Phân lập và định danh chủng khuẩn có khả năng chuyển hóa nitrite phục vụ nuôi trồng thủy sản

Đồ án tốt nghiệp


LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên Lê Minh Nhựt, là sinh viên nghành Công Nghệ Sinh Học khóa 2011 tại
trường Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Tôi xin cam đoan:
✓ Công trình nghiên cứu này do chính tôi thực hiện.
✓ Các số liệu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố ở

các nghiên cứu khác hay trên bất kì phương tiện truyền thông nào.
Tôi xin hoàn tòa chịu trách nhiệm về kết quả nghiên cứu trong luận văn tốt
nghiệp của mình.

SINH VIÊN

Lê Minh Nhựt


Đồ án tốt nghiệp


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này được hoàn thành với sự quan tâm giúp đỡ rất nhiều của các
thầy cô, anh chị và các bạn. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
Ths Võ Minh Sơn, phòng Sinh Học thực nghiệm, Viện Nghiên Cứu Nuôi
Trồng Thủy Sản II đã luôn tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho em thực hiện và
hoàn thanh khóa luận tốt nghiệp này.
Ts Hoàng Quốc Khánh, Thầy Ngô Đức Duy, anh Dũng, chị Loan phòng Vi
Sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ
Việt Nam cũng đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ em thực hiện đề tài này.

Em cũng xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô khoa Công Nghệ Sinh Học –
Thực Phẩm – Môi Trường, Đại Học Công Nghệ TP.HCM đã truyền đạt kiến thức
làm nền tảng vững chắc cho em đủ khả năng thực hiện đề tài này.
Xin cảm ơn các bạn 11DSH01, 11DSH02 đã quan tâm, giúp đỡ và chia sẻ
niềm vui nỗi buồn trong suốt quá trình học tập tại trường.
Và cuối cùng con xin cảm ơn Ba Mẹ đã nuôi nấng, chăm sóc, luôn dạy con
điều hay lẽ phải và tạo điều kiện cho con ăn học nghiêm túc để trở thành người có
ích cho gia đình và xã hội.


Đồ án tốt nghiệp


MỤC LỤC
MỤC LỤC ..................................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................iv
DANH MỤC HÌNH ẢNH............................................................................................ v
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................vi
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 4
1.1. Hệ vi sinh vật trong nuôi trồng thủy sản........................................................... 4
1.2. Các quá trình chuyển hóa nitơ vô cơ ................................................................ 5
1.2.1. Quá trình nitrate hóa .................................................................................. 6
1.2.2. Vai trò nhóm vi khuẩn nitrate hóa ............................................................. 8
1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nitrate hoá ........................................ 9
1.3. Nhóm vi khuẩn Nitrosomonas ....................................................................... 11
1.3.1 Các thông số sinh lý của vi khuẩn Nitrosomonas .................................... 13
1.3.2. Quá trình nitrite hoá ở Nitrosomonas ...................................................... 13
1.4. Nhóm vi khuẩn Nitrobacter ............................................................................ 17
1.4.1. Sự phân bố và điều kiện tồn tại................................................................ 18

1.4.2. Những nghiên cứu về vi khuẩn Nitrobacter ............................................ 18
1.4.3. Quá trình nitrate hoá ở Nitrobacter ......................................................... 19
1.5. Nhóm vi khuẩn Bacillus .................................................................................. 21
1.5.1. Đặt điểm sinh học của Bacillus................................................................ 21
1.5.2. Quá trình hình thành bào tử ..................................................................... 21
1.5.3. Vai trò Bacillus trong thủy sản ................................................................ 22
1.6. Kỹ thuật PCR và ứng dụng ............................................................................. 26
i


Đồ án tốt nghiệp

1.6.1. Kỹ thuật PCR ........................................................................................... 26
1.6.2. Kỹ thuật giải trình tự Nucleotide ............................................................. 27
1.6.3. Ứng dụng kỹ thuật PCR để định danh vi khuẩn ...................................... 28
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ....................................................... 29
2.1. Vật liệu ............................................................................................................ 29
2.1.1. Mẫu phân lập ............................................................................................ 29
2.1.2. Điều kiện thực nghiệm ............................................................................. 30
2.1.2.1. Hóa chất............................................................................................. 30
2.1.2.2. Trang thiết bị ..................................................................................... 30
2.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................................. 31
2.2.1. Thu mẫu .................................................................................................... 32
2.2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn............................................................... 32
2.2.3. Quan sát đặc điểm hình thái ..................................................................... 32
2.2.4. Kiểm tra đặc tính sinh hóa vi khuẩn ........................................................ 33
2.2.4.1. Thí nghiệm khả năng chuyển hóa Nitrite ......................................... 33
2.2.4.2. Xác định hàm lượng nitrite bằng Test kit ........................................ 34
2.2.4.3. Xác định hàm lượng nitrite bằng phương pháp Griess llosvay........ 35
2.2.5. Định danh sinh hóa bằng test kit API ...................................................... 37

2.2.5.1. Định danh sinh hóa bằng API 20E .................................................. 37
2.2.5.2. Định danh vi khuẩn bằng API 50CH ............................................... 38
2.2.6. Định danh bằng sinh học phân tử ............................................................ 39
2.2.6.1. Quy trình ly trích và thu nhận DNA ................................................. 39
2.2.6.2. Kiểm tra chất lượng DNA sau ly trích.............................................. 40
2.2.6.3. Phản ứng PCR khuếch đại vùng 16S rDNA..................................... 40

ii


Đồ án tốt nghiệp

2.2.6.4. Định danh vi khuẩn dựa trên vùng gen 16S rDNA .......................... 41
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................. 42
3.1. Kết quả phân lập và kiểm tra hình thái học ................................................... 42
3.1.1. Đặc điểm hình dạng khuẩn lạc ................................................................. 42
3.1.2. Kết quả nhuộm Gram, quan sát tế bào và nhuộm bào tử ........................ 43
3.1.2.1. Kết quả nhuộm Gram, quan sát tế bào ............................................. 43
3.1.2.2. Kết quả nhuộm bào tử ....................................................................... 44
3.1.3. Chọn lọc vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitrite ................................. 45
3.2. Kết quả định danh sinh hóa vi khuẩn............................................................. 47
3.2.1. Định danh bằng API 20E test kit ............................................................. 47
3.2.2. Định danh bằng test API 50CHB ............................................................. 49
3.3. Kết quả định danh bằng sinh học phân tử....................................................... 51
3.3.1. Kết quả ly trích DNA bộ gen ................................................................... 51
3.3.2. Kết quả khuếch đại đoạn gen bằng kĩ thuật PCR các chủng vi khuẩn.... 52
3.3.3. Kết quả giả trình tự các chủng vi khuẩn .................................................. 53
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 56
4.1. Kết luận ........................................................................................................... 56
4.2. Kiến nghị ......................................................................................................... 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 58
PHỤ LỤC

iii


Đồ án tốt nghiệp


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ABIL

Ammonia Binding Inoculum Liquid

AMO

Amonia Monooxygenase

AOB

Ammonia Oxydizing Bacteria

BHI

Brain Heart Infusion Agar

CFU

Colony Forming Unit

ĐC

Đối Chứng

DNA

Deoxyribomucleotide Acid

DO

Dissolved Oxygene

FA

Fluoresent Antibody

FISH

Fluorescent Insitu Hybridization

HAO

Hydroxylamine Oxireductase

MPN

Most Probable Number

PCR

Polymerase Chain Reaction

RET

Reverse Electron Transport

TAE

Tris- Acetic acid-Ethyleneamine-Tetraacetae

TAN

Total Ammonia Nitrogen

iv


Đồ án tốt nghiệp


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Vòng tuần hoàn nitơ (nguồn Boyd, 1998) ..................................................5
Hình 1.2: Con đường vận chuyển điện tử ở Nitrosomonas (Prescoot, 2002) ..........16
Hình 1.3: Con đường vận chuyển điện tử ở Nitrobacter (Wallace, 1969) ...............19
Hình 2.1: Quy trình nghiên cứu.................................................................................31
Hình 2.2: Sera NO2 Test Kit ......................................................................................34
Hình 2.3: Bảng so màu kiểm tra hàm lượng nitrite trong môi trường nước. ...........35
Hình 3.1: Hình dạng khuẩn lạc B1, B2 trên môi trường BHI...................................42
Hình 3.2: Hình dạng khuẩn lạc B3, B4 trên môi trường BHI...................................43
Hình 3.3: Hình dạng tế bào vi khuẩn B1, B2 (100 X) ..............................................43

Hình 3.4: Hình dạng vi khuẩn B3, B4 (100 X) .........................................................44
Hình 3.5: Kết quả nhuộm bào tử B1, B2 (100X) ......................................................45
Hình 3.6: Hình nhuộm bào tử B3, B4 (100X)...........................................................45
Hình 3.7: Kết quả kiểm tra hàm lượng nitrite ở 0 giờ ..............................................46
Hình 3.8: Kết quả kiểm tra nitrite bằng Sera test sau 24 giờ ....................................46
Hình 3.9: Kết quả test API vi khuẩn B4....................................................................49
Hình 3.10: Kết quả định danh B1 và B2 bằng API 50CHB .....................................51
Hình 3.11: Kết quả điện di DNA tổng số trên gel agarose 1,5% ..............................52
Hình 3.12: Kết quả khuếch đại đoạn gen các chủng vi khuẩn bằng kĩ thuật PCR ...52
Hình 3.13: Cây phát sinh loài của các chủng B1, B2 và B4 với các loài trong ngân
hàng gen NCBI. ..........................................................................................................54

v


Đồ án tốt nghiệp


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Các bước thiết lập mẫu chuẩn để phân tích nitrite bằng phương pháp
Griess llosway. ...........................................................................................................36
Bảng 2.2: Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn được xác định bằng
bộ kit API 20E. ...........................................................................................................38
Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra nitrite .............................................................................47
Bảng 3.2: Kết quả phân tích chỉ số sinh lý sinh hóa chủng B4 bằng bộ kit API 20E
.....................................................................................................................................48
Bảng 3.3: Kết quả phân tích chỉ số sinh lý sinh hóa chủng B1 và B2 bằng bộ kit
API 50CHB.................................................................................................................49



vi


Đồ án tốt nghiệp


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Trong nuôi trồng thủy sản thì các chỉ tiêu môi trường như TAN, NO2

-

và

NO3 – là những yếu tố được quan tâm vì trực tiếp ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của
các loài sinh vật trong ao. Theo De Silva et al., (2010) thì khi nuôi một tấn cá tra
bằng thức ăn viên công nghiệp sẽ thải ra môi trường 46,0 kg nitơ và 14,0 kg
phospho. Môi trường ao nuôi ô nhiễm là một trong những nguyên nhân làm cho tỷ
lệ cá chết và hao hụt nhiều (Cao Văn Thich, 2008). Trong nuôi thủy sản nói chung
khi ammonia thải ra thì vi khuẩn Nitrosomonas sẽ chuyển hóa ammonia thành
nitrite (Huey và Beitinger, 1980). Nitrite được xem là một trong những khí độc tồn
tại trong môi trường ao làm ảnh hưởng đến sức khỏe của cá khi hàm lượng tăng
cao. Ở cá thì nitrite được tích trữ trong huyết tương và là nguyên nhân gây ra quá
trình oxy hóa Hb (Hemoglobin) thành MetHb (Methemoglobin). MetHb không vận
chuyển được oxy nên khi đó nitrite có thể trở thành độc chất và ngay cả khi ở mức
thấp thì chất này cũng gây độc cho nhiều loài cá (Huertas et al., 2002). Trong ao
nuôi cá với mật độ thả cao và lượng thức ăn sử dụng nhiều (Lam et al., 2009) dẫn
đến chất thải từ phân cá và thức ăn dư thừa chính là nguồn gốc hình thành một
lượng lớn khí ammonia trong ao nuôi và trở thành yếu tố bất lợi cho cá.

Chính vì thế khóa luận này sẽ tiến hành phân lập và bước đầu định danh bằng
các phản ứng sinh hóa, kỹ thuật sinh học phân tử nhằm xác định một số chủng vi
khuẩn có khả năng chuyển hóa nguồn NO2 phục vụ cho nuôi trồng thủy sản.
2. Mục đích nghiên cứu
✓ Phân lập, chọn lọc và định danh một số chủng vi khuẩn có khả năng
chuyển hóa nitrite trong nước nuôi trồng thủy sản, nhằm tăng khả năng
hấp thu nguồn gây độc này đối với thủy sản.
✓ Tạo nguồn giống vi khuẩn thuần chủng cho những nghiên cứu chuyên
sâu về khả năng sử ứng dụng trong thực tế của các loài vi khuẩn đã định
danh được.
1


Đồ án tốt nghiệp

3. Nhiệm vụ nghiên cứu
✓ Phân lập và chọn lọc được một số chủng vi khuần có khả năng chuyển
hóa nguồn nitrite trong môi trường nuôi trồng thủy sản.
✓ Định danh vi khuẩn bằng hình thái học, sinh lí, sinh hóa và phương pháp
sinh học phân tử dựa trên trình tự gen 16S rDNA.
4. Phương pháp nghiên cứu
✓ Phân lập và chọn lọc vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitrite thông qua
Sera Test Kit và phương pháp Griess llosvay.
✓ Định danh sinh lý, sinh hóa thông qua API Test Kit.
✓ Định danh sinh học phân tử bằng phương pháp PCR thông qua vùng gen
16S rDNA.
✓ Ứng dụng các phần mềm và cơ sở dữ liệu sinh tin học như: ChromasPro,
MEGA5, seaview4 4.32.0.0 và ngân hàng gen />5. Kết quả đạt được
Sau quá trình nghiên cứu đề tài đã phân lập và định danh được 2 chủng vi
khuẩn. Dựa trên các nghiên cứu trên thế giới thì bước đầu nhận định chỉ có 1 chủng

vi khuẩn có khả năng sử dụng nguồn nitrite cao.
6. Kết cấu đề tài
Đề tài gồm 4 chương.
Chương 1: Tổng quan tài liệu.
Trình bày những thông tin liên quan tới vi sinh vật xử lý nước trong nuôi trồng
thủy sản, vi khuẩn Nitrosomonas, Nitrobacter, Bacillus, quá trình nitrate hóa và các
thông tin về phương pháp sinh học phân tử sử dụng trong định danh vi khuẩn.
Chương 2: Vật liệu và phương pháp.
Trình bày toàn bộ những nguyên vật liệu, địa điểm, máy móc thiết bị phục vụ
trong quá trình nghiên cứu và toàn bộ các quy trình, thao tác thực hiện các nghiên
cứu.
Chương 3: Kết quả và thảo luận.
Trình bày những kết quả chi tiết của toàn bộ quá trình thực hiện nghiên cứu.

2


Đồ án tốt nghiệp

Chương 4: Kết luận và kiến nghị
Tổng kết lại những kết quả nghiên cứu đã đạt được và đưa ra những đề nghị
lên quan nhằm hoàn thiện đề tài.







3

Đồ án tốt nghiệp


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Hệ vi sinh vật trong nuôi trồng thủy sản
Trong môi trường nuôi trồng thủy sản luôn tồn tại các mầm bệnh tiềm tàng và
chúng phát triển hoàn toàn độc lập với vật chủ. Ngoài việc tương tác qua lại giữa hệ
vi sinh vật với môi trường sống, môi trường nuôi thủy sản cũng có ảnh hưởng đến
các vi sinh vật gây bệnh. Tần suất cho ăn và sinh khối hữu cơ cao trong các trại nuôi
thâm canh cá, tôm sẽ tích lũy, quá trình phân hủy hữu cơ diễn ra sẽ gây ra tình trạng
thiếu oxy và tạo điều kiện thuận lợi cho cho sự hình thành các loại khí độc ảnh
hưởng đến sức khỏe của thủy sản. Hàm lượng NH3 và NO2 tích lũy vượt quá giới
hạn trong nước là nguyên nhân của vấn đề nghiêm trọng là làm suy giảm chất lượng
nước. Sự gia tăng hàm lượng các chất độc cũng thay đổi thành phần vi sinh trong
môi trường đất và nước đáy ao, đặc biệt là sự gia tăng mật số vi sinh gây bệnh. Chất
lượng nước đóng vai trò quan trọng trong hoạt động nuôi trồng thủy sản, do đó vấn
đề quản lý và giám sát ao nuôi tốt hơn, cần có những giải pháp bền vững để giảm
thiểu tác động của hoạt động nuôi trồng thủy sản đến môi trường. Do đó việc ứng
dụng vi sinh hữu ích và có khả năng điều chỉnh sinh học vào nuôi trồng thủy sản là
điều cần thiết. Như chúng ta đã biết vi sinh vật là mắt xích quan trọng trong các chu
trình chuyển hóa vật chất và năng lượng trong tự nhiên, chúng tham gia vào việc
giữ gìn tính bền vững của hệ sinh thái và bảo vệ môi trường hiện nay đã có một số
nghiên cứu ứng dụng vào các chủng vi sinh vật có lợi vào nuôi trồng thủy sản nhằm
cải tạo môi trường nuôi, hạn chế dịch bệnh.
Các chủng vi sinh vật trong nuôi trồng thủy sản hiện nay được chia làm 3 nhóm:
Nhóm 1: Nhóm probiotic gồm những vi sinh vật thuộc nhóm Bacillus,
Lactobacillus, Saccharomyces… thường chống lại sự xâm nhiễm của vi khuẩn
gây bệnh, nâng cao đáp ứng miễn dịch và giúp tăng cường khả năng tiêu hóa

thức ăn cho cá bằng cách sản xuất các hợp enzyme tiêu hóa như amylase,
protease và lipase.

4


Đồ án tốt nghiệp

Nhóm 2: Nhóm vi sinh vật có tính đối kháng hoặc cạnh tranh với vi sinh vật có
hại gồm các nhóm vi khuẩn Bacillus lichenifomic, Bacillus sp.,… nhằm kiềm
hãm sự sinh trưởng và phát triển của chúng như cạnh tranh cơ chất hữu cơ chủ
yếu là nguồn carbon và năng lượng có sẵn trong môi trường, sản sinh chất sát
khuẩn, các chất này tiết ra trên bề mặt cơ thể vật chủ hay ra môi trường nước
gây ức chế các vi sinh vật gây bệnh.
Nhóm 3: Gồm các vi sinh vật cải thiện chất lượng môi trường như vi khuẩn
Bacillus sp., Nitrosomanas, Nitrobacter, Actinomyces, Rhodobacter sp.,
Rhodospirillum, Rhodopseudomonas virisis… dùng xử lý nước ao như biến đổi
các chất hữu cơ thành CO2, tạo nên sự cân bằng giữa NH3/NO2/NO3 trong nước.
1.2. Các quá trình chuyển hóa nitơ vô cơ

Hình 1.1: Vòng tuần hoàn nitơ (nguồn Boyd, 1998)
Trong nước nitơ tồn tại ở nhiều dạng khác nhau như ở môi trường trên cạn
như nitơ phân tử, các hợp chất nitơ vô cơ và các hợp chất hữu cơ phức tạp có
trong các cơ thể sống (protein, acid amin). Khi cơ thể sinh vật chết đi, các chất
hữu cơ chứa nitơ sẽ bị thối rửa và amôn hoá dưới tác dụng của các vi sinh vật
thành NH3 hay NH4+. Dạng NH4+ sẽ bị chuyển hoá thành dạng NO3- nhờ nhóm vi
khuẩn nitrate hoá. Các hợp chất nitrate lại được chuyển hoá thành dạng nitơ phân
5

Đồ án tốt nghiệp

tử do tác dụng của các vi khuẩn phản nitrtate hoá. Khí nitơ phân tử sẽ được cố
định lại dưới dạng hợp chất hữu cơ nhờ nhóm vi khuẩn cố định đạm. Các quá trình
trên kết hợp lại với nhau tạo thành vòng toàn hoàn nitơ trong thuỷ vực (hình 1.1).
Trong tất cả các quá trình này đều có sự tham gia của các nhóm vi khuẩn khác nhau.
Nếu sự hoạt động của một nhóm vi khuẩn nào đó bị ngừng trệ, toàn bộ tiến trình
chuyển hoá nitơ sẽ bị ảnh hưởng gây tích tụ một số hợp chất nitơ trong
có thể gây nên sự biến đổi chất lượng nước làm ảnh hưởng đến đời sống các thuỷ
sinh vật sống trong thuỷ vực đó (Kiều Hữu Anh và Ngô Tự Thành, 1985).
1.2.1. Quá trình nitrate hóa
Quá trình nitrate hoá là quá trình oxy hoá các muối amôn thành muối nitrate
nhờ sự hoạt động của một nhóm vi sinh vật được gọi chung là nhóm vi khuẩn
nitrate hoá. Đây là nhóm vi khuẩn hiếu khí tự dưỡng hoá năng và bao gồm hai
nhóm nhỏ tham gia vào hai giai đoạn của quá trình này. Giai đoạn 1 là giai đoạn
oxy hoá NH4+ thành NO2- được gọi là giai đoạn nitrite hoá. Giai đoạn 2 là giai
đoạn oxy hoá NO2- thành NO3- được gọi là giai đoạn nitrate hoá (Cole, 1994).
Người đầu tiên nghiên cứu về vi khuẩn Nitrate hóa và hoạt động sinh lý của
chúng là nhà khoa học Nga Winogradsky. Năm 1889 ông chứng minh vi khuẩn
nitrate hóa là những loài vi sinh vật dinh dưỡng vô cơ bằng tổng hợp hóa học. Ông
cũng khẳng định quá trình nitrate hóa gồm 2 giai đoạn: oxy hóa muối amonium
thành nitrite và oxy hóa nitrite thành nitrate.
Hai giai đoạn này được thực hiện do hai loài vi khuẩn khác nhau: Vi khuẩn
oxy hóa muối amonium thành nitrite có ba nhóm chính là Nitrosomonas,
Nitrisocytis và Nitrosopira. Nitrosomonas có hình cầu hoặc bầu dục, Gram âm,
không sinh bào tử và di động bằng tiêm mao. Nitrosopira là loài biến đổi nhiều hình
thái, nhưng dạng điển hình là trực khuẩn (Nguyễn Lân Dũng, 2007). Quá trình
nitrate hoá là quá trình oxy hoá các muối NH4+ thành NO3- nhờ sự hoạt động của
một nhóm vi sinh vật được gọi chung là nhóm vi khuẩn nitrate hoá.

6


Đồ án tốt nghiệp

➢

Giai đoạn nitrite hóa
Vi khuẩn nitrate hoá thực hiện quá trình oxy hoá NH4+ tạo thành NO2- bằng

oxy không khí và tạo ra năng lượng theo phương trình:
NH4+ + 3/2 O2 → NO2- + H2O + 2 H+ +Q
Năng lượng này được vi khuẩn sử dụng để đồng hoá CO2 thành carbon hữu cơ
(sinh khối vi khuẩn). Nhóm vi khuẩn tham gia quá trình nitrite hoá bao gồm 4 giống
khác nhau: Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosobrio, Nitrozolobus và Nitrosospira
(Watson et al., 1989; Bock et al., 1992; trích dẫn bởi Herber, 1999). Chúng đều
thuộc loại tự dưỡng bắt buộc, không có khả năng sống trên môi trường thạch. Bởi
vậy, việc phân lập chúng rất khó, phải dùng silicagel thay cho thạch.
➢

Giai đoạn nitrate hóa
NO2- tạo thành trong giai đoạn nitrite hoá sẽ tiếp tục bị oxy hoá thành NO3-

nhờ một nhóm vi khuẩn khác theo phương trình:
NO2- + ½ O2 → NO3- + Q
Nhóm vi khuẩn thực hiện nitrate hoá này bao gồm 3 giống: Nitrobacter,
Nitrospira và Nitrococcus (Watson et al., 1989; Bock et al., 1992). Vi khuẩn nitrate
hóa phân bố rất ít trong các thủy vực sạch, nghèo dinh dưỡng. Trong các thủy vực
giàu dinh dưỡng thì số lượng của chúng có nhiều hơn, nhưng cao nhất cũng chỉ
khoảng 10 cfu/ml nước. Số lượng của chúng trong thủy vực dao động theo mùa rõ

rệt. Số lượng cực tiểu thường thấy vào mùa đông hoặc đầu mùa xuân, còn số lượng
cực đại thường thấy trong mùa hè.
Quá trình nitrate hoá là một khâu quan trọng trong vòng tuần hoàn nitơ trong
thủy vực. Quá trình này có tầm quan trọng trong quản lý chất lượng nước trong nuôi
trồng thủy sản. Khi quá trình này xảy ra mạnh chất thải amôn độc hại sẽ được
chuyển hoá nhanh sang dạng nitrate không độc đối với sự sống và sinh trưởng của
tôm cá (Kiều Hữu Anh và Ngô Tự Thành, 1985; Lê Xuân Phương, 2007).
7


Đồ án tốt nghiệp

1.2.2. Vai trò nhóm vi khuẩn nitrate hóa
Để làm giảm hàm lượng NO2- trong ao nuôi tôm, thường phải thay một lượng
lớn nước mỗi ngày (Losordo và Timmons, 1994; Boyd, 1998). Trong hầu hết các
trại nuôi thâm canh ở Neger (Israel) tỉ lệ thay nước dao động từ 5% đến 15%/ngày;
nếu hàm lượng nitrite tăng cao >1 mg/L, tỉ lệ thay nước tăng lên tới 70%.
Việc phải thay lượng nước lớn dẫn đến giá cả đầu tư cao và gây ô nhiễm môi
trường xung quanh do lượng nước thải ra không qua xử lý làm tăng hàm lượng
NO2- trong nguồn nước (Van-Breemen và Van-Dijk, 1988). Việc bổ sung các nhóm
vi khuẩn tham gia vào quá trình nitrate hóa vào ao nuôi có thể làm giảm đáng kể
lượng nitrite và do vậy có thể cải thiện chất lượng nước nuôi, ngăn ngừa bệnh phát
sinh và giảm tỉ lệ thay nước (Hochheimer và Wheaton, 1991).
Một nghiên cứu khác cho thấy sự khởi động bể lọc sinh học bằng cách nhân
mật độ vi khuẩn có sẵn trong bể lọc là cách thực hành thông thường trong các trại
nuôi thủy sản, phương pháp này mất rất nhiều thời gian để một bể lọc đạt hiệu quả.
Việc cấy vi khuẩn nitrate hoá cho lọc sinh học mới có thể làm giảm thời gian khởi
động lọc xuống 30%. Việc cung cấp vi khuẩn nitrate hoá cho ao nuôi hoặc bể nuôi
có thể được thực hiện khi hàm lượng NH3 tăng đột ngột (Van Hauteghem et al.,
2000). Từ những nghiên cứu ban đầu, ngày nay kỹ thuật cấy trực tiếp giống vi

khuẩn vào hệ thống lọc tuần hoàn, hoặc cho trực tiếp xuống ao nuôi đã được áp
dụng một cách rộng rãi.
Theo Grommen et al., (2002), cấy hỗn hợp các loại vi khuẩn nitrate hóa
(Nitrosomonas và Nitrobacter) trong một sản phẩm probiotic có tên thương mại là
ABIL (ammonia binding inoculum liquid) vào bể lọc tuần hoàn trong hệ thống nước
ngọt và nước lợ. Kết quả cho thấy với hàm lượng ABIL 3 - 5 mg/l có thể loại bỏ
TAN và NO2- dưới mức phát hiện trong vòng 4 - 14 ngày vận hành trong cả hai hệ
thống nói trên. Một thí nghiệm khác của Grommen et al., (2004), cho thấy loài vi
khuẩn chiếm ưu thế trong bể lọc tuần hoàn cả 2 hệ thống nước lợ và nước ngọt có

8


Đồ án tốt nghiệp

bổ sung ABIL là N. marina. Điều này cho thấy vi khuẩn này có thể tồn tại cả trong
2 môi trường và tham gia vào quá trình nitrite hóa trong bể lọc.
1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nitrate hoá
Các vi khuẩn hoá năng vô cơ nói chung sở hữu những cơ chế hoá sinh đặc biệt
giúp chúng tồn tại và phân bố trong một khoảng không gian rất rộng ở mặt đất và
dưới nước.
Do là vi sinh vật tự dưỡng, nên chúng có khả năng tự tổng hợp sinh khối nhờ
có cơ chế sinh hoá chứa đủ hệ enzyme phân giải các chất vô cơ, ví dụ như một số
loài có thể đồng thời oxi hoá urea và methane cùng lúc với dị hoá rất nhiều loại
hydrocarbon khác nhau. Hơn nữa, các tế bào này có khả năng duy trì sự sống trong
điều kiện thiếu nguồn cơ chất bằng nhờ giảm hoạt động hô hấp nội bào và đồng hoá
xuống mức thấp nhất. Đối với, vi khuẩn nitrate hoá thì chúng bị ức chế bởi ánh sáng
và đặc biệt nhạy cảm với sự xáo động khỏi pH kiềm tối ưu và nhiệt độ ấm (~250C
đến 300C). Ta sẽ xem xét các yếu tố ảnh hưởng cụ thể như sau:
• Nồng độ ammonia

Theo nghiên cứu của Anthonisen et al., (1976) thì khi hàm lượng ammonia
vượt quá từ 10 đến 150 mg/l thì sẽ ức chế quá trình nitrite hoá. Quá trình nitrate hoá
nhạy cảm hơn, nếu ammonia vượt hơn mức 0,1 đến 1mg/l thì vi khuẩn nitrate hoá
đã bị ức chế. Đối với nồng độ ion NO 2- thì từ 0,22 đến 2,8 mg/l sẽ ức chế quá trình
nitrate hoá. Hiện chưa có nghiên cứu nào ghi nhận nồng độ NO 3- ở mức nào sẽ ức
chế quá trình nitrate hoá.
• Nồng độ oxy hoà tan (DO)
Tuy vi khuẩn nitrate hoá là loài hiếu khí bắt buộc nhưng chúng có thể sống
trong thời gian dài ở điều kiện thiếu oxy dưới các tầng nước phía đáy hồ, trong các
bể xử lý nước thải và bùn hoạt tính. Người ta đã ghi nhận được mật độ 102 tế
bào/ml vi khuẩn nitrite hoá trong một bể xử lý kị khí có nồng độ TAN 52 mg/l. Ở
các bể xử lý nước thải liên tục thì nồng độ vi khuẩn nitrite hoá đạt tối ưu ở nồng độ
9


Đồ án tốt nghiệp

oxi hoà tan khoảng 0,2 mg/l. Quá trình nitrite hoá vẫn xảy ra ở mức độ oxi hoà tan
thấp 0,05 mg/l mà vẫn phân giải được một lượng đáng kể ammonia. Đối với vi
khuẩn nitrate hoá thì có sức sống tương tự như vậy, trong một số trường hợp mật độ
tế bào còn nhiều hơn vi khuẩn nitrite hoá vài lần. Việc phát triển các bể xử lý hiếu
khí kín có một vài khu vực kị khí cục bộ đã cho phép tiến hành đồng thời quá trình
nitrate hoá và phản nitrate hoá, chuyển từ ammonia ra đến N2 (Davidson et al.,
1986). Nồng độ oxi hoà tan tối ưu cho hệ vi khuẩn nitrate hoá phát triển tốt là 3 - 4
mg/l O2 (Prosser, 1989).
• Nhiệt độ
Vi khuẩn nitrate hoá là loại vi khuẩn ưa ấm, nhiệt độ tối thích cho chúng phát
triển trong khoảng 25 - 300C. Đối với quá trình nitrite hoá vẫn diễn ra ở nhiệt độ từ
7 - 350C trong khi quá trình nitrate hoá thì nhiệt độ diễn ra rộng hơn từ 5 - 420C.
• pH dung dịch

Hầu hết các vi khuẩn nitrate hoá có giá trị pH tối ưu dao động trong khoảng
7,5 - 8,0. Tại giá trị pH nhỏ hơn 6 hoặc lớn hơn 10 thì quá trình nitrate hoá diễn ra
rất chậm và bị ức chế. Quá trình oxi hoá ammonia bởi vi khuẩn nitrite hoá làm giảm
tính kiềm của môi trường, vì thế độ đệm của pH của môi trường là rất quan trọng,
trong một số trường hợp cần bổ sung kềm để giữ pH. Vi khuẩn Nitrosomonas thì
hoạt động trong khoảng pH 6,7 - 9,2 trong khi vi khuẩn Nitrobacter thì hoạt động
trong khoảng pH 8 - 9,2.
Sự thích nghi của vi khuẩn đối với giá trị pH quá cao hoặc quá thấp đều đòi
hỏi phải có một khoảng thời gian. Trong nhiều nghiên cứu cho thấy các chủng vi
khuẩn tự dưỡng có thể thích nghi được ở cả giá trị pH rất thấp như 3 - 4 hoặc giá trị
pH rất cao 11 - 12. Trong các nguồn nước thải thường có pH nằm trong dải trung
tính và kiềm nhẹ, vì thế quá trình nitrate hoá vẫn diễn ra thuận lợi mà ít cần sự tác
động chỉnh pH về pH tối thích.
• Sự có mặt của các chất độc
Nitrosomonas sp. và Nitrobacter sp. đều nhạy cảm với một vài hợp chất độc
thường gặp trong nước thải. Tuy nhiên, mức độ nhạy cảm của Nitrosmonas sp.
10


Đồ án tốt nghiệp

thường cao hơn với Nitrobacter sp., các hợp chất này gây ngừng quá trình nitrate
hoá vì ức chế các hệ enzyme trên màng của tế bào. Hầu hết các hợp chất diệt khuẩn
đều tác động nghiêm trọng đến hoạt động sống của vi khuẩn nitrate hoá (điều này
giải thích vì sao các trang trại nuôi trồng thuỷ sản có nguồn nước thải bị ô nhiễm
hữu cơ quá cao vì trong quá trình nuôi, người ta đã sử dụng chất diệt khuẩn để tiêu
diệt vi khuẩn gây bệnh cho động vật nuôi trồng, đồng thời diệt luôn hệ vi khuẩn có
lợi, làm cho khả năng tự làm sạch tự nhiên của ao nuôi bị mất tác dụng). Có thể liệt
kê một vài hợp chất gây ức chế vi khuẩn nitrate hóa như: nitrapyrin (2-chloro-6trichloromethyl-pyridine),

allylthiourea

(2-propenyl-thiourea),

sodium

azide

(NaN3), DIECA (diethyl-dithiocarbamate), Acetylene (C2H2), sodium chlorate
(NaClO3).
1.3. Nhóm vi khuẩn Nitrosomonas
Nitrosomonas là một trong 5 giống vi khuẩn oxy hóa amonium (AOB) gồm:
Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosocossus, Nitrosolobus, Nitrosospira. Tất cả các
sinh vật này đều giống nhau về mặt sinh lý, sinh hóa nhưng khác nhau về mặt đặc
điểm hình thái học và cấu trúc học (Nguyễn Lân Dũng, 1983). Vi khuẩn
Nitrosomonas là nhóm vi khuẩn tự dưỡng hóa năng và hiếu khí bắt buộc. Chúng sử
dụng NH3 như nguồn năng lượng chủ yếu trong hoạt động tổng hợp cacbon từ CO2
để đáp ứng nhu cầu cacbon củ chúng (Hooper et al., 1997). AOB thuộc 2 nhóm là
γ-Proteobacteria chỉ có giống Nitrosococcus với 2 loài Nitrosococcus oceani và
Nitrosococcus halophilus (Koops et al., 1990) và nhóm β-Proteobacteria với 2
giống Nitrosomonas sp. và Nitrosospira sp. (Head et al., 1993; Koops và
Prommerening, 2001). Các loài thuộc giống Nitrosococcus chỉ có thể được tìm thấy
trong môi trường nước mặn (Watson et al., 1971). Nitrosospira phân bố chủ yếu và
chiếm ưu thế ở nội địa (Stephen et al., 1996). Giống Nitrosomonas thường phân bố
rộng rãi trong đất, bùn nước ngọt và nước lợ, trong đó N. europaea chiếm số lượng
cao (Schmidt và Belser, 1994).Vi khuẩn Nitrosomonas được biết là nhóm vi khuẩn
khó phân lập và nuôi do chúng không có khả năng sống trên môi trường thạch và

11

Đồ án tốt nghiệp

không thể hình thành khuẩn lạc trong điều kiện thời gian cho phép (Heselsoe và
Sorenser, 1998; Herbert, 1999; Trần Cẩm Vân, 2005). Vì vậy, để xác định mật độ vi
khuẩn không thể áp dụng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa. Một phương pháp
được sử dụng phổ biến để xác định mật độ của vi khuẩn Nitrosomonas là kỹ thuật
MPN (Most Probable Number) (Ehrlich, 1975). Tuy nhiên, hiệu quả của kỹ thuật
này tương đối thấp và mức độ chính xác về mặt thống kê cũng không cao
(Herbert, 1999).
Gần đây, có một vài nghiên cứu được giới thiệu nhằm cải thiện
phương pháp định lượng vi khuẩn Nitrosomonas như kỹ thuật kháng thể huỳnh
quang FA (Fluorescent Antibody) (Belser và Schmidt, 1978; Sanden et al., 1994).
Nổi bật hơn là những kỹ thuật mới về sinh học phân tử như PCR định lượng
(Phillps et al., 2000; Hermansson et al., 2001), kỹ thuật lai tại chỗ với huỳnh
quang (FISH) (Wagner et al., 1995; Schramm et al., 1996).
Nhận thấy phần lớn những loài vi khuẩn thuộc giống Nitrosomonas không có
khả năng di động nên cần phải bám vào bề mặt các loại giá thể như đá, cát, giá thể
sinh học…giúp chúng phát triển thuận lợi. Khả năng bám là nhờ chúng tiết ra chất
nhầy từ màng bao bên ngoài (Meicklejohn, 1950).
Engel (1960) cho biết N. europaea có khả năng di động và có 2 tiêm mao khi
các tế bào vi khuẩn phát triển ở giai đoạn tăng trưởng. Nitrosomonas thuộc nhóm vi
khuẩn Gram âm, đều có hình que nhưng các tế bào vi khuẩn khác nhau có hình
dạng và kích thước khác nhau. Có 3 hình dạng cơ bản được xác định là hình que
ngắn rộng 0,8 µm và chiều dài đạt 1 - 2 µm, hình que rộng 1 - 1,3 µm và dài 2 - 2,5
µm, hình dạng thứ ba là những tế bào rộng 1,2 µm và chiều dài thường 2 -2,5 µm
(Mecklejohn, 1950).
Những đặc điểm về hình dạng tế bào theo như mô tả trên giúp phân biệt với
giống Nitrosospira là những tế bào dạng sợi xoắn, vòng xoắn hay thể xoắn, trong
khi đó Nitrosococcus có hình cầu và các tế bào dính chặt với nhau (Watson và

Mandel, 1971).
12


Đồ án tốt nghiệp

1.3.1 Các thông số sinh lý của vi khuẩn Nitrosomonas
Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của Nitrosomonas vào khoảng 25 – 30°C.
Tỉ lệ sinh trưởng cũng bị giảm 50% ở 18°C. Ngưng hoạt động ở 4°C. Vi khuẩn sẽ
chết ở 0°C và 49°C. Khả năng chịu đựng ở nhiệt độ thấp của Nitrosomonas cao hơn
ở Nitrobacter. Vì vậy trong các thủy vực nước lạnh xảy ra trường hợp tích lũy NO2khoảng pH thích hợp là 7,8 - 8,0. Tại mức pH thấp hơn 7, Nitrosomonas sẽ phát
triển chậm và làm tăng lượng NH3 trong thủy vực. Sự phát triển của chúng bị ức
chế ở pH = 6,5. Tại mức pH đó hầu hết NH3 trong nước sẽ trở thành chất độc ôn
hòa, ở trạng thái ion hóa NH3. Nhu cầu oxy hòa tan (DO): quá trình nitrite hóa sẽ
đạt cao nhất nếu DO ở mức lớn hơn 80% trạng thái bảo hòa và sẽ không xảy ra
nếu nồng độ DO = 2 mg/L hoặc thấp hơn. Hàm lượng chất dinh dưỡng tối thiểu:
tất cả các vi khuẩn nitrate hóa đều cần một lượng chất dinh dưỡng vô cơ tối thiểu,
trong số đó cần thiết và quan trọng nhất là phosphorus để sản xuất ra ATP
(Adenosine Tri-Phosphate). Sự chuyển hóa ATP cung cấp năng lượng cho các chức
năng của tế bào. Phosphorus thông thường có sẵn trong nước thường dưới dạng lân
hòa tan PO43-.
Tất cả các loài thuộc giống Nitrosomonas đều sử dụng NH3 như là
nguồn năng lượng cho sự chuyển hóa thành NO2-. Amonia đầu tiên bị khử hydro
thành amine (NH2) sau đó bị oxy hóa thành NO2-. Tiến trình chuyển hóa đó cho
phép Nitrosomonas sử dụng một số hợp chất của amine. Một vài loài của
Nitrosomonas có khả năng sử dụng urea như nguồn năng lượng như N. nitrosa, N.
ureae, N. marina (Koops và Rommerening, 2001). Nitrosomonas là vi khuẩn mẫn
cảm với ánh sáng, đặc biệt ánh sáng màu xanh dương và tím.
1.3.2 Quá trình nitrite hoá ở Nitrosomonas
Hai enzyme chìa khoá ở đây là ammonia monooxygenase - AMO (oxi hoá

NH3 thành NH2OH và H2O) và hydroxylamine oxidoreductase (oxi hoá NH2OH
thành NO2-). Trong tế bào vi khuẩn nitrite hoá, cơ chế chung như sau: đầu tiên,

13


Đồ án tốt nghiệp

enzyme ammonia monooxygenase xúc tác chuyển NH3 ngoài môi trường thành
NH2OH theo phản ứng.
NH3 + O2 + 2e-+ 2H+  NH2OH + H2O + 0,7 kcal/mol.

(1)

Cần một năng lượng ban đầu để hoạt hóa enzyme AMO xúc tác phản ứng, do
đó các tế bào không thu được năng lượng sinh ra trong phương trình (1) vì chính
năng lượng này được sử dụng để hoạt hóa tiếp enzyme AMO cho phản ứng với
phân tử ammonia tiếp theo. Hydroxylamine (NH2OH) sinh ra được vận chuyển đến
tế bào chất và chuyển thành nitrite và đồng thời giải phóng ra 1 proton (H+).
NH2OH + O2 + H2O  NO2- + H2O + H+ + 83,3 kcal/mol.

(2)

Để kiểm tra hệ enzyme AMO có thực sự xúc tác chuyển NH3 thành NH2OH
hay không, Hollocher và cộng sự (1981) đã sử dụng hydrazine là một chất ức chế
cạnh tranh đối với enzyme oxy hóa hydroxylamine thành NO2- ở phản ứng (2), kết
quả là môi trường tích tụ ngày càng nhiều hydroxylamine, chứng tỏ đó là kết quả
hoạt động của hệ ezyme AMO.
Bình thường hydroxylamine là chất gây độc cho tế bào khi ở nồng độ thấp,
nên mặc dù nó có thể được sử dụng làm chất khử cho các phản ứng sinh hóa bên

trong tế bào, nhưng tế bào lại oxy hóa chất này thành NO2- và giải phóng năng
lượng.
Chú ý rằng khi oxy hóa NH4OH thành NO2- thì sẽ giải phóng ra nước và H+
đây là nguyên nhân làm tăng tính acid trong môi trường từ qua trình nitrate hóa.
Điều này phá vỡ độ đệm của nước.
Ở phản ứng (1) thì tế bào cần sử dụng oxy trực tiếp để enzyme chuyển NH3
thành NH2OH, trong phản ứng (2) thì oxy sử dụng gián tiếp từ quá trình phân ly
nước. Cụ thể là H2O sẽ bị phân ly trong periplasm bởi enzyme hydroxylamine
oxidoreductase (HAO) thành O2, H+ và e-.
NH2OH + H2O  NO2- + H+ + 4[H+ + e-]
14

(3)


Đồ án tốt nghiệp

Trong quá trình chuyển từ NH2OH ra NO2- có đi qua một hợp chất trung gian
là HNO, do đó phản ứng (2) có thể tách thành hai giai đoạn như sau:
NH2OH  (HNO) + 2[H+ + e-]
(HNO) + H2O  NO2- + H+ + 2[H+ + e-]
Như vậy, phản ứng chung của quá trình nitrite hoá như sau:
NH3 + 1,5O2  NO2- + H+ + H2O + 84 kcal/mol
Điều cần được lưu ý trong quá trình nitrate hóa là cơ chất của ammonia
monooxygenase là NH3 chứ không phải NH4+, vì vậy quá trình nitrite hoá diễn ra
mạnh nhất ở pH trung tính hoặc kiềm (pH 7,5-8,5). Vi khuẩn nitrite hoá thuộc loại
hiếu khí tuỳ nghi, trong điều kiện thiếu oxy chúng sẽ oxi hoá tiếp ra N2O và NO
(Coliver et al., 2000).
Theo Hagopian và cộng sự (1998) thì vi khuẩn nitrite hóa không thể sử dụng
trực tiếp electron cung cấp từ hydroxylamine cho hoạt động khử NAD thành

NADH2. Thay vào đó, năng lượng khử này phải được thu nhận thông qua giai đoạn
tiêu tốn năng lượng (energy-consuming process) được cho là từ con đường vận
chuyển ngược điện tử (reverse electron transport – RET). Điều này cần thiết vì thế
oxy hóa năng lượng sinh ra từ chuỗi vận chuyển điện tử (ETC) ở phản ứng (3) thì
lớn hơn (more positive) so với việc sản xuất ra NADH2. Bản chất của việc vận
chuyển ngược e- theo con đường RET là nhằm tạo ra NADH2 được sử dụng cho
phản ứng:
NH3 + O2 + NADH2  NH2OH + H2O + NAD+
Ở chuỗi vận chuyển điện tử của các vi khuẩn thông thường thì NADH sẽ nhả
H+ ra periplasm và nhường điện tử cho các chất chuyển điện tử nhằm tổng hợp
ATP. Nhưng vì tế bào vi khuẩn không có hệ vận chuyển điện tử như vậy, nên ½
tổng lượng NADH2 của tế bào được tổng hợp ra sẽ tuần hoàn lại phục vụ lại cho hệ
enzyme oxy hóa ammonia (AMO-catalyzed), ½ còn lại sẽ dùng cho chu trình
15


Đồ án tốt nghiệp

Calvin. Hệ enzyme AMO dựa vào hoạt động của enzyme hydroxylamine
oxireductase (HAO) như một nhân khử trong tế bào (vì quá trình phân ly nước diễn
ra ở enzyme này, cung cấp cho tế bào H+ và e-). Kết quả là chỉ một phần năng
lượng ban đầu thu được từ quá trình khử hydro của NH2OH ở phản ứng được dùng
cho hoạt động sinh trưởng. Chuỗi RET xuất hiện không thường xuyên tương ứng
với vòng quay của HAO (có thể enzyme này không thể có đủ để đáp ứng các nhu
cầu khử xuất hiện liên tục, và chuỗi RET buộc phải có để tạo ra NADH2 phục vụ
cho quá trình khử nếu tế bào cần).
Đặc trưng cho chuỗi vận chuyển điện tử ở vi khuẩn nitrate hóa (hay ammoniaoxidizer) là cứ một cặp điện tử electron chuyển đến thì chuỗi vận chuyển điện tử sẽ
tạo ra 2 proton và periplasm. Vì khi cytochrome aa 3 khử oxi về nước, nó sử dụng
2H+ để kết hợp với 0,5 O2 và đồng thời bơm 2H+ khác ra periplasm. Lượng H+ tích
tụ ở periplasm tạo ra gradient và quay trở vào cytoplasm thông qua phức ATPase.

Do đó, có thể kết luận chuỗi vận chuyển điện tử ở vi khuẩn nitrite hoá thực chất là
chuyển e từ quá trình oxi hoá ammonia qua các chất chuyển điện tử và tổng hợp nên
ATP.

Hình 1.2: Con đường vận chuyển điện tử ở Nitrosomonas (nguồn Prescoot, 2002).

16


Đồ án tốt nghiệp

1.4. Nhóm vi khuẩn Nitrobacter
Giống vi khuẩn Nitrobacter gồm hai loài đã được phát hiện: loài N. agilis
được Wignogradsky phân lập từ đất năm 1890. Còn loài N. hamburgensis do Bock
và ctv phát hiện năm 1893 (Watson et al., 1958). Theo Aleem và Alexander (1960),
sự hình thành NO3- là giai đoạn quan trọng trong chu trình nitơ, nhưng số lượng các
loài tham gia vào quá trình này không nhiều. Nitrobacter là nhóm nổi trội, tuy
nhiên vào thời điểm đó chỉ mới được công nhận Nitrobacter agilis.
Vi khuẩn Nitrobacter thuộc nhóm vi khuẩn tự dưỡng hoá năng vô cơ và
hiếu khí bắt buộc. Nitrobacter nhận nguồn năng lượng từ quá trình oxy hoá NO2thành NO3-. Theo Bock và Koops (1992) đã mô tả có 4 giống khác nhau nằm trong
lớp phụ là α-, β-, γ-Proteobacteria và ngành Nitrospira. Nitrospira phân bố trong
môi trường nước mặn (Koops và Pommerening, 2001), có hình que dài và rất mảnh,
chiều rộng khoảng 0,3 - 0,4 µm và dài 2,7 - 6,5 µm.
Nitrobacter thuộc lớp phụ α-Proteobacteria phân bố ở vùng nước ngọt, nước
lợ, đất, bùn và đá. Trong đó có 4 giống thuộc nhóm vi khuẩn nitrite hóa chỉ có
Nitrobacter đã được chứng minh là có nhiều nhất trong đất và bùn (Schmidt và
Belser 1994; Degrange và Bardin, 1995), chúng giữ vai trò quan trọng nhất trong
bước thứ hai của quá trình (Breed et al., 1957). Mặc dù có tối thiểu 4 giống vi
khuẩn nitrate hóa tồn tại trong tự nhiên nhưng phần lớn những hiểu biết về các vi
sinh vật này đều xuất phát từ sự nghiên cứu trên giống Nitrobacter (Lê Văn Khoa,

1995; Bock và Wagner, 2006).
Cũng theo nghiên cứu của các tác giả này các loại vi khuẩn tự dưỡng dùng
năng lượng sinh ra để khử CO2 của không khí và tạo nên các chất hữu cơ cần thiết
cho cơ thể của chúng. Loại vi khuẩn nitrate hóa điển hình nhất là Nitrobacter.
Chúng là những tế bào có hình bầu dục, kích thước vào khoảng 0,8 x 1,0 µm, vi
khuẩn thuộc Gram (-) và không sinh bào tử. Hai loài Nitrobacter chủ yếu là N.
winogradskyi (không di động) và N. agilic (di động). Cơ chất oxy hóa duy nhất của
Nitrobacter là nitrite. Nitrobacter cũng có thể sinh trưởng và phát triển trên các môi
17