Nghiên cứu chọn tạo giống lúa nếp thơm kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị phân tử DAN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI













NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG




NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG LÚA NẾP THƠM
KHÁNG BỆNH BẠC LÁ BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DAN




CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ : 60.42.02.01


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :

PGS.TS. PHAN HỮU TÔN





HÀ NỘI - 2013
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
ii
LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn
này là trung thực và không trùng lặp với các ñề tài khác.
Tôi cũng xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn
ñều ñược ghi rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày tháng năm 2013
Tác giả luận văn


Nguyễn Thị Huyền Trang
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
iii
LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận văn, ngoài sự nỗ lực và cố gắng của bản
thân, tôi ñã nhận ñược sự giúp ñỡ tận tình của rất nhiều cá nhân và tập thể.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, sự cảm ơn chân thành và
sâu sắc tới thầy PGS.TS. Phan Hữu Tôn, trưởng Bộ môn Công nghệ sinh
học Ứng dụng ñã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình tôi
thực hiện ñề tài.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Nguyễn Văn Hùng cùng toàn bộ các
cán bộ ñang công tác tại bộ môn Công nghệ sinh học Ứng dụng - ðại học
Nông Nghiệp Hà Nội ñã giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi
trong suốt thời gian thực hiện ñề tài.
Qua ñây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị và
bạn bè ñã giúp ñỡ, ñộng viên em trong suốt quá trình học tập cũng như thực
tập tốt nghiệp.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể gia ñình
mình ñã luôn là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình học tập và
nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2013
Tác giả luận văn


Nguyễn Thị Huyền Trang
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
iv

MỤC LỤC

LỜI CAM ðOAN
ii
LỜI CẢM ƠN
iii
MỤC LỤC
iv
DANH MỤC BẢNG
vi

DANH MỤC HÌNH
vii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
viii
TÓM TẮT
1
PHẦN I: MỞ ðẦU
2
1.1. ðặt vấn ñề
2
1.2. Mục ñích và yêu cầu
3
1.2.1. Mục ñích
3
1.2.2. Yêu cầu
3
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
4
2.1. Tổng quan về bệnh bạc lá lúa
4
2.1.1. Nguyên nhân, triệu chứng và tác hại của bệnh
4
2.1.2. Quy luật và các yếu tố ảnh hưởng ñến phát sinh, phát triển bệnh
5
2.1.3. Biện pháp phòng chống
7
2.2. Chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá
8
2.2.1. Cơ chế kháng bệnh
8

2.2.2. Nghiên cứu về di truyền tính kháng bệnh
11
2.2.3. Các phương pháp chọn giống lúa kháng bệnh bạc lá
14
2.2.4. Ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu và chọn giống kháng
bệnh bạc lá
15
2.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử vào chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá
17
2.3.1. Giới thiệu về chỉ thị phân tử DNA
17
2.3.2. Một số nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử vào chọn tạo giống kháng
bệnh bạc lá lúa
20
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
v

2.3.3. Chỉ thị phân tử liên quan một số gen kháng bệnh bạc lá lúa
21
2.4. Các phương pháp chuyển gen kháng bệnh bạc lá vào giống
24
2.4.1. Phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen
24
2.4.2. Phương pháp lai hữu tính kết hợp với việc sử dụng chỉ thị phân tử
24
PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
26
3.1. Vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu
26
3.1.1. Vật liệu nghiên cứu

26
3.1.2. ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu
26
3.2. Phương pháp nghiên cứu
26
3.2.1 Thí nghiệm ñồng ruộng
26
3.2.2. Thí nghiệm trong phòng
29
3.3. Phương pháp xử lý số liệu
32
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
33
4.1. Lai Backcross chuyển gen kháng X4,Xa7 vào giống tốt.
33
4.1.1. Kết quả chọn lọc cá thể từ quần thể 12BC1F1 ((NV4 x 10915) x NV4)
39
4.1.2. Tổ hợp 21BC1F1
41
4.1.3. Tổ hợp 154BC1F1
43
4.1.4. Tổ hợp 63BC1F1
46
4.2. Chọn lọc các cá thể tốt ở quần thể phân ly F2, sử dụng chỉ thị phân tử
ADN chọn lọc dạng ñồng hợp tử trội.
49
4.2.1. Kết quả chọn lọc các cá thể từ quần thể 62F2
52
4.2.2. Tổ hợp 31F2
55

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ
57
5.1. Kết luận
57
5.2. ðề nghị
57
TÀI LIỆU THAM KHẢO
58
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
vi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Bản ñồ liên kết di truyền giữa gen quy ñịnh tính trạng nông sinh học
quan trọng với RFLP ñánh dấu
21
Bảng 3.1. Các quần thể phân ly sử dụng trong nghiên cứu
26
Bảng 3.2. Thành phần dung dịch chiết tách
30
Bảng 3.3. Thành phần dung dịch TE
30
Bảng 3.4. Thành phần phản ứng PCR cho một gen Xa4, Xa7
31
Bảng 3.5. Các Primer dùng trong PCR
31
Bảng 3.6. Chu kỳ nhiệt cho gen Xa4, Xa7
31
Bảng 4.1. ðặc ñiểm nông sinh học của các dòng chọn lọc từ các tổ hợp
34

Bảng 4.1.1a. ðặc ñiểm một số cá thể dị hợp tử của tổ hợp 12BC1F1
40
Bảng 4.1.1b. ðặc ñiểm của mẫu cá thể chất lượng tốt ñược chọn
40
Bảng 4.1.2a. ðặc ñiểm một số cá thể dị hợp tử của tổ hợp 21BC1F1
42
Bảng 4.1.2b. ðặc ñiểm của mẫu cá thể chất lượng tốt ñược chọn
42
Bảng 4.1.3a ðặc ñiểm một số cá thể dị hợp tử của tổ hợp 154BC1F1
45
Bảng 4.1.3b ðặc ñiểm của mẫu cá thể chất lượng tốt ñược chọn
45
Bảng 4.1.4a . ðặc ñiểm một số của cá thể dị hợp tử của tổ hợp 63BC1F1
48
Bảng 4.1.4b. ðặc ñiểm của mẫu cá thể chất lượng tốt ñược chọn
48
Bảng 4.2. ðặc ñiểm nông sinh học của các dòng chọn lọc

từ các tổ hợp phân ly F2
50
Bảng 4.2.1a. ðặc ñiểm một số cá thể dồng tử trội của tổ hợp 62F2
54
Bảng 4.2.1b. ðặc ñiểm của mẫu cá thể chất lượng tốt ñược chọn
54
Bảng 4.2.2a. ðặc ñiểm một số cá thể ñồng tử trội của tổ hợp 31F2
56
Bảng 4.2.2b. ðặc ñiểm của mẫu cá thể chất lượng tốt ñược chọn
56
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
vii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Ảnh ñiện di sản phẩm gen Xa7 các cá thể trong quần thể 12BC1F1
39
Hình 2: Ảnh ñiện di sản phẩm gen Xa7 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ
hợp lai 21BC1F1 ((Khẩu Lếch x 10132 – 2) x Khẩu Lếch)
41
Hình 3: Ảnh ñiện di sản phẩm gen Xa4 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ
hợp lai 154BC1F1 ((11000 x 10900) x 11000)
43
Hình 4: Ảnh ñiện di sản phẩm gen Xa7 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ
hợp lai 154BC1F1 ((11000 x 10900) x 11000)
44
Hình 5: Ảnh ñiện di sản phẩm gen Xa4 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ
hợp lai 63BC1F1 ((10883 x 10222) x 10883)
46
Hình 6: Ảnh ñiện di sản phẩm gen Xa7 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ
hợp lai 63BC1F1 ((10883 x 10222) x 10883)
47
Hình 7: Ảnh ñiện di sản phẩm gen Xa7 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ
hợp lai 62F2 (10165 x 10140 – 2)
53
Hình 8: Ảnh ñiện di sản phẩm gen Xa7 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ
hợp lai 31F2 (10165 x 10140 – 2)
55

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Tên viết tắt Tên ñầy ñủ
AFLP Amplified fragment length polymorphism
ALP Amplicon length polymorphism
AP - PCR Arbitrary primer-PCR
BVTV Bảo vệ thực vât
CNSH Công nghệ sinh học
DAF DNA amplification fingerprinting
DHT Dị hợp tử
ðHT ðồng hợp tử
ðC ðối chứng
MRDHV- DNA
Moderately repeated, dispersed, and highly variable
DNA(minisatellite)
NS Năng suất
NST Nhiễm sắc thể
PCR Polymerase Chain Reaction
RAPD Random amplified polymorphic DNA
RFLP Restriction fragment length polymorphism
SSCP Single strand conformation polymorphism
SSR Simple sequence repeat (microsatellite)
TGST Thời gian sinh trưởng
TL Tỷ lệ
Xoo Xanthomonas oryzae. pv. oryzae
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
1

TÓM TẮT

Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA nhằm chọn lọc những cá thể tốt trong
các quần thể phân ly chứa các gen kháng bệnh bạc lá hữu hiệu Xa4, Xa7
làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống kháng bệnh có năng suất cao,
phẩm chất tốt là một việc làm vô cùng có ý nghĩa. Thí nghiệm ñược thực
hiện trên 6 quần thể phân ly 12BC1F1 ((NV4 x 10915) x NV4), 21BC1F1
((Khẩu Lếch x 10132 – 2) x Khẩu Lếch), 31F2 (10969 x 10900), 62F2
(10165 x 10140 – 2), 63BC1F1 ((10883 x 10222) x 10883), 154BC1F1
((11000 x 10900) x 11000).
Sau khi có kết quả theo dõi một số ñặc ñiểm nông sinh học, năng
suất, các yếu tố cấu thành năng suất và áp dụng phương pháp chọn lọc tăng
tiến trên 6 quần thể phân ly ñã chọn ñược 98 cây có năng suất cao, phẩm chất
tốt. Tiến hành chạy PCR các cá thể tốt ñã chọn ñược 59 cây mang gen kháng
ðHT trong ñó 38 cây mang gen kháng Xa7 , 21 cây mang 2 gen kháng
xa4/xa7. Các cá thể mang gen kháng ðHT là nguồn vật liệu quý giá trong
công tác chọn tạo giống kháng có năng suất cao, chất lượng tốt. Các cá thể
còn chứa gen DHT cần ñược tiếp tục chọn tạo trong các thế hệ phân ly.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
2

PHẦN I: MỞ ðẦU

1.1. ðặt vấn ñề
Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)
gây ra là bệnh phổ biến và tàn phá lúa nghiêm trọng trên toàn thế giới (Khan,
1996), bệnh ñặc biệt nặng ở những nơi có mức ñộ thâm canh cao. Ở miền Bắc
nước ta, bệnh gây hại ở tất cả các vụ trong năm, nặng nhất vào vụ mùa, ñặc biệt
trên các giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc. Cho ñến nay, chưa có loại thuốc
hóa học nào ñặc trị bệnh bạc lá, việc tạo ra các giống lúa có khả năng kháng
bệnh bền vững ñược xem là hiệu quả nhất, cả về mặt kinh tế và môi trường.
Mỗi vùng trồng lúa lại có một số chủng vi khuẩn bạc lá ñặc trưng,

phụ thuộc vào cơ cấu các giống lúa và ñiều kiện tự nhiên của vùng:
Philipin 6 chủng, Nhật Bản 12 chủng, Ấn ðộ 9 chủng,… (Tika và cộng
sự, 1999). Ở Việt Nam, nhiều nghiên cứu trước ñó ñã xác ñịnh ñược 14
chủng vi khuẩn bạc lá lúa có mặt ở miền Bắc (trích dẫn theo Pham Van
Du và Le Cam Loan, 2007).
ðã có trên 30 gen kháng bệnh bạc lá ñược phát hiện ở lúa trồng và lúa dại
(Ninox-Lui và cộng sự, 2006; Singh và cộng sự, 2007; Siriporn Korinsak, 2009).
Trong ñó có nhiều gen ñã ñược ñịnh vị trên genome cây lúa như: gen Xa2 liên
kết với marker Npb197 ñịnh vị trên NST số 4 (Yoshimura và cộng sự, 1995);
Gen Xa4 liên kết với chỉ thị Npb181 và Npb76 trên NST số 11, với khoảng cách
di truyền là 1.7cM (Yoshimura và cộng sự, 1992); Gen Xa7 liên kết với chỉ thị
P3 trên NST số 6, với khoảng cách di truyền 2.5cM ( Taura và cộng sự, 2003);
Mỗi gen kháng chỉ kháng ñược một hay một số chủng vi khuẩn nhất ñịnh, trong
khi ñó mỗi vùng trồng lúa lại tồn tại nhiều chủng vi khuẩn khác nhau, vì vậy nếu
giống chỉ chứa một gen kháng thì sau một thời gian ngắn sẽ bị nhiễm bệnh. Vấn
ñề ñặt ra ở ñây là cần phải quy tụ nhiều gen kháng vào một giống ñể giống ñó có
khả năng kháng ñược nhiều chủng vi khuẩn khác nhau. Theo kết quả nghiên cứu
của Phan Hữu Tôn và cộng sự (2005) thì các gen Xa4, Xa7 kháng ñược hầu hết
các chủng vi khuẩn ở miền Bắc Việt Nam.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
3

Với mục ñích quy tụ nhiều gen kháng hữu hiệu vào các giống lúa tốt.
Trong thời gian qua nhóm nghiên cứu lúa bộ môn CNSH Ứng dụng - Khoa
CNSH - Trường ðHNN Hà Nội ñã tiến hành lai tạo một số tổ hợp: 12BC1F1
((NV4 x 10915) x NV4), 21BC1F1 ((Khẩu Lếch x 10132 – 2) x Khẩu Lếch),
31F2 (10969 x 10900), 62F2 (10165 x 10140 – 2), 63BC1F1 ((10883 x 10222)
x 10883), 154BC1F1 ((11000 x 10900) x 11000). Những quần thể phân ly này cần
phải tiến hành chọn lọc bằng chỉ thị phân tử nhằm chọn ra những cá thể tốt có chứa
gen kháng bệnh bạc lá làm vật liệu cho quá trình tạo giống kháng có năng suất cao,

phẩm chất tốt. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành ñề tài: “Nghiên cứu chọn tạo
giống lúa nếp thơm kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị phân tử DNA ”.
1.2. Mục ñích và yêu cầu
1.2.1. Mục ñích
Chọn lọc các cá thể giống lúa nếp có các ñặc tính nông sinh học tốt, năng
suất cao, chất lượng tốt và mang gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7 từ một số quần
thể phân ly F2 của một số tổ hợp lai phục vụ cho quá trình tạo giống lúa nếp
thơm kháng bệnh bạc lá bền vững.
1.2.2. Yêu cầu
Chọn ra những cá thể F2 có chứa gen kháng bệnh bạc lá, có năng suất
cao, phẩm chất tốt, mang các ñặc ñiểm nông sinh học tốt
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
4

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tổng quan về bệnh bạc lá lúa
2.1.1. Nguyên nhân, triệu chứng và tác hại của bệnh
2.1.1.1. Nguyên nhân, triệu chứng
Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae. pv. oryzae (Xoo) gây
ra, ñược phát hiện ñầu tiên ở Fukuoka - Nhật Bản vào năm 1884.
Theo Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (2004), bệnh bạc lá phát sinh
và phá hại trong suốt từ thời kỳ mạ ñến khi lúa chín, nhưng triệu chứng
bệnh thể hiện rõ nhất vào giai ñoạn từ sau ñẻ nhánh tới trỗ, chín sữa. Khi bị
bệnh, vết bệnh xuất hiện ở mép lá, mút lá, sau ñó lan dần vào phiến lá
theo ñường gợn sóng hoặc lan thẳng xuống gân chính. Trong ñiều kiện ẩm,
nhiệt ñộ tương ñối cao, hoặc buổi sáng sớm, trên vết bệnh có thể xuất hiện
giọt dịch vi khuẩn màu vàng, gặp trời nắng tạo thành dạng hạt keo vi khuẩn
màu hổ phách, hay màu mật ong. Thường thì giữa mô bệnh và mô khỏe có ranh
giới rõ ràng theo ñường gợn sóng, màu vàng hoặc khô vàng, có khi có một

ñường chỉ viền màu nâu sẫm ñứt quãng hay không ñứt quãng.
2.1.1.2. Tác hại của bệnh
Bệnh bạc lá lúa là bệnh phổ biến và tàn phá mùa màng nghiêm trọng trên
toàn thế giới (Khan, 1996), là bệnh nghiêm trọng nhất ñối với ngành sản xuất
lúa ở các nước thuộc khu vực ðông Nam châu Á, ñặc biệt ở những nơi áp dụng
thâm canh các loại cây hàng năm năng suất cao (Ray và Sengupta, 1970; Feakin,
1971). Tác hại của bệnh chủ yếu là làm cho lá ñòng sớm tàn, khô xác, giảm
quang hợp, tăng lượng hạt lép, dẫn ñến giảm năng suất lúa.
Nhiều nghiên cứu cho thấy, thiệt hại do bệnh bạc lá lúa gây ra phụ thuộc
vào ñiều kiện khí hậu, giống, giai ñoạn nhiễm bệnh, và mức ñộ nhiễm bệnh
(Gnanamanickam và cộng sự, 1999). Hàng năm, thiệt hại về năng suất lúa
khoảng 20 - 30%, nhưng nếu bệnh nghiêm trọng có thể mất tới 50% năng suất
(Ou, 1985). Một số vùng ở Châu Á, thiệt hại năng suất do bệnh gây ra có thể từ
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
5

50% (Khush và cộng sự, 1989) tới 80% (Singh và cộng sự, 1977). Vào năm
1954, nhiều nơi ở Nhật Bản có 90.000 - 150.000 ha bị nhiễm bệnh, thiệt hại
năng suất ước tính là 22.000 - 110.000 tấn thóc; ở Ấn ðộ có thể làm giảm tới
60% năng suất (Mew và cộng sự, 1981); ở Philippin, bệnh thường làm giảm
22.5% năng suất vào vụ mưa, và 7.2%, có khi lên tới 9.5 - 18% năng suất vào
mùa khô (Exconde, 1973).
Ở Việt Nam bệnh ñã ñược phát hiện từ lâu trên các giống lúa mùa cũ.
Hiện nay, bệnh gây hại trên cả lúa lai và lúa thuần, ñặc biệt nặng trên các giống
lúa lai nhập nội từ Trung Quốc. Qua một số nghiên cứu về các giống lúa lai
nước ta thấy có năm khoảng hơn 350.000 ha lúa bị nhiễm nặng ở cả vụ mùa và
vụ xuân, hàng trăm ha mất trắng như vụ mùa năm 2002 tại một số nơi ở Hà Nội
(ðan Phượng, Phú Xuyên), Bắc Ninh, Ninh Bình,… Theo số liệu năm 2004 trên
tạp chí BVTV số 03, bệnh bạc lá lúa xuất hiện ở các tỉnh Hà Nam, Hải Phòng,
Phú Thọ, ðiện Biên, Bắc Giang, Nghệ An, Thanh Hóa với tổng diện tích lên tới

3.770 ha, trong ñó diện tích nhiễm nặng là 560 ha. Tỷ lệ bệnh phổ biến là 8 –
20% số lá, nơi nhiễm nặng là 50 – 70% số lá.
2.1.2. Quy luật và các yếu tố ảnh hưởng ñến phát sinh, phát triển bệnh
2.1.2.1. Quy luật phát sinh, phát triển của bệnh
Mỗi vùng lãnh thổ lại có một số chủng vi khuẩn bạc lá ñặc trưng,
phụ thuộc vào cơ cấu các giống lúa và ñiều kiện tự nhiên của vùng:
Philipin 6 chủng, Nhật Bản 12 chủng, Ấn ðộ 9 chủng,… (Tika và cộng
sự, 1999). Ở Việt Nam, nhiều nghiên cứu trước ñó ñã xác ñịnh ñược 14
chủng vi khuẩn bạc lá lúa có mặt ở miền Bắc Việt Nam (trích dẫn theo
Pham Van Du và Le Cam Loan, 2007). Trong nghiên cứu về bệnh bạc lá
ở 15 tỉnh miền Bắc, Nguyễn Văn Viết và cộng sự (2005) ñã nhận thấy
các nhóm chủng Xoo thường xuất hiện ñan xen, ở một ñịa phương có thể
xuất hiện nhiều nhóm chủng, trái lại một nhóm chủng có thể hiện diện ở
nhiều ñịa phương, trên một vết bệnh ñôi khi có thể tồn tại một hoặc một
số chủng vi khuẩn nhất ñịnh.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
6

Ở miền Bắc nước ta, bệnh bạc lá có thể xuất hiện và gây hại ở tất
cả các vụ lúa, bệnh thường nặng hơn trong vụ lúa mùa. Vụ xuân bệnh
phát triển mạnh vào tháng 5 - 6, còn vụ mùa là tháng 8 - 9 khi có nhiều
mưa bão gây tổn thương cho lá lúa. Giai ñoạn mẫn cảm nhất của cây lúa
với bệnh là giai ñoạn làm ñòng ñến chín sữa (Vũ Triệu Mân và Lê Lương
Tề, 2001).
2.1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng ñến sự phát sinh, phát triển bệnh
Nguồn bệnh là từ hạt giống, tàn dư cây bệnh, ngoài ra, ñất, nước
cũng như dạng viên keo vi khuẩn trên lá cũng có ý nghĩa nhất ñịnh trong
việc lan truyền bệnh cho vụ sau (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 2004).
Các yếu tố ngoại cảnh: Nhiệt ñộ thích hợp nhất cho vi khuẩn sinh
trưởng là 26

0
C - 30
0
C; pH thích hợp 6.8 - 7.2; ẩm ñộ và lượng
mưa là hai yếu tố quyết ñịnh cho sự phát sinh phát triển của bệnh,
lượng mưa lớn và nhiều kèm theo gió bão làm tổn thương ñến lá khiến vi
khuẩn dễ dàng xâm nhập, sinh sản, tạo nhiều giọt dịch vi khuẩn và lây lan
nhanh chóng (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 2004).
Phân bón và thời kỳ bón cũng là yếu tố ảnh hưởng rõ rệt ñến sự phát sinh
phát triển của bệnh. Bón ñạm vừa ñủ và cân ñối với lân và kali, bón sớm,
bón tập trung sẽ giảm khả năng bị bệnh hơn so với bón muộn, bón rải rác.
ðất màu mỡ nhiều chất hữu cơ thì bệnh phát triển hơn ở chân ñất cằn
cỗi. Theo Kozaka và Santo thì vi khuẩn xâm nhiễm mạnh, dễ dàng trong
ñiều kiện ruộng ngập nước do ñó nên cấy thưa, giữ mực nước vừa phải
sẽ làm giảm tác hại của bệnh (dẫn theo Tạ Minh Sơn, 1996). Cũng theo
Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (2004) thì trong ñiều kiện ñất chua, ngập
úng, thiếu ánh sáng, bệnh phát triển sớm và mạnh hơn.
Giống cũng là một yếu tố ảnh hưởng ñến sự phát sinh phát triển
của bệnh bạc lá. Các giống lúa cũ, lúa ñịa phương nhiễm bệnh nhẹ hơn
so với các giống lúa nhập nội có thời gian sinh trưởng ngắn, phàm ăn. Theo
ñiều tra của Hà Bích Thu và cộng sự (2002, Viện Bảo vệ thực vật) thì các giống
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
7

lúa lai Trung Quốc nhập nội từ năm 1993 - 1997 hầu hết ñều bị nhiễm bệnh
bạc lá với mức tỷ lệ bệnh 50 - 80%, cấp phổ biến là 5 - 7, nếu bệnh nặng,
năng suất giảm 20 - 50%.
2.1.3. Biện pháp phòng chống
2.1.3.1. Biện pháp canh tác
Sử dụng kết hợp các kỹ thuật trong canh tác nhằm hạn chế nguồn bệnh và

sự phát triển của bệnh. Bao gồm các kỹ thuật: vệ sinh ñồng ruộng, diệt trừ cỏ
dại; xử lý hạt giống trước khi trồng; bón phân cân ñối, tăng cường bón phân hữu
cơ, bón ñạm sớm và tập chung ;…
Ưu ñiểm: dễ thực hiện, không gây ô nhiễm môi trường, thực hiện tốt còn
có tác dụng giảm thiểu các loại sâu bệnh hại khác.
Nhược ñiểm: tốn công lao ñộng, hiệu quả không cao.
2.1.3.2. Biện pháp hóa học
Dùng các loại thuốc hợp chất ñồng, chất kháng sinh Streptomycin hoặc
các chất như MBAMT, acid Oxolinic, Ningnamycin,… Các chất này có bản chất
kháng vi khuẩn gram âm, chỉ sử dụng khi bệnh phát triển mạnh và lan tràn
nhanh. Có thể kết hợp sử dụng các chất tăng ñề kháng của cây lúa với vi khuẩn
như acid Salicylic,…
Biện pháp này mang lại hiệu quả ñáng kể khi sử dụng ñúng lúc, tuy nhiên
ngoài nhược ñiểm gây tốn kém về mặt kinh tế ra thì hậu quả nghiêm trọng nhất
do sử dụng các hóa chất này là làm mất cân bằng sinh thái, ñặc biệt là mất cân
bằng về thành phần vi sinh vật ñất.
2.1.3.3. Biện pháp sinh học
Sử dụng vi sinh vật ñối kháng: Một số loài vi sinh vật có khả năng ñối kháng với
vi khuẩn Xoo ñã ñược tìm thấy như: Pseudomonas fluorescens và một số chủng
Bacillus ñược phân lập từ các mẫu ñất vùng rễ lúa có khả năng ức chế sự phát
triển của X. oryzae pv. oryzae trong phòng thí nghiệm (Gnanamanickam và cộng
sự, 1999), hay chủng Lysobacter APMus ñược phân lập từ rễ lúa của tỉnh
Yunnan, Trung Quốc, có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại nấm và vi
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
8

khuẩn gây bệnh thực vật, trong ñó có X. oryzae pv. oryzae (Ji và cộng sự, 2008).
ðây là một hướng ñi mới trong chiến lược phòng chống bệnh bạc lá hứa hẹn
mang lại hiệu quả cao. Tuy nhiên, biện pháp này chỉ mới ñược tiến hành nghiên
cứu và thử nghiệm trong những bước ñầu tiên mà chưa thực sự ñược ứng dụng

một cách rộng rãi.
Chọn tạo giống kháng: là biện pháp khả thi và mang lại hiệu quả cao nhất trong
công tác phòng chống lại bệnh bạc lá lúa hiện nay. Ưu ñiểm của phương pháp
này là có thể ứng dụng rộng rãi ở tất cả các nơi trồng lúa trên thế giới, việc
phòng chống bệnh mang tính chất chủ ñộng, lại không gây ô nhiễm môi trường
và tạo ra nông sản sạch.
2.2. Chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá
2.2.1. Cơ chế kháng bệnh
2.2.1.1. Cơ chế sinh hóa và sinh thái
Kiryu và Mizuta (1955), phân tích các ñặc trưng hình thái của giống
kháng, giống trung gian và giống nhiễm nhận thấy các giống có bản lá hẹp,
ngắn, ñứng lá thường có phản ứng kháng. Môi trường dinh dưỡng bên trong của
cây kí chủ cũng là một yếu tố rất quan trọng trong việc xác ñịnh tính kháng và
nhiễm. Khi vi khuẩn xâm nhiễm vào cây, chúng nhanh chóng nhân lên ở cả
giống kháng và giống nhiễm. Tuy nhiên, ở các giống kháng sự nhân lên bị trì
hoãn và không hình thành vết bệnh hoặc chỉ xuất hiện những vết nhỏ. Ở các
giống nhiễm, vi khuẩn nhân lên theo cấp số nhân, ñồng thời xuất hiện triệu
chứng rất rõ ràng trên lá với vết bệnh to (Mizukami và Murayama, 1960). Theo
Fang và cộng sự (1963), các giống nhiễm có hàm lượng amino acid tự do cao
hơn giống kháng, hàm lượng polyphenol thấp hơn và hàm lượng ñường giảm
xuống. Những phân tích của IRRI ở Philippin cho thấy, hàm lượng ñường giảm
ñi ở mức ñộ cao ñối với ñạm tổng số ở các giống nhiễm. Theo Uchara (1960), sự
tạo ra phytoalexin, chất kìm hãm sự nhân lên của vi khuẩn ñược xác ñịnh ở các
giống kháng nhưng không xác ñịnh ở các giống nhiễm. Ngoài ra, có sự thay ñổi
về hàm lượng các hợp chất carbohydrat, nitrogen và photpho trong lá bệnh
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
9

(Misawa và Miyazaki, 1972). Watanabe và Asaumi (1975) cho rằng, có sự tăng
về cường ñộ hô hấp ở các lá nhiễm bệnh và có sự liên kết cao giữa sự hoạt hoá

của các phynylalanine. Nghiên cứu về tính kháng ñạt ñược (acqured resistance,
induced resistance), Watanabe và cộng sự (1976), Watanabe và Nakanishi
(1976, 1977) thấy rằng khi lây nhiễm vi khuẩn vào kí chủ nếu không có sự
tương hợp giữa kí sinh và kí chủ thì kí chủ sẽ tiết ra các hợp chất chống lại vi
khuẩn. Các tác giả ñã xác ñịnh ñược các hợp chất kìm hãm chỉ trong 24 giờ ở
các giống kháng, trong khi ñó phải sau lây nhiễm 5 ngày các chất này mới ñược
xác ñịnh ở các giống nhiễm khi vết bệnh thể hiện rõ ràng. Gần ñây, những ngiên
cứu của Reimers và Leach (1991) nhận thấy rằng, trong phản ứng không tương
hợp giữa vi khuẩn gây bệnh và cây lúa thì chất kìm hãm sự phát triển của vi
khuẩn tương quan với chất tích luỹ ban ñầu của các hợp chất huỳnh quang và
phản ứng tự chết của tế bào kí chủ. Bên cạnh ñó, trong phản ứng không tương
hợp, các hợp chất cao phân tử như ligin ñược hình thành rất nhanh ở các giống
kháng nhưng lại không ñược hình thành ở các giống nhiễm. Sự tạo ra các hợp
chất kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn và các hợp chất cao phân tử có tương
quan với sự tăng lên khả năng hoạt ñộng của các hợp chất peroxidase ñược hình
thành trong bước cuối của quá trình sinh tổng hợp các enzym của lignin. Bởi vì,
vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae cư trú tại các mô bó mạch và không
xâm nhập trực tiếp vào tế bào kí chủ nên các hợp chất cao phân tử như lignin là
một rào cản vật lý ñể ngăn chặn sự lan rộng của vi khuẩn trong kí chủ. Ngoài ra,
các hoạt ñộng của peroxidase, các hợp chất phenolic ñược hình thành trong
quá trình sinh tổng hợp lignin cũng ñóng vai trò quan trọng trong quá trình
chống lại sự xâm nhập cũng như sự nhân lên của vi khuẩn Xanthomonas oryzae
pv. oryzae.
2.2.1.2. Cơ sở sinh học phân tử về tính kháng bền vững
Trong phản ứng với bệnh cây kí chủ biểu hiện mức ñộ khác nhau ñối với sự
xâm nhiễm của tác nhân gây bệnh. Hầu hết các ghi nhận về tính kháng của lúa ñối
với vi khuẩn bạc lá ít nhiều thay ñổi theo tính kháng ngang và tính kháng dọc.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
10

Khái niệm tính kháng ngang, kháng dọc ñược J.E Vander Plank ñịnh
nghĩa ñầu tiên vào năm 1963.
Tính kháng dọc thường do một hoặc một vài gen qui ñịnh nên còn ñược
gọi là tính kháng ñơn gen. Chỉ cần một hoặc một vài gen kháng là có thể tạo ra
tính kháng. Tính kháng dọc mang tính ñặc hiệu cao chỉ chống ñược các chủng
tương thích của tác nhân gây bệnh. Tính kháng dọc còn ñược gọi là tính kháng
cao, kháng ñặc hiệu, kháng chỉ thị. Kháng dọc ở kí chủ còn cho phản ứng siêu
nhạy (hypersensitive response –HR) hoặc miễn nhiễm hoặc làm giảm dần sự
sinh sản của kí sinh, ngăn chặn bước phát triển khởi ñầu của kí sinh xâm nhập.
Tính kháng dọc dễ bị bẻ gẫy bởi một chủng tác nhân gây bệnh mới hình thành.
Tính kháng ngang thường do nhiều gen qui ñịnh nên còn ñược gọi là tính
kháng ña gen, mỗi gen ñóng góp một mức ñộ nhỏ vào tính kháng. Tính kháng
ngang di truyền theo qui luật số lượng. Tính kháng ngang qui ñịnh tính kháng
không hoàn toàn nhưng bền vững, tính kháng ngang biểu hiện khi tất cả các cây
trồng ñều có khả năng kháng không chuyên biệt chống lại tất cả các vi sinh vật
gây bệnh hoặc tấn công cây ñó. Tính kháng ngang liên quan ñến nhiều quá trình
dẫn tới phản ứng phòng thủ. Bên cạnh ñó, dưới tác ñộng của môi trường tính
kháng ngang dễ bị tác ñộng và dễ bị thay ñổi hơn tính kháng dọc. Một cách tổng
quát, tính kháng ngang không bảo vệ cây trồng khi bị xâm nhiễm nhưng giảm
dần sự phát triển của kí sinh tại những ñiểm xâm nhập. Do ñó, tính kháng ngang
không làm giảm bớt nguồn bệnh ban ñầu như tính kháng dọc nhưng làm giảm
tốc ñộ phát triển của dịch bệnh và thời gian tồn tại của tính kháng ngang là lâu
dài hơn. Vì vậy, có thể nói tính kháng ngang bền vững hơn tính kháng dọc.
Tính kháng bền vững, tính kháng không hoàn toàn
Theo Jonshon (1984), tính kháng bệnh bền vững (durable resistance) là
khả năng duy trì tính kháng trong khoảng thời gian dài trong môi trường thuận
lợi cho kí sinh gây bệnh. Khả năng kháng bền vững có thể có ñược ở những
giống lúa chứa hai hay nhiều gen kháng ñặc thù với từng nòi sinh lý. Chỉ khi các
nòi này ñồng thời tạo nên nhiều ñột biến ñộc lập mới có thể phá vỡ hàng rào
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

11

kháng bệnh của giống ñó. Trên thực tế tính kháng bệnh bền vững thường kết
hợp tính kháng không chuyên tính và có tính chất số lượng, nhưng sự hiểu biết
về mối quan hệ này chưa rõ ràng trên cơ sở sinh hoá học. Sự ra ñời của các
giống lúa kháng bệnh kéo theo sự xuất hiện các chủng vi khuẩn gây bệnh mới có
ñộc tính cao hơn, làm giảm tính bền vững của gen kháng. Do ñó, trong công tác
chọn tạo giống chống bệnh , người ta chú ý ñến việc tìm nguồn gen kháng
phong phú với mỗi chủng, mỗi nòi và mỗi vùng sinh thái khác nhau từ ñó tổ hợp
vào một giống ñể tăng tính kháng bền vững của giống. ðây là mục tiêu chiến
lược trong giai ñoạn hiện nay.
Tính kháng không hoàn toàn ñược do J.E Parlevliet ñịnh nghĩa ñầu tiên
năm 1979. Biểu hiện của tính kháng bệnh không hoàn toàn là sự sinh bào tử bị
giảm, mặc dù kí chủ nhiễm bệnh nhưng thời kì ủ bệnh kéo dài, thời kì nhiễm
bệnh của kí chủ ngắn ñi. Gần ñây, người ta gọi tính kháng không hoàn toàn là
tính kháng số lượng (quatitativeloci resistance – QR).
2.2.2. Nghiên cứu về di truyền tính kháng bệnh
Những nghiên cứu có tính chất hệ thống về gen kháng bệnh bạc lá ñược
thực hiện tại Nhật Bản vào ñầu thập kỷ 60. Năm 1961, những nghiên cứu ñầu
tiên về di truyền khả năng kháng bệnh bạc lá ñã ñược Nishimura tiến hành.
Trong khi nghiên cứu về sự luân chuyển các giống lúa trồng ở Nhật Bản, ông ñã
phát hiện ra khả năng kháng bệnh bạc lá ở hai giống lúa trồng Kogyoku và
Kaganeman ñược ñiều khiển bởi một gen trội nằm trên NST số 11 (theo hệ
thống thứ tự NST của ông). Vào thập kỷ 60 của thế kỷ trước, cùng với việc phổ
biến các giống lúa bán lùn và năng suất cao vào sản xuất, bệnh bạc lá phát triển
ngày càng rộng. Nhận thấy thực tế này, IRRI ñã tiến hành ñánh giá khả năng
kháng bệnh của các giống lúa nhiệt ñới, ñồng thời tiến hành nghiên cứu về bản
chất di truyền khả năng kháng bệnh bạc lá (Tsugufumi Ogawa,1997). Cho ñến
những năm 80 của thế kỷ XX, viện nghiên cứu lúa quốc tế ñã xác ñịnh bản chất
di truyền tính chống bệnh là do gen qui ñịnh (Mew, 1987).

Với kĩ thuật di truyền phân tử, các nòi Xoo ñã ñược sử dụng ñể ñánh giá
kiểu gen kháng và nhiễm của cây lúa với các marker phân tử tương ứng, gen
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
12

kháng ñược thống nhất có tên là Xa + số thứ tự (Mew, 1987). ðến nay, ñã có 30 gen
kháng ñược phát hiện, ký hiệu từ Xa1 ñến Xa29, trong ñó có 21 gen trội và 9 gen lặn
(Sidhu và Khush 1978; Ogawa,1988; Lin, 1996; Nagato và Yoshimura, 1998;
Zhang, 1998; Khush và Angeles, 1999; Gao, 2001; Chen, 2002; Lee, 2003; Yang,
2003; Tan, 2004)

. Các gen kháng ñược thu thập từ nhiều nguồn khác nhau: Gen
kháng nguyên thuỷ có sẵn trong các giống lúa trồng, gen kháng ñược tạo ra bởi ñột
biến như xa19, xa20, xa25 hoặc các gen kháng có nguồn gốc từ các giống lúa dại
như Xa21, Xa23 (K.S Lee và cộng sự, 2003).
Các gen kháng bạc lá có thể bị kiểm tra bởi một gen ñơn trội (Xa1, Xa2,
Xa3, Xa4), một gen ñơn lặn (xa5, xa8, xa13) hoặc do hai gen liên kết với nhau
như Xa1Xa4, Xa4Xa7, Xa1Xa10. Tính kháng bạc lá có thể ñược ñiều khiển bởi
một gen ñơn trội như Xa4 ở các giống lúa IR 20, Peta hoặc gen lặn xa5 ở các
giống IR 339-1545, DV 85. Do vậy mức ñộ chống bệnh theo ñó cũng khác nhau.
Với các giống kháng bạc lá, các gen chính ñược phát hiện nhờ áp dụng RFLP,
RAPD ñể xây dựng bản ñồ di truyền. Người ta ñã xác ñịnh ñược vị trí của một
số gen kháng quan trọng: Gen Xa-4 liên kết với RFLP ở locus XNpb181 và
XNpb78 trên NST số 11, với khoảng cách liên kết ñều là 1,7 cM (Yoshida et al,
1992); gen xa-5 liên kết với chỉ thị RZ390, RG556 và RG207 trên NST số 5 với
khoảng cách liên kết 0-1 cM (Mc Couch et al, 1991); gen Xa-7 nằm trên NST số
6 liên kết với chỉ thị Mp3 với khoảng cách di truyền 2,5 cM; gen Xa-13 nằm
trên NST số 8 liên kết với chỉ thị RZ390 với khoảng cách di truyền 0 cM. Một
nghiên cứu thành công có ý nghĩa trong lịch sử trong nghiên cứu phân lập gen
kháng bệnh của cây lúa là Xa21, nhờ kĩ thuật thiết kế những STS marker

(sequence tagged site) Xa21 là gen lần ñầu tiên ñược clone hoá từ loài lúa dại O.
Longistaminata. Nó mã hoá kinase ñóng vai trò như receptor gồm nhiều phân tử
lặp giàu leucine (LRR) ở vùng ngoại bào và mã hoá kinase có serine hoặc
threonine ở vùng nội bào. Phân tích chuỗi mã di truyền bảy thành viên của họ
gen này tại locus Xa21 cho thấy hiện tượng lặp ñoạn, tái tổ hợp, chuyển vị ñều
xuất hiện trong suốt quá trình tiến hoá họ gen này (Wang và ctv, 2001). Gen Xa-
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
13

21 có phổ kháng rộng ñối với nhiều nòi vi khuẩn Xoo, gen này ñược phát hiện
trong quần thể lúa hoang dại ở Châu Phi (O. longistaminata – Khush và ctv,
1990) nằm trên NST số 11 liên kết với chỉ thị pTA818 và pTA248 với khoảng
cách di truyền 0-1 cM (Ronal et al, 1992). Việc xác ñịnh chính xác các gen
kháng, NST chứa gen kháng và vị trí sắp xếp của các gen ñó trên NST ñã phục
vụ ñắc lực trong công tác chọn tạo giống kháng bệnh.
Di truyền tính kháng bệnh bạc lá tuân theo thuyết “gen ñối gen” (gene for
gene) của Flor, ông ñã viết: “ ðối với mỗi gen qui ñịnh tính kháng trong cây kí
chủ có một gen tương ứng qui ñịnh tính gây bệnh trong kí sinh”. Nói cách khác,
gen kháng trong kí chủ chỉ hoạt ñộng nếu kí sinh mang alen không gây bệnh.
Luôn tồn tại mối tương tác giữa Xoo và cây lúa, biểu hiện kháng ñược chi phối
bởi tương tác giữa một gen kháng ñơn, trội (R genes) ở cây lúa và gen của tác
nhân gây bệnh tương ứng ñược gọi là avirulence (avr) genes (Mew 1987, Leach
và White 1995). Do mỗi vùng ñịa lý khác nhau tồn tại những nòi sinh lý khác
nhau nên có những giống kháng bệnh rất hiệu quả ở vùng này nhưng lại nhiễm
bệnh nặng ở vùng khác. Vì vậy, ñể chọn tạo giống chống bệnh phù hợp với từng
vùng sinh thái khác nhau cần xác ñịnh ñược nòi sinh lý, khu vực phân bố và khả
năng kháng của gen ñối với nòi ñó. Viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI) ñã tạo ra
các dòng ñẳng gen chứa các gen kháng bệnh bạc lá khác nhau trên thế giới bằng
phương pháp lai giữa giống IR24 và giống chứa gen kháng bệnh bạc lá khác
nhau. Từ ñó tạo ra các dòng, có nền gen chung của IR24, chỉ khác nhau ở một

gen kháng bệnh bạc lá. Do ñó, có thể phân biệt ñược nòi sinh lý dựa vào phổ
kháng nhiễm ñặc trưng của từng gen kháng. ðây là phương pháp có ý nghĩa lớn
trong việc phát triển giống kháng bệnh bạc lá.
Tika và Mew nghiên cứu khả năng kháng bệnh trên 11 dòng ñẳng gen
mang 1, 2, 3 hoặc 4 gen kháng bằng cách lây nhiễm nhân tạo với 50 chủng vi
khuẩn thu thập tại Nepal. Kết quả cho thấy các dòng nào mang nhiều gen kháng
sẽ biểu hiện bị nhiễm nhẹ hơn hẳn so với dòng chỉ mang một gen kháng (Tika B.
Adhikari, Ram Chandra Basnyat, T. W. Mew, 1999). ðiều này chứng tỏ việc tổ
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
14

hợp 2 hay nhiều gen kháng vào một giống chính là chiến lược ñể tăng phổ kháng
cho giống cũng như tăng ñộ bền cho gen kháng.
Theo Phan Hữu Tôn và Bùi Trọng Thuỷ (2003), thì việc có thêm gen
kháng không hữu hiệu khác tổ hợp với một trong số các gen kháng hữu hiệu ñều
không làm tăng tính kháng của các dòng. Như vậy, việc tổ hợp 2 gen kháng và
kháng hữu hiệu, kháng và nhiễm không làm thay ñổi khả năng kháng hoặc
nhiễm của từng gen thành phần. ðiều này có ý nghĩa to lớn trong việc tạo giống
kháng bệnh bền vững. Thay bằng phải tổ hợp nhiều gen kháng vào một giống
chúng ta chỉ cần chuyển một trong số các gen kháng hữu hiệu thì có thể tạo
ñược giống kháng bệnh bạc lá bền vững.
Ở Việt Nam ñã xác ñịnh các gen kháng Xa4, xa5, Xa7 và Xa21 ñều có
tính kháng cao ñối với hầu hết các nhóm nòi vi khuẩn (Races) vi khuẩn X.oryza
gây bệnh bạc lá lúa ở các tỉnh phía bắc nước ta, cần ñược sử dụng trong lai tạo
các giống lúa mới kháng bệnh ñể phòng trừ bệnh bạc lá trong thời kì hiện nay.
Như vậy, sự ra ñời của các giống lúa kháng bệnh kéo theo sự tiến hoá của các
chủng vi khuẩn gây bệnh, làm giảm tính bền vững của gen kháng. Do ñó, chiến
lược nhằm kéo dài thời gian kháng bền vững của gen kháng là vô cùng quan
trọng trong việc chọn giống kháng bệnh bạc lá.
2.2.3. Các phương pháp chọn giống lúa kháng bệnh bạc lá

Phương pháp chọn giống kháng bệnh bạc lá phổ biến và quan trọng nhất
cho ñến nay là phương pháp lai hữu tính. Phương pháp này tiến hành lai giữa
các giống có chứa gen kháng, sau ñó chọn lọc các thế hệ phân li. Bằng phương
pháp này nhiều giống kháng bệnh ñã ñược tạo ra. Khả năng kháng bạc lá
thường do ñơn gen quy ñịnh, vì vậy việc sử dụng phương pháp lai lại ñể
chuyển gen kháng là rất hiệu quả. Nguyên lý của phương pháp này là sử dụng
một giống lúa tốt nhưng không mang gen kháng cần thiết ñể lai lại với một
giống mang gen kháng hữu hiệu. Sau một số lần chọn lọc và lai lại liên tục,
giống mới ñược tạo thành gần như mang toàn bộ nguồn gen tốt của cây lai lại
và mang thêm ñược gen kháng mong muốn. Trong quá trình lai lại, có thể kết
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
15

hợp với tự phối, chọn lọc các dạng phân ly ñể ñẩy nhanh quá trình tạo dòng
thuần. Ở phương pháp này bắt buộc nhà chọn giống phải sử phương pháp lây
nhiễm nhân tạo ñể xác ñịnh con lai có mang gen kháng hay không. Nhưng
bằng phương pháp này ñôi khi khó phân biệt ñược các gen kháng khác nhau,
nếu chúng cùng biểu hiện một phổ kháng nhiễm với các chủng vi khuẩn tương
tự. Hoặc nếu gen kháng là gen trội, bằng lây nhiễm nhân tạo ta có thể chọn
ñược cả 2 dạng, dạng ñồng hợp tử trội và dạng dị hợp tử, cả 2 dạng này ñều
biểu hiện kiểu hình như nhau, rất khó ñể phân biệt. ðể khắc phục nhược ñiểm
này, hiện nay phương pháp dùng chỉ thị phân tử, dựa trên các trình tự DNA
liên kết chặt với gen kháng, ñược sử dụng nhằm xác ñịnh các gen kháng dễ
dàng và có thể phân biệt ñược các trạng thái alen khác nhau.
Ngoài phương pháp chuyển gen kháng bệnh bạc lá bằng lai hữu tính, hiện
nay còn có các nghiên cứu nhằm chuyển gen kháng bằng phương pháp cứu phôi
và lai tế bào trần. Bằng phương pháp cứu phôi, Amide-Border và cộng sự (1992)
ñã chuyển gen kháng từ lúa dại vào lúa trồng (K.S.Lee và cộng sự). Bằng
cách lai tế bào trần giữa lúa trồng Oryzae sativa L. với nguồn cho gen kháng là
lúa dại Oryzae meyeriana, Cheng-qui Yan và cộng sự tiến hành thành công việc

tạo dòng tế bào mang gen kháng bạc lá. Kết quả thu ñược 29 dòng cây lai xoma,
hình thái biểu hiện giống cả hai bên bố mẹ và trong ñó có 2 dòng biểu hiện tính
kháng cao, 8 dòng biểu hiện tính kháng vừa (Cheng - qui Yan và cộng sự, 2004).
2.2.4. Ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu và chọn giống kháng
bệnh bạc lá
Sự phát triển của công nghệ sinh học, ñặc biệt là công nghệ gen ñã mang
ñến những bước tiếng ñáng kể trong nghiên cứu và chọn tạo giống kháng bệnh
bạc lá. Vi khuẩn Xanthomonas oyzae pv. Oyzae có thể ñược xác ñịnh nhanh
chóng bằng cách sử dụng các chỉ thị phân tử. Adachi và T. Oku (2000) ñề xuất
sử dụng 2 ñoạn mồi XOR-F và XOR-R2 ñể nhân ñoạn DNA, ñoạn DNA này
nằm giữa hai gen tổng hợp nên cấu tử 16S và 23 S của ribosome vi khuẩn bạc lá
(Phan Hữu Tôn, 2005).
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
16

Ngoài ra, các kỹ thuật phân tử như RFLP (restriction fragment length
polymorphism) cũng ñược áp dụng thành công trong việc xác ñánh giá sự ña
dạng hay xác ñịnh chủng mới của vi khuẩn Xoo ở Việt Nam, Phillipnes, Hàn
Quốc và những nước trồng lúa khác (Adhikari, 1995; Yashitola, 1997; Etham
Ghasemie, 2008; Phan Hữu Tôn,2009).
Tại Việt Nam, chỉ thị phân tử ñã ñược ứng dụng nhiều trong nghiên cứu
bệnh bạc lá và chọn tạo giống lúa kháng bệnh ở các trung tâm chọn giống.
Từ năm 1997-2004, Viện lúa ñồng bằng sông Cửu Long ñã sử dụng
phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử kết hợp với lây nhiễm nhân tạo bằng 9
chủng vi khuẩn phổ biến trong ñánh giá khả năng kháng bệnh của 348 giống lúa
ñịa phương thu thập ñược ở duyên hải Trung Bộ và ñồng bằng sông Cửu Long.
Kết quả ñã thu ñược 17 giống mang gen Xa13, 6 giống mang gen Xa4, 4 giống
mang gen xa5, 3 giống mang gen Xa7, 3 giống mang gen Xa14. Kiểm tra ñộ tin
cậy của phương pháp chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phát hiện gen kháng ở
quần thể con lai giữa IR24/Barer ñối với gen xa5 cho thấy ñộ chính xác lên tới

93,3% (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2004). Bùi Chí Bửu và Cộng sự cũng
ñã sử dụng chỉ thị phân tử ñể kiểm tra tổ hợp BC4F4 của IR24 với giống lúa ñịa
phương mang gen kháng Xa4, xa5, Xa13 với ñộ chính xác cao.
Trong các năm 2000-2005, Phan Hữu Tôn và cộng sự tiến hành việc tìm
kiếm nguồn gen kháng từ các giống lúa ñịa phương bằng cả hai phương pháp lây
nhiễm nhân tạo và PCR. Năm 2000, theo kết quả nghiên cứu ñã công bố của
Phan Hữu Tôn thì trên cơ sở ñiều tra 145 giống lúa ñịa phương ñã phát hiện
ñược 12 giống chứa gen xa5 và 2 giống chứa gen Xa7. Năm 2004, trên cơ sở
tiếp tục ñiều tra 120 giống ñịa phương, Phan Hữu Tôn và cộng sự phát hiện
ñược thêm 8 giống lúa ñịa phương chứa gen xa5. Các kết quả nghiên cứu trên
ñều nhằm mục ñích phục vụ cho chiến lược chọn tạo giống lúa chống bệnh bạc
lá ở miền Bắc Việt Nam.
ðến nay, bước ñầu có thể khẳng ñịnh các gen Xa3, Xa4, xa5, Xa7, Xa10,
xa13, Xa14 là các gen kháng thường có mặt trên các giống lúa ñịa phương ở
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
17

Việt Nam. Các gen kháng Xa4, xa5, Xa7, Xa21 là các gen có ý nghĩa quan trọng
trong việc chọn tạo giống lúa kháng bệnh, bởi chúng có khả năng kháng ñược
hầu hết các chủng vi khuẩn phổ biến ở nước ta. Nhưng trong số các gen kháng
hữu hiệu, tại miền Bắc thì gen Xa7 có khả năng xuất hiện nhiều hơn xa5. Hiện
chưa có nghiên cứu nào công bố việc phát hiện ñược gen Xa21 trên các giống
lúa trồng. Việc sử dụng kỹ thuật PCR xác ñịnh gen kháng và vi khuẩn bạc lá
trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh cho kết quả rất khả quan.
2.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử vào chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá
2.3.1. Giới thiệu về chỉ thị phân tử DNA
Bất kỳ ñoạn DNA nào ñược sử dụng ñể phân biệt sự khác nhau về kiểu
hình (tính trạng) giữa các cá thể, dòng, giống và giữa các loài ñều ñược gọi là chỉ
thị phân tử DNA ñánh dấu gen (Phan Hữu Tôn, 2005). Hiện nay chỉ thị phân tử
DNA ñược sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu di truyền và chọn giống.

Chỉ thị DNA ñánh dấu gen gồm 9 phương pháp, sắp xếp theo thứ tự
thường ñược sử dụng:
* Chỉ thị RFLP (sự ña hình chiều dài các ñoạn cắt giới hạn, lai DNA/DNA).
Phương pháp lai DNA là một kỹ thuật nhằm gắn kết với chọn lọc những mẫu
ñặc thù của sợi DNA ñơn hoặc RNA dựa trên cơ sở ghép cặp bổ sung những
ñoạn DNA sợi ñơn tương ứng ñã ñược chuyển dính vào màng lọc Nitrocellulose
hoặc màng Nilon. ðể tiến hành phương pháp này, trước hết DNA của bộ genom
ñược tách chiết, sau ñó tiến hành cắt bằng một hoặc vài emzym cắt hạn chế, ñể
tạo ra các ñoạn DNA khác nhau, những mẫu này ñược phân tách trên gel Agarose.
Tuỳ theo các ñoạn DNA dài, ngắn khác nhau mà sự di chuyển trên gel là khác
nhau. Sau ñó người ta chuyển các vạch DNA lên màng Nitrocellulse hoặc màng
Nilon và dính chặt vào ñó, như vậy ở gel có bao nhiêu vạch DNA thì trên màng có
bấy nhiêu vạch. Màng lai ñược lai với các mẫu dò mục tiêu, ñã ñược ñánh dấu
phóng xạ. Màng sau khi lai ñược rửa và chụp hình trên phim X-quang.
Chỉ thị RFLP thường ñược sử dụng ñể nghiên cứu ñộ phong phú về di
truyền, sự phân hoá trong di truyền huyết thống (phylgenetics), lập bản ñồ gen.