả chọn lọc tính trạng mục tiêu dựa trên các quần thể
lai F2 ………………………………………………………………………………………. 33
3.3.3 Nội dung 3: Chọn tạo quần thể lai hồi giao có hàm lượng amylose thấp
thông qua MAS …………………………………………………………………. 33
3.3.4 Nội dung 4: Chọn lọc các quần thể hồi giao BCnF2 thông qua lập bản đồ
GGT ……………………………………………………………………………... 35
3.3.4.1 Kiểm tra kiểu gen của quần thể con lai trên 12 nhiễm sắc thể dựa trên
các chỉ thị phân tử đa hình giữa cây bố và mẹ ……………………………………… 35
3.3.4.2 Lập bản đồ GGT đánh giá sự di truyền của quần thể con lai, qua đó
35
chọn lọc các cá thể mang gen mục tiêu mong muốn ………............................
......
3.3.5 Nội dung 5: Đánh giá và chọn lọc cá thể có hàm lượng amylose và năng
36
suất cao trên các quần thể lai hồi giao BCnF3 ……………………………………
3.3.5.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm ………………………………………………. 36
3.3.5.2 Đánh giá kiểu hình và kiểu gen liên quan hàm lượng amylose trên quần
thể con lai ………………………………………………………………………………… 37
3.3.5.3 Đánh giá các thành phần năng suất và năng suất để chọn lọc các dòng
con lai ưu tú vừa có hàm lượng amylose thấp vừa có năng suất cao…………….. 40
3.3.6. Phương pháp xử lý số liệu................................................................................................... 40
ix
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………………..........
4.1. Đánh giá vật liệu bố mẹ sử dụng trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa phẩm
chất cao có hàm lượng amylose thấp ………………………………....................
4.1.1 Đánh giá hàm lượng amylose trên bộ giống vật liệu lai …………………….
4.1.2 Đánh giá đặc tính nông học trên bộ giống lúa vật liệu lai
…………............
4.1.3 Đánh giá các thành phần năng suất và năng suất trên bộ giống lúa vật
liệu lai
…………………………………………………………………………................
4.1.4 Phân nhóm đa dạng di truyền kiểu hình của bộ giống lúa vật liệu
lai………………………………………………………………………………………………..
4.1.5 Đa dạng nguồn gen trên các giống lúa bố mẹ ……………………….............
4.2 Đánh giá hiệu quả di truyền của các tổ hợp lai ………………………..........
4.2.1Tạo các quần thể F1
……………………………………………………………….
4.2.2 Đánh giá hiệu quả chọn lọc tính trạng mục tiêu dựa trên các quần thể lai
F2
………………………………………………………………………...........................
4.3 Chọn tạo quần thể lai hồi giao có hàm lượng amylose thấp thông qua
MAS…………………………………………………………………...................
4.3.1 Kết quả lai tạo quần thể hồi giao OM6976/Jasmine85//OM6976 ………….
4.3.2 Kết quả lai tạo quần thể hồi giao OM6976/KDML//OM6976 ….................
4.3.3 Kết quả lai tạo quần thể hồi giao OM5930/OM7347//OM5930
……………
4.4 Chọn lọc các quần thể hồi giao BC4F2 thông qua lập bản đồ GGT………….
4.4.1 Chọn lọc các cá thể BC4F2 của quần thể lai hồi giao OM6976/ Jasmine85//
OM6976 …………………………………………………………………………
4.4.2 Chọn lọc các cá thể BC4F2 của quần thể lai hồi giao OM6976/
KDML105// OM6976 …………………………………………………………...
4.4.3 Chọn lọc các cá thể BC4F2 của quần thể lai hồi giao OM5930/ OM7347//
OM5930 ………………………………………………………............................
4.5 Đánh giá và chọn lọc cá thể có hàm lượng amylose thấp và năng suất cao
trên các quần thể lai hồi giao BC4F3 …………………………………………….
4.5.1 Đánh giá và chọn lọc cá thể có hàm lượng amylose thấp và năng suất cao
trên các quần thể lai hồi giao BC4F3 của tổ hợp
O
M
6
9
7
6
/
J
a
s
m
i
n
e
8
5
/
/
O
M
6
9
7
6
…
…
…
…
…
…
…
…
…
…
…
…
…
…
…
…
…
…
…
.
.
56
41
56
6
4
41
41
6
7
42
69
43
69
44
48
71
51
51
72
51
75
75
x
4.5.2 Đánh giá và chọn lọc cá thể có hàm lượng amylose và năng suất cao trên
các
quần
thể
lai
hồi
giao
BC4F3
của
tổ
hợp
OM6976/KDML105//OM6976………………………………………………….
79
4.5.3 Đánh giá và chọn lọc cá thể có hàm lượng amylose và năng suất cao trên
các
quần
thể
lai
hồi
giao
BC4F3
của
tổ
hợp
OM5930/OM7347//OM5930……………………………………………………
84
4.6 Thảo luận…………………………………………………………………….
88
Chuơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ………………………………………………
93
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................................ 96
PHỤ LỤC……………………………………………………………………………… 109
xi
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Sự hiểu biết về Haplotype trong gạo dựa trên các đột biến gen Waxy……...
13
Bảng 2.2 Sự tương quan giữa số thế hệ BCnF1 với tỷ lệ kiểu gen của dòng triển
vọng (nhận gen mong muốn) được đưa vào con lai BCnF1…………………………….
21
Bảng 3.1: Các chỉ thị phân tử liên kết các gen liên quan đến năng suất và thành
26
phần năng suất trên các giống lúa bố mẹ
Bảng 3.2 Thành phần dung dịch đệm ly trích ADN và TE buffer (pH = 8) …………...
30
Bảng 3.3 Các thành phần của gel polyacrylamide và agarose được sử dụng……..........
31
Bảng 3.4 Thang điểm đánh giá nhiệt trở hồ theo tiêu chuẩn của IRRI ...........................
38
Bảng 3.5 Phân loại độ bền thể gel theo tiêu chuẩn SES (IRRI, 1996) …………………
39
Bảng 4.1 Kết quả đánh giá đa hình các chỉ thị phân tử liên kết các gen liên quan
đến năng suất và thành phần năng suất trên các giống lúa bố mẹ……………………..
50
Bảng 4.2 Số lượng các cá thể F1 của các quần thể lai được tạo ra……………………..
51
Bảng 4.3 Các thông số di truyền và hiệu quả chọn lọc của các tổ hợp lai …………….
55
Bảng 4.4 Số lượng cá thể chọn lọc qua các thế hệ F1 đến BC4F1 ....................................
57
Bảng 4.5 Số lượng cá thể chọn lọc qua các thế hệ F1 đến BC4F1 ………………………
66
Bảng 4.6 Số lượng cá thể chọn lọc qua các thế hệ F1 đến BC4F1 ………………....
68
Bảng 4.7 Phẩm chất các dòng BC4F3 của quần thể OM6976/Jasmine85//OM6976
trong vu ̣Đông Xuân 2016-2017 ………………………………………………….........
76
Bảng 4.8 Năng suất và một số yếu tố cấu thành năng suất của các dòng BC 4F3 trong
vụ Đông Xuân 2016-2017 ……………………………………………………….
Bảng 4.9 Phẩm chất các dòng BC4F3 của quần thể OM6976/KDML105//OM6976
trong vu ̣Đông Xuân 2016-2017 ………………………………………………….........
78
80
Bảng 4.10 Năng suất và một số yếu tố cấu thành năng suất của các dòng BC 4F3
trong vụ Đông Xuân 2016-2017 ……………………………………………………….
Bảng 4.11 Phẩm chất các dòng BC4F3 của quần thể OM5930/OM7347//OM5930
trong vu ̣Đông Xuân 2016-2017………………………………………………………..
Bảng 4.12 Năng suất và một số yếu tố cấu thành năng suất của các dòng BC 4F3 trong
vụ Đông Xuân 2016-2017 ……………………………………………………….
xii
83
85
87
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cấu trúc của (a) amylose và (b) amylopectin (Liu, 2005) ……………
10
Hình 2.2 Sơ đồ phương pháp lai hồi giao ………………………………………
15
Hình 2.3 Giá trị trung bình của gen phục hồi qua từng thế hệ hồi giao ……….
15
Hình 3.1 Phân tích hàm lượng amylose bằng phương pháp sinh hóa và trên
máy đo quang phổ ………………………………………………………………
27
Hình 3.2 Thao tác khử đực trên cây mẹ ………………………………………...
32
Hình 3.3 Sự thụ phấn và tạo hạt lai ………………………………………..........
32
Hình 3.4 Sơ đồ quy tụ gen waxy trên quần thể lai hồi giao thông qua MAS
34
Hình 3.5 Phân tích GGT trên quần thể lai ở cây lúa…………………………….
36
Hình 3.6 Sơ đồ bố trí các dòng lúa hồi giao trên ruộng thí nghiệm chọn
dòng……………………………………………………………………………...
37
Hình 3.7 Nhiệt độ trở hồ………………………………………………………...
38
Hình 3.8 Hình ảnh minh họa sự khác nhau của độ bền gel sau khi phân tích
hóa sinh…………………………………………………………………….........
39
Hình 4.1: Hàm lượng amylose (%) các giống lúa của bộ vật liệu lai…………..
42
Hình 4.2: Thời gian sinh trưởng (ngày) được ghi nhận trên các giống lúa
của bộ lúa địa phương (a) và bộ lúa cao sản (b)………………………………..
43
Hình 4.3: Năng suất thực tế (tấn/ha) của các giống lúa trong bộ vật liệu lai.
44
Hình 4.4: Phân nhóm di truyền các giống lúa cao sản trong bộ vật liệu lai (Ghi
chú: NS: năng suất; AC: hàm lượng amylose)………………………………….
46
Hình 4.5: Phân nhóm di truyền các giống lúa địa phương trong bộ vật liệu lai
(Ghi chú: NS: năng suất; AC: .hàm lượng amylose)……………………………
47
Hình 4.6: Sản phẩm PCR của các giống lúa bố mẹ với chỉ thị Wx trên gel
agarose 3% ……………………………………………………………………...
49
Hình 4.7: Kết quả đa hình của các giống bố mẹ với các chỉ thị cho gen liên
quan đến các thành phần năng suất và năng suất trên gel agarose 3%................
50
Hình 4.8 Sự biến động của hàm lượng amylose trên con lai của các quần
thể lai hồi giao…………………………………………………………………...
xv
52
Hình 4.9: Sự biến động của năng suất trên con lai của các quần thể lai hồi
giao………………………………………………………………………………
Hình 4.10: Sơ đồ chọn tạo quần thể OM6976/Jasmine85//OM6976 thông qua
MAS………………………………………………………………….………….
53
56
Hình 4.11: Kết quả kiểu gen F1 của một số cá thể thuộc quần thể
OM6976/Jasmine85…………………………………………………………………. 57
Hình 4.12: Kết quả kiểu gen BC1F1 của quần thể lai hồi giao
OM6976/Jasmine85//OM6976 với chỉ thị phân tử Wx ………………………..
58
Hình 4.13: Kết quả kiểu gen BC1F1 của quần thể lai hồi giao
OM6976/Jasmine85//OM6976 với chỉ thị phân tử RM240, RM162, RM256 và
RM257…………………………………………………………………….......... 59
Hình 4.14: Kết quả kiểu gen BC2F1 của quần thể lai hồi giao
OM6976/Jasmine85//OM6976 với chỉ thị phân tử Wx………………………… 60
Hình 4.15: Kết quả kiểu gen BC2F1 của quần thể lai hồi giao
OM6976/Jasmine85//OM6976 với chỉ thị phân tử RM240, RM162, RM256 và
RM257………………………………………………………………………….. 60
Hình 4.16: Kết quả kiểu gen BC3F1 của quần thể lai hồi giao
OM6976/Jasmine85//OM6976 với chỉ thị phân tử Wx ………………………... 61
Hình 4.17: Kết quả kiểu gen BC3F1 của quần thể lai hồi giao
OM6976/Jasmine85//OM6976 với chỉ thị phân tử RM240, RM162, RM256 và
RM257………………………………………………………………………….. 62
Hình 4.18: Kết quả kiểu gen BC4F1 của quần thể lai hồi giao
OM6976/Jasmine85//OM6976 với chỉ thị phân tử Wx ………………………
63
Hình 4.19: Kết quả kiểu gen BC4F1 của quần thể lai hồi giao
OM6976/Jasmine85//OM6976 với chỉ thị phân tử RM240, RM162, RM256 và
RM257…………………………………………………………………………
64
Hình 4.20 Sơ đồ chọn tạo quần thể OM6976/KDML105//OM6976 thông qua
MAS..............................................................................................................
65
Hình 4.21 Sơ đồ chọn tạo quần thể OM5930/OM7347//OM5930 thông qua
MAS……………………………………………………………………….......
67
Hình 4.22 Sự đa dạng di truyền các gen từ bố mẹ của quần thể lai hồi giao
OM6976/ Jasmine85// OM6976 trên nhiễm sắc thể số 6…………………......
69
xvi
Hình 4.23 Sự đa dạng di truyền các gen từ bố mẹ của quần thể lai hồi giao
OM6976/ Jasmine85// OM6976 trên 12 nhiễm sắc thể ………………………
70
Hình 4.24 Sự đa dạng di truyền các gen từ bố mẹ của quần thể lai hồi giao
OM6976/ KDML105// OM6976 trên nhiễm sắc thể số 6……………………..
71
Hình 4.25 Sự đa dạng di truyền các gen từ bố mẹ của quần thể lai hồi giao
OM6976/ KDML105// OM6976 trên 12 nhiễm sắc thể………………………
72
Hình 4.26 Sự đa dạng di truyền các gen từ bố mẹ của quần thể lai hồi giao
OM5930/ OM7347// OM5930 trên nhiễm sắc thể số 6………………………
73
Hình 4.27 Sự đa dạng di truyền các gen từ bố mẹ của quần thể lai hồi giao
OM5930/ OM7347// OM5930 trên 12 nhiễm sắc thể………………………..
74
Hình
4.28 Quần thể lai hồi giao BC4F3 của tổ hợp
OM6976/Jasmine85//OM6976…. ……………………………………………
75
Hình 4.29 Kết quả điện di sản phẩm PCR của các dòng BC4F3 của quần
thể
OM6976/ Jasmine85// OM6976 với chỉ thị Wx trên gel agarose
3%...................................................................................................................
77
Hình
4.30 Quần thể lai hồi giao BC4F3 của tổ hợp
OM6976/KDML105//OM6976………………………………………………..
79
Hình 4.31 Kết quả điện di sản phẩm PCR của các dòng BC4F3 của quần
thể
OM6976/ KDML105// OM6976 với chỉ thị Wx trên gel agarose 3%..............
82
Hình
4.32 Quần thể lai hồi giao BC4F3 của tổ hợp
OM5930/OM7347//OM5930………………………………………………….
84
Hình 4.33 Kết quả điện di sản phẩm PCR của các dòng BC4F3 của quần
thể
OM5930/OM7347//OM5930 với chỉ thị Wx trên gel agarose 3%...................
86
xvii
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
AC
DNA
Amylose Content
Axcid Deoxyribonucleic
Hàm lượng amylose
Axit Đề-ôxy-ribô-nuclêôtit
AE
Amylose Extender
Hàm lượng amylose ae
BC
Backcross
Lai hồi giao
dCAPS
Derived Cleaved Amplified
Chuỗi đa hình nhân bản được cắt
DP
Polymorphic Sequence
Donor Parent
hạn chế
Giống cho gen
ĐBSCL
Đồng bằng Sông Cửu Long
GBSS
Granule-bound Starch Synthase
Enzyme xúc tác tổng hợp tinh bột
GC
Gel consistency
Độ bền gel
GGT2
Graphical Genotypes 2
Đồ họa kiểu gen 2
GT
Gelatinization Temperature
Độ trở hồ, nhiệt hóa hồ
INQR
International Network for Quality Rice
Mạng lưới quốc tế nghiên cứu lúa
IRRI
International Rice Research Institute
chất lượng
Viện nghiên cứu lúa Quốc Tế
MABC
Marker-Assisted Backcrossing
Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử
MAS
Marker Assisted Selection
trong lai hồi giao
Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử
NILs
Near-isogenic-lines
Các dòng đẳng gen
NTSYSpc
Numerical Taxonomy System
Hệ thống phân nhóm bằng số
PCR
Polymerase Chain Reaction
Phản ứng khuếch đại gen
QTL
Quantitative Trait Loci
Di truyền tính trạng số lượng
RP
Recipient Parent
Cá thể nhận
SES
Standard Evaluation System for Rice
Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá trên
SNP
Single Nucleotide Polymorphism
lúa
Đa hình nucleotide đơn
SSR
Simple Sequence Repeat
Trình tự lặp lại đơn giản
SSS
Soluble Stach Synthase
Enzyme xúc tác tổng hợp tinh bột
hòa tan
xviii
Chương 1: GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực quan trọng
trên thế giới cung cấp nguồn năng lượng chính cho một nửa dân số trên thế
giới. Trong đó, ở châu Á, hơn 90% sản lượng lúa được sản xuất và tiêu thụ.
Trước đây, đa số nông dân Việt Nam có thói quen sản xuất giống lúa ngắn
ngày, năng suất cao và dễ canh tác vì chống chịu sâu bệnh tốt. Tuy nhiên, các
giống này thường có phẩm chất thấp, cứng cơm và không có mùi thơm. Do đó,
mặc dù có nhiều đột phá về mặt sản lượng nhưng chất lượng cũng như giá
thành sản phẩm chưa cao và thị trường tiêu thụ còn hạn chế. Ngày nay, với sự
phát triển của xã hội, nhu cầu ăn ngon thay thế dần nhu cầu ăn no, các sản
phẩm gạo mềm dẻo, thơm ngày càng được ưa chuộng. Chính vì vậy, việc
nghiên cứu, lai tạo và phát triển các giống lúa mới ngon dẻo lại thích nghi đa
dạng và cho năng suất cao đang là nhu cầu cấp bách của sản xuất lúa gạo trong
vùng.
Chất lượng gạo là một khái niệm chung bao hàm rất nhiều các đặc tính
khác nhau từ các đặc tính vật lý đến sinh hóa và sinh lý. Tinh bột và prôtêin là
hai thành phần chính trong nội nhũ của hạt, vì vậy nó là chìa khóa của chất
lượng hạt. Tinh bột (polysacarit carbohydrate) chứa hỗn hợp amylose và
amylopectin (Juliano, 2003; Fitzgerald et al., 2009a; Chen et al., 2012). Nhiều
nghiên cứu cho rằng tính chất mềm dẻo của cơm phụ thuộc chủ yếu vào hàm
lượng amylose (AC), nó là kết quả của kiểu gen và một vài thay đổi của môi
trường (Fitzgerald et al., 2009a). Hàm lượng này được sử dụng như một chỉ số
quan trọng để đánh giá chất lượng cơm (Asghar et al., 2012). Hàm lượng
amylose thấp đặc trưng cho tính mềm, dẻo và bóng của hạt cơm. Ngược lại
hàm lượng amylose cao làm cho gạo hấp thụ nhiều nước hơn và do đó làm
tăng tính trương nước của hạt gạo, dẫn đến khô, xốp và cứng khi nguội lại.
(Fitzgerald et al., 2009a; Patindol et al., 2010). Về mặt di truyền, nhiều nghiên
cứu cho rằng tính trạng hàm lượng amylose cao và thấp đều do một gen duy
nhất điều khiển. Gen waxy là gen điều khiển tính trạng hàm lượng amylose
trong hạt gạo định vị trên nhiễm sắc thể số 6. Gen trội A qui định hàm lượng
amylose cao và gen đồng hợp lặn aa qui định hàm lượng amylose thấp. Hạt
mang gen dị hợp tử có hàm lượng amylose trung bình nhưng không ổn định.
Nếu cần hạt có hàm lượng amylose trung bình thì bố hoặc mẹ phải có hàm
lượng amylose từ thấp đến trung bình (Denyer et al., 2001; Nakamura and
Yuki, 1992). Việc phát triển các giống lúa mới có năng suất và chất lượng cao
1
là thách thức đối với phương pháp chọn giống truyền thống. Vì vậy cần có
những đột phá mới cho công tác chọn tạo giống bằng phương pháp hiện đại.
Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống (MAS) cho lai hồi giao (MABC) là
phương pháp chuyển một gen mục tiêu từ giống cho gen (donor) sang giống
nhận gen (recipient) trong khi vẫn giữ lại các đặc tính quan trọng của giống
nhận thông qua lai hồi giao. Việc sử dụng các chỉ thị phân tử cho phép giải mã
di truyền của con lai ở mỗi thế hệ, rút ngắn thời gian chọn tạo, do đó tăng hiệu
quả chọn lọc gen trên một đơn vị thời gian (Hospital, 2003). MABC đã được
sử dụng trong nhiều nghiên cứu tạo chọn giống lúa chất lượng cao trước đây
(Hasan et al, 2015; Hồ Văn Được và ctv., 2016a, 2017; Nguyen Thị Lang and
Bui Chi Buu, 2004).
Xuất phát từ những vấn đề đặt ra, nghiên cứu được thực hiện nhằm khai
thác phương pháp MABC trong lai tạo giống lúa có hàm lượng amylose thấp
(≤20%), năng suất cao phù hợp với nhu cầu về giống lúa cũng như điều kiện
canh tác của ĐBSCL hiện nay.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
1.2.1 Mục tiêu tổng quát
Nghiên cứu, chọn tạo các dòng/giống lúa có phẩm chất tốt liên quan đến
chỉ tiêu hàm lượng amylose thấp dựa trên sự kết hợp giữa phương pháp lai hồi
giao và chọn giống bằng chỉ thị phân tử.
1.2.2 Mục tiêu nghiên cứu cụ thể
Khai thác gen liên quan đến chỉ tiêu hàm lượng amylose thấp thông qua
đa dạng nguồn vật liệu ban đầu từ bộ lúa địa phương và bộ lúa cao sản ngắn
ngày.
Ứng dụng MABC trong chọn lọc các quần thể lai hồi giao thông qua
đánh giá kiểu hình và phân tích kiểu gen dựa trên việc xác định gen waxy trên
nhiễm sắc thể số 6 và các gen liên quan năng suất và thành phần năng suất
được đánh dấu trên cá thể cây mẹ.
Đánh giá đa dạng di truyền trên quần thể con lai và chọn lọc các cá thể
mang gen mục tiêu mong muốn thông qua xây dựng bản đồ GGT trên các
quần thể NILs.
Chọn lọc các dòng lúa triển vọng có tính trạng hàm lượng amylose thấp
(≤20%) và năng suất cao (từ 7 - 8 tấn/ha vụ Đông xuân và 4 – 5 tấn/ha vụ Hè
thu) nhằm phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa mới.
2
1.3 Nội dung nghiên cứu
1.3.1 Nội dung 1: Đánh giá vật liệu bố mẹ sử dụng trong nghiên cứu
chọn tạo giống lúa phẩm chất cao có hàm lượng amylose thấp
Đánh giá hàm lượng amylose trên bộ giống vật liệu lai Đánh giá đặc tính
nông học trên bộ giống lúa vật liệu lai
Đánh giá các thành phần năng suất và năng suất trên bộ giống lúa vật liệu
lai
Phân nhóm đa dạng di truyền kiểu hình của bộ giống lúa vật liệu lai
Đa dạng nguồn gen trên các giống lúa bố mẹ
1.3.2 Nội dung 2: Đánh giá hiệu quả di truyền của các tổ hợp lai
Tạo các quần thể F1
Đánh giá hiệu quả chọn lọc tính trạng mục tiêu dựa trên các quần thể lai
F2
1.3.3 Nội dung 3: Chọn tạo quần thể lai hồi giao có hàm lượng
amylose thấp thông qua MAS
Lai tạo và chọn lọc các quần thể lai hồi giao nhờ các chỉ thị phân tử
(BC1F1- BCnF1)
1.3.4 Nội dung 4: Chọn lọc các quần thể hồi giao BCnF2 thông qua
lập bản đồ GGT
Kiểm tra kiểu gen của quần thể con lai trên 12 nhiễm sắc thể dựa trên các
chỉ thị phân tử đa hình giữa cây bố và mẹ.
Lập bản đồ GGT đánh giá sự di truyền của quần thể con lai, qua đó chọn
lọc các cá thể mang gen mục tiêu mong muốn.
1.3.5 Nội dung 5: Đánh giá và chọn lọc cá thể có hàm lượng amylose
và năng suất cao trên các quần thể lai hồi giao BCnF3
Đánh giá kiểu hình và kiểu gen liên quan hàm lượng amylose trên quần
thể con lai.
Đánh giá các thành phần năng suất và năng suất để chọn lọc các dòng
con lai triển vọng vừa có hàm lượng amylose thấp vừa có năng suất cao
1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.4.1 Ý nghĩa khoa học
Khai thác nguồn gen một cách hiệu quả thông qua đa dạng nguồn vật liệu
3
lai bố mẹ từ lúa địa phương và lúa cao sản.
Nghiên cứu, chọn tạo các giống/dòng lúa có phẩm chất tốt và năng suất
cao kết hợp chọn giống truyền thống với phương pháp hiện đại bằng chỉ thị
phân tử nhằm khắc phục những hạn chế của phương pháp truyền thống, rút
ngắn thời gian lai tạo và nâng cao hiệu quả chọn lọc.
Những thành công bước đầu trong quy tụ gen hàm lượng amylose thấp
sử dụng chỉ thị phân tử ở lúa sẽ mở ra khả năng ứng dụng rộng rãi trong công
tác chọn tạo giống nói chung, không chỉ đối với chỉ tiêu hàm lượng amylose
mà còn đối với nhiều đặc tính nông học quý khác.
1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn
Ứng dụng các thành tựu mới của khoa học hiện đại vào trong chọn giống
nhằm khai thác triệt để nguồn gen, nâng cao hiệu quả chọn tạo, rút ngắn thời
gian và tăng hiệu suất chọn lọc cũng như hiệu quả kinh tế.
Đề tài chọn ra được các dòng lúa triển vọng có hàm lượng amylose thấp
để bổ sung vào cơ cấu giống phẩm chất cao nhằm phục vụ cho nhu cầu tiêu thụ
nội địa và nâng cao khả năng cạnh tranh với các nước trên thế giới về xuất
khẩu gạo.
Các nội dung nghiên cứu trong đề tài có thể ứng dụng cho công tác chọn
giống hiện nay. Sản phẩm từ đề tài là nguồn vật liệu và phương pháp của đề tài
là nguồn tư liệu cho các công trình nghiên cứu tiếp theo. Ngoài ra, đề tài còn
góp phần phục vụ trong các công tác nghiên cứu và giảng dạy.
1.5 Tính khoa học của đề tài
Ứng dụng các kỹ thuật hiện đại để bổ sung cũng như giải quyết các hạn
chế cho phương pháp lai tạo giống truyền thống.
Kế thừa các nghiên cứu trước trong việc lựa chọn vật liệu lai và chỉ thị
phân tử.
Ứng dụng sinh học phân tử và tin sinh học để phân tích và đánh giá các
dữ liệu của đề tài.
Các dòng lúa được chọn tạo trong đề tài là kết quả khoa học có khả năng
ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu và sản xuất giống lúa phẩm chất cao ở
vùng ĐBSCL.
1.6 Những đóng góp mới của đề tài
Đề tài đã đánh giá và khai thác hiệu quả nguồn vật liệu bố mẹ mà các
nghiên cứu trước đây ở Việt Nam còn nhiều hạn chế.
4
Bên cạnh mục tiêu chọn tạo giống có hàm lượng amylose thấp, đề tài còn
chú ý đến năng suất cao và thời gian sinh trưởng phù hợp. Điều này là điều
kiện quyết định để các sản phẩm giống lúa có thể ứng dụng và phát triển rộng
khi đề tài kết thúc.
Kết hợp giữa lai tạo truyền thống, sinh học phân tử và tin sinh học trong
nghiên cứu.
1.7 Tính ứng dụng của đề tài
Đề tài được thực hiện thông qua phương pháp lai tạo truyền thống kết
hợp phương pháp chọn lọc hiện đại bằng chỉ thị phân tử. Thông qua kết quả đề
tài cũng cho thấy tính hiệu quả của việc ứng dụng các kỹ thuật mới vào chọn
tạo giống truyền thống.
Sản phẩm giống lúa của đề tài góp phần bổ sung vào cơ cấu giống phẩm
chất cao hiện nay cho vùng đồng bằng Sông Cửu Long, phục vụ sản xuất và
xuất khẩu của vùng. Ngoài ra, sản phẩm đề tài còn là nguồn vật liệu về giống
và chỉ thị phân tử cho các chương trình lai tạo giống kế tiếp.
Đề tài cung cấp một chương trình chọn tạo giống hiệu quả, mang giá trị
tham khảo cao.
1.8 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Các giống lúa địa phương thu thập ở các tỉnh đồng bằng Sông Cửu Long
và các giống cao sản từ Ngân hàng gen của Bộ môn Di truyền- Chọn giống,
Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long.
Phòng phân tích phẩm chất, Phòng Sinh học phân tử, Nhà lưới, Ruộng
thí nghiệm của Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long.
5
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Các chỉ tiêu phẩm chất của hạt gạo
Đối với lúa gạo, chất lượng nấu nướng được người tiêu dùng quan tâm
nhất. Các loại gạo cho cơm ngon phải mềm xốp, hạt cơm nấu ít trương nở và
có mùi vị đặc trưng. Tính chất mềm xốp của cơm phụ thuộc chủ yếu vào hàm
lượng amylose/amylopectin trong thành phần tinh bột của hạt gạo. Trong công
tác chọn tạo giống phẩm chất, các phương pháp xác định hàm lượng amylose
trong nội nhũ gạo đã được ứng dụng rộng rãi và cho độ tin cậy cao (Juliano,
1971). Bên cạnh đó, độ bền gel liên quan đến độ mềm dẻo của cơm khi để
nguội và độ trở hồ liên quan đến thời gian nấu cơm. Hai chỉ tiêu này tương
quan với hàm lượng amylose đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu
trước đây. Trong một số trường hợp, các nhà chọn giống có thể dựa vào cách
thử độ trở hồ đơn giản để ước lượng hàm lượng amylose. Vì vậy, hai chỉ tiêu
này được thực hiện để kiểm chứng cho hàm lượng amylose của hạt gạo.
2.1.1 Hàm lượng amylose (AC)
Hàm lượng amylose được coi là một trong những chỉ số quan trọng nhất
quyết định phẩm chất gạo. Với những giống lúa cho gạo có hàm lượng
amylose cao thường lâu chín, cơm khô và cứng khi để nguội. Gạo có hàm
lượng amylose thấp hoặc rất thấp thường dính không tơi cơm, trong khi đó gạo
có hàm lượng amylose trung bình thường tơi cơm, và không cứng khi để nguội
nên được người tiêu dùng ưa chuộng.
Dựa vào hàm lượng amylose hiện diện trong gạo, các giống lúa được
phân ra thành hai nhóm phẩm chất: waxy (hàm lượng amylose 1-2%) và
nonwaxy (hàm lượng amylose > 2%). Đối với nhóm nonwaxy, hàm lượng
amylose thấp khi AC ≤ 20%, hàm lượng amylose trung bình khi AC = 20-25%
và hàm lượng amylose cao khi AC > 25%. Các giống Basmati có nguồn gốc từ
Ấn Độ và Pakistan hầu hết là giống có hàm lượng amylose trung bình. Trong
khi đó, phần lớn gạo có nguồn gốc từ Việt Nam, Thái Lan, Myanmar và tiểu
lục địa Ấn Độ có hàm lượng amylose cao (Trương Bá Thảo, 2006; Frei et al.,
2003; Coffman and Juliano, 1987). Hàm lượng amylose trong gạo dao động từ
15-35%. Phần lớn các quốc gia trồng lúa thích loại gạo có hàm lượng amylose
trung bình, ngoài trừ các giống japonica có hàm lượng amylose thấp (Nguyễn
Ngọc Đệ, 2008). Hàm lượng amylose có thể thay đổi giữa các giống do môi
trường và yếu tố di truyền (Chen et al., 2007; 2012). Một số nghiên cứu đã chỉ
ra rằng sự tương tác giữa kiểu gen và nhiệt độ môi trường xung quanh ảnh
6
