Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme chitin deacetylase và khả năng ứng dụng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

---------------------------

NGUYỄN TRẦN THIỆN ĐỨC

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SINH
TỔNG HỢP ENZYME CHITIN DEACETYLASE
VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Mã số ngành: 6042020

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 9 năm 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

---------------------------

NGUYỄN TRẦN THIỆN ĐỨC

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SINH
TỔNG HỢP ENZYME CHITIN DEACETYLASE
VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Mã số ngành: 6042020
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 9 năm 2017


CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Luận văn Thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Công nghệ TP. HCM
ngày … tháng … năm …
Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm:
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn Thạc sĩ)

TT
1
2
3
4
5

Họ và tên
GS.TSKH.Nguyễn Trọng Cẩn
PGS.TS.Nguyễn Tiến Thắng
TS. Nguyễn Hoàng Dũng
TS. Trịnh Thị Lan Anh
TS.Nguyễn Ngọc Hồng

Chức danh Hội đồng

Chủ tịch
Phản biện 1
Phản biện 2
Ủy viên
Ủy viên, Thư ký

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận sau khi Luận văn đã được
sửa chữa (nếu có).
Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV


TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHỆ TP. HCM
VIỆN ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
TP. HCM, ngày..… tháng….. năm 20..…

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Nguyễn Trần Thiện Đức

Giới tính:Nam

Ngày, tháng, năm sinh:13/07/1992

Nơi sinh:TP.HCM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

MSHV:1541880003

I- Tên đề tài:
Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitin
deacetylase và đánh giá khả năng ứng dụng trong sản xuất chitosan từ chitin của các
chủng vi sinh vật.
II- Nhiệm vụ và nội dung:
- Thu thập mẫu phân lập
- Tăng sinh chọn lọc VSV
- Phân lập chủng VSV thuần khiết từ các nguồn mẫu
- Sàng lọc khả năng sinh tổng hợp CDA của các chủng phân lập
- Khảo sát VSV sàng lọc và định danh
- Thử nghiệm chuyển hóa chitin thành chitosan, sử dụng môi trường lên men cơ
bản nuối cấy các chủng sàng lọc
- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn C, N, khoáng đến hiệu suất thu hồi chitosan và
chất lượng chitosan tạo thành (độ deacetyl, độ hòa tan)
- Tăng hiệu suất thu hồi bằng cách tăng nồng độ acid acetic hòa tan chitosan.
- Tăng hiệu suất thu hồi chitosan bằng cách thay đổi các nguồn cơ chất cảm ứng.


- Khảo sát tính chất chitosan tạo thành bằng phương pháp sinh học so sánh với
chitosan sản xuất bằng phương pháp hóa học và chitosan thương mại
- Đề nghị quy trình sản xuất chitosan từ chitin bằng phương pháp sinh học.
III- Ngày giao nhiệm vụ: 15/02/2016
IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 30/08/2016
V- Cán bộ hướng dẫn: (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên): TS. Nguyễn Hoài Hương
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN

NGÀNH

(Họ tên và chữ ký)

(Họ tên và chữ ký)


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ
công trình nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã
được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
TP.HCM, ngày……tháng……năm 2017
Học viên thực hiện Luận văn


ii

LỜI CÁM ƠN
Tôi xin chân thành cám ơn tất cả quý thầy cô trong trường Đại học Công
Nghệ TP.HCM, thầy cô ngành Công nghệ sinh học đã tận tình giảng dạy, truyền đạt
kinh nghiệm kiến thức, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và tạo
điều kiện thực hiện để tôi hoàn thành luận văn này.
Đặc biệt tôi xin cám ơn Tiến sĩ Nguyễn Hoài Hương đã tận tình hướng dẫn
và tạo mọi điều kiện để tôi thực hiện và hoàn thành tốt luận văn.
Xin được gửi lời cảm ơn đến cô Đỗ Thị Tuyến – Trung tâm phân tích kỹ
thuật cao Sài Gòn STC cùng sinh viên Đỗ Thị Phương Trinh đã giúp tôi hoàn thành
kết quả chạy điện di các mẫu enzyme.
Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn các thầy cô trong hội đồng phản biện đã

dành thời gian đọc và nhận xét cho luận văn này để tôi có thể hoàn thiện nó tốt hơn.
Tôi xin chúc các thầy cô được nhiều sức khỏe và luôn thành công trong
cuộc sống.
Học viên thực hiện Luận văn

Nguyễn Trần Thiện Đức


iii

TÓM TẮT
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
ENZYME CHITIN DEACETYLASE VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG
CÁC CHỦNG NÀY TRONG SẢN XUẤT CHITOSAN TỪ CHITIN
Trong nghiên cứu này, 26 chủng vi khuẩn đã được phân lập từ các mẫu đất
thu thập từ các địa điểm khác nhau ở Vũng Tàu, Cần Giờ, trong đó chỉ có 3 chủng
(CD1, CD5, CD10) cho thấy khả năng sinh tổng hợp enzyme chitin deacetylase
được định danh là Bacillus cereus, B. amyloliquefaciens và B. siamensis.
Môi trường sử dụng lên men các chủng trên chuyển hóa chitin huyền phù
thành chitosan chứa nguồn C là tinh bột 2%, nguồn N là cao nấm men 1%, nguồn
khoáng là MgSO4 0,04% được bổ sung NaCl 0,1%. Hiệu suất thu hồi chitosan khi
sử dụng acid acetic 2% hòa tan chitosan lần lượt là 73%, 52%, 49% tương ứng với
các chủng CD1, CD5 và CD10. Độ hòa tan, độ nhớt, độ deacetyl hóa và khối lượng
phân tử, hoạt tính kháng khuẩn của chitosan sinh học không khác biệt nhiều so với
chitosan hóa học và chitosan thương mại.


iv

ABSTRACT

ISOLATION AND SCREENING OF CHITIN DEACETYLASE PRODUCING
MICROORGANISMS AND APPLICATION POTENTIAL IN CHITOSAN
PRODUCTION FROM CHITIN.
In this study, 26 bacterial strains were isolated from soil samples, collected
from different locations in Ba Ria Vung Tau Province, among which only three
strains namely CD1, CD5 and CD10 showed their chitin deacetylase activity and
were identified as Bacillus cereus, B. amyloliquefaciens and B. siamensis,
respectively.
The culture medium for above – mentioned strains to convert colloidal chitin
to chitosan contained 2% soluble starch as the carbon source, 1% yeast extract as
the nitrogen source and several minerals such as 0,04% MgSO4 and 0,1% NaCl.
Chitosan recovery yields by using 2% acetic acid to dissolve chitosan were 73%,
52%, 49% for CD1, CD5 and CD10 respectively. Chitosan obtained by biological
method displayed solubility, viscosity, deacetylation degree, molecular weight and
antibacterial activity in the same range as this obtained by chemical method as well
as the commercial one.


v

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i
LỜI CÁM ƠN...................................................................................................................... ii
TÓM TẮT ............................................................................................................................iii
ABSTRACT ....................................................................................................................... iv
MỤC LỤC........................................................................................... ....................... v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT.......... .............................................................. ix
DANH MỤC CÁC BẢNG................... ...................................................................... x
DANH MỤC CÁC HÌNH............................. ............................................................. xi
MỞ ĐẦU................................. ....................................................................................1

1. Đặt vấn đề............................. ................................... .......................................1
2. Tính cấp thiết của đề tài.................... ...................... .......................................1
3. Mục tiêu nghiên cứu................... ....................................................................2
4. Nhiệm vụ nghiên cứu.................. ...................................................................2
5. Phương pháp nghiên cứu. ...............................................................................3
6. Các kết quả đạt được của đề tài.. ............................ ........................................3
7. Kết cấu của luận văn thạc sĩ....... ....................................................................4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN....... ................................................................................5
1.1. Tổng quan về chitin..... .........................................................................................5
1.1.1. Giới thiệu............. .....................................................................................5
1.1.2. Tính chất vật lý............... ..........................................................................5
1.1.3. Tính chất hóa học........... ..........................................................................6
1.1.4. Tính chất sinh học.......... ..........................................................................6
1.1.5. Nguồn nguyên liệu thu nhận.......... ...................... ....................................7
1.1.6. Tình hình sản xuất và nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới. ... .........7
1.1.6.1. Tình hình sản xuất và nghiên cứu tại Việt Nam ....................... ........7
1.1.6.2. Tình hình sản xuất và nghiên cứu trên thế giới................................. 8
1.1.7. Ứng dụng............ ......................................................................................9
1.2. Tổng quan về chitosan........... ..............................................................................9


vi

1.2.1. Giới thiệu........... .......................................................................................9
1.2.2. Tính chất hóa lý......................... .............................................................10
1.2.3. Tính chất sinh học.................. ................................................................10
1.2.4. Các tính chất của chitosan........ ..............................................................14
1.2.4.1. Mức độ deacetyl hóa...................... ............... ..................................14
1.2.4.2. Trọng lượng phân tử Chitosan........... ......... ....................................14
1.2.4.3. Độ nhớt..................... ......................................................................11

1.2.4.4. Tính tan........................ ...................................................................11
1.2.4.5. Tỷ trọng............... ............................................................................12
1.2.4.6. Khả năng kết hợp với nước và khả năng kết hợp với chất béo ....... 12
1.2.4.7. Khả năng tạo màng............. ................................ ............................12
1.2.4.8. Hoạt tính sinh học của chitosan......... ............. ................................12
1.2.5. Nguồn nguyên liệu thu nhận...... ............................................................14
1.2.6. Công nghệ sản xuất chitosan... ...............................................................14
1.2.6.1. Quy trình sản xuất chitosan từ chitin bằng phương pháp hóa học..15
1.2.6.2. Quy trình sản xuất chitosan bằng phương pháp bán sinh học.........16
1.2.7. Tình hình sản xuất và nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới.... .......18
1.2.7.1. Tình hình sản xuất và nghiên cứu tại Việt Nam.......... . ..................18
1.2.7.2. Tình hình sản xuất và nghiên cứu trên thế giới................. ..............19
1.2.8. Ứng dụng...... ..................................................................... .....................19
1.3. Tổng quan về enzyme chitin deacetylase....... ....................................................20
1.3.1. Giới thiệu enzyme chitin deacetylase.... .................................................20
1.3.2. Cơ chế xúc tác................ ........................................................................20
1.3.3. Phướng pháp xác định hoạt tính............. ................................................22
1.3.4. Điều kiện hoạt động của enzyme...... ................ .....................................22
1.3.5. Ứng dụng............ ....................................................................................23
1.3.6. Lịch sử nghiên cứu enzyme chitin deacetylas... ........... ..........................23
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................ ............ 25
2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài.......................... ...... ...............................25
2.1.1. Thời gian............. ...................................................................................25


vii

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu............. .............................................. ...................25
2.2. Vật liệu nghiên cứu.................. ..........................................................................25
2.2.1. Nguồn mẫu.......... ...................................................................................25

2.2.2. Hóa chất........... .......................................................................................27
2.2.3. Thiết bị – dụng cụ................... ................................................................27
2.2.3.1. Thiết bị............................ ................................. ...............................27
2.2.3.2. Dụng cụ........................... ................................................................28
2.3. Phương pháp luận...............................................................................................28
2.4. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................28
2.4.1. Phân lập, sàng lọc vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme chitin deacetylase30
2.4.1.1. Thu thập mẫu................... ...............................................................30
2.4.1.2. Tăng sinh, phân lập chủng thuần khiết................... ........ ................31
2.4.1.3. Sàng lọc...................... .....................................................................31
2.4.1.4. Định danh các chủng sàng lọc....................... .............. ...................32
2.4.2. Khảo sát khả năng chuyển hóa chitin thành chitosan bằng các chủng
sàng lọc............. ................................................................................................36
2.5. Phương pháp xử lý số liệu..................................................................................47
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............... .................... .........................48
3.1. Phân lập và sang lọc chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme chitin
deacetylase....... ........................................................................ .................................48
3.1.1. Tăng sinh, phân lập chủng thuần khiết........... ......................... ...............48
3.1.2. Sàng lọc........... .................................................. .....................................48
3.1.3. Định danh sơ bộ các chủng sàng lọc............ ......... .................................49
3.1.3.1. Đặc điểm hình thái..................... .................. ...................................49
3.1.3.2. Kết quả định tính khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng vi
khuẩn.... ........................................................................................................49
3.1.4. Định danh chủng vi khuẩn chọn lọc bằng phương pháp sinh học phân
tử.. ..................................................................................................................... 53
3.2. Khảo sát khả năng chuyển hóa chitin thành chitosan bằng các chủng sàng
lọc................ ................... ..........................................................................................53


viii

3.2.1. Thử nghiệm chuyển hóa chitin thành chitosan, sử dụng môi trường lên
men chọn cơ bản nuôi cấy các chủng sàng lọc........................ .........................53
3.2.1.1. Định tính sự hiện diện của chitosan.......... ............. .........................54
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của cơ chất đến hiệu suất thu hồi chitosan.... ...... ..55
3.2.2.1. Nguồn Carbon................... ..............................................................56
3.2.2.2. Nguồn Nitơ........................ ............................. ................................57
3.2.2.3. Thành phần khoáng.................. .................... ...................................58
3.2.3. Tăng hiệu suất thu hồi bằng cách tăng nồng độ acid acetic hòa tan
chitosan....... ......................................................................................................60
3.2.4. Tăng hiệu suất thu hồi bằng cách thay đổi cơ chất cảm ứng..................61
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............. .....................................................................72
Kết luận................. ....................................................................................................72
Kiến nghị.............. .....................................................................................................72
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................74


ix

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CDA

: Chitin deacetylase

CS

:Chitinase

DDA

: Độ deacetyl

LMWC : Low molecular weight chitosan
VSV

: Vi sinh vật


x

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Tổng kết các đặc điểm nuôi cấy của các chủng vi sinh vật khảo sát..... .. .52
Bảng 3.2. Khảo sát ảnh hưởng nguồn Carbon đến hiệu suất thu hồi và chất lượng
chitosan tạo thành.............. ........................................................................................56
Bảng 3.3. Ảnh hưởng nguồn Nito đến khả năng sản xuất chitosan của 3 chủng VSV
CD1, CD5, CD10........ ..............................................................................................57
Bảng 3.4. Ảnh hưởng nguồn Muối đến khả năng sản xuất chitosan của 3 chủng
VSV CD1, CD5, CD10.......... ...................................................................................58
Bảng 3.5. Khảo sát enzyme trong dịch nuôi cấy vi khuẩn tuyển chọn nhằm chuyển
hóa chitin thành chitosan....... ....................................................................................59
Bảng 3.6. Ảnh hưởng nồng độ acid acetic đến khả năng sản xuất chitosan của 3
chủng VSV CD1, CD5, CD10......... .........................................................................60
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng đến khả năng sản xuất chitosan của 3
chủng VSV CD1, CD5, CD10.......... ........................................ ................................61
Bảng 3.8. So sánh chitosan điều chế từ phương pháp lên men sinh học, chitosan hóa
học, chitosan thương phẩm......... ..............................................................................62
Bảng 3.9. Độ deacetyl hóa chitosan chuyển hóa sinh học sơ với chitosan hóa học và
chitosan thương mại.................. ........................................................ ........................63

xi

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin......... ..............................................................5
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học N-acety-D-glucosamine liên kết với nhau bằng cầu nối
β-(1,4)-glucoside.... .....................................................................................................6
Hình 1.3. Deacetyl hóa chitin thành chitosan........ ................. ..................................10
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của chitosan........ .........................................................10
Hình 1.5. Quy trình tổng quát thu nhận chitin và sản xuất chitosan từ vỏ đầu tôm. .14
Hình 1.6. Quy trình sản xuất chitin, chitosan từ nguyên liệu vỏ đầu tôm bằng
phương pháp thuần túy hóa học của Robert, đại học Nottingham Trent (1998).......15
Hình 1.7. Quy trình lên men vỏ tôm thu nhận chitin của Bhaskar, viện nghiên cứu
công nghệ thực phẩm, Ấn Độ, 2010......... ................................................................17
Hình 1.8. Cơ chế hoạt động của enzyme chitin deacetylase.... ... ..............................21
Hình 2.1. Các mẫu thu thập sử dụng cho phân lập............ .... ...................................26
Hình 2.2. Quy trình các bước định danh sơ bộ chủng vi sinh vật............ ......... ........33
Hình 2.3. Quy trình sản xuất chitosan bằng chủng vi sinh vật thí nghiệm........ .. ....36
Hình 2.4. Nhớt kế Ostwald............. ..........................................................................44
Hình 3.1. Kết quả định tính enzyme chitin deacetylase...................................... ...... 48
Hình 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật chọn lọc............ . ...............49
Hình 3.3. Kết quả thử nghiệm khả năng thủy phân tinh bột............. ............. ...........50
Hình 3.4. Thử nghiệm khả năng sinh enzyme chitinase........ ...... .............................50
Hình 3.5. Kết quả khảo sát sự phân giải protein của chủng vi sinh vật.....................51
Hình 3.6. Chitosan được tạo thành từ các vi sinh vật............ .......... .........................54
Hình 3.7. Định tính chitosan bằng phương pháp Lugol/H2SO4... ..... ........................55
Hình 3.8. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của chitosan trên vi khuẩn .Coli... ...65
Hình 3.9. Ống vi khuẩn E.Coli sau 24h nuôi cấy không bổ sung chitosan....... ........66
Hình 3.10. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn chủng CD1............. ........ ...............66
Hình 3.11. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn chủng CD5.............. .......................67
Hình 3.12. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn chủng CD10............. ... ..................68

1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Như chúng ta đã biết về chitin – chitosan, đây là một loại polysaccharide tự
nhiên và chiếm tỉ lệ rất lớn, chỉ sau cellulose. Bên cạnh đó chitosan cũng có nhiều
ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau rất hiệu quả và thân thiện với môi trường.
Tuy nhiên để có được nguồn nguyên liệu chitin – chitosan thì đòi hỏi phải có một
quy trình xử lý hiệu quả, bản chất chung của việc sản xuất chitin – chitosan là khử
các thành phần khoáng và hàm lượng protein còn dư thừa trong phế liệu vỏ tôm sẽ
cho ra chitin từ đó tiếp tục sử dụng kiềm mạnh ở nhiệt độ cao để cắt các gốc acetyl
nhằm chuyển chitin thành chitosan. Hiện nay người ta sử dụng phương pháp hóa
học để xử lý, quá trình này sử dụng kiềm mạnh ở nhiệt độ cao trong thời gian dài,
mang tới những nhược điểm như tiêu thụ nhiều năng lượng, lãng phí lượng lớn
kềm, khó xử lý, ăn mòn thiết bị, ô nhiễm môi trường,…
Do đó, việc ứng dụng sinh học mà ở đây là sử dụng vi sinh vật vào quy trình
sản xuất nhằm làm tăng chất lượng, hạ giá thành sản phẩm và thân thiện với môi
trường là một việc làm quan trọng và thiết yếu. Việc áp dụng vi sinh vật sẽ giúp
hoàn toàn loại bỏ những nhược điểm mà phương pháp hoá học hiện nay đang mắc
phải và gia tăng chất lượng sản phẩm chitosan tạo thành.
2. Tính cấp thiết của đề tài
Chitosan, N-deacetylase dẫn xuất của chitin, hòa tan trong dung dịch acid, và
có một phạm vi sử dụng rộng, như một loại thuốc trừ sâu tự nhiên (Thome & Văn
Daele, 1986), một tác nhân kháng khuẩn (Liu et al., 2004; Liu et al., 2004), một
polymer sinh học cho kim loại (Wan et al., 2004), chất xử lý môi trường như một
tác nhân kết bông, hoặc kết tủa chất bẩn. Hiện nay, deacetylation của chitin để tạo
thành chitosan thường đạt được bằng nhiệt hóa học để loại bỏ các nhóm acetyl. Quá
trình này sử dụng kiềm mạnh ở nhiệt độ cao trong thời gian dài. Tuy nhiên, phương

pháp này có năm nhược điểm quan trọng bao gồm:
(1) Tiêu thụ một lượng đáng kể năng lượng;
(2) Lãng phí một lượng lớn kiềm, dẫn đến sự gia tăng về mức độ ô nhiễm môi
trường và làm tăng giá thành sản phẩm;


2

(3) Các sản phẩm có một loạt các khối lượng phân tử và không đồng nhất mức
độ deacetylation;
(4) Vấn đề thu hồi và xử lý hoá chất;
(5) Điều kiện làm việc với hóa chất (NaOH 50%) ở nhiệt độ cao dễ gây ăn
mòn thiết bị, làm giảm chất lượng Chitosan do làm giảm hoạt tính của nhóm chức –
NH2.
Do đó việc ứng dụng sinh học mà ở đây là sử dụng enzyme chitin deacetylase
vào quy trình sản xuất nhằm làm tăng chất lượng, hạ giá thành sản phẩm và thân
thiện với môi trường là một việc làm quan trọng và thiết yếu. Việc áp dụng enzyme
sẽ giúp hoàn toàn loại bỏ những nhược điểm mà phương pháp hoá học hiện nay
đang mắc phải và gia tăng chất lượng sản phẩm chitosan tạo thành.
3. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập, sàng lọc vi sinh vật sinh enzyme chitin deacetylase.
Khảo sát khả năng chuyển hóa chitin thành chitosan bằng các chủng sàng
lọc.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
-

Thu thập mẫu phân lập.

-

Tăng sinh chọn lọc vi sinh vật.

-

Phân lập chủng vi sinh vật thuần khiết từ các nguồn mẫu.

-

Sàng lọc khả năng sinh tổng hợp CDA của các chủng phân lập.

-

Khảo sát vi sinh vật sàng lọc và định danh.

-

Thử nghiệm chuyển hóa chitin thành chitosan, sử dụng môi trường lên men

cơ bản nuôi cấy các chủng sàng lọc.
-

Khảo sát ảnh hưởng của nguồn C, N, khoáng đến hiệu suất thu hồi chitosan

và chất lượng chitosan tạo thành (độ deacetyl, độ hòa tan).
-

Tăng hiệu suất thu hồi bằng cách tăng nồng độ acid acetic hòa tan chitosan.

-

Tăng hiệu suất thu hồi bằng cách thay đổi các nguồn cơ chất cảm ứng.

-

Khảo sát tính chất chitosan tạo thành bằng phương pháp sinh học so sánh với

chitosan sản xuất bằng phương pháp hóa học và chitosan thương mại
-

Đề nghị quy trình sản xuất chitosan từ chitin bằng phương pháp sinh học.


3

5. Phương pháp nghiên cứu
 Phương pháp tổng hợp tài liệu
-

Thu thập, tìm hiểu các tài liệu tham khảo, sách, giáo trình và internet liên

quan đến đề tài.
-

Tổng hợp, lựa chọn các tài liệu liên quan đến mục tiêu của đề tài.

 Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh
chitin deacetylase
 Phương pháp định tính chitin deacetylase
 Phương pháp đánh giá khả năng sản xuất chitosan của các chủng vi sinh vật
 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu

-

Ghi nhận số liệu trực tiếp từ các thí nghiệm bố trí khảo sát.

-

Xử lý số liệu bằng phần mềm Statistical Analysis System (SAS) 9.4 và

Microsoft Excell 2010.
6. Các kết quả đạt được của đề tài
-

Tuyển chọn được chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme chitin

deacetylase ứng dụng sản xuất chitosan.
-

Thiết lập được quy trình công nghệ chuyển hóa chitin thành chitosan sử dụng

vi sinh vật tuyển chọn.
-

Chất lượng chitosan thu được bằng phương pháp chuyển hóa sinh học tương

đương chitosan hóa học và chitosan thương mại.
7. Kết cấu của luận văn thạc sĩ
Phần mở đầu
Chương 1: Tổng quan tài liệu.
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên.
Chương 3: Kết quả và thảo luận.

Phần Kết luận và đề nghị.


4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về chitin
1.1.1. Giới thiệu
Chitin là một chuỗi dài polymer của một N-acetylglucosamine, một dẫn xuất
của glucose. Chitin có công thức hóa học (C8H13NO5)n trong đó C chiếm 47,29%, H
chiếm 6,45%, N chiếm 6,89% và O chiếm 39,37%. Về cấu trúc, chitin (còn gọi là
poly-[1,4-(N-acetyl-β-D-glucosamine)]) là một polysaccharide bao gồm các gốc Nacetyl-D-glucosamine [GlcNAc, còn gọi là (1,4)-2-acetamido-2-deoxy-β-Dglucose] gắn với nhau bằng liên kết β-1,4-O-glycoside.

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin
1.1.2. Tính chất vật lý
Ở dạng tự nhiên, chitin là một chất rắn màu trắng vô định hình, dai, có sợi,
phụ thuộc vào nguồn gốc và phương pháp thu nhận.
Trong dạng tinh khiết, không biến đổi của nó, chitin có tính mềm dẻo, đàn hồi,
và khá cứng rắn. Tuy nhiên, ở hầu hết các động vật chân đốt, nó thường bị thay đổi,
xảy ra phần lớn như là một thành phần của vật liệu composite, chẳng hạn như trong
sclerotin, tạo thành nhiều bộ xương ngoài của côn trùng. Kết hợp với canxi
cacbonat, như trong vỏ động vật giáp xác và nhuyễn thể, chitin tạo ra một hỗn hợp
mạnh hơn nhiều. Vật liệu composite này cứng hơn nhiều so với chitin nguyên chất,
ít giòn hơn canxi cacbonat tinh khiết.


5

1.1.3. Tính chất hóa học
Chitin là một polysaccharide có chứa nitơ, nó được tổng hợp từ các đơn vị của

N-acetyl-D-glucosamine. Các đơn vị này hình thành liên kết cộng hóa trị β-(1,4)
(tương tự như mối liên kết giữa các đơn vị glucose tạo thành cellulose). Vì vậy,
chitin có thể được mô tả như là cellulose với một nhóm hydroxyl trên mỗi monome
được thay thế bằng một nhóm acetyl amine. Điều này cho phép tăng liên kết hydro
giữa các polyme liền kề.

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học N-acety-D-glucosamine liên kết với nhau
bằng cầu nối β-(1,4)-glucoside
1.1.4. Tính chất sinh học
Là một vật thể màu trắng vô định hình không mùi. Trong tự nhiên chitin tồn
tại phổ biến trong vỏ ngoài của các loại nấm khuẩn, thực vật cấp thấp, các loại động
vật giáp xác như tôm, cua, côn trùng và trong màng tế bào của các động vật cao
cấp,…
Đây là một loại polymer mạch thẳng, trung tính, không tạo phản ứng hóa học,
không thay đổi trong dịch cơ thể, không phản ứng đào thải với cơ thể, không độc tố,
có tính kháng huyết khối.


6

1.1.5. Nguồn nguyên liệu thu nhận
Vỏ của tôm (tôm hùm, tôm thẻ), cua và các loài giáp xác ở biển là nguồn cung
cấp chitin tốt nhất.
1.1.6. Tình hình sản xuất và nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới
1.1.6.1. Tình hình sản xuất và nghiên cứu tại Việt Nam
Việc nghiên cứu, sản xuất chitin và các ứng dụng của chúng trong sản xuất,
phục vụ đời sống là một vấn đề tương đối mới ở nước ta. Vào những năm 1978 đến
1980, Trường đại học Thủy sản Nha Trang đã công bố quy trình sản xuất chitin –
chitosan của kỹ sư Đỗ Minh Phụng, nhưng chưa có ứng dụng cụ thể trong sản xuất.
Gần đây, trước yêu cầu xử lý phế liệu thủy sản đông lạnh đang ngày càng cấp bách,

trước những thông tin kỹ thuật mới về chitin – chitosan cũng như tiềm năng thị
trường của chúng đã thúc đẩy các nhà khoa học của chúng ta bắt tay vào việc
nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chitin – chitosan ở bước cao hơn, đồng
thời nghiên cứu các ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực sản xuất công nghiệp.
Hiện nay, Việt Nam có nhiều cơ sở khoa học đang nghiên cứu sản xuất chitin –
chitosan như: Trường đại học Nông lâm thành phố Hồ Chí Minh; Trung tâm nghiên
cứu polymer – Viện khoa học Việt Nam; Trung tâm công nghệ và sinh học thủy sản
– viện nghiên cứu và nuôi trồng thủy sản.
Hàng năm chitin được sản xuất ra khoảng 5,11 triệu tấn trên toàn thế giới.
Nhật và Mỹ là những nước sản xuất chitin lớn nhất. Ở Việt Nam, chitin chủ yếu là
phế phụ liệu dạng rắn với số lượng khổng lồ được thải ra hằng ngày từ ngành công
nghiệp chế biến và xuất khẩu thủy hải sản


7

1.1.6.2. Tình hình sản xuất và nghiên cứu trên thế giới
Trước đây, người ta đã thử chiết tách chitin từ thực vật biển nhưng nguồn
nguyên liệu không đủ để đáp ứng nhu cầu. Trữ lượng chitin phần lớn có nguồn gốc
từ vỏ tôm, cua. Trong một thời gian, các chất phế thải này không được thu hồi mà
lại thải ra ngoài gây ô nhiễm môi trường.
Năm 1972, hãng Kyowa Oid and Fat của Nhật lần đầu tiên đưa vào sản xuất
chitin.
Năm 1977, Viện kỹ thuật Masachusetts (Mỹ) khi tiến hành xác định giá trị của
chitin và protein trong vỏ tôm, cua đã cho thấy việc thu hồi các chất này có lợi nếu
sử dụng trong công nghiệp. Phần protein thu được sẽ dùng để chế biến thức ăn gia
súc, còn phần chitin sẽ được dùng như một chất khởi đầu để điều chế các dẫn xuất
có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực công nghiệp.
Sản lượng chitin năm 1990 trên thế giới là 1200 tấn. Nước sử dụng hàng đầu
là Nhật (600 tấn/năm) và Mỹ (400 tấn/năm). Ngoài ra các nước như Trung Quốc,

Ấn Độ, Pháp cũng đang triển khai thêm các cơ sở sản xuất quy mô 50 kg
chitin/ngày với giá bán là 200 – 300 France/kg. Ở Mỹ, hàng năm tổng giá trị về các
chế phẩm chitin – chitosan sử dụng là 355 triệu USD, trong đó 190 triệu thuộc
ngành y tế, sau đó nông nghiệp (54 triệu) và mỹ phẩm (50 triệu). Theo FAO, nhu
cầu chitin – chitosan có thể lên tới 36.700 tấn/năm trong thập kỷ tới.
Các phòng thí nghiệm của Malaysia và công nghiệp làm ngọt nước biển đã
thành lập công ty liên doanh Seafresh chitosan để khai thác khả năng cung cấp
thương phẩm các dẫn xuất của vỏ tôm. Công ty này đặc biệt quan tâm với chitin và
polysaccharide từ vỏ tôm thải bỏ và hướng hoạt động chính vào các thị trường xuất
khẩu.
Theo tiến sĩ Arisol Alimuniar – giám đốc kỹ thuật, ông hy vọng sản xuất
khoảng 150 – 180 triệu sản phẩm chitin – chitosan/năm góp phần cùng các nước sản
xuất chính khác như Nhật Bản, Mỹ, Na Uy, Canada và Nga.
Ngày nay, người ta tập trung vào các dẫn xuất của chitin và khả năng ứng
dụng của các dẫn xuất này. Toàn bộ quá trình hoạt động khoa học của R.A.A.
Muzzarelli (Đại học Y Khoa Ancona – Ý) tập trung vào chitin và dẫn xuất của nó.


8

Cho đến nay, trên thế giới đã có rất nhiều quy trình sản xuất chitin, với nhiều nguồn
nguyên liệu khác nhau, nhưng chủ yếu là vỏ tôm, cua, ghẹ.
1.1.7. Ứng dụng
Với kỹ thuật chế biến hiện đại, chitin và các dẫn xuất của chúng có một tiềm
năng to lớn đặc biệt là trong các lĩnh vực như y sinh học, dinh dưỡng, chế biến thực
phẩm, dược phẩm, vi sinh, nông nghiệp và mỹ phẩm. Chitin có thể ứng dụng làm
chất phụ gia trong thực phẩm, tạo độ bền dai cho thực phẩm thay thế một số chất
không cho phép (như hàn the…). Chitin làm chất mang trong cố định enzyme hay
cố định tế bào, làm chất mang tạo các giá thể trồng cây cảnh.
Các oligomer có nguồn gốc từ chitin cũng có hoạt tính kháng khối u, kháng

nấm, kháng khuẩn, là thành phần tạo nên glycolipid và glycoprotein có vai trò quan
trọng trong sinh học và nhiều ứng dụng khác
1.2. Sơ lược về chitosan
1.2.1. Giới thiệu
Chitosan là một polysaccharide mạch thẳng được cấu tạo từ các Dglucosamine (đơn vị đã deacetyl hóa) và N-acetyl-D-glucosamine (đơn vị chứa
nhóm acetyl) liên kết tại vị trí β-(1,4). Nó được sản xuất từ quá trình xử lý vỏ các
loài giáp xác (ví dụ vỏ tôm, cua) với dung dịch kiềm NaOH.

Hình 1.3. Deacetyl hóa chitin thành chitosan
1.2.2. Tính chất hóa lý
Chitosan là một chất rắn, xốp, nhẹ, hình vảy, có thể xay nhỏ theo các kích cỡ
khác nhau. Có màu trắng hay vàng nhạt, không mùi vị, không tan trong nước, dung


9

dịch kiềm và acid đậm đặc nhưng tan trong acid loãng (pH 6,0 – 6,6) tạo dung dịch
keo trong, có khả năng tạo màng tốt, nhiệt độ nóng chảy 309ºC – 311ºC.Trọng
lượng phân tử trung bình: 100.000 – 1.200.000 dalton tùy loại

Hình 1.4. Công thức cấu tạo của chitosan
1.2.3. Tính chất sinh học
Vật liệu chitosan có nguồn gốc tự nhiên, không độc, dùng an toàn cho người.
Chúng có tính hòa hợp sinh học cao với cơ thể, có khả năng tự phân hủy sinh học.
Chitosan có nhiều ứng dụng đa dạng như: có khả năng hút nước, giữ ẩm, tính kháng
nấm, kháng khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích sự phát triển tăng sinh
của tế bào, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, tác
dụng cầm máu, chống sưng u.
Chitosan không những ức chế các vi khuẩn gram dương, gram âm, mà cả nấm
men và nấm mốc. Khả năng kháng khuẩn phụ thuộc vào một vài yếu tố như loại

chitosan sử dụng (độ deacetyl, khối lượng phân tử), pH môi trường, nhiệt độ, sự có
mặt của một số thành phần thực phẩm.
1.2.4. Các tính chất của chitosan (MargueriteRinaudo, 2006; Li et al., 1997;
Onsoyen E et al., 1990)
1.2.4.1. Mức độ deacetyl hóa
Mức độ deacetyl hóa là một đặc tính quan trọng của quá trình sản xuất
chitosan bởi vì nó ảnh hưởng đến tính chất hóa lý và khả năng ứng dụng của
chitosan sau này. Mức độ deacetyl hóa của chitosan vào khoảng 56 – 99% (nhìn
chung là 80%).
1.2.4.2. Trọng lượng phân tử Chitosan
Chitosan là polymer sinh học có khối lượng phân tử cao. Khối lượng chitin
thường lớn hơn 1 triệu Dalton trong khi các sản phẩm chitosan thương phẩm có
khối lượng khoảng 100.000 – 1.200.000 Dalton.
1.2.4.3. Độ nhớt