Tuyển chọn vi khuẩn bacillus SP có khả năng đối kháng nấm mốc sinh aflatoxin trên hạt nông sản

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

DANH MỤC VIẾT TẮT ................................................................................................................ iv
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................................... v
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ,ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH ..................................................... vi
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................................... 1
1.

Đặt vấn đề ............................................................................................................................. 1

2.

Tình hình nghiên cứu............................................................................................................. 1

3.

Mục đích................................................................................................................................ 3

4.

Mục tiêu đồ án ...................................................................................................................... 3

5.

Phương pháp nghiên cứu..................................................................................................... 3

a)

Phương pháp luận ................................................................................................................ 3

b)

Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................................... 3

6.

Nội dung đồ án...................................................................................................................... 3

7.

Kết cấu đồ án ........................................................................................................................ 4

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................................... 5
1.1.

Nấm Aspergillus flavus ..................................................................................................... 5

1.1.1

Hình thái............................................................................................................................ 5

1.1.2.

Sinh thái ............................................................................................................................ 5

1.1.3.

Thành tế bào ...................................................................................................................... 8

1.2.

Độc tố aflatoxin............................................................................................................... 11

1.2.1.

Lịch sử phát hiện aflatoxin ............................................................................................. 11

1.2.2.

Các loài có khả năng sinh độc tố.................................................................................... 12

1.2.3.

Cơ chất và môi trường .................................................................................................... 14

1.2.4.

Cấu trúc và tính chất của aflatoxin ................................................................................ 18

1.2.5.

Cơ chế gây độc của aflatoxin .......................................................................................... 20

1.2.6.

Độc tính của aflatoxin..................................................................................................... 21

1.2.7.

Giới hạn mức cho phép độc tố aflatoxin ........................................................................ 24

1.2.8.

Tình hình nhiễm độc aflatoxin ...................................................................................... 26

1.3.

Các phương pháp phát hiện Aflatoxin ......................................................................... 27

1.3.1.

Phương pháp phát quang sinh học (Hamed K.Abass và cộng sự, 2004)...................... 27

1.3.2.

Phát hiện bằng đường lý - hoá học ................................................................................ 32
i


Đồ án tốt nghiệp

1.3.3.

Các phương pháp định lượng ......................................................................................... 35

1.4.

Phương pháp khử nhiễm aflatoxin ............................................................................... 37

1.4.1. Phương pháp vật lý học ........................................................................................................ 37
1.4.2. Phương pháp hóa học ........................................................................................................... 38
1.4.3. Phương pháp sinh học:......................................................................................................... 39
CHƯƠNG II: MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................ 41
2.1. Vật liệu – thiết bị – hóa chất................................................................................................... 41
2.1.1. Vật liệu .................................................................................................................................. 41
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ............................................................................................................... 41
2.1.3. Môi trường - Hóa chất ........................................................................................................ 41
2.2. Phương pháp nghiên cứu........................................................................................................ 43
2.2.1. Mục tiêu ................................................................................................................................ 43
2.2.2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................................ 43
2.2.3. Nội dung ............................................................................................................................... 43
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................................... 43
2.2.5. Bố trí thí nghiệm .................................................................................................................. 44
3.1 Phân lập nấm sinh aflatoxin từ sản phẩm nông nghiệp........................................................ 55
3.1.1 Phân lập nấm từ sản phẩm nông nghiệp và khảo sát đặc điểm hình thái ........................ 55
3.1.2 Khảo sát hình thái nấm phân lập trên môi trường phân biệt AFPA ............................... 57
3.1.3 Khảo sát khả năng sinh aflatoxin của các chủng nấm phân lập ....................................... 58
3.1.4 Định tính aflatoxin bằng phương pháp HPLC ................................................................... 60
3.2. Danh sách các chủng vi khuẩn Bacillus spp. có sẵn từ các nguồn nông sản dễ nhiễm mốc
và đất trồng ..................................................................................................................................... 61
3.3. Tuyển chọn vi khuẩn tổng hợp hợp chất kháng nấm sinh aflatoxin .................................. 62
3.3.1 Khảo sát vi khuẩn có khả năng kháng nấm khi đồng nuôi cấy với nấm sinh aflatoxin . 62
3.3.2

Chọn lọc chủng có khả năng tổng hợp chất kháng nấm mạnh nhất ......................... 65

3.3.3

Phương pháp đối kháng sử dụng dịch nuôi cấy có tơ nấm làm chất cảm ứng ......... 65

3.4. Khảo sát đặc điểm của VK chọn lọc và xác định sản phẩm trao đổi chất kháng nấm ..... 68
3.4.1 Khảo sát hình thái, sinh lý, sinh hóa và khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng VK
chọn lọc............................................................................................................................................ 68
3.4.2 Xác định tác nhân đối kháng nấm mốc ............................................................................... 71

ii


Đồ án tốt nghiệp

3.5. Khảo sát khả năng sử dụng sản phẩm trao đổi chất chủng CS1b trong bảo quản hạt bằng
phương pháp tạo màng bao ........................................................................................................... 77
KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 82
1.

Kết luận ................................................................................................................................ 82

2.

Kiến nghị ............................................................................................................................. 83

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................................. 84
PHỤ LỤC .......................................................................................................................................... 1

iii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC VIẾT TẮT
AFPA: Aspergillus flavus and parasiticus agar
EA: ethyl acetate
NA: Nutrient agar
NB: Nutrient broth
MT: Môi trường
PDA: Potato dextrose agar
HPLC: High pressure liquid chromatography
TLC: Thin layer chromatography
UV: Ultraviolet
VK: vi khuẩn

iv


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Các thành phần chính của thành tế bào ở một số nấm ............................... 8
Bảng 1.2 : Thành phần màng nguyên sinh chất ......................................................... 9
Bảng 1.3: Một số loài nấm mốc có khả năng sinh Aflatoxin ................................... 13
Bảng 1.4: Ảnh hưởng của chủng Asp. flavus và các điều kiện nuôi cấy để sản sinh ra
Aflatoxin.................................................................................................................... 16
Bảng 1.5: Ảnh hưởng của các đường hexose khác nhau lên lượng Aflatoxin sinh
ra. ............................................................................................................................... 17
Bảng 1.6:Tính chất hóa lý của một số aflatoxin. ...................................................... 20
Bảng 1.7: Ảnh hưởng của Aflatoxin có mặt trong thức ăn đến các biểu hiện bệnh lý
ở vật nuôi. .................................................................................................................. 22
Bảng 1.8: Giới hạn aflatoxin ở một số nuớc theo tiêu chuẩn của FDA. .................. 24
Bảng 1.9: Những quy định tạm thời cho phép trong thức ăn chăn nuôi và nguyên liệu

làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam. .......................................................................... 25
Bảng 1.10: Các phương pháp khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học. ....... 39
Bảng 2.1: Thành phần dung dịch được sử dụng để làm màng bao đậu phộng ........ 53
Bảng 3.1: Khả năng sinh aflatoxin của các nấm mốc phân lập trên sản phẩm nông
nghiệp.. ...................................................................................................................... 59
Bảng 3.2: Danh sách các chủng vi khuẩn phân lập. ................................................. 62
Bảng 3.3: Tỉ lệ đối kháng trực tiếp của các chủng vi khuẩn với các chủng nấm. .... 63
Bảng 3.4: Tỉ lệ đối kháng (%) của 4 chủng VK tuyển chọn đối với chủng nấm CĐP1
theo cả 3 phương pháp. ............................................................................................. 66
Bảng 3.5: Đặc điểm nuôi cấy của vi khuẩn CS1b. .................................................. 68
Bảng 3.6: Đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch nuôi cấy CS1b. ................. 70
Bảng 3.7: Kết quả phân tích định tính các chất có trong các dung dịch trích ly ...... 71
Bảng 3.8: Đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch kết tủa protein từ dịch nuôi
cấy CS1b ................................................................................................................... 75
Bảng 3.9: Khả năng ức chế nấm mốc và vi khuẩn phát triển trên hạt đậu phộng được
bao màng chitosan và sản phẩm trao đổi chất CS1b ................................................. 95
v


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ,ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Hình thái nấm mốc Asp.flavus.................................................................... 5
Hình 1.2: Nấm mốc Asp.flavus trên hạt đậu phộng. ................................................... 7
Hình 1.3: Cấu tạo của Aflatoxin. .............................................................................. 19
Hình 1.4: Cơ chế tác dụng của aflatoxin B1 ở mức tế bào gan................................ 21
Hình 2.1: Sơ đồ chi tiết phân lập vi nấm sinh aflatoxin từ hạt đậu phộng, đậu nành,
cà phê hư hỏng, khảo sát khả năng sinh aflatoxin của chúng. .................................. 44
Hình 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát đặc điểm vi khuẩn chọn lọc và xác định
sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính kháng nấm. ....................................................... 47

Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát đặc điểm VK chọn lọc và xác định sản
phẩm trao đổi chất có hoạt tính kháng nấm.. .......................................................... 50
Hình 2.4: Sơ đồ thí nghiệm ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng bằng màng bao kháng
nấm. .......................................................................................................................... 54
Hình 3.1: Mẫu hạt nuôi cấy trên môi trường WA. ................................................... 56
Hình 3.2: Các chủng nấm phân lập trên PDA. ......................................................... 57
Hình 3.3: Kết quả chạy sắc ký bản mỏng (TLC) của các chủng vi nấm phân lập phát
hiện phát huỳnh quang khi chiếu tia UV 254 nm. .................................................... 60
Hình 3.4: Kết quả định tính aflatoxin bằng phương pháp HPLC. ........................... 61
Hình 3.5: Kết quả khẳng định khả năng sinh tính aflatoxin bằng phương pháp tái
nhiễm ........................................................................................................................ 62
Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn khả năng đối kháng của các chủng VK Bacillus spp. đối
với các nấm sinh aflatoxin. ....................................................................................... 65
Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn khả năng đối kháng của các chủng 4 VK tuyển chọn đối
với chủng nấm CĐP1. ............................................................................................... 67
Hình 3.8 : Kết quả đối kháng của vi khuẩn CS1b với nấm mốc CĐP1 sau 72 giờ.. 68
Hình 3.9: Hình thái vi khuẩn CS1b. ........................................................................ 70
Hình 3.10: Khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng CS1b sau 48 giờ ủ. ........... 71

vi


Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.11: Khảo sát khả năng đối kháng nấm mốc của dịch protein kết tủa từ canh
trường nuôi cấy vi khuẩn CS1b................................................................................. 74
Hình 3.12: Phát hiện các enzyme thu hồi bằng phương pháp kết tủa sử dụng ethanol
bằng phương pháp đĩa thạch. .................................................................................... 75
Hình 3.13: Khảo sát đối kháng của cao ethyl acetate đối với sự phát triển nấm mốc
................................................................................................................................... 77

Hình 3.14: Đồ thị biểu diễn khả năng đối kháng nấm mốc CĐP1 ........................... 78
Hình 3.15: Theo dõi quá trình phát triển của nấm mốc và vi khuẩn trên hạt đậu phộng
đã được bao gói bằng chitosan kết hợp các sản phẩm trao đổi chất vi sinh vật. Kết
quả coating đậu phộng ngày thứ 10 .......................................................................... 82

vii


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Trên thế giới hiện nay, việc nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và độc tố nấm trên
lương thực, thực phẩm là vấn đề quan trọng nhằm bảo vệ sức khoẻ con người và vật
nuôi.
Độc tố aflatoxin chủ yếu do loài vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus
tạo ra, là độc tố nguy hiểm nhất và thường nhiễm trên nông sản, gây độc cho người
và gia súc, như gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan (ung thư gan…), gây quái
thai, gây đột biến,…thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tử vong. Trong rất
nhiều loại aflatoxin trong tự nhiên thì aflatoxin B1 được coi là chất độc nguy hiểm
nhất. Mặc dù sự hiện diện của Aspergillus flavus không phải lúc nào cũng gắn liền
với việc tồn tại aflatoxin với hàm lượng gây độc, nhưng nó cũng thể hiện nguy cơ lớn
về việc có thể nhiễm aflatoxin.
Ở nước ta, với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, độ ẩm trong không khí thường
cao, thời vụ canh tác, thu hoạch thường rơi vào mùa mưa trong khi các phương tiện
thu hoạch, phơi sấy nông sản kém, kho chứa không đảm bảo khô ráo thoáng mát là
điều kiện rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây nhiễm độc tố cho thực phẩm và
thức ăn chăn nuôi.
Do đó việc kiểm soát dư lượng aflatoxin là cần thiết và quan trọng. Giới hạn về mức
nhiễm aflatoxin đã là một trong những tiêu chuẩn của an toàn vệ sinh thực phẩm. Để

có cái nhìn tổng quan về aflatoxin, các ảnh hưởng của độc tố này lên cơ thể con người
cũng như các loài động vật và các biện pháp phòng tránh việc nhiễm aflatoxin, nhó
chúng tôi đã chọn đề tài: “Tuyển chọn VK Bacillus sp. có khả năng đối kháng nấm
mốc sinh aflatoxin trên hạt nông sản”.
2. Tình hình nghiên cứu
Ðã từ lâu độc tố nấm ít được các nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu, kể cả các
nước tiên tiến có đời sống cao. Tuy nhiên trong những năm 1920-1930 ở Anh và Nga
đã thấy xuất hiện nhiều trường hợp ngộ độc ankaloic ở người và gà mà chất này có
trong lúa mạch, lúa mì. Năm 1924 Shofield và cộng tác đã phát hiện một loại độc tố
1


Đồ án tốt nghiệp

được sản sinh từ nấm mốc gây dịch bệnh cho gia súc. Cũng trong thời gian này Nga
tìm ra bệnh Aleukemic ở một số người ăn phải ngũ cốc bị mốc.
Ðến năm 1960 nhân một vụ dịch làm chết hàng ngàn con gà tây con tại một quần đảo
nước Anh do ăn phải lạc thối mốc, các nhà khoa học Tây âu tiến hành nghiên cứu và
phát hiện ra độc tố Aflatoxin, một độc tố được tiết ra từ nấm Aspergillus flavus,
parasiticus và fumigatus. Năm 1961 ở Anh, người ta đã tiến hành thực nghiệm trên
chuột cống trong, cho ăn thức ăn đã nhiễm mốc trong đó 20% là bột lạc thối, sau 6
tháng thấy xuất hiện ung thư gan.
Theo thống kê của một số tác giả thì ở những nước có đời sống cao như châu Âu,
cùng với điều kiện khí hậu lạnh khô thì tỉ lệ ung thư gan do Aflatoxin thấp hơn nhiều
so với các nước có đời sống thấp và khí hậu nóng ẩm như châu Phi. Robinson nghiên
cứu trên trẻ em Ấn Độ bị xơ gan, bằng phương pháp sấc kí lớp mỏng, ông đã tìm thấy
Aflatoxin trong nước tiểu của những trẻ bị xơ gan và trong sữa của những bà mẹ có
con bị xơ gan. Như vậy, theo ông giữa xơ gan và Aflatoxin có một mối quan hệ khá
chặt chẽ với nhau.
Ở Thái Lan, năm 1967 nhóm nghiên cứu của Shank cho thấy các mẫu lương thực

thực phẩm bị mốc thì 50-60% số mẫu đó có Aflatoxin . Ðồng thời nhóm tác giả này
tiến hành trên thức ăn gia đình (lấy mẫu lương thực thực phẩm tại các gia đình) cũng
thấy có 30-50% số mẫu có độc tố aflatoxin.
Ở Việt Nam cho đến nay còn ít có những công thành công bố vế vấn đế này. Theo
kết quả của Viện Vệ Sinh Dịch Tễ đã nghiên cứu trên 29381 mẫu lương thực thực
phẩm thấy có 30 loại men mốc khác nhau, trong đó mốc Aspergillus chiếm tỉ lệ cao
nhất (5,2-80,39%) bao gồm 12 chủng loại Aspergillus khác nhau. Trong số đó có 11
chủng có khả năng sinh độc tố. Năm 1984 theo tài liệu của Viện dinh dưỡng quốc gia
đã nghiên cứu trên 200 mẫu gạo bán ở Hà Nội thấy ở 2 mẫu có nhiều nấm Aspergillus
Flavus một loại nấm có khả năng tạo ra Aflatoxin.
Năm 1988, Viện dinh dưỡng đã thông báo kết quả thăm dò Aflatoxin B1 trong lạc và
sản phẩm từ lạc như sau: Có 7/55 số mẫu lạc nhân có Aflatoxin B1 (13%) 2/6 mẫu xì
dầu có Aflatoxin (33%).Theo kết quả nghiên cứu bước đầu của Bộ môn Dinh dưỡng
2


Đồ án tốt nghiệp

và An toàn thực phẩm (Trường Đại Học Y Hà Nội) kết quả nghiên cứu 30 mẫu tương
ăn và trên 60 mẫu sữa mẹ ở Hà Nội, kết quả cho thấy xấp xỉ 30% số mẫu tương có
độc tố Aflatoxin; còn trên sữa mẹ thì chưa phát hiện thấy.
3. Mục đích
-

Phân lập VK có khả năng đối kháng nấm sinh aflatoxin.

4. Mục tiêu đồ án
-

Phân lập vi nấm sinh aflatoxin từ hạt đậu phộng, hạt đậu nành và hạt cà phê.

-

Sàng lọc tuyển chọn VK đối kháng nấm sinh aflatoxin.

5. Phương pháp nghiên cứu
a) Phương pháp luận
Có nhiều phương pháp khảo sát khả năng đối kháng của các chủng VK với vi nấm
sinh afltoxin. Trong đó, các phương pháp tối ưu được sử dụng là phương pháp đồng
nuôi cấy không ly tâm, phương pháp đồng nuôi cấy có ly tâm và phương pháp sử
dụng tơ nấm làm chất cảm ứng. Từ các kết quả đối kháng tìm ra các tác nhân đối
kháng mà không phải sử dụng trực tiếp tế bào VK.
b) Phương pháp xử lý số liệu
-

Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị.

-

Sử dụng phần mềm Statgraphics để xử lý số liệu.

6. Nội dung đồ án
Nghiên cứu được thực hiện bởi 2 sinh viên ( Đỗ Tuyết Mai, Nguyễn Vân Hương).
Riêng đồ án tốt nghiệp này được trình bày bởi Đỗ Tuyết Mai với các nội dung sau:
-

Phân lập vi nấm từ hạt đậu phộng, hạt đậu nành và hạt cà phê.

-

Sàng lọc vi nấm sinh aflatoxin.

-

Khẳng định khả năng sinh aflatoxin của vi nấm.

-

Sàng lọc, tuyển chọn và định danh sơ bộ VK Bacillus.

-

Khảo sát khả năng đối kháng của VK đã phân lập với vi nấm sinh aflatoxin mạnh
nhất.

-

Khảo sát các tác nhân đối kháng từ VK chọn lọc.

-

Khuyến cáo ứng dụng.
3


Đồ án tốt nghiệp

7. Kết cấu đồ án
- Chương I: Tổng quan tài liệu – nội dung chương này đề cập đến các nội dung
liên quan đến tài liệu nghiên cứu.

- Chương II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập
đến các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án.
- Chương III: Kết quả và thảo luận – nội dung chương đưa ra những kết quả
mà đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biện chứng cho kết quả
thu được.
- Chương IV: Kết luận và đề nghị - nội dung chương tóm lại những kết quả mà
đề tài đạt được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài

4


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Nấm Aspergillus flavus

1.1.1 Hình thái
Loài Aspergillus flavus rất dễ nhận biết bởi màu vàng hơi lục và dạng ít nhiều vón
cục của tán. Ở đỉnh các cuống bào tử đính mọc thẳng đứng, có vách sần sùi, hình
thành những đầu mang bào tử đính có dạng gần hình cầu đến thuôn dài. Các thể chai
hoặc đính trực tiếp vào đầu mang bào tử đính (thể bình một lớp) hoặc qua một lớp
thể bình trung gian (thể bình 2 lớp); đôi khi cả hai kiểu đồng thời tồn tại.

Hình 1.1: Hình thái nấm mốc Asp.flavus.
Các bào tử có kích thước khá lớn (đường kính từ 5-7 μm) hình cầu, màu vàng nâu
đến hơi lục, hơi sần sùi. Đôi khi người ta chỉ coi là thuộc loài Asp. flavus những loài
nấm có cuống bào tử đính xù xì và hai lớp thể bình, còn ở loài Asp. parasiticus thì
cuống bào tử đính nhẵn và thể bình một lớp.

1.1.2. Sinh thái
Asp.flavus được xem là loài được phân bố khắp mọi nơi: dưới đất, trên các chất hữu
cơ, và các loại hạt nhất là các hạt có dầu. Từ lâu, người ta đã phát hiện sự có mặt của
nó ở dưới đất, dù là trong rừng, ở vùng than bùn, vùng đất hoang sa mạc Sahara, hoặc
trong đất cày cấy, đất mùn, hệ rễ cà chua, hoặc hệ rễ lúa mì. Người ta còn coi nó là
có thể nhanh chóng xâm nhập lại đất đã khử trùng bằng hơi nước. Đất đai vùng nhiệt
đới chứa nhiều loài này hơn nhiều so với đất đai vùng ôn đới. Nó thường gặp trên lúa
mì, bột, trên các chế phẩm bột sống, trong bánh mì.

5


Đồ án tốt nghiệp

Ngô gạo cũng như các sản phẩm từ ngô gạo thường chứa loài này. Nó có rất nhiều
trên sợi bông và nhất là trên hạt bông, nó xâm nhập vào hạt qua các điểm hợp hoặc
nhờ những chỗ hủy hoại do côn trùng gây ra... Ngoài ra người ta còn thấy nó trên: hạt
và khô dầu tương, củi dừa, sắn, nhân hạt ca cao, quả cà phê, quả hồ đào Brazin, thuốc
lá, hạt lúa miến, hạt hướng dương, hạt thông, kê, ớt hạt tiêu đỏ, củ cải đường, quả lê,
giăm bông, dồi thịt và nhiều thức ăn khác... Sự có mặt của các loài này trong các thức
ăn phức hợp của gia súc, ngay khi nuôi không có ngô lạc, trên cỏ khô gia súc cũng
vậy. Nếu có điều kiện thuận lợi, nó sinh sôi này nở rất nhiều; trên lúa mì tồn trữ trong
kho kín có độ ẩm 15,2 % đến 17 % bào tử của nó chiếm từ 50-100 % tổng số bào tử
có mặt, nhiều đến nỗi trên mặt kho đóng vón lại thành một lớp vỏ cứng sâu tới 0.6 m.
Nó cũng thường có mặt trên ngô bẹ khi độ ẩm vượt quá 15,5 %. Nấm mốc độc
Aspergillus flavus gặp nhiều ở các loại lương thực, thực phẩm khác nhau, nhưng các
loại hạt có dầu (đặc biệt là đậu phộng) thích hợp nhất cho sự phát triển của nó, và
cũng ở đậu phộng độc tố aflatoxin hình thành mạnh nhất. Người ta ngiên cứu hơn
1.000 mẫu đậu phộng thí nghiệm thì thấy hạt đậu phộng có 3,3 % số hạt là rất độc –
1 kg chứa trên 0,25 mg aflatoxin B1 (độc tố chủ yếu của Aspergillus flavus) và 21,7%

số hạt độc vừa, 75 % số hạt không độc. Còn trên đậu phộng khô: 42% số mẫu là rất
độc, 49,3% độc vừa và chỉ có 8,7% là không độc. Như vậy chất độc tích lũy lại trong
đậu phộng khô là do sự chế biến, hoặc do Aspergillus flavus phát triển mạnh lên.
Bào tử của nấm Asp. flavus có khả năng phát tán trong không khí, trong nước, trong
đất. Đặc biệt khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát sinh phát triển trên lương thực,
thực phẩm, hoa quả và thậm chí còn gây hại một số loài cây trồng. Vì phạm vi ký chủ
rộng, khả năng phát tán rất lớn nên phòng trừ nấm hại này thường rất khó khăn. Nấm
Asp. flavus có thể ký sinh, gây hại các loại lương thực như: lúa, ngô, sắn, trên một số
loại hạt làm thực phẩm như: đậu phộng, đậu, vừng..., trên thực phẩm như: các sản
phẩm chế biến từ ngũ cốc, đậu phộng, vừng, đậu đỗ,…và thậm chí cả trên hoa quả
tươi bị dập như: thanh long, nhãn, xoài, vải,… Trong quá trình xâm nhiễm, sinh
trưởng phát triển, chúng tiết ra độc tố aflatoxin.

6


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.2: Nấm mốc Asp.flavus trên hạt đậu phộng.
Gạo và đậu phộng là nguồn lương thực, thực phẩm rất cần thiết và quan trong đối với
con người. Song nếu gạo và đậu phộng không đảm bảo an toàn thì đây lại là nguồn
lây nhiễm cho con người những căn bệnh hiểm nghèo, đặc biệt là ung thư gan. Đứng
trên góc độ an toàn thực phẩm các nhà khoa học đều cho rằng tác nhân gây ngộ độc
thực phẩm lớn nhất trong gạo và đậu phộng là nấm mốc.
Đậu phộng và các sản phẩm từ đậu phộng chắn chắc là nơi phát triển ưa thích nhất
của Asp. flavus. Không phải chỉ có duy nhất loài này, nhiều loài nấm khác thường đi
kèm với nó, trong số này một số lớn loài cũng được xem là độc với súc vật: một số
loài Fusarium trong đó có F. monoliforme, các loài Rhizopus, các loài Penicillium
citrinum, P. purpurogenum.
Đậu phộng là một loại hạt có nước: 7,4%, protein:28%, lipid: 44,5%, glucid:

15%...Các nhà khoa học cũng đã phân lập được ở trong đậu phộng có một loài nấm
độc Aspergillus flavus và thấy rằng các trường hợp ngộ độc trước đây đều liên quan
đến nấm mốc độc đó. Nấm mốc độc này cũng có gặp ở trong một số ngũ cốc khác
nhưng với đậu phộng có thể là môi trường thuận lợi nhất cho nó phát triển. Nấm mốc
khi xâm nhập vào trong đậu phộng chúng phát triển làm cho đậu phộng bị mốc xanh
hoặc mốc vàng. Đặc biệt nấm mốc này sinh ra độc tố aflatoxin.
Trong gạo có chứa các thành phần hoá học như ở gạo tám glucid: 82,2%, protein:
6,6%, nước: 10%, lipid:1,0%, chất khoáng: 0,4%, vitamin B1: 0,08%. Do đó đây là
một môi trường rất thuận lợi cho nấm mốc xâm nhập và phát triển khi biện pháp bảo
quản không hiệu quả. So với thóc, gạo không còn lớp vỏ trấu để bảo vệ, các chất dinh
dưỡng ở lớp ngoài của gạo lại nhiều nên rất dễ bị nấm mốc phá hoại. Đặc biệt ở nước
7


Đồ án tốt nghiệp

có khí hậu nóng ẩm, đây là một điều kiện tốt để cho nấm mốc sinh trưởng gây ảnh
hưởng đến chất lượng của gạo. Các nhà khoa học đã phân lập được nhiều loài nấm
mốc trên gạo, trong mỗi loài có nhiều chủng, nhưng có hai loài hay gặp nhất là
Aspergillus và Penicilium.
1.1.3. Thành tế bào
Sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh bên trong chứa chất nguyên sinh có
thể lưu động. Về chiều dài chúng có sự sinh trưởng vô hạn nhưng về đường kính thì
thường chỉ thay đổi trong phạm vi 1-30 µm (thông thường là 5-10 µm).
Đầu sợi nấm có hình viên trụ, phần đầu gọi là vùng kéo dài (extension zone). Lúc sợi
nấm sinh trưởng mạnh mẽ đây là vùng thành tế bào phát triển nhanh chóng, vùng này
có thể dài đến 30 µm. Dưới phần này thành tế bào dày lên và không sinh trưởng thêm
được nữa. Màng nguyên sinh chất thường bám sát vào thành tế bào. Trên màng
nguyên sinh chất có một số phần có kế cấu gấo nếp hay xoắn lại, người ta gọi là biên
thể màng (plasmalemmasome) hay biên thể (lomasome). Nhiều khi chúng có tác dụng

tiết xuất các chất nào đó.
Thành tế bào (cell wall) của nấm có thành phần hóa học khác nhau. Đây là một tiêu
chí quan trọng khi định loại nấm.
Bảng 1.1: Các thành phần chính của thành tế bào ở một số nấm
Chi nấm:

1

2

3

4

5

6

β-Glucan

16

54

0

43

29

6

Cellulose

-

36

0

0

0

0

58

0

9

19

1

10

Chitosan

-

10

33

-

0

-

Mannan

-

<1

2

2

31

<3

Protein

10

5

6

11

13

7

-

3

8

5

9

3

Thành phần thành tế
bào:

Chitin

Lipid

8

Đồ án tốt nghiệp

Chú thích:

1- Allomyces
2- Phytophthora
3- Mucor
4- Aspergillus
5- Saccharomyces
6- Schizophyllum

Thành phần chính trong thành tế bào của một số nhóm nấm là như sau:
 Acrasiales

Cellulose, Glycogen

 Oomycetes Cellulose, Glucan
 Hyphochytriomycetes
 Zygomycetes

Cellulose. Chitin

Chitin, Chitosan

 Chytridiomycetes, Ascomycota (dạng sợi),
 Fungi Imperfecti

Basidiomycota (dạng sợi),

Chitin, Glucan

 Riêng với Saccharomycetales và Cryptomycocolacales là Glucan, mannan
 Với Rhodotorula và Sporobolomycetales là Chitine, mannan
Với màng nguyên sinh chất (protoplasmic membrane) thì thành phần ít thay đổi ở các
loài nấm sợi, có khác nhau với dạng nấm men.
Bảng 1.2 : Thành phần màng nguyên sinh chất
Loài nấm

1

2

3

4

5

Thành phần màng
NSC
Protein

52,0

38,5 46,5

45,5

25,5

Lipid

43,0

40,4 41,5

31,0

40,0

Polysaccharide

9,0

5,2

3,2

25,0

30,0

Acid nucleic

0,3

1,1

7,5

0,5

-

Chú thích:

1- Candida albicans (dạng nấm men)
2- Candida utilis
3- Saccharomyces cerevisiae
9


Đồ án tốt nghiệp

4- Candida albicans (dạng nấm sợi)
5- Fusarium culmorum
Nhân tế bào được bao bọc bởi màng nhân, trên màng nhân có nhiều lỗ thủng,
trong nhân có hạch nhân (nucleolus). Thường có nhiều nhân tập trung ở phần ngọn
của sợi nấm. Trong các tế bào phía sau ngọn thường chỉ có 1-2 nhân.
Nhân của nấm thường nhỏ, khó thấy rõ dưới kính hiển vi quang học. Nhiễm
sắc thể trong nhân thường không dễ nhuộm màu, số lượng tương đối nhỏ. Số lượng
này là 6 ở các nấm Magnaporthe grisea, Paecilomyces fumosoroseus, Trichoderma
reesei; là 7 ở các nấm Histoplasma capsulatum, Neurospora crassa, Phenaerchateae
chrysosporium, Podospora anserina, là 8 ở các nấm Aspergillus nidulans.
Aspergillus niger,Acremonium chrysogenum, Beauveria basiana, Lentinus edodes, là
10 ở nấm Penicillium janthinellum,là 11 ở nấm Schizophyllum commune, là 12 ở
nấm Curvularia lunata, là 13 ở nấm Agaricus bisporus, là 15 ở nấm Cyanidioschyzon
merolae, là 20 ở nấm Ustilago maydis….

Trong tế bào nấm còn có các cơ quan giống như trong tế bào các sinh vật có
nhân thực (Eukaryote) khác. Đó là ty thể (mitochondrion), mạng nội chất
(endoplasmic reticulum), dịch bào hay không bào (vacuolus), thể ribô (ribosome),
bào nang (vesicle) , thể Golgi sinh bào nang (Golgi body, Golgi apparatus,
dictyosome), các giọt lipid (lipid droplet), các tinh thể (chrystal) và các vi thể đường
kính 0,5-1,5 nm (microbody), các thể Vôrônin đường kính 0,2µm (Woronin body),
thể Chitô đường kính 40-70 nm(chitosome)… Ngoài ra trong tế bào chất còn có các
vi quản rỗng ruột, đường kính 25 nm (microtubule), các vi sợi đường kính 5-8 nm
(microfilament),các

thể

màng

biên

(plasmalemmasome).

Ribosome của nấm thuộc loại 80S (S là đơn vị hệ số lắng Svedberg) có đường
kính khoảng 20-25 nm, gồm có 2 bán đơn vị (subunit); bán đơn vị lớn (large subunit)
60S (gồm 3 loại RNA- 25S; 5,8S và 5S cùng với 30-40 loại protein). Bán đơn vị nhỏ
(small subunit) 40S (gồm loại RNA 18S và 21-24 loại protein)
Phần ngọn có thể tách với phần bên dưới bằng một không bào, lúc đầu nhỏ
nhưng về sau kết hợp lại với nhau để lớn dần, tạo nế áp lực dồn tế bào chất về phía
10


Đồ án tốt nghiệp

đỉnh ngọn sợi nấm. Tại phần già nhất của sợi nấm thường xảy ra hiện tượng tự tan

(autolysis) hoặc bị tan rã dưới tác dụng của các men phân cắt (lytic enzyme) do các
vi sinh vật khác sinh ra. Cũng có những phần sợi nấm già phần lipid tích tụ nhiều và
kết hợp với thành tế bào tạo nên một màng dày, tạo thành những bào tử áo
(chlamydospore). Loại bào tử này có thể giúp sợi nấm tồn tại được qua những điều
kiện môi trường khắc nghiệt. Trường hợp này rất giống với các bào tử nội sinh
(endospore).
Sợi nấm không ngừng phân nhánh và vì vậy khi một bào tử nẩy mầm trên một
môi trường đặc sẽ phát triển thành một hệ sợi, sau 3-5 ngày có thể tạo thành một đám
nhìn thấy được gọi là khuẩn lạc (colony). Vào giai đoạn cuối của sự phát triển khuẩn
lạc sẽ xảy ra sự kết mạng (anastomosis) giữa các khuẩn ty với nhau, làm cho cả khuẩn
lạc là một hệ thống liên thông mật thiết với nhau, thuận tiện cho việc vận chuyển chất
dinh dưỡng đến toàn bộ hệ sợi nấm. Hiện tượng kết mạng thường gặp ở nấm bậc cao
nhưng lại ít gặp ở các sợi nấm dinh dưỡng của nấm bậc thấp. Hình thái, kích thước
màu sắc, bề mặt của khuẩn lạc…có ý nghĩa nhất định trong việc định tên nấm.
Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt, ở một số nấm sợi nấm mang sắc tố tạo
nên màu tối hay màu sặc sỡ. Sắc tố của một số nấm còn tiết ra ngoài môi trường và
làm đổi màu khu vực có nấm phát triển. Một số nấm còn tiết ra các chất hữu cơ tạo
nên các tinh thể trên bề mặt khuẩn lạc. Vì bào tử của nấm thường cũng có màu nên
cả khuẩn lạc thường có màu.
1.2.

Độc tố aflatoxin

1.2.1. Lịch sử phát hiện aflatoxin
Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm ở nước Anh bị tổn thất rất nặng nề, lúc đầu hơn
10.000 gà tây chết vì một bệnh mới gọi là“bệnh gà tây X” (Turkey X disease). Sau
đó, các loại gia cầm khác như vịt, gà lôi cũng bị nhiễm bệnh và chết rất nhiều. Qua
điều tra người ta xác định được bệnh đó có liên quan đến một loại độc tố do nấm có
trong thức ăn sinh ra. Đến năm 1961, người ta đã tìm ra bản chất hoá học của chất
này là aflatoxin do vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Aflatoxin có

4 dẫn xuất quan trọng là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2. Giữa 4 loại trên thì aflatoxin
11


Đồ án tốt nghiệp

B1 chiếm nhiều nhất trong nông sản và gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc nhanh
nhất và phổ biến nhất (Nabil Saad, 2004).
Năm 1961, các công trình nghiên cứu công nhận rằng aflatoxin được sinh ra bởi nấm
Aspergillus flavus và có thể là nguyên nhân gây ra khối u gan của động vật. Trên
động vật thủy sản, những nghiên cứu đầu tiên về độc tố aflatoxin trên cá hồi được
thực hiện bởi Ashley và các cộng sự.
Từ đó trở đi có nhiều công trình nghiên cứu về độc tố aflatoxin. Các nhà khoa học
cũng đã xác định được công thức phân tử và công thức cấu tạo của aflatoxin.
1.2.2. Các loài có khả năng sinh độc tố
Aflatoxin được sản sinh chủ yếu từ 2 chủng nấm quen thuộc là chủng Aspergillus
flavus và Aspergillus parasiticus. Ngoài ra còn có một số loài khác cũng có khả năng
sinh Aflatoxin nhưng yếu hơn như Asp. nomius.
Bảng 1.3: Một số loài nấm mốc có khả năng sinh aflatoxin

12


Đồ án tốt nghiệp

Loài nấm mốc

Aflatoxin
B1

B2

G1

G2

Aspergillus flavus

+

+

Aspergillus parasiticus

+

+

+

+

Aspergillus nomius

+

+

+

+

Aspergillus oryzae

+

Aspergillus niger

+

Aspergillus wentii

+

Aspergillus ruber

+

Aspergillus ostianus

+

Aspergillus orchraceus

+

Penicilliumpuberulum

+

Penicilliumvariabile

+

+

+

+

+

Penicillium frequentans +
Penicilliumcitrinum

+

Rhizopus sp.

+

(Nguồn: Phạm Hoàng Thái, 2007)
Không phải tất cả các chủng Aspergillus flavus được khảo sát đều sinh ra độc tố
aflatoxin, chỉ có 73% có khả năng sinh aflatoxin, trong đó có 23% sản sinh aflatoxin
ở mức cao nhất. Một số tác giả ghi nhận được nhiều biến đổi quan trọng về mặt sinh
độc tố tùy theo cơ chất, từ đó đã phân lập chủng Aspergillus flavus và tùy theo nguồn
gốc địa lý: trong số 284 mẫu phân lập từ gạo ở Mỹ có 94% số chủng sinh độc tố, 86%
đối với các mẫu phân lập từ đậu phộng, và 71% cũng được phân lập từ đậu phộng
như ở Ixraen. Các chủng gốc vùng nhiệt đới có nhiều loài sinh độc tố hơn vùng ôn
đới.

Ngoài ra, số lượng aflatoxin sản sinh ra cũng thay đổi rất nhiều tùy theo các chủng,
người ta đã tìm thấy điều này khi nuôi cấy chúng để so sánh trên cùng một cơ chất và
trong những điều kiện như nhau. Người ta đã ghi lại những mức sản sinh từ một vài
13


Đồ án tốt nghiệp

mg/kg đến 100, 200, 500, 1000 và thậm chí gần 2000 mg/kg cơ chất. Gần đây hơn,
ngoài việc định lượng tổng số aflatoxin, người ta còn quan tâm xác định tỷ lệ riêng
phần của các aflatoxin đã biết. Nói chung, Aflatoxin B1 được tạo ra nhiều nhất trong
cả thiên nhiên lẫn trong nuôi cấy, rồi đến aflatoxin G1, sau đó là aflatoxin B2, còn về
G2 và các chất khác tỷ lệ thấy khá thấp.
Người ta đã thử nhận dạng các chủng sinh độc tố và các chủng không sinh độc tố qua
những đặc điểm hình thái. Một số người cho rằng các chủng sinh độc tố bao giờ cũng
có đầu bào tử đính màu xanh lục, ngay cả ở các giống nuôi cấy lâu ngày, thể bình hai
lớp, cuống bào tử đính có vách có gai, ở những chủng sinh độc tố có sự phình to một
số phần của sợi nấm tạo thành những cục nhỏ, những dị thường đặc trưng cho các
dòng sản sinh aflatoxin. Tuy nhiên, thường rất khó thăm dò biết một cách chắc chắn
những chủng có sinh aflatoxin và những chủng không sinh aflatoxin ngoài cách dùng
con đường sinh học và hóa học.
Một số chủng sinh độc tố có thể mất khả năng đó qua nhiều lần cấy truyền liên tiếp
trên các môi trường tổng hợp. Thế nhưng tính độc của một chủng tăng lên khi cấy
truyền liên tiếp trên những môi trường tự nhiên thích hợp.
Một số loài nấm mốc khác cũng có khả năng sinh aflatoxin với lượng rất ít như loài:
Penicillium puberulum Bai, các chủng thuộc Aspergillus như Aspergillus tamariikita,
Aspergillus niger tiegh, Aspergillus ostiamis wehmen, Aspergillus ruper. Tuy nhiên
cũng còn nhiều tranh cãi vì trong quá trình phát triển, Aspergillus flavus thường lẫn
với nhiều loài nấm khác, đặc biệt là với Penicillium rubrum stoll và khi đó có thể
nhầm aflatoxin là do Penicillium sản sinh ra. Trong một số trường hợp, cũng có thể

nhầm lẫn với độc tố Sterigmatoxistin và Avecsin vì có cấu tạo hóa học gần giống với
aflatoxin.
1.2.3. Cơ chất và môi trường
Khả năng sinh độc tố của các chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus rất
khác nhau. Điều đó phụ thuộc vào các yếu tố như chủng nấm mốc, các cơ chất, các
yếu tố nhiệt độ, độ ẩm của cơ chất và môi trường.

14


Đồ án tốt nghiệp

Các chủng phát triển trên hạt có dầu và nhất là trên đậu phộng và những sản phẩm từ
đậu phộng được ghi nhận sinh đôc tố nhiều hơn các chủng phân lập từ sản phẩm ngũ
cốc ở các nước thuộc địa. Các chủng phân lập từ thịt ôi, bánh mì, các thực phẩm bột
sống hoặc pho mát ô nhiễm tự nhiên thường không hoặc ít sinh độc tố. Ngược lại,
gần một phần ba số chủng phân lập từ gia vị có sản sinh Aflatoxin.
Tính độc của một số chủng được giảm độc tính nếu sau này các chất độc của chúng
được những vi sinh vật khác chuyển hóa thành những chất dẫn xuất không hoạt động.
Chính vì vậy ở Texas, người ta rất ngạc nhiên khi thấy đậu phộng có vỏ nhiễm
Aspergillus flavus rất nặng nhưng lại có độ độc thấp. Nghiên cứu các hạt đậu phộng
đó, thì phát hiện có những loài vi khuẩn và nấm có khả năng hoặc ức chế sự hình
thành các aflatoxin hoặc biến đổi những aflatoxin được sản sinh ra thành những chất
ít độc hơn. Người ta đã dựa trên hiện tượng này để tìm tòi một biện pháp sinh học
nhằm tẩy độc các sản vật đã bị hư hỏng.
Sản lượng aflatoxin thường tỷ lệ với trọng lượng hệ sợi nấm tạo thành khi nuôi cấy:
khi số lượng hệ sợi nấm đạt trị số tối ưu thì sản lượng đó lớn nhất, nhưng nó giảm sút
rất nhanh chóng bắt đầu từ lúc hệ sợi nấm tự phân giải: sự phân giải này tương ứng
với sự phân hủy các aflatoxin, được đẩy mạnh khi thông khí tốt và lắc mạnh các bình
nuôi cấy.

Nhìn chung, sự sản xuất Aalatoxin, trong điều kiện nuôi cấy thông thường, bắt đầu
từ lúc hình thành các cơ quan mang bào tử đính của Aspergillus flavus, nó tăng dần
cho đến giai đoạn sinh bào tử mạnh mẽ, tức là khoảng ngày thứ 6 rồi giảm sút.
Nhiều yếu tố vật lý và dinh dưỡng khác cũng ảnh hưởng đến hàm lượng aflatoxin
được sinh ra trong điều kiện nuôi cấy và điều kiện tự nhiên. Những biến thiên về nhiệt
độ có thể thấy trong thiên nhiên, với nhiêt độ ở các đỉnh cao là 45-500C cho thấy
không thuận lợi cho việc sản sinh aflatoxin bằng nhiệt độ ổn định ở 250C.
Hàm lượng nước của cơ chất có vai trò trong việc sản sinh aflatoxin, gắn liền với sự
phát triển tương đối của Asp. flavus, ở 320C trên lạc có hàm lượng nước trong khoảng
15 và 30 % aflatoxin hình thành sau 2 ngày. Như vậy, trong điều kiện nhiệt đới, nếu
Asp. flavus phát triển trên đậu phộng không có aflatoxin thì 48 giờ sau có thể phát
15


Đồ án tốt nghiệp

hiện được aflatoxin. Trên gạo có hàm lượng nước 24-26 % hoặc trên ngô 19-24 %,
aflatoxin cũng hình thành nhanh chóng như vậy nếu nhiệt độ khá ấm.
Giá trị pH ban đầu có ảnh hưởng rất ít đến sự hình thành aflatoxin. Giá trị pH thích
hợp để Asp. flavus sinh độc tố aflatoxin ở giá trị pH giữa 4-5. Hàm lượng khí cacbonic
tăng lên trong khí quyển làm hạn chế sự sinh trưởng của Asp. flavus do đó giảm lượng
aflatoxin sinh ra, giảm hàm lượng oxi và tăng hàm lượng nitơ trong khí quyển hàm
lượng aflatoxin cũng giảm. Các aflatoxin được xem là nhạy cảm với ánh sáng, nhưng
thực tế chúng nhạy cảm với tia tử ngoại.
Người ta đã tiến hành nhiều công trình nghiên cứu về tầm quan trọng của các yếu tố
dinh dưỡng khác nhau lên sản lượng aflatoxin thể hiện qua các điều kiện nuôi cấy
khác nhau.
Bảng 1.4: Ảnh hưởng của chủng Asp. flavus và các điều kiện nuôi cấy để sản sinh ra
aflatoxin.
Chủng

Môi trường nuôi cấy

Tổng lượng

Số lượng so sánh (% các

aflatoxin

aflatoxin)

(mg/l hoặc

B1

B2

G1

G2

mg/kg)
ATCC 15517

Tổng hợp

45

87

4

9

<1

Chưa xác định

Đậu phộng

265

44

1

54

1

Chưa xác định

Đậu phộng

14

98

2

0

0

NRRL 2999

Lúa mì

870

35

9

48

7

NRRL 2999

Lúa mì +metionin

700

44

11

38

7

NRRL 2999

Gạo

23,8

6,3

6,8

0,9

NRRL 3000

Saccarose + acid amin

86

26

0

74

0

154

70

0

30

0

(nuôi cấy chìm) 72h ở
200C
NRRL 3000

-Nt- ở 250C

Ghi chú: ATCC, NRRL : ký hiệu của bộ sưu tập chủng chuẩn
16


Đồ án tốt nghiệp

(Nguồn: Phạm Hoàng Thái, 2007)
Nguồn Cacbon : Nhiều tác giả đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc thêm các đường
hexose vào môi trường nuôi cấy chất khoáng lên hàm lượng aflatoxin do A. flavus
sinh ra và ghi nhận các đường glucose, fructose, manose thuận lợi cho sự tổng hợp
aflatoxin.
Bảng 1.5: Ảnh hưởng của các đường hexose khác nhau lên lượng Aflatoxin sinh ra.
Glucid

Nồng độ
1%

3%

D – glucose

+++

+++

D – manose

+++

+++

D – fructose

+++

+++

D – galactose

-

++

D – glucose

-

0

D – arabinose

-

-

D – xylose

+

++

D – ribose

-

+

D – eritrose

-

0

D – glyceraldehyde

+++

+++

Ghi chú: Số dấu + chỉ lượng aflatoxin nhiều hay ít, dấu – chỉ không có, số 0 là không
thí nghiệm
Nguồn đạm: Sản lượng aflatoxin cao nhất thu được trên môi trường có tính chất nấm
men hoặc có peptone hoăc tốt hơn nữa là có acid amin trong đó glycin hoặc glutamat,
alanin và acid aspartic thì kém hơn một ít. Tiamin và các vitamin nhóm B kích thích
sự tổng hợp các aflatoxin.
Các ion kim loại: Sự có mặt của Zn, catmi, Mg hoặc Fe kích thích sự sản sinh
aflatoxin, Co, Cr, Ca, Mn chỉ có ít hiệu lực. Thêm 3,9 μmol Bari acetate thì sự tạo
thành aflatoxin bị ức chế.

17


Đồ án tốt nghiệp

Các chất khác: khi Asp. flavus phát triển trên hạt lúa mì, lượng aflatoxin tạo ra ở giai
đoạn phôi mầm nhiều hơn hẳn ở giai đoạn phôi nhũ. Ngoài ra, người ta thấy việc
thêm lipid (chiết từ mầm lúa mì bằng pentan) vào một cơ chất gồm mầm lúa mì đã
loại bỏ lipid có hiệu quả tốt đến việc sản sinh aflatoxin. Ảnh hưởng có lợi của các
acid béo đến việc hình thành độc tố được nhiều người công nhận, làm cho người ta
nghĩ rằng chúng có vai trò quan trọng trong việc sinh tổng hợp các aflatoxin; việc
phân hủy sinh học của chúng đưa đến sự hình thành các tiền sản phẩm tham gia vào
vòng chuyển hóa sinh tổng hợp aflatoxin. Thêm dimetylsulfoxide (DMSO) vào môi
trường nuôi cấy sẽ làm nồng độ aflatoxin hoặc tăng lên chút ít hoặc giảm sút nhiều.
Ở đây có lẽ là một tác động chuyển hóa qua lại hơn là một phản ứng hóa học giữa
DMSO và các aflatoxin.
1.2.4. Cấu trúc và tính chất của aflatoxin

Các aflatoxin thường nhiễm trên các sản phẩm thực vật. Hiện nay người ta đã tìm
thấy khoảng 18 loại aflatoxin khác nhau, tuy nhiên có 4 loại chính thường gặp nhất
gồm 4 hợp chất của nhóm bis-furanocoumarin, là sản phẩm trao đổi chất tạo bởi nấm
Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus, được đặt tên là B1, B2, G1, G2.
Bốn chất được phân biệt trên cơ sở màu phát quang của chúng. B là chữ viết tắt của
Blue (màu xanh nước biển) và chữ G là chữ viết tắt của Green (màu xanh lá cây). Các
sắc kí đồ lớp mỏng alumin, thu được từ nước chiết bằng clorofrom : metanol (98.5 :
1.5) được tách bằng hệ thống clorofrom : cacbon tetraclorua : nước : metanol (2 : 2.5
: 1 : 3) đã phát hiện hai vết huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại: một vết huỳnh quang
xanh tím, đó là aflatoxin B1, một vết khác có Rf thấp hơn và huỳnh quang màu lục,
đó là aflatoxin G1. Aflatoxin G1 có cấu trúc rất gần với cấu trúc aflatoxin B1: nó có
hai chức lacton, còn aflatoxin B1 chỉ có một. Bằng cách khử nối đôi cách trong nhân
hidrofuran tận cùng của dihidroaflatoxin B1 và G1 ta thu được hai sản phẩm độc khác
là aflatoxin B2 và G2. So với aflatoxin B1, độc tính của chúng đối với vịt con kém
hơn từ 60 đến 100 lần; như vậy chúng sẽ không độc, nếu không có các khả năng mất
hidrat chuyển thành aflatoxin B1 rất độc.

18