Tạo dòg plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase d (celd) từ vi khuẩn clostridium thermocellum trên hệ thống nấm men pichia pastoris

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TẠO DÒNG PLASMID TÁI TỔ HỢP CHỨA GEN
MÃ HÓA ENZYME ENDOGLUCANASE D (CelD) TỪ
VI KHUẨN Clostridium thermocellum TRÊN HỆ THỐNG
NẤM MEN Pichia pastoris

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : Thạc sĩ Nguyễn Xuân Đồng
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1051110247

: Phan Vũ Hải Yến
Lớp: 10DSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2014


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các nội dung nghiên
cứu và kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất
kì công trình nào trước đây. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về
lời cam đoan này.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 7 năm 2014
Sinh viên thực hiện

Phan Vũ Hải Yến


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Quý thầy cô khoa Công
nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Công nghệ Thành phố
Hồ Chí Minh đã giảng dạy kiến thức và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho
tôi trong suốt 4 năm đại học.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến T.S Nguyễn Thị Hai người cô
kính mến đã hết lòng giúp đỡ, dạy bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới Th.S Nguyễn
Xuân Đồng và K.S Lê Thị Huỳnh Trâm đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi về kiến
thức chuyên môn và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian làm đề tài tốt
nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị phòng Công nghệ Vi sinh - Trung tâm
Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện và
hỗ trợ tôi về kinh phí cũng như thiết bị để tôi có thể thực hiện đề tài.
Tôi cũng cảm ơn các bạn trong nhóm ESS đã luôn cổ vũ và động viên tôi
những lúc khó khăn để có thể vượt qua và hoàn thành tốt luận văn này.
Và cuối cùng, hơn ai hết, từ đáy lòng con cảm ơn ba mẹ đã sinh ra con, nuôi
dạy con khôn lớn, luôn bên con và là nguồn động viên to lớn của con, tạo mọi điều
kiện tốt nhất cả về tinh thần và vật chất trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và
hoàn thành luận văn này.
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 7 năm 2014
Phan Vũ Hải Yến

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................ vi
DANH SÁCH CÁC HÌNH .............................................................................................. vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG .............................................................................................. ix
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1
1.1.

Đặt vấn đề: ......................................................................................................1

1.2.

Mục đích nghiên cứu đề tài ............................................................................2

1.3.

Nội dung nghiên cứuc.....................................................................................2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN.............................................................................................. 3
2.1.

Cấu tạo lignocellulose ....................................................................................3

2.1.1.

Cellulose ......................................................................................................... 4

2.1.2.

Hemicellulose ................................................................................................ 6

2.1.3.

Lignin .............................................................................................................. 7

2.2.

Enzyme cellulase ............................................................................................8

2.2.1. Phân loại enzyme .............................................................................................. 8
2.2.2.

Cơ chế tác dụng của cellulase ...................................................................... 9

2.2.3.

Vi sinh vật sản xuất cellulase ..................................................................... 10

2.3.

Phức hợp cellulosome trong vi khuẩn Clostridium thermocellum ..............11

2.3.1. Tổng quan về vi khuẩn Clostridium thermocellum..................................... 11
2.3.2.
2.4.

Đặc điểm của phức hệ cellulosome ........................................................... 12

Hệ thống biểu hiện Pichia pastoris ..............................................................14

2.4.1. Đặc điểm hệ thống biểu hiện trên Pichia pastoris ...................................... 14
2.4.2. Tích hợp gen ngoại lai vào P. pastoris ......................................................... 14
2.4.3.

Ưu điểm của hệ thống biểu hiện trên Pichia pastoris............................. 15

i


Đồ án tốt nghiệp

2.5.

Các nghiên cứu trong và ngoài nước về tạo dòng các gen từ Clostridium

thermocellum ...........................................................................................................16
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 19
3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu: ..................................................................19
3.1.1. Địa điểm nghiên cứu:...................................................................................... 19
3.1.2. Thời gian nghiên cứu: ..................................................................................... 19
3.2. Nguyên liệu ......................................................................................................19
3.2.1. Chủng vi sinh vật............................................................................................. 19
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ.......................................................................................... 19
3.2.3. Hóa chất ............................................................................................................ 20
3.2.4. Môi trường ....................................................................................................... 22
3.2.4.1. Môi trường LB (Luria-Bertani): .........................................................22
3.2.4.2. Môi trường MD (Minimal Dextrose): ................................................22

3.2.4.3. Môi trường YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose) ..........................22
3.2.4.4. Môi trường BMGY (Buffered Glycerol-complex): ...........................22
3.2.4.5. Môi trường BMMY (Buffered Methanol-complex) bổ sung CMC...23
3.2.5. Plasmid ............................................................................................................. 23
3.2.5.1. Plasmid pJET1.2/blunt ........................................................................23
3.2.5.2. Plasmid pPIC9K..................................................................................24
3.2.6. Các cặp mồi sử dụng ....................................................................................... 25
3.3. Phương pháp nghiên cứu: ................................................................................26
3.3.1.

Tạo dòng tế bào E. coli DH5α chứa plasmid mang gen CelD của

Clostridium thermocellum......................................................................................... 26
3.3.1.1.

Thiết kế mồi ....................................................................................26

ii


Đồ án tốt nghiệp

3.3.1.2. Thu nhận gen CelD của vi khuẩn C. thermocellum bằng phản ứng
PCR dựa vào cặp mồi đã thiết kế .....................................................................27
3.3.1.3. Quy trình tinh sạch gen theo MEGAquick – spin Total Fragment
DNA Purification Kit – INTRON Biotechnololy............................................28
3.3.1.4. Phương pháp ghép nối gen vào vector nhân dòng pJET1.2/ Blunt ...28
3.3.1.5. Chuẩn bị tế bào E. coli DH5α khả nạp ...............................................29
3.3.1.6. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ bằng phương pháp hóa
biến nạp ............................................................................................................30

3.3.1.7. Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc ....................................31
3.3.1.8. Phương pháp tách chiết plasmid từ tế bào E. coli ..............................32
3.3.1.9. Kiểm tra dòng biến nạp bằng enzyme cắt giới hạn ............................33
3.3.1.10. Xác định trình tự gen và so sánh trình tự gen thu được với trình tự
tương ứng trên GenBank ..................................................................................34
3.3.2.Tạo dòng tế bào E. coli DH5α chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD
...................................................................................................................................... 34

3.3.2.1 Chuẩn bị dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn ..........................34
3.3.2.2. Quy trình tinh sạch gen và plasmid theo MEGAquick-spin PCR &
Agarose Gel DNA Extraction System – INTRON ..........................................35
3.3.2.3. Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD ...........................36
3.3.2.4. Chuẩn bị tế bào E. coli DH5α khả nạp ...............................................36
3.3.2.5. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD vào E. coli DH5α ..........36
3.3.2.6. Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng PCR khuẩn lạc ....................37
3.3.2.7. Kiểm tra dòng biến nạp bằng enzyme cắt giới hạn ............................37
3.3.2.8. Xác định trình tự gen và so sánh trình tự gen thu được với trình tự
tương ứng trên GenBank ..................................................................................38

iii


Đồ án tốt nghiệp

3.3.3.

Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris GS115 mang gen mã hóa

enzyme endoglucanase D .......................................................................................... 38
3.3.3.1.

Chuẩn bị tế bào Pichia pastoris GS115 khả nạp............................39

3.3.3.2.

Phương pháp điện biến nạp.............................................................39

3.3.3.3.

Chọn lọc các dòng Pichia pastoris mang nhiều bản sao của gen

CelD và có khả năng năng tiết enzyme ngoại bào Endoglucanase D .............40
3.3.3.4.

Phương pháp ly trích DNA tổng số ...............................................40

3.3.3.5.

Kiểm tra các dòng Pichia pastoris mang gen mục tiêu bằng

phương pháp PCR với cặp mồi AOX1F/ AOX1R ..........................................41
3.3.5. Định tính khả năng sinh enzyme cellulase của các dòng P. pastoris tái
tổ hợp ........................................................................................................................... 42
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 43
4.1.

Tạo dòng tế bào E. coli DH5α chứa plasmid mang gen CelD của

Clostridium thermocellum ......................................................................................43
4.1.1.

Khuếch đại gen CelD bằng kĩ thuật PCR ................................................. 43

4.1.2.

Tạo dòng E. coli mang plasmid nhân dòng chứa gen CelD ................... 44

4.1.3.

Kiểm tra thể biến nạp bằng PCR khuẩn lạc ............................................. 45

4.1.4.

Phân tích plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với mồi đặc hiệu

CelDF/ CelDR và enzyme cắt giới hạn ................................................................... 46
4.1.5.

Kiểm tra dòng tế bào E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2-CelD bằng

giải trình tự .................................................................................................................. 48
4.2.1.

Kiểm tra thể biến nạp bằng PCR khuẩn lạc ............................................. 52

4.2.2.

Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với mồi đặc hiệu

CelDF/ CelDR và bằng enzyme cắt giới hạn SnaBI và EcoRI ............................ 53

4.2.3.

Kiểm tra dòng E. coli DH5α chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K – CelD

bằng giải trình tự ........................................................................................................ 55
iv


Đồ án tốt nghiệp

4.3.

Tạo dòng Pichia pastoris GS115 tái tổ hợp mang gen CelD ......................57

4.3.1. Biến nạp plasmid pPIC9K – CelD vào chủng Pichia pastoris GS115
...................................................................................................................................... 58

4.3.2.

Sàng lọc tế bào nấm men mang gen mã hóa cho endoglucanase D ...... 59

4.3.3.

Kiểm tra các dòng Pichia pastoris mang gen mục tiêu bằng phương

pháp PCR với mồi AOX1F/ AOX1R ..................................................................... 60
4.3.4. Định tính khả năng sinh enzyme cellulase của các dòng P. pastoris tái tổ
hợp................................................................................................................................ 62
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 63
5.1.

Kết luận .........................................................................................................65

5.2.

Đề nghị ..........................................................................................................65

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...............................................................................................66
PHỤ LỤC

v


Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
AOX

Alcohol oxydase

BMGY

Buffered Glycerol-complex

BMMY

Buffered Methanol-complex

bp

Base pair

CBD

Cellulose binding domain

CMC

Carboxymethyl-cellulose

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

DNA

Deoxyribonucleic acid

Kb

kilo base

LB

Luria-Bertani

MD

Minimal Dextrose

Mut

Methanol Utilisation

NCBI

National Center for Biotechnology Information

OD

Optical Density

PCR

Polymerase Chain Reaction

Taq

Thermus aquaticus

TAE

Tris – acetate – EDTA

TE buffer

Tris EDTA buffer

YNB

Yeast Nitrogen Base

YPD

Yeast Extract Peptone Dextrose

vi


Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1. Tỉ lệ các thành phần trong lignocellulose. ..................................................3
Hình 2.2. Lignocellulose .............................................................................................4
Hình 2.3. Cấu trúc phân tử Cellulose ..........................................................................5
Hình 2.4. Cấu trúc cellulose ........................................................................................6
Hình 2.5. Hemicellulose. .............................................................................................7
Hình 2.6. Lignin ...........................................................................................................7
Hình 2.7. Quá trình phân giải cellulose của enzyme cellulase. ..................................9
Hình 2.8. Clostridium thermocellum ........................................................................ 11
Hình 2.9. Cơ chế hoạt động của Cellulosome ...........................................................12
Hình 3.1. Thang DNA 1 Kb ......................................................................................21
Hình 3.2. Plasmid pJET 1.2 .......................................................................................24
Hình 3.3. Plasmid pPIC9K ........................................................................................25
Hình 3.4. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR với cặp mồi CelDF/ CelDR ...............27
Hình 3.5. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi pJET1.2F/
pJET1.2R ................................................................................................................... 32
Hình 3.6. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi AOX1F/
AOX1R .......................................................................................................................37
Hình 3.7. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR với cặp mồi AOX1F/ AOX1R ...........41

Hình 4.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen CelD .....................43
Hình 4.2. Sàng lọc thể biến nạp E. coli DH5𝛼 chứa plasmid tái tổ hợp pJET1.2CelD trên môi trường LB/ Ampicillin (50 µg/ml) ...................................................444
Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng E. coli
DH5α/pJET1.2-CelD với cặp mồi pJET1.2F/pJET1.2R ...........................................45
Hình 4.4. Kết quả điện di sản phẩm của cắt plasmid pJET1.2-CelD bằng enzyme
SnaBI và EcoRI và sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với mồi đặc
hiệu CelDF/ CelDR ....................................................................................................46
Hình 4.5. Sàng lọc thể biến nạp E. coli DH5𝛼 chứa pPIC9K-CelD bằng môi trường
LB/ ampicillin (50 µg/ml). .........................................................................................51
vii


Đồ án tốt nghiệp

Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng E. coli
DH5α/pPIC9K-CelD với cặp mồi AOX1F/AOX1R. ................................................52
Hình 4.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD với mồi
CelDF/ CelDR và sản phẩm cắt pPIC9K-CelD bằng SnaBI và EcoRI. ....................53
Hình 4.8. Kết quả blast trình tự protein của trình tự trong plasmid
pPIC9K-CelD trên NCBI .......................................................................................... 56
Hình 4.9. Sàng lọc thể biến nạp P. pastoris GS115 chứa pPIC9K-CelD .................58
Hình 4.10. Sàng lọc tế bào P. pastoris mang gen CelD trên môi trường YPD/ G418
.....................................................................................................................................60
Hình 4.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự sát nhập của plasmid
pPIC9K-CelD vào bộ gen P. pastoris GS115 .......................................................... 61
Hình 4.12. Vòng phân giải CMC của các dòng Pichia pastoris tái tổ hợp khi nhuộm
với thuốc đỏ Congo ................................................................................................... 63

viii

Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Các cặp mồi được sử dụng có trình tự như sau: .......................................26
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi CelDF/ CelDR ..........................27
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng nối gen CelD vào plasmid pJET1.2 ......................29
Bảng 3.4. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R ...............31
Bảng 3.5. Thành phần phản ứng cắt pJET1.2-CelD với SnaBI và EcoRI ................33
Bảng 3.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid pPIC9K và pJET1.2-CelD với SnaBI
và EcoRI .....................................................................................................................35
Bảng 3.7. Thành phần phản ứng nối CelD vào vector biểu hiện pPIC9K ................36
Bảng 3.8. Thành phần phản ứng cắt pPIC9K-CelD bằng SnaBI và EcoRI..............38
Bảng 4.1. Đường kính vòng phân giải CMC của các chủng P. pastoris tái tổ hợp
.................................................................................................................................... 64

ix


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề:
Ethanol là một trong những dung môi quan trọng trong công nghiệp hóa học

và công nghệ sản xuất thực phẩm. Gần đây, ethanol được coi là một nhiên liệu sạch
có khả năng tái tạo, có thể thay thế một phần cho các nguồn nhiên liệu hoá thạch
đang ngày càng cạn kiệt như than đá, dầu mỏ trong tương lai. Hiện nay 98% ethanol

được sản xuất từ ngũ cốc hoặc nguyên liệu thực phẩm. Điều này sẽ gây ảnh hưởng
nghiêm trọng đến tình hình an ninh lương thực trên thế giới. Trong khi đó, sản xuất
nông nghiệp hàng năm sinh ra một lượng lớn phụ phế phẩm như rơm rạ, cám mì,
trấu, bã mía,…Việc tận dụng được nguồn chất thải này để sản xuất ethanol sinh học
không những giảm khai thác nguồn tài nguyên thiên nhiên đang dần cạn kiệt mà còn
giảm ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên việc sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu tái
sinh này vẫn còn gặp nhiều khó khăn khi sản xuất ở quy mô công nghiệp.
Trong công nghệ sản xuất cồn sinh học, hai hướng chính để thủy phân
cellulose là phương pháp hóa học và sinh học. Trong thủy phân hóa học, cellulose
bị phân hủy thành đường đơn dưới tác dụng của H2SO4 ở nhiệt độ cao. Công nghệ
này mặc dù có hiệu suất cao nhưng rất độc hại và phức tạp, ảnh hưởng xấu đến môi
trường và con người. Chính vì vậy, hướng ứng dụng enzyme để thủy phân cellulose
là một hướng nghiên cứu mới, hứa hẹn đem đến những đột phá về mặt công nghệ.
Enzyme cellulase là enzyme ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình thủy phân cellulose
thành glucose – nguyên liệu chính trong sản xuất cồn sinh học. Tuy nhiên, việc sử
dụng chúng vẫn còn hạn chế vì chi phí sản xuất enzyme cellulase cao và hiệu suất
chuyển hóa cơ chất thấp. Nguyên nhân là do quá trình thu nhận enzyme trực tiếp từ
vi sinh vật tốn nhiều thời gian và công sức, khó thực hiện ở quy mô công nghiệp,
enzyme đôi khi không có đủ các đặc tính mong muốn. Chính vì thế, ứng dụng
những tiến bộ của kỹ thuật di truyền vào việc sản xuất enzyme cellulase tái tổ hợp
là một trong những hướng nghiên cứu tiềm năng để thu nhận enzyme với sản lượng
lớn.

1


Đồ án tốt nghiệp

Hiện nay trên thế giới đã có những nghiên cứu về hệ enzyme phân hủy
cellulose của cellulosome ở vi khuẩn kỵ khí ưa nhiệt Clostridium thermocellum.

Hướng biểu hiện hệ cellulosome tái tổ hợp để thu nhận được số lượng lớn
cellulosome có chức năng phân giải cellulose được coi là hướng có tiềm năng nhất
trong công nghệ sản xuất cồn từ cellulose. Trên cơ sở đó đề tài: “Tạo dòng plasmid
tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase D (CelD) từ vi khuẩn
Clostridium thermocellum trên hệ thống nấm men Pichia pastoris” được tiến hành.
Kết quả của đề tài là tiền đề cho các nghiên cứu tạo hỗn hợp enzyme cellulase phân
hủy cellulose từ các nguồn phụ phế phẩm nông – lâm nghiệp và ứng dụng để sản
xuất cồn sinh học với giá thành hợp lý.
1.2.

Mục đích nghiên cứu đề tài
Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris mang gen mã hóa enzyme

endoglucanase D từ vi khuẩn Clostridium thermocellum.
1.3.

Nội dung nghiên cứu:
-

Thu nhận gen mã hóa endoglucanase D (CelD) từ Clostridium
thermocellum bằng phản ứng PCR.

-

Tạo dòng tế bào E. coli DH5𝛼 mang plasmid nhân dòng tái tổ hợp chứa
gen CelD

-

Tạo dòng E. coli DH5𝛼 mang vector biểu hiện pPIC9K chứa gen mã hóa

enzyme endoglucanase D.

-

Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris mang gen mã hóa enzyme
endoglucanase D.

2


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
2.1.

Cấu tạo lignocellulose
Lignocellulose là một hợp chất hữu cơ phổ biến trong tự nhiên. Hàng năm sản

lượng sinh khối thực vật trên Trái Đất khoảng 200 tỉ tấn, trong đó 90% là
lignocellulose (Himmel và cộng sự, 2007). Việc chuyển hóa lignocellulose không
chỉ quan trọng đối với vòng tuần hoàn vật chất mà còn ảnh hưởng đến việc tái hồi
dinh dưỡng cho cây.
Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và một số
thực vật khác như cỏ, lúa, ngô…Trong tự nhiên, lignocellulose chủ yếu có trong
phụ phế phẩm nông nghiệp, sản phẩm phụ của công nghiệp sản xuất giấy và các
chất thải rắn,…Về thành phần cấu tạo, lignocellulose gồm cellulose, hemicellulose
và lignin. Số lượng mỗi loại polymer thay đổi tùy loài, tuổi và từng bộ phận khác
nhau của cây.

Hình 2.1. Tỉ lệ các thành phần trong lignocellulose

Nguồn: Pérez và cộng sự (2002)
Với thành phần chính là cellulose, lignocellulose là một nguồn nguyên liệu
tiềm năng cho sản xuất cồn sinh học. Tuy nhiên đây là một hợp chất khó phân hủy
trong điều kiện tự nhiên vì nó có cấu trúc đa dạng và phức tạp, bao gồm các thành
phần có độ polymer hóa cao và liên kết với nhau một cách chặt chẽ. Do đó muốn
phân hủy được chúng, cần phải có một hệ enzyme chuyên biệt, đòi hỏi một hệ vi
sinh vật có khả năng tổng hợp hệ enzyme để phân hủy chúng. (Himmel và cộng sự,
2007).
3


Đồ án tốt nghiệp

Các mạch cellulose tạo thành các sợi cơ bản, các sợi này gắn lại với nhau
nhờ hemicellulose, tạo thành cấu trúc vi sợi. Hemicellulose và lignin bao bọc xung
quanh các vi sợi, tạo nên một cấu trúc vững chắc, bảo vệ cellulose khỏi sự tấn công
của enzyme cũng như các hóa chất khác trong quá trình thủy phân (Charles E.
Wyman, 1996).

Hình 2.2. Lignocellulose
Nguồn: Joseleau và cộng sự (1992)
2.1.1. Cellulose
Cellulose là thành phần polymer phổ biến nhất trong tự nhiên, chiếm 50%
lượng sinh khối thực vật, giúp mô thực vật có độ bền cơ học và tính đàn hồi. Thành
phần cellulose thường không đều ở các cơ quan khác nhau trong thực vật. Người ta
thấy rằng, lượng cellulose ít nhất ở lá và nhiều nhất ở thân cây. Cellulose chiếm đến
90% trong sợi bông, 50% trong gỗ, 40 – 50% trong bã mía, 35 – 40% trong rơm lúa
mỳ và lúa gạo (Sloneker, J. H., 1971; Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2012).
Cellulose là chất rắn màu trắng, không mùi vị, có độ bền nhiệt cao, không tan
trong nước và các dung môi thông thường (rượu, ete, benzen,…) nhưng tan trong

dung dịch Schweitzer (dung dịch Cu(OH)2 trong NH3). Cellulose bị phân hủy mạnh
dưới tác dụng của một số dung dịch axit vô cơ mạnh như: HCl, H2SO4,… và tương
đối yếu với các axit hữu cơ (axit acetic, axit formic,…) nhưng bền vững dưới tác
dụng của kiềm (Nguyễn Văn Lân, 2004).

4


Đồ án tốt nghiệp

Cellulose là polysaccharide có công thức cấu tạo (C6H10O5)n, trọng lượng
phân tử khoảng từ 50.103 đến 2,5.106 Da, gồm từ 5000 đến 14000 gốc β - D glucose
nối lại với nhau bằng liên kết 𝛽 – 1,4 glucoside tạo thành dạng chuỗi. Các phân tử
cellulose liên kết với nhau nhờ lực hút Van der Waals và liên kết hidro tạo thành
cấu trúc dạng sợi bền vững.

Hình 2.3. Cấu trúc phân tử Cellulose
Nguồn: Gardner và cộng sự (1974)
Cellulose có cấu trúc sợi dài, đường kính khoảng 3 nm. Nhiều sợi liên kết
song song với nhau thành chùm nhờ liên kết hidro giữa các nhóm OH, tạo thành vi
sợi. Trong tự nhiên, các vi sợi không đồng nhất, chúng thường tồn tại ở 2 vùng:
- Vùng kết tinh: có cấu trúc trật tự rất cao, chặt chẽ như tinh thể, chiếm khoảng
¾ cấu trúc cellulose (Taiz và cộng sự, 2006). Các mạch cellulose liên kết với nhau
nhờ liên kết hidro giữa nhóm hydroxyl của mạch này với nhóm hydroxyl của mạch
khác, tạo thành một mạng lưới liên kết hydro dày đặc, ngăn cản sự tác động của
enzyme ở điều kiện bình thường.
- Vùng vô định hình: các mạch liên kết với nhau nhờ lực Van der Waals do đó
vùng này có cấu trúc không chặt và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài (Charles
E. Wyman, 1996). Khi gặp nước, chúng dễ bị trương lên, tạo điều kiện thuận lợi
cho enzyme cellulase tấn công dễ dàng, làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của chúng.

Tuy vậy việc thủy phân cellulose chỉ có thể đạt hiệu quả cao khi tách cellulose khỏi
các thành phần khác cùng cấu tạo nên màng tế bào thực vật (Tô Kim Anh và cộng
sự, 2010).

5


Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.4. Cấu trúc cellulose
Nguồn: Hsu và cộng sự (1980)
2.1.2. Hemicellulose
Hemicellulose là hợp chất polysaccharide chiếm tỷ lệ lớn trên thế giới sau
cellulose. Đây là polysaccharide phức tạp, có phân tử khối nhỏ hơn nhiều so với
cellulose. Chúng được cấu tạo từ các gốc đường khác nhau như arabinose,
galactose, glucose, mannose và xylose. Các gốc đường này liên kết với nhau thông
qua các liên kết 𝛽 – 1,4 glucoside, 𝛽 – 1,3 glucoside và 𝛽 – 1,6 glucoside tạo thành
cấu trúc dạng mạch nhánh. Sự phân nhánh trong cấu trúc của hemicellulose cũng
tạo điều kiện thuận lợi cho dung môi và các chất hóa học tấn công. Cấu trúc của
hemicellulose không bền, dễ bị phân hủy bởi acid loãng hoặc kiềm. Khi bị phân
hủy, hemicellulose tạo thành các monosaccharide (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự,
2012).

6


Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.5. Hemicellulose
Nguồn: Fengel và Wegener (1989)

2.1.3. Lignin
Lignin là hợp chất cao phân tử có nhiều ở thực vật bậc cao (cả thực vật hạt
trần và thực vật hạt kín). Hàm lượng và thành phần lignin thay đổi theo tế bào, mô
và theo nhóm thực vật, ở cây gỗ, lignin chiếm từ 20 – 30%... Lignin có nhiệm vụ
kết dính và tăng độ bền cơ học cho tế bào, tăng khả năng chống thấm nước, ngăn
chặn các độc tố và sự xâm nhiễm của các vi sinh vật đồng thời cản trở sự tiếp xúc
của enzyme cellulase với cellulose (Odier và cộng sự, 1992; Nguyễn Đức Lượng và
cộng sự, 2012). Do vậy phân hủy lignin sẽ tạo điều kiện cho thủy phân hiệu quả
cellulose. Các nghiên cứu đã cho thấy có sự tỉ lệ thuận giữa mức độ lignin bị phân
hủy và mức độ thủy phân cellulose ( Kim và cộng sự, 2006).

Hình 2.6. Lignin
Nguồn: J. Pérez và cộng sự (2002)
7


Đồ án tốt nghiệp

Lignin có cấu tạo vô định hình, kị nước và bền với các tác nhân phân giải
hóa học và sinh học. Dưới tác dụng của bisulfite natri và H2SO4, lignin bị phân giải
tạo ra các hợp chất thơm. Đây là hợp chất được tạo thành từ sự ngưng tụ của các
loại rượu khác nhau, trong đó có ba loại rượu cơ bản là conyferylic, synafilic và
courmarylic. Các loại rượu này liên kết với nhau bằng liên kết C – C và C – O.
2.2.

Enzyme cellulase

2.2.1. Phân loại enzyme
Cellulase là enzyme được sinh ra từ nhiều sinh vật khác nhau như nấm mốc,
vi khuẩn, thực vật,…có khả năng thủy phân cellulose. Cellulase có thể tồn tại dưới

dạng enzyme đơn hoặc phức hệ enzyme còn gọi là cellulosome. Dựa vào cơ chế
thủy phân cellulose, enzyme cellulase được Wood và Mc. Cral (1979) chia làm 3
nhóm chủ yếu : endoglucanase, exoglucanase và 𝛽 – glucosidase.
- Endoglucanase hay 1,4 𝛽 – D – glucanohydrolase (EC 3.2.1.4): là enzyme
tham gia phân giải liên kết 𝛽-1.4 glucoside trong cellulose. Sản phẩm của quá trình
phân giải là cellodextrin, cellobiose và glucose. Chúng tham gia tác động mạnh đến
cấu trúc cellulose vô định hình và tác dụng yếu đến cấu trúc cellulose kết tinh.
- Exoglucanase hay 1,4 𝛽 – D – glucan – cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91): cắt
đầu không khử của chuỗi cellulose và giải phóng ra các cellobiose. Enzyme này
không có khả năng phân giải cellulose ở dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất
hóa lý của chúng, giúp cho enzyme endoglucanase phân giải chúng.
- 𝛽 – D – glucoside glucohydrolase hay 𝛽 – glucosidase (EC 3.2.1.21):
enzyme này có tác dụng thủy phân cellobiose và cellodextrine tan tạo thành D –
glucose. Chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy.
Ba enzym này xúc tác cho các giai đoạn nối tiếp nhau nhưng phụ thuộc lẫn
nhau của quá trình thủy phân cellulose thành glucose (Cullen và cộng sự, 1992).

8


Đồ án tốt nghiệp

2.2.2. Cơ chế tác dụng của cellulase
Trong thiên nhiên, quá trình thủy phân cellulose có sự tham gia của cả ba
loại enzyme là endoglucanase, exoglucanase và 𝛽 – glucosidase. Mỗi loại enzyme
tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định, xúc tác cho các giai đoạn nối
tiếp nhau nhưng phụ thuộc lẫn nhau trong quá trình thủy phân từ cellulose thành
glucose (Cullen và cộng sự, 1992). Nhờ vào sự phối hợp hoạt động của các enzyme
này mà cơ chất được thủy phân hoàn toàn.
Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng enzyme endoglucanase có tác dụng phân cắt

tốt trên vùng vô định hình, đặc biệt trên các cellulose biến tính như carboxymethylcellulose (CMC), hydroxyethyl cellulose (HEC). Ngược lại, enzyme exoglucanase
tác động trên vùng cellulose kết tinh, ít trên vùng cellulose vô định hình và hầu như
không có tác dụng phân cắt cellulose biến tính (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự,
2012)
Dưới tác dụng của exocellulase và endocellulase, mạch cellulose tách thành
các mạch nhỏ (oligosaccharide), sau đó tiếp tục bị phân cắt thành đường glucose
nhờ enzyme β-glucosidase.

.

Hình 2.7. Quá trình phân giải cellulose của enzyme cellulase

9


Đồ án tốt nghiệp

2.2.3. Vi sinh vật sản xuất cellulase
Trong tự nhiên, hệ vi sinh vật có khả năng cellulose vô cùng đa dạng và
phong phú. Nhiều loài nấm hoặc vi khuẩn có phân giải cellulose mạnh ở điều kiện
hiếu khí và kị khí và ở các nhiệt độ khác nhau.
Nấm sợi là nhóm có khả năng tiết một lượng lớn enzyme cellulase có cấu
trúc hoàn chỉnh ra ngoài môi trường nên phân hủy cellulose khá mạnh. Đại diện có
các loài như Trichoderma reesei, T. viridae, Aspergillus niger, Fusarium solani,
Penicillium pinophinum, Sporotrichum pulverulentum. Các loài nấm ưa nhiệt cũng
được chú ý vì chúng có thể sinh các enzyme bền nhiệt, sinh trưởng và phân giải
nhanh cellulose. Nhưng thông thường các chủng nấm sợi phân giải cellulose điển
hình thường thiếu enzyme 𝛽 − glucosidase, vì vậy để hệ này hoạt động hiệu quả
cần phải bổ sung 𝛽 − glucosidase (Lee và cộng sự, 1996).
Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật đặc biệt, đa số sống trong đất và phát triển

trong điều kiện hiếu khí, một số ít loài có thể sống trong điều kiện kị khí. Một số xạ
khuẩn có hoạt tính phân giải cellulose là: Streptomyces, Streptosporagium,
Actinomyces nocardia, Micromonospora …(Schimz và cộng sự, 1983).
Vi khuẩn là nhóm vi sinh vật phân giải cellulose mạnh nhưng cường độ
không bằng nấm do lượng enzyme tiết ra ít hơn. Vi khuẩn hiếu khí và kị khí đều có
thể phân giải cellulose. Các vi khuẩn hiếu khí cũng có khả năng phân giải cellulose
khá mạnh như Cellulomonas, Vibrio,…Trong điều kiện yếm khí, các loài vi khuẩn
ưa ấm và ưa nhiệt cũng có khả năng phân giải cellulose. Đại diện điển hình cho các
vi khuẩn ưa ấm phân giải cellulose ở nhiệt độ 30 – 400C là loài Clostridium
omelanskii, vi khuẩn ưa nóng là loài Clostridium thermocellum, nhiệt độ tốt nhất
cho sự phát triển của chúng là 60 – 650C. Các vi khuẩn ưa ấm, ưa nóng phát triển
tốt trên môi trường chứa đường đơn. Khi phân giải cellulose thành glucose và
cellubiose, chúng sử dụng đường này như nguồn năng lượng (Schwarz WH và cộng
sự, 1986; Schwarz, 2001).

10


Đồ án tốt nghiệp

Trong tự nhiên, đa số các loài không có khả năng cùng một lúc sinh tổng hợp
tất cả các loại enzyme có trong phức hệ cellulase. Có loài này có khả năng sinh tổng
hợp mạnh loại enzyme này, loài khác lại tổng hợp loại enzyme khác. Chính vì vậy,
sự phân giải cellulose trong điều kiện tự nhiên thường rất chậm và không triệt để
(Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2012). Tuy nhiên có một loại vi khuẩn có khả
năng phân hủy cellulose nhanh hơn nhờ vào hệ thống phức hợp đa enzyme. Đó
chính là vi khuẩn Clostridium thermocellum.
2.3.

Phức hợp cellulosome trong vi khuẩn Clostridium thermocellum

2.3.1. Tổng quan về vi khuẩn Clostridium thermocellum
Hệ thống phân loại:
Giới: Vi khuẩn
Ngành: Firmicutes
Lớp: Clostridia
Bộ: Clostridiales
Họ: Clostridiaceae
Chi: Clostridium
Loài: Clostridium thermocellum

Hình 2.8. Clostridium thermocellum

Clostridium thermocellum là trực khuẩn gram dương, kỵ khí bắt buộc, ưa
nhiệt, sinh bào tử, phát triển tốt ở nhiệt độ từ 600C – 650C và pH từ 6,1 – 7,5 (Freier
và cộng sự, 1988). Đây là một vi sinh vật tiềm năng trong công nghiệp sản xuất cồn
sinh học vì nó có khả năng phân hủy cellulose. Quá trình phân giải cellulose bởi
Clostridium thermocellum là các phản ứng được thực hiện bởi 1 phức hệ enzyme
gắn kết với nhau gọi là cellulosome (Bayer và cộng sự, 1998). Tuy nhiên đây là vi
sinh vật kị khí bắt buộc nên quá trình nuôi cấy đạt hiệu quả không cao, lượng
enzyme tạo ra thấp, khó áp dụng vào quy mô công nghiệp.

11


Đồ án tốt nghiệp

2.3.2. Đặc điểm của phức hệ cellulosome
Cellulosome là phức hệ đặc biệt gồm nhiều enzyme liên kết với nhau. Phức
hệ này có khả năng phân huỷ cơ chất phức tạp như cellulose vì có chứa đầy đủ các

thành phần enzyme để thuỷ phân triệt để cơ chất này. Vì vậy, cellulosome có thể
thủy phân cả vùng vô định hình và vùng tinh thể của cellulose trong khi các enzyme
đơn lẻ không thể thực hiện được chức năng này.
Cấu trúc quan trọng của cellulosome bao gồm scaffoldin cùng dạng enzyme
hoạt động cho phép thủy phân cellulose một cách có hiệu quả.

Hình 2.9. Cơ chế hoạt động của Cellulosome
Nguồn: Shoham Y và cộng sự (1999)
Scaffoldin là thành phần quan trọng của hệ cellulosome có các vùng chức
năng :
- Kết nối các enzyme thủy phân thuộc phức hợp cellulsome thông qua tương
tác cohesin (scaffoldin) và dockerin (enzyme).

12


Đồ án tốt nghiệp

- Kết nối phức hợp và các nguồn cơ chất, cellulose nhờ vùng CBD (cellulosebinding domain).
- Kết nối bề mặt tế bào và phức hợp enzyme nhờ các protein dính kết với bề
mặt tế bào, nhờ đó mà tế bào thuận tiện trong việc sử dụng sản phẩm phân giải cho
quá trình đồng hóa.
Trong cấu tạo của scaffoldin thì cohesin luôn có mặt và là thành phần dính
kết với các dockerin của enzyme. Số lượng các cohesin là khác nhau trong các
scaffoldin khác nhau và có tính đặc trưng cho tương tác của chúng với dockerin
trong các enzyme có nguồn gốc cùng loài. Ví dụ trong Clostridium thermocellum,
scaffoldin bao gồm 9 cohesin loại I nối với các enzyme phân giải qua các dockerin
loại I, các dockerin này không tương tác với các cohesin được tìm thấy trong
scaffoldin của Clostridium cellulolyticum. Bên cạnh đó, một dockerin loại II nối với
các protein bề mặt tế bào qua các cohensin loại II. Tương tác này sẽ gắn chặt cấu

trúc cellulosome lên bề mặt tế bào, giúp quá trình thủy phân cellulose hiệu quả hơn
(Doi và cộng sự, 2004).
CBD (Carbonhydrate binding domain) là một thành phần của scaffoldin, có
chức năng gắn hệ cellulosome vào cơ chất cellulose. Scaffoldin của Clostridium
thermocellum chứa CBD IIIa liên kết rất mạnh với cellulose kết tinh. Ngoài ra nó
còn làm yếu các liên kết giữa các sợi của cellulose kết tinh, thúc đẩy cho quá trình
phân giải tiếp theo (Bayer và cộng sự, 1998).
Ở C. thermocellum có một hệ thống enzyme endoglucanase rất đa dạng bao
gồm: CelA, CelB, CelC, CelD, CelE, CelF, CelG, CelH, CelJ, CelK, CelN, CelO,
CelP, CelQ (Roy H. Doi và Akihiko Kosugi, 2004). Trong đó, endoglucanase CelD
có hoạt tính rất cao được nhiều nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu. Enzyme này
hoạt động tối ưu ở pH 6,3 và nhiệt độ 600C. Hoạt tính riêng của enzyme này đạt 428
IU/ mg cao hơn nhiều so với các enzyme endoglucanase khác của C. thermocellum
(Gwennael và cộng sự, 2000).

13