Phân lập vi khuẩn lactobacillus spp từ cơm mẻ

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

MỤC LỤC
MỤC LỤC ....................................................................................................................i
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT................................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................v
DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................ vi
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................5
1.1.

Tổng quan về cơm mẻ ....................................................................................5

1.1.1.

Giới thiệu cơm mẻ ...................................................................................5

1.1.2.

Vi sinh vật có trong cơm mẻ....................................................................5

1.2.

Giới thiệu về vi khuẩn Lactobacillus. ............................................................6

1.2.1.

Phân loại ...................................................................................................6

1.2.2.

Lịch sử nghiên cứu về Lactobacillus spp. ...............................................6

1.2.3.

Đặc điểm phân bố ....................................................................................7

1.2.4.

Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Lactobacillus spp. ..............................8

1.2.5.

Đặc điểm sinh trưởng của vi khuẩn Lactobacillus spp. ..........................8

1.2.6.

Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Lactobacillus spp. ............................8

1.2.7.

Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Lactobacillus spp. .............................14

1.2.8.

Khả năng phân giải protein của vi khuẩn Lactobacillus spp. ...............14

1.2.9. Khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn và đối kháng với các vi khuẩn
gây bệnh ...............................................................................................................14
1.2.10. Tình hình nghiên cứu sử dụng Lactobacillus bổ sung vào chế phẩm
phân bón vi sinh hữu cơ trong nông nghiệp........................................................15

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................16
2.1.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................16

2.1.1.

Địa điểm nghiên cứu ..............................................................................16

2.1.2.

Thời gian nghiên cứu .............................................................................16

2.2.

Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................16

2.2.1.

Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn Lactobacillus ........................................16

2.2.2.

Dụng cụ và thiết bị .................................................................................16

2.2.3.

Hóa chất và môi trường .........................................................................17

i

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2.3.

Bố trí thí nghiệm ...........................................................................................18

2.3.1.
2.4.

Bố trí thí nghiệm chi tiết ........................................................................19

Phương pháp nghiên cứu ..............................................................................27

2.4.1.

Phương pháp thu mẫu, xử lý mẫu ..........................................................27

2.4.2.

Phương pháp tăng sinh ..........................................................................27

2.4.3.

Phương pháp pha loãng mẫu .................................................................28

2.4.4.

Phương pháp phân lập vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic ..............28

2.4.5.

Phương pháp tăng sinh chủng vi khuẩn phân lập được ........................30

2.4.6.

Các phương pháp quan sát đặc điểm hình thái......................................30

2.4.7.

Các thử nghiệm sinh hóa đối với chủng vi khuẩn phân lập ..................31

2.4.8. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang
(OD600nm) ..........................................................................................................33
2.4.9.

Phương pháp đục lỗ thạch .....................................................................34

2.4.10. Phương pháp nghiên cứu khả năng phân giải tinh bột, protein ............34
2.4.11. Phương pháp xử lý số liệu .....................................................................35
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................36
3.1.

Phân lập một số chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. từ cơm mẻ .................36

3.1.

Đặc điểm hình thái của các chủng phân lập từ cơm mẻ ..............................36

3.2. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn
Lactobacillus spp. phân lập được ...........................................................................50
3.3.

Xác định hàm lượng acid tổng .....................................................................50

3.4. Khảo sát khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp.
phân lập được ..........................................................................................................52
3.4.1. Khảo sát khả năng đối kháng bằng sinh khối của của các chủng vi
khuẩn Lactobacillus spp. phân lập được với nấm Neoscytalidium. ...................52
3.1.1. Khảo sát khả năng đối kháng bằng dịch nuôi cấy của của các chủng vi
khuẩn Lactobacillus spp. phân lập được với nấm Neoscytalidium. ...................54
3.1. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp.
phân lập được ..........................................................................................................56
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................................60
1. Kết luận ............................................................................................................60
2. Đề nghị .............................................................................................................61

ii


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................62
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT .........................................................................................62
TÀI LIỆU TIẾNG ANH .........................................................................................63
TÀI LIỆU INTERNET ...........................................................................................66
PHỤ LỤC ....................................................................................................................1

iii

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
----- Ϊ  Ϊ ----CFU

Colony Form Unit

ĐKVKN

Đường kính vòng kháng nấm

ĐKVKK

Đườn kính vòng kháng khuẩn

MT

Môi trường

NA

Nutrient Agar

NB

Nutrient Broth

OD

Optical Density

VK

Vi khuẩn

VSV

Vi sinh vật

LAB

Lactic Acid Bacteria

iv


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC BẢNG
----- Ϊ  Ϊ ----Bảng 3. 1. Danh sách các chủng vi khuẩn phân lập ..................................................36
Bảng 3. 2. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập. ............................37
Bảng 3. 3. Kết quả định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn phân lập được từ các mẫu
cơm mẻ .......................................................................................................................38
Bảng 3. 4. Hàm lượng % acid lactic của 11 chủng vi khuẩn Lactobacillus nuôi cấy
trong 24 giờ.................................................................................................................51
Bảng 3. 5. Tỉ lệ ức chế nấm Neoscytalidium của các chủng vi khuẩn Lactobacillus
spp. ..............................................................................................................................52
Bảng 3. 6. Tỉ lệ ức chế các chủng nấm của vi khuẩn Lactobacillus phân lập được .54

Bảng 3. 7. Trung bình đường kính vòng kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus .57

v


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC HÌNH ẢNH
----- Ϊ  Ϊ ----Hình 1. 1. Vi khuẩn Lactobacillus sakei......................................................................6
Hình 1. 2. Hình dạng tế bào của một số chủng vi khuẩn Lactobacillus .....................8
Hình 2. 1. Sơ đồ tổng quát bố trí các bước thí nghiệm .............................................18
Hình 2. 2. Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic từ cơm
mẻ ................................................................................................................................19
Hình 2. 3. Quy trình định danh sơ bộ các chủng phân lập được ..............................21
Hình 2. 4. Quy trình khảo sát khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn
Lactobacillus spp. .......................................................................................................22
Hình 2. 5. Quy trình khảo sát khả năng kháng nấm bằng dịch nuôi cấy của các
chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. .............................................................................24
Hình 2. 6. Quy trình khảo sát khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn
Lactobacillus spp. .......................................................................................................26
Hình 3. 1. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L1 .......................................39
Hình 3. 2. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L2 .......................................40
Hình 3. 3. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L3 .......................................41
Hình 3. 4. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L4 .......................................42
Hình 3. 5. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L5 .......................................43
Hình 3. 6. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L6 .......................................44
Hình 3. 7. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L7 .......................................45
Hình 3. 8. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L8 .......................................46
Hình 3. 9. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L9 .......................................47
Hình 3. 10. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L10 ...................................48

Hình 3. 11. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L11 ...................................49
Hình 3. 12. Khảo sát khả năng phân giải tinh bột của các chủng vi khuẩn
Latobacillus phân lập được ........................................................................................50
Hình 3. 13. Hàm lượng % acid lactic sinh ra của 11 chủng Lactobacillus sau 24 giờ
nuôi cấy. ......................................................................................................................51
Hình 3. 14. Tỷ lệ ức chế nấm của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. ..............53
Hình 3. 15. Đĩa nấm đối kháng của vi khuẩn Lactobacillus với nấm Neoscytalidium
.....................................................................................................................................53
Hình 3. 16. Tỷ lệ ức chế nấm của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. phân lập
được ............................................................................................................................55
Hình 3. 17. Đĩa nấm đối kháng của vi khuẩn Lactobacillus với nấm Colletotrichum
.....................................................................................................................................55
Hình 3. 18. Trung bình đường kính vòng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn
Lactobacillus spp. phân lập được ...............................................................................57

vi


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3. 19. Đĩa đối kháng của vi khuẩn Lactobacillus với vi khuẩn E. coli ............58
Hình 3. 20. Đĩa đối kháng của vi khuẩn Lactobacillus với vi khuẩn Salmonella ....58
Hình 3. 21. Đĩa đối kháng của vi khuẩn Lactobacillus với vi khuẩn Staphylococcus
.....................................................................................................................................59

vii


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Trong những năm gần đây, lượng rác thải từ thực phẩm như rác thải nông nghiệp,
rác thải từ các khu công nghiệp sản xuất và chế biến thực phẩm hoặc rác thải nhà bếp
đang không ngừng tăng nhanh đã trở thành một vấn đề mang tính toàn cầu. Đây là
những loại rác thải hữu cơ, khi phân hủy sẽ phát tán ra môi trường một lượng lớn các
loại khí nhà kính như methane và carbon dioxide làm tình trạng nóng lên toàn cầu
ngày một xấu hơn [45]. Theo nghiên cứu vào năm 2012 cho thấy có gần 9.278 tấn
chất thải rắn đô thị, trong đó có khoảng 3.337 tấn là rác thải từ thực phẩm được xử lý
tại bãi rác mỗi ngày [46]. Việc các loại chất thải này được xử lý bằng cách chôn lấp
như hiện nay là không thân thiện với môi trường và thiếu tính bền vững. Vì việc xử
lý chúng tiêu tốn gần 75% đến 80% chi phí xử lý rác thải đô thị trong ngân sách chưa
kể đến phí chôn lấp chúng chiếm đến 30%. Ngoài ra chôn lấp rác thải từ thực phẩm
làm hao phí đi rất nhiều giá trị về năng lượng, giá trị dinh dưỡng mà các loại rác thải
này đem lại từ quá trình phân hủy trong đất. [47], [48].
Mới đây nhiều nghiên cứu đã cho thấy việc tái sử dụng các nguồn rác thải hữu cơ
như thức ăn thừa bằng cách sử dụng vi khuẩn LAB để lên men lactic nhằm tạo ra các
loại phân bón hữu cơ đang là xu hướng phát triển mang tính bền vững [51], [53], [54].
Đây không những là phương pháp có tính khả thi cao, hiệu quả, ít tốn chi phí mà việc
tái tạo các nguồn tài nguyên này sẽ tạo ra một lượng lớn phân bón hữu thân thiện với
môi trường, không những có khả năng kháng các loại vi khuẩn gây bệnh cho cây mà
còn có khả khăng kích thích sự tăng trưởng của cây trồng [55].
Hiện nay việc sử dụng các chủng vi khuẩn lên men lactic (LAB) như các chủng
Lactobacillus spp. để lên men các loại rác thải nhà bếp có nhiều tiềm năng to lớn [49].
Thông thường các loại rác thải từ nhà bếp bao gồm hầu hết là tinh bột, các loại đường
hòa tan, lipid, protein, một số những hợp chất dễ phân hủy sinh học [50]. Đây là một
nguồn cơ chất lý tưởng để tiến hành lên men vi khuẩn lactic vì không những giàu chất
dinh dưỡng, ít tốn chi phí mà còn giúp làm giảm ô nhiễm môi trường [51]. Đối với
các chủng vi khuẩn LAB, chúng đặc trưng bởi khả năng lên men các nguồn cơ chất

1


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

như cellulose, hemicellulose và tinh bột tạo ra đường và acid lactic. Ngoài ra theo
Wang và đồng tác giả (2002) việc sử dụng vi khuẩn LAB trong lên men lactic có thể
được kiểm soát ổn định bằng cách kiểm soát thích hợp điều kiện lên men (nhiệt độ,
oxy, pH,…) [56].
Dựa trên cơ sở đó, đề tài “Phân lập vi khuẩn Lactobacillus spp. từ cơm mẻ”
được thực hiện nhằm tìm ra các chủng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus có khả năng
sinh nhiều acid lactic, khả năng kháng nấm, kháng khuẩn mạnh nhất để làm vật liệu
sản xuất phân bón lá từ nguồn rác thải nhà bếp là một đề tài rất thiết thực.
2. Mục đích nghiên cứu
-

Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. từ cơm mẻ.

3. Nhiệm vụ nghiên cứu
-

Phân lập và chọn lọc vi khuẩn Lactobacillus.

-

Định danh sơ bộ.

-

Khảo sát đặc điểm nuôi cấy, hình thái và khả năng lên men lactic.

-

Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. phân
lập được đối với các chủng nấm Neoscytalidium sp., Fusarium sp. và nấm
Colletotrichum sp..

-

Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. phân
lập được đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh Salmonella, Ecoli và
Staphylococcus.

4. Phương pháp nghiên cứu
-

Phương pháp tổng hợp tài liệu:

Nghiên cứu, thu thập tài liệu tham khảo, tài liệu internet và tổng hợp những tài liệu
có liên quan đến mục tiêu đề ra của đề tài.
-

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:
+ Phân lập các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. từ cơm mẻ.
+ Khảo sát hình thái, thực hiện các thử nghiệm sinh lý sinh hóa để định danh
sơ bộ các chủng vi khuẩn phân lập được.

2

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

+ Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng sinh acid lactic, khả năng kháng các
chủng nấm và các chủng vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn
Lactobacillus spp. đã được phân lập.
-

Phương pháp thu thập và xử lý số liệu:
+ Ghi nhận số liệu từ kết quả thí nghiệm ở từng thời điểm khảo sát.
+ Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để xử lý số liệu và vẽ đồ thị.
+ Sử dụng phần mềm Statgraphics, phân tích ANOVA

5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
-

Đối tượng:
+ Các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp.

-

Phạm vi giới hạn:
+ Phân lập các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. từ cơm mẻ.
+ Thực hiện lên men tạo chế phẩm phân bón lá ở quy mô phòng thí nghiệm.

6. Các kết quả đạt được của đề tài
-

Phân lập được 11 chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic từ cơm mẻ. Từ
kết quả phân lập và định danh sơ bộ cho thấy 11 chủng vi khuẩn trên đều có
đặc tính của vi khuẩn Lactobacillus spp.

-

Khảo sát khả năng sinh acid lactic, kháng nấm, kháng khuẩn và chọn lọc ra 4
chủng có đủ tiêu chí đề ra.

-

Ứng dụng 4 chủng vi khuẩn chọn lọc vào lên men sản xuất phân bón lá.

7. Kết cấu của đồ án
-

Phần Mở đầu

-

Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung liên
quan đến tài liệu nghiên cứu.

-

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến
các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án.

-

Chương 3: Kết quả và thảo luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà
đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biện chứng cho kết quả thu
được.

3


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Phần kết luận và kiến nghị: Nội dung chương tóm lại những kết quả mà đề tài đạt
được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài.

4


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cơm mẻ
1.1.1. Giới thiệu cơm mẻ
Trong ẩm thực Việt Nam, mẻ là một gia vị đặc trưng có vị chua xuất xứ từ miền
Bắc không thể thiếu trong những bữa ăn hàng ngày. Với nguyên liệu lên men đơn
giản là cơm hoặc bún, mẻ được tạo ra có hương thơm dịu nhẹ và có hàm lượng dinh
dưỡng cao, giàu đạm, acid lactic và vitamin. Cơm mẻ thường được bán ở các chợ
dưới dạng làm sẵn như một loại gia vị kèm theo, hoặc có thể được làm tại nhà với
cách làm rất đơn giản.
Là một vị trong 5 vị cơ bản của ẩm thực người Việt, mẻ luôn khẳng định được
giá trị khác biệt của nó so với những thứ gia vị quả chua khác.
1.1.2. Vi sinh vật có trong cơm mẻ
Cơm mẻ bao gồm các thành phần như con mẻ, nấm men, vi khuẩn lên men acid
lactic:
-

Con mẻ là một loại tuyến trùng hữu ích mang tên nematode rất nhỏ nhưng có

thể nhìn thấy bằng mắt thường, bò ngọ nguậy trên bề mặt cơm trong hũ mẻ và thành
dụng cụ chứa đựng. Thức ăn của con mẻ là nấm men. Chúng có hàm lượng protein
rất cao, có vai trò hỗ trợ dinh dưỡng. Bản chất con cơm mẻ không đóng vai trò cốt
yếu đối với tiến trình lên men cơm hay bún thành cơm mẻ mà chỉ cho người sử dụng
biết chất lượng của cơm mẻ.[41]
-

Nấm men là thành phần thứ hai trong cơm mẻ, có dạng hình chùm, cung cấp

nhiều vitamin và đạm, hỗ trợ dinh dưỡng.
-

Vi khuẩn lactic là thành phầm thứ ba và thành phần chính của cơm mẻ. Đây là

một nhóm các trực khuẩn Gram dương, kị khí tùy nghi, có khả năng lên men các loại
đường khác nhau sinh ra acid lactic [28]. Chính nhờ acid lactic mà tạo thành vị chua
của cơm mẻ.
C6H12O6 + 2CH3  CHOCOH + Kcal (lên men đồng hình) (Axit lactic)
Những sản phẩm mà những vi khuẩn Lactic này tạo ra trong quá trình lên men
đường sẽ làm giảm pH đến khoảng 3 - 3.5 [18], sẽ giúp ức chế các vi khuẩn có hại

5


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

cho đường ruột như Escherichia coli, Samonella (pH: 5 – 5.5); vi khuẩn gây thối (pH:
4.5 -5); nấm men dại (pH: 1.2 -3) phát triển.

Bản thân vi khuẩn lactic tạo nên chất kháng sinh cần thiết để diệt các vi sinh vật
có hại [20], [21] nên rất có lợi cho người ăn. Cũng nhờ những đặc tính này mà ăn
cơm mẻ sống có lợi hơn nhiều khi ăn cơm mẻ chín.
1.2. Giới thiệu về vi khuẩn Lactobacillus.
1.2.1. Phân loại
Theo khóa phân loại của vi khuẩn của Bergey’s [57] Lactobacillus được phân loại
như sau :
Giới (Kingdom): Vi khuẩn (Bacteria)
Ngành (Phylum): Firmicutes
Lớp (Class):

Bacilli

Bộ (Order):

Lactobacillales

Họ (Family):

Lactobacillaceae

Chi (Genus):

Lactobacillus

Loài (Species):

Lactobacillus spp.
Hình 1. 1. Vi khuẩn Lactobacillus sakei

1.2.2. Lịch sử nghiên cứu về Lactobacillus spp.
Trong suốt 15 năm qua, các nhà nghiên cứu đã tìm ra được gần hơn 25 loài
khác nhau từ các chi Lactobacillus trong đó phải kể đến các chủng tiêu biểu như
Lactobacillus acidophilus (L.acidophilus), Lactobacillus casei (L.casei),
Lactobacillus fermentum (L.fermentum), Lactobacillus plantarum (L.plantarum),
Lactobacillus brevis (L.brevis) hay Lactobacillus bulgaricus (L.bulgaricus),…[22]
Phần lớn các chủng Lactobacillus có nguồn gốc từ dạ dày – ruột người và
trong âm đạo. Hầu hết chúng đều có khả năng chuyển đường thành acid lactic,
ngoài ra nó còn có thể tiết ra Bacteriocin – một loại hợp chất có hoạt tính kháng

6


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

khuẩn có phổ ức chế vi sinh vật khá rộng và không gây ra tính kháng kháng sinh ở
các vi khuẩn gây bệnh [24]. Hiện nay chúng là đối tượng nghiên cứu chính về
probiotic cho con người [23] vì có tiềm năng trong việc điều trị các bệnh viêm
nhiễm, kháng các vi khuẩn gây bệnh, khử cholesterol huyết thanh, chống ung thư,
[24] … mang nhiều lợi ích đối với sức khỏe con người. Ngoài ra Lactobacillus còn
điều hòa các miễn dịch không đặc hiệu bằng cách kích thích hoạt động của lympho
bào, các đại thực bào và giảm cytokine.
Bên cạnh đó Lactobacillus từ lâu đã được ứng dụng trong thương mại đặc biệt
là trong lĩnh vực thực phẩm nhất là trong công nghiệp sản xuất các thực phẩm lên
men chua như sữa chua, phô mai, bắp cải muối, dưa chua, bia, rượu vang, rượu táo,
kim chi,….hoặc trong lĩnh vực y học một số chủng đáng chú ý được biết đến như
Lactobacillus acidophilus sản xuất niacin, acid folic và pyridoxine, một nhóm các
hợp chất chung được gọi là vitamin B hay chủng Lactobacillus GG được phân lập từ
người trong những năm 1980 bởi tiến sĩ Sherwood Gorbach và Barry Goldin [25].
Lactobacillus GG là một hứa hẹn tuyệt vời do chúng có thể sống trong đường ruột, ở

đó các vi khuẩn tạo ra một hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn giúp duy trì hệ vi sinh
đường ruột khỏi vi khuẩn xâm nhập.
1.2.3. Đặc điểm phân bố
Phần lớn các loài Lactobacillus là nhóm vi khuẩn có nguồn gốc từ dạ dày –
ruột người, âm đạo. Trong tự nhiên phân bố tương đối rộng rãi trong tự nhiên, có
nhiều ở các môi trường sống chứa nhiều cacbohydrate và trong hầu hết các thực phẩm
lên men như sữa chua, kim chi, phô mai, trong đường ruột của động vật, thủy sản và
trong đường ruột, đường tiết niệu, đường sinh dục của người [25].

7


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.2.4. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Lactobacillus spp.
Lactobacillus là một nhóm gồm đa dạng các loài vi sinh vật. Chúng là những
vi khuẩn Gram dương, kích thước lớn 0,5 – 1,2 μm × 1 - 10 μm, đại bộ phận các loài
không di động, không sinh bào tử [34], hình dạng thay đổi: dạng que thẳng dài, que
hơi cong như hình lưỡi liềm cho đến hình cầu có thể xếp đôi, chuỗi hoặc đứng riêng
rẽ [33].

Hình 1. 2. Hình dạng tế bào của một số chủng vi khuẩn Lactobacillus
1.2.5. Đặc điểm sinh trưởng của vi khuẩn Lactobacillus spp.
Vi khuẩn Lactobacillus là vi khuẩn kị khí tùy nghi, chịu môi trường acid, có
nhu cầu về dinh dưỡng phức tạp, phát triển trong điều kiện kị khí và sinh acid lactic
[29]. Nhiệt độ phát triển tối ưu thường là 30 – 450 C, pH tối ưu là 5,5 – 6,8.
Lactobacillus được đặc trưng bởi khả năng sản xuất acid lactic là một sản phẩm của
quá trình chuyển hóa glucose.
Dựa trên các sản phẩm của quá trình biến dưỡng để phân chia các loài
Lactobacillus thành 2 nhóm: Các loài lên men đồng hình và lên men dị hình.

Khuẩn lạc của Lactobacillus thường có hình tròn, màu trắng đục hoặc trắng sữa
có bờ đều, láng và lồi, mờ đục. Chúng không tạo mùi đặc trưng trên môi trường nuôi
cấy thông thường [30].
1.2.6. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Lactobacillus spp.
Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao và các loài khác
nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Để sinh trưởng bình thường, ngoài nhu
cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cở bản như nguồn carbon, nitơ một phần

8


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

dưới dạng các acid amin, photphate và lưu huỳnh mà chúng còn có nhu cầu về một
số vitamin, các chất sinh trưởng và chất khoáng.
❖ Nhu cầu dinh dưỡng cacbon
Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại hydratcacbon từ các
monosaccarit (glucoza, fructoza, manoza) và các disaccarit (saccaroza, lactoza,
maltoza) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin). Các loài vi khuẩn khác nhau đòi
hỏi các nguồn cacbon khác nhau, chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng
lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các
acid hữu cơ như acid citric, lactic, pyruvic, fumaric, acetic,..
Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho vi khuẩn lactic là các monosaccarit và
disaccait. Các nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu
trúc tế bào và sinh ra các acid hữu cơ như các acid glutamide và galacturonic tạo
thành CO2, acid acetic và acid lactic như Lactobacterium lycopersici,
Streptobacterium hassice fermentatae. Trong quá trình lên men các cơ chất như
cacbon, vi khuẩn lactic có thể sử dụng cả các acid amine như acid glutamic, arginine,
tyrosine làm nguồn cung cấp năng lượng. Khi đó tạo ra các quá trình decacboxyl và
tạo ra CO2.

❖ Nhu cầu dinh dưỡng nitơ
Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau. Phần lớn vi khuẩn
lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ. Vì vậy để
đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn
trong môi trường. Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao
nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,....
Hiện nay, cao nấm men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả
nhất tuy nhiên ở quy mô công nghiệp người ta không sử dụng nguồn nitơ này vì rất
tốn kém [1].
❖ Nhu cầu về vitamin
Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào,
nên rất cần thiết cho hoạt động sống như acid nicotinic và acid pantothenic rất cẩn
9


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

cho sự sinh trưởng của tất cả các loài vi khuân lactic. Tuy nhiên, đa số các loài vi
khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào môi
trường các loại vitamin. Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ
khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men [1]. Cần lưu ý vitamin bị ảnh hưởng
bởi nhiều yếu tố như pH, nhiệt độ nuôi cấy, lượng CO2 ban đầu và thế oxy hóa khử
của môi trường [35].
❖ Nhu cầu các chất hữu cơ khác
Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ
khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các acid hữu cơ. Một số acid hữu cơ có
ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric, acid
oleic. Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫn xuất của acid oleic làm
thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic.
Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quan trọng

đến sự sinh trưởng của tế bào. Nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới dạng
các muối acetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic.
❖ Nhu cầu các muối vô cơ khác
Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các
muối vô cơ. Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho,
lưu huỳnh, magie, mangan. Đặc biệt là magie và mangan, vì nó tham gia và đảm bảo
chức năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu
trúc tế bào.
❖ Nhu cầu dinh dưỡng oxy
Lactobacilli là những vi khuẩn vi hiếu khí (microaerophile), sinh trưởng trên bề
mặt môi trường thạch ở điều kiện kỵ khí, một số loài là vi khuẩn kỵ khí [32]. Vi khuẩn
lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy, vừa sống được trong môi
trường không có oxy. Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sinh khối vi khuẩn sẽ phát
triển nhanh hơn so với trong điều kiện kị khí.
❖ Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men - quá trình sinh trưởng và phát
triển của vi khuẩn lactic

10


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Acid lactic lần đầu tiên được tách ra từ sữa bò lên men chua nhờ nhà khoa học
Thụy Điển Scheele vào năm 1780.
Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kị khí đường với sự tích lũy acid lactic.
Trong thự tiễn người ta đã biết đến hiện tượng này từ lâu và đã sử dụng rộng rãi để
chế biến các loại thức ăn chua (sữa chua, dưa muối, cà muối…) ủ chua thức ăn cho
gia súc hoặc để sản xuất acid lactic và các loại lactate.
Sản phẩm trao đổi chất
Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua

việc lên men lactic. Tùy theo các sản phẩm sinh ra trong quá trình lên men mà người
ta chia làm hai loại: lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình:
• Vi khuẩn lên men lactic đồng hình:
Lên men đồng hình chỉ tạo ra sản phẩm là acid lactic chiếm gần như 90%, ngoài
ra còn có thể xuất hiện lượng acid bay hơi, rượu ethylic hoặc các sản phẩm khác ở
một lượng rất nhỏ không đáng kể acid acetic, acetol, diacetyl.
Phương trình chung biểu diễn quá quá trình lên men:
C6H12O6  2CH3CHOHCOOH + 21,8.104 J
Tùy thuộc vào tính chuyển hóa không gian của men xúc tác cho phản ứng này
là lactathydrogenaza và tùy thuộc vào sự tồn tại của men lactatraxemaza mà có thể
xuất hiện các acid lactic dạng D (-), L (+) hay DL. Chỉ có một phần nhỏ pyruvate
được decacboxyl hóa và chuyển thành acid axetic, ethanol và CO2 cũng thành aceton.
Mức độ tạo thành sản phẩm này rõ rang phụ thuộc vào sự có mặt của oxy.
Trong quá trình lên men lactic đồng hình, glucoza được chuyển hóa theo chu
trình EMP (Embden-Mayerhoff), vi khuẩn sử dụng tất cả loại enzyme aldolase cho
quy trình này, còn hydro tách ra khi dehydro hóa triozophophat được chuyển đế
pyruvat. Vì trong vi khuẩn lên men lactic đồng hình không có enzyme cacboxylase
cho nên acid pyruvic không thủy phân hủy nữa mà tiếp tục khử thành acid lactic.
• Lên men lactic dị hình
Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đó ngoài acid lactic còn có các
sản phẩm khác như acid acetic, ethanol, acid succinic, CO2,…

11


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Phương trình chung biễu diễn quá trình len men:
C6H12O6 CH3CHOHCOOH+ HOOC(CH2)COOH + CH3COOH + C2H5OH +CO2
Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượu etylic

và acid acetic 10% các loại khí 20%, đôi khi không có các khí mà thay vào đó là sự
tích lũy một lượng lớn acid formic. Như vậy, trong quá trình lên men lactic dị hình
có nhiều sản phẩm phụ khác nhau đáng kể được tạo thành, chứng tỏ quá trình này
phức tạp hơn nhiều so với quá trình lên men lactic đồng hình. Theo quan điểm tiến
hóa sinh lý trong vi sinh vật học, người ta cho rằng lên men lactic đồng hình là hướng
tiến hóa độc lập của lên men dị hình.
Thành phần môi trường nuôi cấy
Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phát triển
cần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệu suất thu
hồi là lớn nhất và giá thành rẻ. Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng
đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mà còn ảnh hưởng không nhỏ
đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này. Sự phát triển của vi
khuẩn lactic trên các loại đường khác nhau sẽ tạo ra các tế bào có đặc điểm hình thái
và sinh lý khác nhau và vì vậy cũng sẽ có khả năng chống chịu khác nhau trước trước
những áp lực của các quá trình sử lý sau này. Khả năng sống sót của L. bulgaricus
trong và sau sấy đông khô phụ thuộc vào loại đường được bổ sung trong quá trình
nuôi cấy và thu hồi chế phẩm, nếu lên men tử maltose thì tỷ lệ tế bào chết sẽ nhiều
hơn hẳn so với lên men từ fructose và lactose. Tuy nhiên việc lựa chọn loại đường
nào cũng cần quan tâm đến vấn đề kinh tế nhằm giảm thiểu chi phí đầu vào [1].
Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng. Nguồn năng lượng cần thiết cho
hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chất với môi
trường bên ngoài. Thành phần môi trường MRS (Phụ lục A) để nuôi cấy vi khuẩn
lactic có chứa nhiều chất dinh dưỡng và dễ bị tạp nhiễm cũng ảnh hưởng đến quá
trình nuôi cấy vi khuẩn lactic.
Ngoài ra, để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyển hóa trong tế bào,
chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trường dinh dưỡng làm nguồn carbon

12

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

(chủ yếu là đường lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin), vitamin, muối khoáng và
các yếu tố vi lượng. Vì vậy, ta cần bổ sung các nguồn dinh dưỡng trên với liều lượng
thích hợp nhất giúp vi khuẩn lactic phát triển tốt, nâng cao hiệu suất lên men.
Yếu tố môi trường
1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng, ảnh enzyme của tế bào vi sinh
vật. Khi nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzyme,
làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất, dẫn đến ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng
và phát triển của vi khuẩn. Nhiệt độ càng cao thì sự lên men càng mạnh. Phần lớn vi
khuẩn lactic sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 30 - 400C. Một số có thể sinh trưởng dưới
150C và thậm chí một số dòng có thể sinh trưởng dưới 500C [31].
2. Ảnh hưởng của pH
Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh acid làm pH môi trường giảm, và
khi nó giảm tới mức nào đó nó sẽ ức chế chính sự phát triển của vi khuẩn lactic. Do
đó, cần phải luôn điều chỉnh pH về khoảng tối thích cho vi khuẩn trong suốt quá trình
nuôi. Để lên men nhanh và trọn vẹn, phạm vi pH tối ưu phải nằm giữa 5,5 và 6,0.
3. Ảnh hưởng của nồng độ acid
Acid là sản phẩm chính của quá trình lên men lactic do hoạt động sống của vi
khuẩn lactic tạo nên. Các vi khuẩn này chịu được acid, tuy nhiên với lượng acid tích
lũy trong môi trường ngày một nhiều sẽ ức chế chúng. Để giúp vi khuẩn lactic phát
triển bình thường không bị chính sản phẩm do hoạt động của chúng để tạo ra, người
ta cho vào môi trường các chất đệm thích hợp với một lượng đủ để trung hòa lượng
acid sinh ra thông thường chất đệm này là CaCO3.
4. Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men
Hệ vi sinh vật tạp nhiễm, thường ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men ở những
mức độ khác nhau có thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào quá trình trao
đổi chất cần thiết cho sự tạo thành sản phẩm lên men.

13


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.2.7. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Lactobacillus spp.
Lactobacillus sp. được thử nghiệm nhận biết qua các phản ứng sinh hóa đặc
trưng như phản ứng catalase, oxydase, khả năng sinh acid lactic, khả năng sử dụng
các nguồn carbohydrate đặc biệt là các loại đường [14]. Bên cạnh đó, khả năng sinh
bacteriocin đã được kiểm tra và minh chứng đối với các chủng Lactobacillus được
thực hiện bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch [34].
1.2.8. Khả năng phân giải protein của vi khuẩn Lactobacillus spp.
Đại đa số các loài Lactobacillus có khả năng sản sinh enzyme phân giải protein.
Phổ biến trong số đó là các chủng Lactobacillus bulgaricus, L. casein, L. paracasein,
L. fermentum và L. plantarum. Hệ enzyme phân giải protein của nhiều loài
Lactobacillus mang tính đặc hiệu cao tuy nhiên ở enzyme của một số loài lại có tính
đặc hiệu ở phổ rộng dẫn đến có nhiều vùng cắt đặc hiệu cho một cơ chất.
Hoạt tính này giúp cho các chế phẩm lên men từ Lactobacillus trở thành nguồn
dinh dưỡng có giá trị cao cho con người, động vật hoặc trong phân bón.
1.2.9. Khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn và đối kháng với các vi khuẩn
gây bệnh
Vi khuẩn Lactobacillus có khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn như các acid
hữu cơ (acid lactic, acid acetic), hydrogen peroxide, carbondioxide và diacetyl và đặc
biệt là bacteriocin [1], [37]. Nhiều vi khuẩn Gram (+), Gram (-) bị ức chế bởi
hydrogen peroxide [1], [27].
Acid lactic do vi khuẩn Lactobacillus sinh ra cùng với các cơ chất khác sẽ tạo
một môi trường bất lợi cho vi sinh vật gây thối trong đường tiêu hóa phát triển do đó
lượng urase trong ruột giảm, hơn nữa pH thấp do acid lactic tạo ra gây trở ngại cho
NH3 hấp thu từ ruột vào mô và thúc đẩy việc bài tiết NH3 từ máu vào ruột. Những vi
khuẩn gây thối rửa ở ruột kết tạo các enzyme β-glucuronidase, azoreductase và

nitroreductase thành carcinogen (chất có vai trò trong việc hình thành và phát triển
khối u), bằng các ức chế cạnh tranh và tạo môi trường acid không thuận lợi [41].
Lactobacillus đã kiềm hãm sự trao đổi chất của vi khuẩn trong ruột kết điều này làm
giảm sự hình thành carcinogen ở ruột già. [39], [40].

14


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Ngoài ra còn phải đặc biệt kể đến các bacteriocin, đây là các hợp chất không có
tính kháng sinh điển hình tức chỉ kìm hãm mà không tiêu diệt vi sinh vật. Điển hình
như plantaricin được tạo ra từ Lactobacillus plantarum [42]. Bacteriocin hoạt động
trong khoảng pH rộng, chống lại nhiều vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm, cơ chế hoạt
động dựa trên các tác động lên kênh màng tế bào vi khuẩn và làm thay đổi tính thấm
của màng, vi khuẩn bị rối loạn các quá trình sinh hóa trong tế bào từ đó gây ức chế
hoặc gây chết vi khuẩn. Bacteriocin có tính diệt khuẩn cao ở pH thấp, tương đối bền
ở nhiệt độ cao, không bị ảnh hưởng nhiều bởi các dung môi hữu cơ và có thể mất hoạt
tính nếu như gặp các enzyme thủy phân protein có điện tích âm.
1.2.10. Tình hình nghiên cứu sử dụng Lactobacillus bổ sung vào chế phẩm phân
bón vi sinh hữu cơ trong nông nghiệp.
Vi khuẩn lactic có khả năng hạn chế sự phát triển của Fusarium- loại nấm gây
bệnh quan trọng trong nông nghiệp. Nấm Fusarium khi phát triển sẽ làm câyyếu và
là cơ hội gây bệnh cho cây trồng. Chế phẩm EM (effective microorganism) hay chế
phẩm vi sinh hữu hiệu bao gồm 80 chủng vi sinh trong đó có sự góp phần của vi
khuẩn lactic. Hiệu quả của chế phẩm này là cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng và
giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường [44].

15

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Địa điểm nghiên cứu
Đề tài được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công nghệ sinh học
- Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Công Nghệ Tp.HCM.
2.1.2. Thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ Thời gian: tháng 3/2016 đến tháng 8/2016
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn Lactobacillus
Cơm mẻ được thu mua tại các chợ ở quận Gò Vấp, Bình Thạnh thành phố Hồ
Chí Minh.
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị
2.2.2.1. Dụng cụ
- Ống nghiệm

-

Giấy pH

-

Đĩa petri

-

Đèn cồn

-

Que cấy trang

-

Becher 100 ml, 500 ml.

-

Dây cấy vòng, dây cấy thẳng

-

Pipet 1 ml, 5ml, 10 ml, 20 ml.

-

Erlen loại 100 ml, 250 ml

-

Micropipette 100 µl, 1000 µl.

-

Đũa thủy tinh

-

Đầu tuýp

-

Cốc thủy tinh

-

Bông không thấm nước

-

Ống đong 50 ml, 100 ml.

-

Bông thấm nước

-

Eppendorf.

-

Lame và lamelle.

-

Chai môi trường 250 ml, 500

-

Dụng cụ đục lỗ thạch

-

Máy cất nước

ml.
2.2.2.2. Thiết bị
- Tủ cấy
-

Máy hấp Autoclave

-

Bếp từ

-

Tủ lạnh

-

Buồng đếm hồng cầu

-

Máy đo pH

-

Máy đo quang

-

Kính hiển vi

-

Máy lắc

-

Cân phân tích

-

Bể điều nhiệt

16


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2.2.3. Hóa chất và môi trường
2.2.3.1. Hóa chất
- Thuốc nhuộm Safranin

-

Cao thịt

-

Thuốc nhuộm Crystal violet

-

(NH4)2SO4

-

Thuốc nhuộm Lugol

-

MgSO4

-

Các loại thuốc nhuộm khác

-

H2SO4

-

Dung dịch Lục Malachite

-

NaOH

-

Phenol Red

-

MnSO4.4H2O

-

Bromothymol blue

-

MgSO4.7H2O

-

Thuốc thử Kovac’s

-

Agar

-

Một số loại thuốc thử khác

-

Ethanol

-

Methyl red

-

D – Glucose

-

Hydrogen poroxide H2O2

-

Xylose

-

Pepton

-

Mantose

-

Meat extract

-

Galactose

-

Tween 80

-

Sucrose

-

Triamoni xitrat

-

Glycerol

-

Nước cất

-

Tween 80

-

CaCO3

2.2.3.2. Môi trường
- Môi trường MRS agar

-

Môi trường Starch Agar

-

Môi trường MRS broth

-

Môi trường Ashby

-

Môi trường Nutrient broth (NB)

-

Môi trường thạch mềm MRS

-

Môi trường thạch mềm MRS

-

Môi trường Tryptone Broth

-

Môi trường canh MR - VP

-

Môi trường LB – Agar

-

Môi trường Simmon Citrate

-

Môi trường MRS

0.5% agar
-

17

Một số loại môi trường khác


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2.3. Bố trí thí nghiệm
Nội dung nghiên cứu được trình bày theo sơ đồ sau:

Nguồn mẫu

Phân lập các chủng vi khuẩn Lactobacillus

Chủng thuần khiết

Định danh sơ bộ

Khảo sát khả năng kháng nấm, kháng khuẩn
của các chủng vi khuẩn

Ứng dụng chủng chọn lọc vào sản xuất phân
bón lá
Hình 2. 1. Sơ đồ tổng quát bố trí các bước thí nghiệm

18