Phân lập và định danh vùng gen its của nấm men nhiễm bệnh trên da chó nuôi tại tp hồ chí minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VÙNG GEN ITS
CỦA NẤM MEN NHIỄM BỆNH TRÊN DA CHÓ NUÔI
TẠI TP. HỒ CHÍ MINH

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC- THỰC PHẨM- MÔI TRƯỜNG
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: Ts. Hoàng Quốc Khánh
Ngô Đức Duy
Sinh viên thực hiện:

Huỳnh Long Thủ

MSSV: 1051110154

Lớp: 10DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2014


LỜI CAM ĐOAN
Tôi tên Huỳnh Long Thủ, là sinh viên đại học chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học,
khóa 2010, tại trường Đại học Công Nghệ TP Hồ Chí Minh. Tôi xin cam đoan:
✓ Công trình nghiên cứu này do chính tôi thực hiện.
✓ Các số liệu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố ở các
nghiên cứu khác hay trên bất kỳ phương tiện truyền thông nào.

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về kết quả nghiên cứu trong Luận văn tốt
nghiệp của mình.

SINH VIÊN

Huỳnh Long Thủ


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
MỤC LỤC .......................................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. iv
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH .................................................................... v
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 4
1.1. Tình hình nuôi chó .................................................................................................. 4
1.1.1. Thống kê về số lượng chó trên thế giới ............................................................ 4
1.1.2. Tình hình nuôi chó ở Việt Nam ........................................................................ 5
1.2. Tổng quan về bệnh ngoài da ................................................................................... 6
1.2.1. Bệnh ngoài da trên chó .................................................................................... 6
1.2.2. Bệnh ngoài da của người ................................................................................. 7
1.3. Các tác nhân gây bệnh ............................................................................................ 7
1.3.1. Vi khuẩn ............................................................................................................ 7
1.3.1.1. Một số nhóm vi khuẩn gây bệnh ngoài da thường gặp ............................. 7
1.3.1.2. Các biểu hiện do nhóm vi khuẩn gây ra .................................................... 7
1.3.1.3. Khả năng lây lan sang người..................................................................... 8
1.3.2. Nấm men ........................................................................................................... 8
1.3.2.1. Các loài nấm men thường gây bệnh trên da chó ...................................... 8
1.3.2.2. Các biểu hiện bệnh do nhóm nấm men gây ra .......................................... 8

1.3.2.3. Khả năng lây lan sang người..................................................................... 9
1.3.3. Nấm sợi ............................................................................................................. 9
1.3.3.1. Một số nhóm nấm mốc gây bệnh thường gặp. .......................................... 9
1.3.3.2. Bệnh và các biểu hiện bệnh do các nhóm nấm mốc gây ra ...................... 9
1.4. Tổng quan về nấm men ......................................................................................... 10
1.4.1. Hình thái của tế bào nấm men ....................................................................... 10
1.4.2. Dinh dưỡng và sinh trưởng của nấm men ..................................................... 10

i


Đồ án tốt nghiệp

1.4.3. Sinh sản của nấm men .................................................................................... 11
1.4.4. Nấm men gây bệnh ......................................................................................... 12
1.5. Những nghiên cứu trên thế giới về nấm men gây bệnh ....................................... 12
1.6. Định danh nấm men .............................................................................................. 13
1.6.1. Định danh nấm men bằng phương pháp truyền thống .................................. 14
1.6.1.1. Quan sát các đặc điểm hình thái ............................................................. 14
1.6.1.2. Khảo sát các đặc tính sinh lí, sinh thái ................................................... 14
1.6.2. Định danh nấm men bằng sinh học phân tử .................................................. 15
1.6.2.1 Đoạn gen rDNA ........................................................................................ 15
1.6.2.2. Nhân gen và Kỹ thuật giải trình tự trong định danh loài ...................... 17
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................................ 19
2.1. Vật liệu và thiết bị ................................................................................................. 19
2.1.1. Dụng cụ........................................................................................................... 19
2.1.2. Thiết bị ............................................................................................................ 19
2.1.3. Vật liệu ............................................................................................................ 19
2.1.3.1. Nguồn phân lập ........................................................................................ 19
2.1.3.2. Hóa chất ................................................................................................... 20

2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 21
2.2.1. Phân lập nấm men gây bệnh .......................................................................... 21
2.2.2. Quan sát hình thái nấm men .......................................................................... 22
2.2.2.1. Quan sát tế bào nấm men ........................................................................ 22
2.2.2.2. Quan sát khuẩn ty thật khuẩn ty giả ........................................................ 23
2.2.3. Sử dụng sinh học phân tử định danh nấm men .............................................. 24
2.2.3.1. Tách chiết DNA ........................................................................................ 24
2.2.3.2. Điện di ...................................................................................................... 24
2.2.3.3. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) ........................................ 25
2.2.3.4. Giải trình tự và định danh mẫu nấm men ............................................... 29

ii


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ................................................................... 33
3.1. Kết quả hình thái học nấm men ............................................................................ 33
3.1.1 Kết quả khuẩn lạc ............................................................................................ 33
3.1.2. Kết quả hình ảnh tế bào sinh dưỡng .............................................................. 34
3.1.3. Kết quả quan sát tế bào sinh sản ................................................................... 35
3.1.4. Kết quả quan sát khuẩn ty .............................................................................. 35
3.2. Kết quả li trích, thu nhận và nhân bản đoạn gen ITS rDNA của nấm men ......... 36
3.2.1. Kết quả ly trích và thu nhận bộ gen của nấm men ........................................ 36
3.2.2. Kết quả nhân bản đoạn gen bảo tồn ITS rDNA của nấm men ...................... 36
3.3. Kết quả so sánh vùng gen bảo tồn ITS rDNA của nấm men trên ngân hàng gen
NCBI và thiết lập cây phân loài ................................................................................... 37
3.3.1. Kết quả Giải trình tự vùng gen ITS rDNA của 4 mẫu nấm men ................... 37
3.3.2. Kết quả so sánh trình tự ITS rDNA trên ngân hàng gen NCBI và xây dựng
cây phân loài............................................................................................................. 39

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................... 43
4.1. Kết luận ................................................................................................................. 43
4.2. Đề nghị .................................................................................................................. 43
Tài liệu tham khảo ........................................................................................................... 45

iii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Bp

Base Pair

DNA

Deoxyribonucleotide Acid

EDTA

Ethylene- diamine-Tetraacetic-Acid

PCR

Polymerase Chain Reatio

PDA

Potato Dextrose Agar

TAE

Tris-Acetic acid- Ethylenediamine- Tetraacetae

TE

Tris- Ethylenediamine- Tetraacet

iv


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH
Bảng
Bảng 1.1 Phát hiện về nấm men gây bệnh từ năm 1989 đến 1993…………..………..13
Bảng 1.2 Internal transcribed spacer region (ITS region, including the 5.8S gene)…..17
Bảng 3.1 Hình ảnh kết quả hình thái khuẩn lạc ………………………………………33
Bảng 3.2 Hình ảnh tế bào sinh dưỡng…………………………………………………34
Bảng 3.3 Hình ảnh tế bào sinh sản của nấm men……………………………………...35
Bảng 3.4 Hình ảnh quan sát khuẩn ty …………………………...……………..……..35
Hình ảnh
Hình 1.1 Bảng đồ primer ITS……………………………………………..…………..17
Hình 3.1 Kết quả kiểm tra ly trích bộ gen của 4 mẫu nấm men………..……………..36
Hình 3.2 Kết quả sản phẩm PCR ……………………………………….…………….37
Hình 3.3 Kết quả sản phẩm PCR M23-2 ……………………………………..………37
Hình 3.4 Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự vùng gen ITS rDNA của các
chủng nấm men phân lập( M9-1, M9-5, M11-1, M23-2) và các loài nấm men trong

ngân

hàng

gen……………………………………………………………………………………..39

v


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Chó là người bạn thân thiết của con người, con người tiếp xúc với chó gần như
là mọi lúc, dù là trực tiếp hay gián tiếp. Chính vì thế mà việc lây nhiễm những căn
bệnh nguy hiểm của chó sang người là một vấn đề đáng quan tâm. Hiện nay, khi nhu
cầu sở hữu một con chó làm thú cưng của con người ngày càng cao, về đa dạng, chủng
loài và số lượng ngày càng nhiều, cùng với điều kiện nuôi đa dạng cho nên có nhiều
hơn căn bệnh xuất hiện trên chó và có khả năng lây lan sang người.
Trong các căn bệnh dễ lây lan sang người thì các căn bệnh ngoài da trên chó là
những bệnh dễ tấn công sang người nhất. Vì chỉ cần thông qua tiếp xúc trực tiếp hay
gián tiếp, và trong một điều kiện thích hợp thì con người cũng bị lây nhiễm.
Có nhiều tác nhân gây bệnh ngoài da trên chó, trong đó nấm men cũng là một
tác nhân quan trọng có thể gây nên những hậu quả nghiêm trọng cho chó và cả con
người. Vì thế để xác định được các loài nấm men đó thì trong khóa luận này sẽ tiến
hành phân lập và bước đầu định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử trên vùng gen ITS
rDNA nhằm xác định một số chủng nấm men nhiễm bệnh da trên chó nuôi tại thành
phố Hồ Chí Minh.
2. Mục đích nghiên cứu
✓ Cung cấp những thông tin chính xác về một số chủng nấm men nhiễm bệnh da

trên chó cũng như khả năng lây lan của chúng sang con người, nhằm tăng khả
năng điều trị và phòng ngừa lây lan khi chó bị nhiễm những loại nấm men trên.

1


Đồ án tốt nghiệp

✓ Tạo nguồn giống nấm men thuần cho những nghiên cứu chuyên sâu về bệnh học
của các loài nấm men đã định danh được.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
✓ Phân lập được một số nấm men nhiễm bệnh da trên chó nuôi tại thành phố Hồ
Chí Minh.
✓ Định danh nấm men bằng phương pháp sinh học phân tử dựa trên việc giải trình
tự đoạn gen ITS rDNA của nấm men.
✓ Bước đầu xác định khả năng gây bệnh của các loài nấm men đã định danh dựa
trên các nghiên cứu trên thế giới.
4. Phương pháp nghiên cứu
✓ Sử dụng phương pháp sinh học phân tử giải trình tự đoạn gen bảo tồn ITS rDNA
của nấm men để định danh nấm men.
✓ Các tài liệu phục vụ nghiên cứu được tham khảo từ các nghiên cứu, các bài báo
khoa học, các luận văn khoa học được sưu tầm trên internet.
✓ Đề tài có sử dụng các phần mềm: BioEdit 7.2.5.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4
4.32.0.0
✓ Ngân hàng gen />5. Các kết quả đạt được
Sau quá trình nghiên cứu đề tài đã phân lập và định danh được 4 loài nấm men, dựa
trên các nghiên cứu trên thế giới thì bước đầu nhận định cả 4 loài nấm men này đều có
khả năng gây bệnh nguy hiểm trên chó và cả con người.
6. Kết cấu đề tài
Đề tài gồm 4 chương

2


Đồ án tốt nghiệp

Chương 1: Tổng quan tài liệu
Trình bày những thông tin liên quan đến chó, nấm men và các thông tin về phương
pháp sinh học phân tử đã được sử dụng trong định danh nấm men.
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Trình bày toàn bộ những nguyên vật liệu, địa điểm, máy móc thiết bị phục vụ nghiên
cứu và toàn bộ các quy trình, thao tác thực hiện các phương pháp nghiên cứu.
Chương 3: Kết quả và biện luận
Trình bày những kết quả chi tiết của toàn bộ quá trình thực hiện nhiên cứu.
Chương 4: Kết luận và đề nghị
Tổng kết lại những kết quả nghiên cứu đã đạt được và đưa ra những đề nghị liên quan
nhằm hoàn thiện đề tài.

3


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nuôi chó
Ngay từ thời tiền sử, khi loài người còn phải sống bằng các phương thức săn bắt,
hái lượm, sống trong hang động. Khi tìm ra lửa, con người đã biết chế biến thức ăn đầu
tiên bằng phương pháp nướng thịt thú rừng và sản phẩm thừa là xương động vật, đó là
món khoái khẩu của chó rừng, một loài động vật có khứu giác rất phát triển. Đó chính
là nguyên nhân khiến loài người và loài chó "tiếp cận" với nhau và cùng chung sống.

Chó nhờ vào bản năng tự nhiên rất thính tai, thính mũi, có thể tìm ra được dấu vết cũng
như khả năng nhìn trong bóng đêm rõ hơn con người, rất tỉnh ngủ, có trí thông minh và
dễ huấn luyện.Vì thế con người đã sớm biết sử dụng chó để bảo vệ cho mình. Chó lại
là một giống vật có tình nghĩa nhất khi so sánh với các con vật khác đã sống gần gũi
với con người như trâu, bò, ngựa v.v…
1.1.1. Thống kê về số lượng chó trên thế giới
Số lượng chó được con người nuôi trên thế giới là một con số thống kê rất khó
để đạt độ chính xác cao, vì ở một số quốc gia đặc biệt các quốc gia ở châu Á và châu
Phi thì chó được nuôi một cách tự do, có nghĩa là không có bất cứ một hệ thống quản
lý nào nhằm quản lý và kiểm soát số lượng chó của người dân.
Tuy nhiên trong một nỗ lực nghiên cứu thị trường, nhằm đánh giá tiềm năng của
ngành công nghiệp sản xuất thực phẩm vật nuôi của Mỹ, đã đưa ra được một số thống
kê sơ bộ về số lượng chó trên thế giới.
Theo đó Mỹ là quốc gia đứng đầu về số lượng chó mà người dân họ sở hữu, với
42,5 triệu hộ gia đình ở Mỹ nuôi một hoặc nhiều con chó và tổng số chó trong cả nước
là 73 triệu con. Canada có 6 triệu con chó. [1]
Các nước Tây Âu cũng sở hữu 43 triệu con trong đó: đứng đầu là Pháp 8,8 triệu
con chó, cả Ý và Balan có 7,5 triệu, Anh có 6,8 triệu. Ở Đông Âu, Nga hiện có 12 triệu

4


Đồ án tốt nghiệp

con chó trong khi Ukraina cũng có 5,1 triệu con chó. Ở Nam Mỹ thì Brazil với 30 triệu
con, Argentina 6,5 triệu con, Columbia 5 triệu con. [1]
Ở châu Á và châu Úc thì việc thống kê số lượng chó gặp nhiều khó khăn khi
việc đăng ký sở hữu chó là một điều không cần thiết ở nhiều quốc gia trên châu lục
này. Nhưng theo ước tính Trung Quốc có khoảng 110 triệu con chó, Ấn Độ có khoảng
32 triệu con, Úc khoảng 4 triệu con. Các con số trên là chưa tính tới số lượng chó sống

tự do và đi hoang. Tuy nhiên, Nhật Bản lại là quốc gia thuộc châu Á quản lý chặt chẽ
nhất số lượng chó nuôi của người dân theo ước tính là khoảng 9,5 triệu con. [1]
Ở châu Phi, theo những thống kê của tổ chức Y tế thế giới về số lượng chó
nhằm kiểm soát bệnh dại trên người đang gia tăng, thì có khoảng 78 triệu con chó trên
toàn châu lục và trong số đó có tới 70 triệu con là chó hoang vô chủ. [1]
1.1.2. Tình hình nuôi chó ở Việt Nam
Ở Việt Nam, việc nuôi chó mèo và chim cảnh trong gia đình đã có từ lâu đời. Hầu
như trong mỗi gia đình nào của người dân nước ta cũng đều nuôi chó và mèo, với chức năng
chính là bảo vệ, diệt chuột… Ngày nay, khi nền kinh tế đã tương đối phát triển, nghề nuôi
chim, thú cảnh trong nhà càng phát triển, nhất là ở các thành phố lớn.
Gần đây, ở nước ta việc sử dụng chó nghiệp vụ vào công tác an ninh quốc
phòng đã và đang phát triển theo nhu cầu bảo vệ các xí nghiệp, cơ quan, cơ sở nông
nghiệp, kho tàng và mục tiêu quân sự. Số người yêu thích chó nghiệp vụ và chó làm
cảnh ngày một tăng. Vì vậy số lượng chó béc giê và các giống chó cảnh châu Âu trong
các gia đình, nhất là ở thành phố lớn ngày càng tăng.
Việc chăn nuôi chó nghiệp vụ tập trung ở các trường huấn luyện nghiệp vụ và
chó cảnh trong các gia đình, trong những năm qua gặp rất nhiều khó khăn, khó khăn
nhất là dịch bệnh làm chó chết. Vì vậy số lượng chó nghiệp vụ và chó cảnh tăng lên rất
chậm.

5


Đồ án tốt nghiệp

Nước ta có 2 trung tâm chăn nuôi giống chó nghiệp vụ thuần là giống chó của
Nga và Đức. Bên cạnh đó, có một số địa phương chú ý phát triển giống chó nghiệp vụ
lai có chất lượng tốt.
Ngày 19-01-2009, Bộ Nội vụ đã ban hành quyết định số 71 QĐ/BNV về việc
thành lập Hiệp hội nuôi chó giống Việt Nam (Vietnam kennel Association-VKA).

Về việc quản lý số lượng chó thì ở Việt Nam gần đây cũng đã đưa ra một quyết
định, trong đó quy định chủ sở hữu chó phải đến UBND để đăng ký và được cấp số
(Quyết định số 2891/QĐ-BNN-TY ngày 14/11/2012 của Bộ Nông nghiệp và phát triển
nông thôn về phê duyệt kế hoạch khống chế và loại trừ bệnh dại năm 2012) [32]. Tuy
nhiên cũng như một số nước ở châu Á thì người dân vẫn có tâm lý rất thoải mái trong
việc nuôi và sở hữu chó và thường không quan tấm tới các điều lệ về việc nuôi và sở
hữu chó.
1.2. Tổng quan về bệnh ngoài da
1.2.1. Bệnh ngoài da trên chó
Chó là vật nuôi rất gần gũi với con người và được cho là trung thành nhất với
con người. Tuy nhiên nếu việc chăm sóc người bạn này không tốt thì chúng rất dễ mắc
bệnh. Cũng giống con người, chó rất dễ mắc một số bệnh về đường tiêu hóa dẫn đến
các triệu chứng như tiêu chảy, chán ăn, tụt cân. Chó cũng dễ mắc các bệnh về hô hấp
với các triệu chứng tương tự con người như sổ mũi, nghẹt mũi khó thở. Và chó cũng
thường xuyên mắc các căn bệnh nghiêm trọng liên quan đế nội tạng như gan, phổi, tim
hay các bệnh về xương khớp v.v….
Trong các căn bệnh thường gặp ở chó có thể nói căn bệnh đáng lo ngại nhất đối
với con người là các căn bệnh ngoài da ở chó. Vì con người thường xuyên gần gũi và
tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp với chó nên việc một con chó bị bệnh ngoài da là một
điều đáng lo ngại vì tính chất lây lan của các căn bệnh đó.

6


Đồ án tốt nghiệp

Các bệnh ngoài da tuy ít ảnh hưởng đến tính mạng của chó nhưng chúng lại gây
ra những tổn thương nghiêm trọng trên cơ thể chó và có nguy cơ ảnh hưởng đến con
người.
Các triệu chứng thường thấy cục bộ ở các vùng da như: rụng lông, đỏ tấy có

chảy nước dịch hoặc dịch mủ màu vàng, da dầy hóa bì, loét sùi. Con vật khó chịu, ngứa
ngáy hay gãi, kêu rên, thần kinh không ổn định, lở loét ở vùng cổ, chân, kẻ móng, mũi,
mặt, tai. Có mùi hôi tanh khó chịu.
1.2.2. Bệnh ngoài da của người
Là những bệnh thường gặp do nhiều tác nhân gây ra, bệnh thường chỉ gây
thương tổn trên da và rất ít gây nguy hiểm đến tính mạng. Một số bệnh thường gặp là:
ghẻ, nấm cạn, nhiễm trùng da thông thường, mụn trứng cá, chàm, vẩy nến, luput đỏ,
bệnh lao da.
1.3. Các tác nhân gây bệnh
1.3.1. Vi khuẩn
1.3.1.1. Một số nhóm vi khuẩn gây bệnh ngoài da thường gặp
Các tác nhân gây bệnh ngoài da trên chó thường thuộc các nhóm:
Staphylococcus, Micrococcus, Bacillus , Escherichia, Pseudomonas, Proteus.
1.3.1.2. Các biểu hiện do nhóm vi khuẩn gây ra
Các nhóm vi khuẩn trên thường gây nên các triệu chứng về viêm bề mặt da của
chó. Trong điều kiện bình thường da chó luôn có cơ chế để vô hiệu hóa các vi khuẩn
cũng như các yêu tố vi sinh vật gây bệnh khác. Nhưng trong trường hợp da bị tổn
thương do va chạm cơ học tạo chỗ hở trên bề mặt da làm thay đổi điều kiện sinh lý trên

7


Đồ án tốt nghiệp

bề mặt da, lúc đó các vi sinh vật gây bệnh sẽ dễ dàng xâm nhập, gây bệnh trên da chó
và có một số biểu hiện của viêm da do vi khuẩn như sau:
Viêm da mủ bề mặt: là những dấu hiệu trên bề mặt đặc trưng bởi vết loét và xói mòn,
bao gồm viêm da ẩm cấp tính (viêm da chấn thương) và viêm da nếp gấp (hăm da).
[33]
Viêm da mủ cạn: bao gồm những phần trên bề mặt của nang lông và biểu bì kể cả

bệnh chốc lở (viêm da mủ trên chó con) và viêm nang lông do vi khuẩn bề mặt (mụn
mủ với phần lông lồi ra). [33]
Viêm da mủ sâu: bao gồm những phần dưới của nang lông và chân bì kể cả viêm nang
lông sâu, mụn nhọt và viêm mô tế bào, như viêm mủ mũi, mụn trên chó, viêm bì móng.
[33]
1.3.1.3. Khả năng lây lan sang người
Các loại vi khuẩn trên thường có khả năng lây lan từ chó sang người. Và một
điều đáng quan tâm là những tổn thương do chúng gây ra khi lây lan sang người còn
nguy hiểm hơn trên chó như staphylococcus aureus gây các bệnh mụn nhọt ngoài da,
viêm phổi, áp xe phổi, nhiễm khuẩn huyết. Bệnh rất nặng, rất dễ gây tử vong. Các vi
khuẩn như Proteus vulgaris có khả năng gây nên các bệnh trên đường tiểu như viêm
cầu thận, sỏi thận cấp, viêm bàng quang , v.v…
1.3.2. Nấm men
1.3.2.1. Các loài nấm men thường gây bệnh trên da chó
Các loài nấm men Melasezia vàCandida là 2 loài được xác định thường xuyên nhất
trong các trường hợp chó bị bệnh ngoài da. [2]
1.3.2.2. Các biểu hiện bệnh do nhóm nấm men gây ra

8


Đồ án tốt nghiệp

Bệnh biểu hiện đặc trưng bởi những vẩy trắng, hay màng giả trên niêm mạc
miệng hay lưỡi, đôi khi lan cả đến môi, bệnh tích thường nổi lên với sự sung huyết ở
xung quanh và bên ngoài còn ở dưới thì loét, những bệnh tích này có thể lan tràn đến
hầu hoặc thực quản.
1.3.2.3. Khả năng lây lan sang người
Loài nấm men Candida có thể lây lan sang người thông qua tiếp xúc gián tiếp
hay trực tiếp. Khi lây sang người chúng có khả năng gây ra các tổn hại giống như ở

chó. Ngoài ra chúng còn có khả năng gây tổn thương cho cơ quan sinh dục của người.
Đặc biệt khi gây bệnh trên cơ thể người bị suy giảm miễn dịch (người bị nhiễm
HIV, đang điều trị ung thư, cấy gép tủy) thì chúng trở thành nguyên nhân gây tử vong
hàng đầu bởi những thương tổn lan toàn thân mà chúng gây ra.
1.3.3. Nấm sợi
1.3.3.1. Một số nhóm nấm mốc gây bệnh thường gặp.
Các nhóm nấm mốc gây bệnh ngoài da thường được phân lập trên da và lông chó là:
Aspergillus, Microsporum, Trichophyton, Epidermophyton.[3]
1.3.3.2. Bệnh và các biểu hiện bệnh do các nhóm nấm mốc gây ra
Chúng thường gây bệnh ở hốc mũi của chó. Chó bị nhiễm khi bị thương hoặc hít
phải dị vật. Khi bị nhiễm nấm này sẽ sinh trưởng và sinh ra độc tố phá hủy lớp niêm
mạc trong mũi, hình thành khối u sưng phòng, kèm theo các triệu chứng như viêm mũi,
viêm xoang. Nếu bệnh kéo dài sẽ dẫn đến tử vong do gây tổn thương lên não [4]. Các
nhóm nấm này gây rụng từng mảng lông, gãy sợi lông, nhất là vùng mặt, tai, ngứa ngáy

9


Đồ án tốt nghiệp

khó chịu, hay dùng móng gãi tai. Bệnh diễn biến chậm, lâu ngày gây viêm da bội
nhiễm, viêm thận, nhiễm trùng máu và tử vong.
1.4. Tổng quan về nấm men
Nấm men là vi sinh vật nhân thực, là một phần trong giới nấm với hơn 1500 loài
đã được phát hiện. Tuy nhiên, theo ước tính thì con số đó chỉ chiếm 1% trong giới nấm
đang tồn tại trên trái đất[5]. Đa số nấm men là đơn bào và một số loài còn có khả năng
hình thành các chuỗi liên kết đa bào được gọi là khuẩn ty thật và khuẩn ty giả [6]. Nấm
men có kích lớn hơn rất nhiều so sới các cộng đồng vi sinh khác.
Nấm men có thể có lợi hoặc gây bệnh cho con người, chúng có mặt ở khắp mọi
nơi và hiện diện nhiều nhất ở những nơi giàu nguồn đường như trái cây, một số loài

còn được tìm thấy trong đất, trên cơ thể động vật, côn trùng. [7]
1.4.1. Hình thái của tế bào nấm men
Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật. Tế bào nấm men thường
lớn gấp 10 lần so với tế bào vi khuẩn. Kích thước khoảng từ 2.5µm-10µm, do đó có thể
quan sát rõ được dưới kính hiển vi quang học.
Tùy loài nấm men mà tế bào có hình cầu, hình tròn, hình ô van, hình elip, hình
thoi, hình chai, hình quả lê …
Tuy nhiên hình dạng nấm men hầu như không ổn định, phụ thuộc vào tuổi của
nấm men và điều kiện nuôi cấy. Saccharomyces cerevisiace có hình bầu dục khi nuôi ở
môi trường giàu dinh dưỡng, còn nuôi trong điều kiện yếm khí thì nó có hình tròn, và
ngược lại khi nuôi trong môi trường có oxy thì tế bào có hình thon dài.
1.4.2. Dinh dưỡng và sinh trưởng của nấm men
Nấm men là nhóm vi sinh vật hóa dị dưỡng hữu cơ. Chúng sử dụng các hợp chất
hữu cơ như là nguồn năng lượng duy nhất và không cần ánh sáng để phát triển. Những
loại đường mà nấm men dễ sử dụng nhất là các đường đơn như glucose, fructose, hoặc

10


Đồ án tốt nghiệp

các đường đôi như saccharose, maltose, một vài loài còn có khả năng sử dụng các
đường pentose, rượu và các hợp chất acid hữu cơ. [8]
Hô hấp nấm men là hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi. Không giống như vi
khuẩn nấm men không thể phát triển trong môi trường kỵ khí bắt buộc [8]. Nấm men
sinh trưởng tốt trong môi trường trung tính hoặc hơi chua. Một số chủng nấm men có
thể sinh trưởng ở độ cồn lên đến 10-11%.
Các loài nấm men khác nhau thì có phạm vi nhiệt độ sinh trưởng khác nhau, có
những loài có thể sống ở -2oC cũng có những loài có thể đạt ngưỡng 45oC.
Chủng Leucosporidium frigidum phát triển ở -2 đến 20°C, Saccharomyces telluris ở 535°C, và Candida slooffi tại 28-45°C [9]. Các tế bào có thể tồn tại trong điều kiện đông

lạnh nhất định, với khả năng giảm theo thời gian.
Trong phòng thí nghiệm nấm men được nuôi cấy và phát triển tốt trên các môi
trường giàu nguồn đường như: Potato Dextrose Agar (PDA), Yeast Peptone Dextrose
Agar(YPD), Sabouraud Agar…
1.4.3. Sinh sản của nấm men
Nấm men giống như tất cả các loại nấm, có thể sinh sản vô tính và hữu tính.
Nhưng hình thức phổ biến nhất là sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi [10]. Nhân của
tế bào mẹ chia tách thành một nhân con (nhân hoàn chỉnh) và di chuyển đến tế bào
con. Chồi tiếp tục phát triển cho đến khi nó tách ra từ tế bào mẹ, tạo thành một tế bào
mới [11]. Các tế bào còn được tạo ra qua hình thức sinh sản này thường nhỏ hơn tế bào
mẹ. Cũng có một số loài nấm men sinh sản bằng hình thức phân bào và tạo ra hai tế
bào con gần bằng nhau về kích thước. [10]
Trong điều kiện môi trường nghèo dinh dưỡng các tế bào đơn bội sẽ chết, tuy
nhiên trong cùng điều kiện đó, các tế bào lưỡng bội có thể sống sót nhờ tiếp hợp với
nhau (sinh sản hữu tính) tạo thành hợp tử và các hợp tử phân chia thành các bào tử nằm
11


Đồ án tốt nghiệp

trong nang sau đó sẽ được phát tán ra ngoài khi nang chín. Nếu 2 tế bào nấm men có
hình thái kích thước giống nhau tiếp hợp với nhau thì được gọi là tiếp hợp đẳng giao.
Nếu 2 tế bào nấm men khác nhau thì gọi là tiếp hợp dị giao.
1.4.4. Nấm men gây bệnh
Một số loài nấm men là tác nhân gây bệnh cơ hội có thể gây nhiễm trùng ở
những người bị tổn thương hệ thống miễn dịch. Cryptococcus neoformans và
Cryptococcus gattii là tác nhân gây bệnh quan trọng của suy giảm miễn dịch người.
Chúng là nguyên nhân gây ra hơn 600.000 ca tử vong cho những người đang điều trị
HIV/AIDS [12]. Các tế bào được bao quanh bởi các nang khuẩn polysaccharide giúp
chúng tránh bị phát hiện và tấn công bởi các tế bào bạch cầu. [13]

Các nấm men thuộc chi Candida là một nhóm các tác nhân gây bệnh cơ hội
thường gây ra các tác động bệnh lý lên miệng hoặc cơ quan sinh dục. Candida được
tìm thấy như một vi sinh vật hội sinh sống trong các vùng nhầy và ẩm ướt trên cơ thể
người và động vật máu nóng. Khi xâm nhập vào niêm mạc các tế bào nấm men nảy
mầm gây kích ứng và biến đổi các mô gây nên các triệu chứng bệnh lý.
1.5. Những nghiên cứu trên thế giới về nấm men gây bệnh
Trong thế kỷ thứ năm trước Công nguyên, Hippocrates đã mô tả bệnh tưa miệng
[14] và chính vì vậy ông được coi là người đầu tiên mô tả một triệu chứng nhiễm trùng
nấm men.
Đến năm 1839 nhờ sự xuất hiện của kính hiển vi và những nghiên cứu của
Langenbeck và sau đó là Berg Gruby đã chứng minh Candida albicans là một tác nhân
nấm men gây bệnh và ảnh hưởng đến tính mạng. Chúng là nấm men điểm hình được
phân lập từ bệnh phẩm của những người bị bệnh. [15]
Đến những năm 1960 với sự ra đời của các phương pháp điều trị ung thư, các
biện pháp điều trị kháng sinh, đã vô tình làm bùng phát và tăng nguy cơ nhiễm trùng

12


Đồ án tốt nghiệp

nấm men nghiêm trọng. (Candida được chứng minh là ra các triệu chứng nhiểm trùng ở
những người suy giảm miễn dịch). [16]
Bảng 1.1 Phát hiện về nấm men gây bệnh từ năm 1989 đến 1993.
Các chủng phát hiện

Năm
1989

Malassezia vàTrichosporon là nấm bệnh cơ hội ngày càng được phát hiện

nhiều hơn. [17]

1989

C. tropicalis, Malassezia spp, Hansenulaspp,T. beigelii. [18]

1989

Phổ của nấm men kết hợp với ung thư có nhiều sự thay đổi bao gồm
T. beigelii, Saccharomyces spp, Torulopsis pintolopesii,
Pichiafarinosa, và Rhodotorula spp. [19]

1992

Các báo cáo về Saccharomyce,Hansenula,
Rhodotorula và Malassezia spp. Và C. glabrata. [20]

1993

Kết quả theo dõi từ năm 1980-1990 số ca nhiễm nấm C. albicans tăng từ
(52%-60%), các loài khác giảm (21%-16%). [21]

1993

So sánh kết quả phân lập 15 tháng (1991-1992) với cùng kỳ (1987-1988)
C. glabrata tăng gấp đôi, C. krusei tăng nhẹ; Tỷ lệ C. guilliermondii, C.
lipolytica, và C. kefyrtăng. [22]

1.6. Định danh nấm men
Có hai phương pháp để định danh nấm men là phương pháp truyền thống và

phương pháp sinh học phân tử. Hiện nay, phương pháp được dùng nhiều nhất là sử
dụng sinh học phân tử vì những ưu điểm như nhanh chóng, chính xác và hiệu quả cao.

13


Đồ án tốt nghiệp

1.6.1. Định danh nấm men bằng phương pháp truyền thống
1.6.1.1. Quan sát các đặc điểm hình thái
Tuy nấm men có kích thước lớn hơn vi khuẩn rất nhiều nhưng vẫn rất nhỏ so
với khả năng quan sát của con người, việc quan sát nấm men phải được thực hiện bằng
kính hiển vi ở độ phóng đại từ vài trăm đến 1000 lần.
Các đặc điểm cần chú ý khi quan sát hình thái nấm men gồm: quan sát tế bào,
quan sát các dạng bào tử, quan sát khuẩn ty thật, khuẩn ty giả, quan sát nhân tế bào.
1.6.1.2. Khảo sát các đặc tính sinh lí, sinh thái
Để có thể định danh nấm men bằng phương pháp truyền thống người ta phải
tiến hành các thử nghiệm sinh hóa và sinh lý rất phức tạp và tốn thời gian:
- Lên men 13 loại đường.
- Đồng hóa 46 nguồn carbon. Có thể dùng bộ kít chẩn đoán nhanh ID 32C (Bio
Mérieux SA, Marchy-l’Étoile…)
- Tính chống chịu với 0,01% hoặc 0,1% cycloheximide (có thể bao gồm trong bộ kit
ID 32C).
- Đồng hoá 6 nguồn nitơ: nitrate, nitrite, ethylnamine hydrochloride, L-lyzine,
cadaverine dihydrochloride, creatine.
- Sinh trưởng khi thiếu hụt một số vitamin (myo-Inositol, calcium pantothenate, biotin,
thiamine hydrochloride, pyridoxin hydrochloride, niacin, folic acid, p-aminobenzoic
acid.
- Sinh trưởng tại các nhiệt độ khác nhau: 25oC, 30oC, 35oC, 37oC và 42oC.
14

Đồ án tốt nghiệp

- Tạo thành tinh bột.
- Sản sinh acid từ glucose.
- Thủy phân Urê.
- Phân giải Arbutin.
- Phân giải lipid.
- Năng lực sản sinh sắc tố.
- Sinh trưởng trên môi trường chứa 50% và 60% glucoza.
- Hóa lỏng gelatin.
-Phản ứng với Diazonium Blue B.
- Phát triển trên môi trường chứa acid acetic 1%.
1.6.2. Định danh nấm men bằng sinh học phân tử
Định danh nấm men bằng sinh học phân tử chủ yếu dựa trên sự phát triển của
những kỹ thuật gen hiện đại và có độ chính xác cao. Đó là những kỹ thuật hiện đại có
sự kết hợp của nhiều ngành khoa học như sinh học, hóa học, tin học và cơ khí tự động.
Để định danh một loài nào đó thì người ta phải tiến hành các phản ứng như PCR và kỹ
thuật giải trình tự, sau đó xử lý số liệu với ngân hàng gen.
1.6.2.1 Đoạn gen rDNA
Gen rDNA là nhóm gen mã hóa RNA của ribosome, đóng vai trò quan trọng
trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài. rDNA được quan tâm nghiên cứu vì nó là

15


Đồ án tốt nghiệp

một gen có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho protein nào. Các bản sao của

gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa. Hơn nữa,
ribosome hầu như tồn tại ở mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa. Phần lớn phân
tử rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và các khác
biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau. Các primer thiết kế dựa trên những
oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại
các vùng tương đương dùng trong so sánh. Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng được
thiết kế dựa trên các vùng trình tự không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi
sinh vật. [23]
Gen rDNA được quan tâm nghiên cứu từ rất sớm. Bằng cách tách gen, khuếch
đại và đọc trình tự, người ta đã đọc được rất nhiều trình tự rDNA. Đặc biệt phương
pháp đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR ra đời tạo rất nhiều thuận lợi cho các nghiên
cứu liên quan đến rDNA . [24]
Các nghiên cứu sinh học phân tử nhằm phân loại nấm trên cơ sở rDNA được phát triển
những năm đầu của thập niên 90 đã tìm được quan hệ di truyền của nhiều loài nấm
sợi.[25]
❖ Primer
Các primer vùng ITS được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn của các gen 18S, 5.8S và
28S. ITS1 là trình tự bổ sung của NS8. Primer ITS2 và ITS3 được thiết kế và sàng lọc
dựa trên vùng bảo tồn thuộc 5,8 S của N. crassa, Szchiosaccharomyces prombe và S.
cerevisiae, Viciafaba và chuột. Vùng bảo tồn trên rDNA 28S của S. prombe, S.
cerevisiae và lúa (Oryza sativa) được so sánh để thiết kế ITS4. Primer ITS5 có trình tự
giống với rDNA 18 S của N. crassa, có đầu 5’ chỉ cách primer ITS1 25bp. [24]

16


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.2 Internal transcribed spacer region (ITS region, including the 5.8S gene)
ITS1

TCC GTA GGT GAA CCT GCG
1773-1791
White et al. 1990
G
(18S)
ITS1-F CTT GGT CAT TTA GAG GAA
1735-1756
Gardes & Bruns
GTA A
(18S)
1993
ITS2
GCT GCG TTC TTC ATC GAT
53-34
White et al. 1990
GC
ITS3
GCA TCG ATG AAG AAC GCA
34-53
White et al. 1990
GC
ITS4
TCC TCC GCT TAT TGA TAT
57-38 (25S)
White et al. 1990
GC
ITS4-B CAG GAG ACT TGT ACA CGG
194-172 (25S) Gardes & Bruns
TCC AG
1993

ITS5
GGA AGT AAA AGT CGT AAC
1749-1770
White et al. 1990
AAG G
(18S)
5.8S
CGC TGC GTT CTT CAT CG
54-38
Vilgalys lab
5.8SR TCG ATG AAG AAC GCA GCG
37-54
Vilgalys lab

Hình 1.1 Bảng đồ primer ITS
Chỉ định dùng cho PCR: ITS1 hoặc ITS5, ITS1-F và ITS4 hoặc LR15, ITS4-B
1.6.2.2. Nhân gen và Kỹ thuật giải trình tự trong định danh loài
❖ Nhân gen (Polymerase Chain Reaction)
Kỹ thuật lai DNA đã được sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu xác định typ của
nhiều đối tượng vi sinh vật. Nguồn DNA đích đôi khi chỉ có số lượng ít trừ khi tiến
hành nuôi cấy vi sinh vật. Trong một số trường hợp việc nuôi cấy không thể thực hiện
17


Đồ án tốt nghiệp

được với nhiều loài vi sinh vật hay virút hoặc trong các trường hợp khác cần thời gian
dài nuôi cấy vi sinh vật để có đủ DNA cho các kỹ thuật lai hay định typ. Khó khăn này
được khắc phục bằng cách làm tăng nguồn DNA đích một cách nhanh chóng bằng kỹ
thuật nhân gene PCR. [30]

Việc nhân DNA cho phép làm tăng số lượng gấp hàng triệu hoặc nhiều hơn nữa đối
với đoạn DNA hay ARN nghiên cứu. Có nhiều phương pháp khác nhau để phân tích
nguồn DNA khuyếch đại theo cách này. Phương pháp đơn giản nhất là sử dụng điện di
để xác định kích thước sản phẩm của phản ứng PCR. Có thể xác định độ nhạy và tính
đặc hiệu cao hơn nếu sản phẩm PCR được lai với mẫu dò đặc hiệu đã được đánh dấu.
Phương pháp đưa lại thông tin nhiều nhất là xác định được trình tự DNA và RNA của
sản phẩm PCR. Việc xác định được sai khác của chuỗi DNA sẽ cho phép xác định và
định typ chính xác nhất các đối tượng vi sinh vật nghiên cứu. Kết quả xác định trình tự
DNA còn cho phép xác định mối liên hệ tiến hoá và dịch tễ học của các chủng vi sinh
vật. [30]
❖ Kỹ thuật giải trình tự
Phương pháp chính xác và đưa lại nhiều thông tin nhất cho định danh và định typ vi
sinh vật là xác định chính xác trình tự chuỗi DNA của một vùng quy định trên nhiễm
sắc thể. Phương pháp giải trình tự DNA phát triển nhanh chóng, kết quả so sánh sự
tương đồng của trình tự gen nghiên cứu trở thành phương pháp phân loại chuẩn theo
sinh học phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và cây phả hệ di truyền giữa các đối
tượng nghiên cứu. Các gen bảo tồn được giải trình tự làm cơ sở để xác định vị trí của
sinh vật nghiên cứu, trong khi đó các trình tự không tương đồng (khác biệt) lại làm cơ
sở cho sự biệt hóa cũng như xác định mối quan hệ giữa các cá thể gần với nhau. [30]

18