Chế tạo và thử nghiệm bộ kit tách chiết DNA từ các tiêu bản cố định mẫu mô ung thư để phát hiện một số virus gây bệnh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------

Nguyễn Thị Huyền

CHẾ TẠO VÀ THỬ NGHIỆM BỘ KIT TÁCH CHIẾT DNA
TỪ CÁC TIÊU BẢN CỐ ĐỊNH MẪU MÔ UNG THƢ
ĐỂ PHÁT HIỆN MỘT SỐ VIRUS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------

Nguyễn Thị Huyền

CHẾ TẠO VÀ THỬ NGHIỆM BỘ KIT TÁCH CHIẾT DNA
TỪ CÁC TIÊU BẢN CỐ ĐỊNH MẪU MÔ UNG THƢ
ĐỂ PHÁT HIỆN MỘT SỐ VIRUS
Chuyên ngành:

Vi sinh vật học

Mã số:

60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS. Nguyễn Thị Vân Anh
XÁC NHẬN HỌC VIÊN ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG

Giáo viên hƣớng dẫn

Chủ tịch hội đồng chấm luận văn
thạc sĩ khoa học

PGS.TS. Nguyễn Thị Vân Anh

PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà

Hà Nội - 2017


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp, tôi luôn nhận được rất
nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và chỉ dẫn tận tình.
Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.
Nguyễn Thị Vân Anh đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi
trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn GS.TS.
Phan Tuấn Nghĩa, TS. Phạm Thị Thu Hường đã tư vấn và góp ý cho các kết quả
nghiên cứu trong luận văn.
Qua đây, tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ và tập thể nhóm nghiên
cứu tại phòng Sinh học Nano và Ứng dụng, phòng Protein tái tổ hợp thuộc Phòng
Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme & Protein của Trường Đại học Khoa

học Tự nhiên, những người đã giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi rất nhiều trong
suốt thời gian thực hiện luận văn thạc sĩ; các thầy cô giáo trong Bộ môn Vi sinh vật
học và các thầy cô thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại
học Quốc gia Hà Nội đã mang đến kiến thức quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho
tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Nguyễn Lĩnh Toàn thuộc Khoa Sinh
lý Bệnh, Học viện Quân Y, cảm ơn Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện TƯQĐ 108,
PGS.TS. Trần Vân Khánh, Trung tâm Nghiên cứu Gen và Protein - Đại học Y Hà
Nội, PGS.TS. Nguyễn Hoàng Nam, Trung tâm Nano và Năng lượng - Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên đã cung cấp mẫu cho chúng tôi trong quá trình nghiên cứu.
Luận văn được thực hiện dưới sự tài trợ kinh phí của đề tài mã số QG.16.22
do ĐHQGHN tài trợ, PGS.TS. Nguyễn Thị Vân Anh làm chủ nhiệm.
Sau cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn
bè đã luôn sát cánh động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt
nghiệp này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quí báu đó!
Hà Nội, tháng
năm 2017
Học viên

Nguyễn Thị Huyền


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Chữ viết đầy đủ

BB

Binding Buffer (Đệm gắn kết)

bp

Base pair

DNA

Deoxyribonucleic acid

EB

Elution Buffer (Đệm chiết đẩy)

EBV

Epstein - Barr virus

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

EtBr

Ethidium bromide

GuHCl

Guanidine hydrochloride

GuSCN

Guanidine Thiocyanate

HPV

Human Papilloma virus

kb

Kilo base pair

KoAc

Kali acetate

LB

Lysis Buffer (Đệm ly giải)
Formalin Fixed and Paraffin Embedded

Mô FFPE

Tissue (Mô cố định bằng formalin và đúc
trong thể vùi parafin)

PCR

Polymerase chain reaction

RNA

Ribonucleic acid

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

UTĐTT

Ung thƣ đại trực tràng

UTVMH

Ung thƣ vòm mũi họng

WB

Washing Buffer (Đệm rửa)


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................. 3
1.1. UNG THƢ VÕM MŨI HỌNG (UTVMH) VÀ VIRUS GÂY UTVMH ............ 3
1.1.1. Giới thiệu chung về UTVMH....................................................................... 3
1.1.2. Epstein-Barr virus (EBV) tác nhân gây UTVMH ........................................ 4
1.1.3. Human Papilloma virus (HPV) tác nhân gây UTVMH ............................... 8
1.2. TÁCH CHIẾT DNA TỪ MÔ FFPE ................................................................. 13
1.2.1. Vai trò quan trọng của việc tách chiết DNA từ các mẫu mô FFPE ........... 13

1.2.2. Tách chiết DNA từ các mẫu mô FFPE ....................................................... 14
1.3. SỰ CẦN THIẾT PHẢI TRIỂN KHAI VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .................... 19
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ......................................... 20
2.1. NGUYÊN LIỆU ................................................................................................ 20
2.1.1. Mẫu mô đúc trong thể FFPE ...................................................................... 20
2.1.2. Hạt nano từ bọc silica ................................................................................. 20
2.1.3. Các bộ kit thƣơng mại tách chiết DNA từ mẫu mô FFPE.......................... 21
2.1.4. Các cặp mồi, probe ..................................................................................... 21
2.1.5. Các hóa chất và nguyên liệu khác .............................................................. 22
2.1.6. Máy móc và thiết bị .................................................................................... 23
2.2. PHƢƠNG PHÁP ............................................................................................... 23
2.2.1. Chế tạo bộ đệm cho kit tách chiết .............................................................. 23
2.2.2. Tách chiết DNA từ các tiêu bản cố định mẫu mô ung thƣ bằng hạt nano
từ bọc silica và bộ đệm pha chế ................................................................................ 24
2.2.3. Tách chiết DNA từ các tiêu bản cố định mẫu mô ung thƣ bằng hạt nano
từ bọc silica bằng bộ kit thƣơng mại MagMAX FFPE DNA Isolation kit
(Thermo Scientific) ................................................................................................... 25
2.2.4. Đánh giá nồng độ và độ tinh sạch của nucleic acid tách chiết
đƣợc dựa trên quang phổ kế ...................................................................................... 27
2.2.5. Nhân bản đoạn gen đặc hiệu Braf............................................................... 27
2.2.6. Real-time PCR phát hiện EBV ................................................................... 28
2.2.7. Real-time nested PCR phát hiện HPV ........................................................ 29
2.2.8. Giải trình tự gen.......................................................................................... 30
2.2.9. Phƣơng pháp phân tích gen ........................................................................ 30


CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ ......................................................................................... 31
3.1. CHẾ TẠO BỘ KIT TÁCH DNA TỪ MÔ FFPE SỬ DỤNG HẠT
TỪ BỌC SILICA ...................................................................................................... 31
3.1.1. Đệm Lysis Buffer, Binding Buffer phù hợp với tách chiết DNA

từ mô FFPE ............................................................................................................... 31
3.1.2. Hạt Magsi nano phù hợp với tách chiết DNA từ mô FFPE ....................... 34
3.1.3. DNA tách chiết từ mô FFPE phù hợp làm khuôn cho PCR
và giải trình tự gen .................................................................................................... 36
3.1.4. Xây dựng bộ kit tách chiết từ mô FFPE hoàn chỉnh .................................. 38
3.2. THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG TÁCH DNA TỪ MÔ FFPE CỦA BỘ KIT
TRÊN CÁC MẪU MÔ FFPE Ở BỆNH NHÂN UTVMH ĐỂ PHÁT HIỆN
EBV-DNA VÀ HPV-DNA....................................................................................... 42
3.2.1. Bƣớc đầu so sánh chất lƣợng bộ kit với kit thƣơng mại và đánh giá
khả năng tách chiết DNA của virus EBV và HPV từ mẫu mô FFPE UTVMH ....... 42
3.2.2. Thử nghiệm phát hiện EBV và HPV từ mẫu cố định mô UTVMH ........... 46
KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO .................................... 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 54


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Ảnh chụp vòm họng của bênh nhân ung thƣ vòm mũi họng [43] .............. 4
Hình 1.2: Hình ảnh Epstein Barr Virus dƣới kính hiển vi điện tử [44] ...................... 5
Hình 1.3: Cấu trúc EBV [53] ...................................................................................... 6
Hình 1.4: Sơ đồ minh họa quá trình tiến triển của Epstein Barr virus trong cơ thể
ngƣời bị nhiễm [45] .................................................................................................... 7
Hình 1.5: Hạt virus và cấu trúc gen của HPV [54] ................................................... 10
Hình 1.6: Hình ảnh minh họa mẫu mô đúc trong khối nến [47]............................... 14
Hình 1.7 : Liên kết chéo trong mẫu mô FFPE [38] .................................................. 15
Hình 1.8: DNA liên kết với silica trong môi trƣờng có nồng độ muối cao và
chất diện hoạt sức căng bề mặt thấp [55].................................................................. 16
Hình 2.1: Ảnh chụp hạt nano từ bọc silica dƣới kính hiển vi điện tử
(Transmission Electron Microscope, TEM) ............................................................. 21
Hình 3.1: So sánh nồng độ DNA của 5 bệnh nhân khi tách chiết bởi 3 bộ đệm
(n=3).......................................................................................................................... 32

Hình 3.2: Kết quả điện di PCR nhân đoạn gen Braf từ mẫu DNA của
Bệnh nhân 2 tách bởi ba bộ đệm tƣơng ứng ............................................................. 33
Hình 3.3 : Đồ thị nồng độ DNA của 5 bệnh nhân khi tách chiết bởi ba loại hạt
Magsi nano khác nhau (n=3) .................................................................................... 34
Hình 3.4: Ảnh điện di kết quả PCR nhân đoạn gen Braf từ mẫu DNA của
bệnh nhân 6 tách bởi ba loại hạt nano từ bọc silica .................................................. 36
Hình 3.5: Các peak trình tự acid nucleic của một đoạn gen Braf tách từ
bệnh nhân số 1 và bệnh nhân số 2 (B) ...................................................................... 37
Hình 3.6: So sánh kết quả giải trình tự đoạn gen Braf của hai bệnh nhân với
cơ sở dữ liệu trên NCBI ............................................................................................ 38
Hình 3.7: Sơ đồ tách chiết DNA từ mô FFPE từ hạt magsi nano và bộ đệm
pha chế ...................................................................................................................... 40
Hình 3.8 : Hình ảnh bộ kit Magpure FFPE DNA mini kit ....................................... 41
Hình 3.9: Hàm lƣợng DNA của 10 bệnh nhân tách bằng kit Magpure và
MagMAX .................................................................................................................. 43
Hình 3.10: Tín hiệu real-time PCR phát hiện EBV và real-time nested PCR
phát hiện HPV sử dụng DNA khuôn tác từ 2 bộ kit Magpure và MagMAX
ở BN7 và BN ............................................................................................................ 45
Hình 3.11: Tín hiệu chạy real-time PCR phát hiện EBV sử dụng khuôn DNA tách
từ mô bệnh phẩm của 3 bệnh nhân ung thƣ vòm họng FFPE bằng kit Magpure ..... 48
Hình 3.12: Tín hiệu chạy Real-time nested PCR SYBR Green phát hiện HPV
sử dụng khuôn DNA tách từ mô FFPE của 3 bệnh nhân UTVMH bằng kit Magpure . 50


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Đặc diểm của 3 loại hạt nano từ bọc silica............................................... 20
Bảng 2.2: Trình tự các cặp mồi, probe ..................................................................... 22
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR nhân đoạn gen Braf ...................................... 27
Bảng 2.4: Thành phần phản ứng Real-time PCR phát hiện EBV ............................. 29
Bảng 3.1: Kí hiệu và thành phần các bộ đệm ........................................................... 31

Bảng 3.2: Kết quả đo độ tinh sạch DNA của 5 bệnh nhân tách bởi 3 bộ đệm
khác nhau .................................................................................................................. 33
Bảng 3.3: Kết quả đo độ tinh sạch DNA của 5 bệnh nhân tách bởi 3 loại hạt
khác nhau .................................................................................................................. 35
Bảng 3.4: Các thành phần trong Magpure FFPE DNA nano kit (100 pứ) ............... 42
Bảng 3.5: Kết quả đo độ tinh sạch DNA tách chiết từ 10 mẫu mô FFPE của
bệnh nhân UTVMH tách bằng bởi 2 bộ kit Magpure và MagMAX ........................ 43
Bảng 3.6: Kết quả real-time PCR phát hiện EBV 26 mẫu dƣơng tính EBV và
real-time nested PCR phát hiện HPV sử dụng DNA khuôn tách từ 2 bộ kit
Magpure và MagMAX trên 10 bệnh nhân UTVMH ................................................ 44
Bảng 3.7: Kết quả real-time PCR 26 bệnh nhân dƣơng tính virus EBV trên
35 bệnh nhân nghi UTVMH ..................................................................................... 47
Bảng 3.8: Kết quả real-time nested PCR 16 bệnh nhân dƣơng tính virus HPV trên
35 bệnh nhân nghi UTVMH ..................................................................................... 49


MỞ ĐẦU
Ung thƣ là một trong những căn bệnh nguy hiểm gây tử vong hàng đầu trên
thế giới. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến bệnh ung thƣ nhƣ: yếu tố di truyền, tác
nhân hóa học, tác nhân vật lý, lây nhiễm virus … Một trong số những bệnh ung thƣ
có liên quan tới nhiễm virus đƣợc nghiên cứu nhiều nhất là ung thƣ vòm mũi họng
(UTVMH). Nguyên nhân gây ra UTVMH cho tới nay chƣa đƣợc xác định rõ ràng,
tuy vậy có rất nhiều giả thuyết, trong đó giả thuyết đƣợc đề cập nhiều nhất là do
Epstein Barr virus (EBV) và Human Papilloma virus (HPV). Nhiều nghiên cứu của
các tác giả trên thế giới cho thấy UTVMH có liên quan đến sự có mặt của virus
EBV, HPV trong máu hoặc niêm mạc họng [4, 27, 36].
Để phát hiện sự có mặt của EBV và HPV ở các bệnh nhân nghi UTVMH, kỹ
thuật sinh học phân tử đƣợc áp dụng vì độ chính xác và đặc hiệu cao cho phép định
tính, định lƣợng số lƣợng virus trong các mô UTVMH [6, 34]. Việc tách chiết DNA
từ mô ngƣời là bƣớc đầu tiên không thể thiếu để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp

theo nhƣ PCR và real time PCR phát hiện EBV, HPV, giải trình tự, xác định đột
biến hay chẩn đoán ung thƣ, bệnh học. Hiện nay, các mẫu mô cố định bằng formalin
và đúc trong thể vùi parafin (Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue- FFPE
Tissue; mô FFPE) đƣợc lƣu trữ rất nhiều tại các khoa bệnh học của bệnh viện cho
mục đích chẩn đoán, nghiên cứu hồi cứu về mô bệnh học và di truyền phân tử. Do
ƣu điểm bảo quản đƣợc toàn vẹn cấu trúc mô trong thời gian dài từ vài năm đến
hàng chục năm, các mẫu mô FFPE là giải pháp đƣợc nhiều bệnh viện, phòng xét
nghiệm lựa chọn để giữ lại các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân ung thƣ, trong đó có
UTVMH [8].
Tuy nhiên, việc sử dụng formalin, các tác nhân vùi nhƣ nhiệt độ làm xuất hiện
các liên kết chéo giữa nucleic acid với protein và giữa các nucleic acid với nhau gây
khó khăn cho quá trình tách chiết đồng thời DNA tách chiết đƣợc bị đứt gãy rất
nhiều [23, 30, 38]. Hiện nay, các hãng nổi tiếng về sinh học phân tử trên thế giới
nhƣ Thermo Scientific và Promega đã phát triển và thƣơng mại hóa các kit tách

1


chiết DNA từ mô FFPE sử dụng cột màng silica hoặc hạt micro từ tính bọc silica đi
cùng với các bộ đệm. Theo nguyên lý của Boom và cộng sự, DNA đƣợc bám trên
bề mặt của màng silica hoặc hạt micro từ tính thông qua cầu nối Na+ để liên kết với
silica và giữ lại bởi nam châm, còn các tạp chất khác đƣợc loại bỏ [9-11, 28]. Hiện
nay chƣa có nhóm nghiên cứu nào trong nƣớc phát triển một bộ kit tách chiết DNA
từ mô FFPE sử dụng màng/cột silica hay hạt từ tính bọc silica, vì thế hầu hết các
bệnh viện và phòng thí nghiệm đều sử dụng kit ngoại nhập với giá thành cao.
Trong các công bố gần đây của nhóm nghiên cứu thuộc phòng Sinh học Nano
và Ứng dụng, PTNTĐ Công nghệ Enzym và Protein phối hợp với Trung tâm Nano
và Năng lƣợng, hạt oxit sắt từ tính bọc silica (Fe3O4@SiO2) kích thƣớc nano đƣợc
chế tạo và thử nghiệm cho việc tách chiết DNA từ virus, tế bào máu, mô tƣơi vì ƣu
điểm có tổng diện tích bề mặt tƣơng tác với DNA lớn nên có khả năng gắn kết hiệu

quả với DNA hơn dạng cột/màng silica hay hạt micro từ tính bọc silica [5, 35, 40].
Xuất phát từ thực tế nhu cầu sử dụng kit tách chiết DNA từ mô FFPE cho phát hiện
các tác nhân virus gây bệnh ung thƣ, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Chế tạo và
thử nghiệm bộ kit tách chiết DNA từ các mẫu tiêu bản mô ung thư sử dụng hạt
nano từ bọc silica và bộ đệm phù hợp để phát hiện một số virus gây bệnh” với các
mục tiêu sau:
 Chế tạo bộ kit tách DNA từ mô FFPE sử dụng hạt từ bọc silica.
 Thử nghiệm khả năng tách DNA từ mô FFPE của bộ kit trên các mẫu mô
FFPE ở bệnh nhân UTVMH để phát hiện EBV-DNA và HPV-DNA.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. UNG THƢ VÒM HỌNG (UTVMH) VÀ VIRUS GÂY UTVMH
1.1.1. Giới thiệu chung về UTVMH
Ung thƣ vòm mũi họng (UTVMH) là một dạng ung thƣ xuất phát từ các tế
bào biểu mô ở vùng vòm mũi họng (phần cao nhất của họng, có hình vòm).
UTVMH thƣờng gặp ở nam giới và để lại nhiều hậu quả nhƣ đau đớn và khó khăn
trong quá trình ăn uống với hầu hết bệnh nhân, tỉ lệ tử vong vì căn bệnh này cao.
UTVMH có thể gặp ở mọi lứa tuổi nhƣng đặc biệt hay mắc phải là ở nam giới, tuổi
từ 40 đến 60. UTVMH là thể ung thƣ thƣờng gặp nhất trong số các ung thƣ ở vùng
đầu cổ và là một trong mƣời ung thƣ phổ biến nhất tại Việt Nam. Những ngƣời hay
uống rƣợu, hút thuốc, có tiền sử gia đình bị bệnh… cũng có nguy cơ mắc UTVMH.
Nhƣng các triệu chứng lại không điển hình, hầu hết là các triệu chứng của các cơ
quan lân cận nhƣ: tai, mũi, thần kinh, hạch…do đó việc chẩn đoán gặp nhiều khó
khăn. Vẫn chƣa có một thống kê đầy đủ, chính xác nhƣng theo thống kê của Bệnh
viện K - Hà Nội (1998) thì UTVMH đứng hàng thứ 5 sau ung thƣ phổi, tử cung,
buồng trứng, vú, ung thƣ gan và là bệnh đứng đầu trong các ung thƣ vùng đầu, cổ
với tỷ lệ: 9 - 10 bệnh nhân/100.000 dân/năm [1, 3, 5].

Nguyên nhân gây ra UTVMH cho tới nay chƣa đƣợc xác định rõ ràng tuy vậy
có rất nhiều giả thuyết, trong đó giả thuyết đƣợc đề cập nhiều nhất là do EBV và
HPV. Nhiều nghiên cứu của các tác giả trên thế giới cho thấy UTVMH có liên quan
đến sự có mặt của virus EBV, HPV trong máu hoặc niêm mạc họng [7, 8]. Tuy
nhiên, tỷ lệ phát hiện về sự liên quan giữa EBV, HPV và UTVMH còn là vấn đề
gây tranh cãi. Bằng kĩ thuật PCR, Hording phát hiện ra sự có mặt của HPV trong
nhiều mẫu UTVMH mà các mẫu này hoàn toàn âm tính với EBV [27]. Trong khi
đó, cũng bằng kĩ thuật này Rassekh phát hiện tỷ lệ các mẫu mô tƣơi UTVMH có
HPV là 88% và tỷ lệ có chứa EBV là 53% [36]; Du- Bois và cs nghiên cứu trên
mẫu mô FFPE UTVMH chỉ phát hiện đƣợc tỷ lệ mẫu dƣơng tính với EBV là 25%
và 19,4% với HPV[20]. Một số nghiên cứu khác cho thấy kháng thể chống virus
EBV, HPV cao ở các bệnh nhân UTVMH loại biểu mô không biệt hoá [18, 41].
3


Hình 1.1: Ảnh chụp vòm họng của bênh nhân ung thƣ vòm họng [44]

1.1.2. Epstein-Barr virus (EBV) tác nhân gây UTVMH
Biếu mô vùng vòm mũi họng là vị trí chủ yếu cho EBV tìm kiếm tế bào thích
ứng thực hiện sự nhân lên tạo ra nhiều thể virus hoàn chỉnh mới. Ngoài ra, vùng
mũi họng còn có hệ thống dẫn lƣu bạch huyết rất phong phú, nên trong UTVMH
các hạch vùng cổ thƣờng bị di căn rất sớm. UTVMH đƣợc xếp vào các khối u
đƣờng tiêu hóa và hô hấp trên. Về mặt lâm sàng, UTVMH có triệu chứng khá
phong phú, dễ bị chẩn đoán nhầm với các bệnh thông thƣờng khác trong tai mũi
họng. Do vậy, các bệnh nhân thƣờng đến khám và đƣợc chuẩn đoán ở các giai đoạn
muộn của bệnh, điều này làm ảnh hƣởng tới kết quả điều trị bệnh [19].
Tại Việt Nam, đã có nhiều nhóm nghiên cứu mối liên quan của EBV và
UTVMH. Tác giả Phạm Huy Tần và cộng sự thuộc Trƣờng ĐH Y Hà Nội đã nghiên
cứu phát hiện nồng độ DNA của EBV trong huyêt tƣơng ở 74 bệnh nhân UTVMH
giai đoạn I và II-IVB và phát hiện thấy tỷ lệ EBV dƣơng tính lên tới khoảng 6367%. Nhóm tác giả cũng chỉ ra có mối tƣơng quan giữa nồng độ EBV với tình trạng

di căn hạch và giai đoạn ung thƣ (giai đoạn II đến IV) của bệnh nhân [4]. Tác giả
Nghiêm Đức Thuận tại Học Viện Quân Y cũng đã công bố về nghiên cứu phát hiện
DNA của biểu mô sống không sừng hóa là 55%. Tác giả Phạm Thị Trà, tại phòng
Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym & Protein đã công bố về phát hiện EBV
trong mẫu huyết thanh của bệnh nhân nghi có triệu chứng của bệnh UTVMH với tỷ
lệ mẫu dƣơng tính phát hiện chỉ là 9% [5].
4


1.1.2.1. Giới thiệu chung về EBV
Nhóm tác giả Epstein, Barr và Pulvertafl phân lập đƣợc loại virus ở dòng
lymphoblast trong khối u LB (Lympho’s Burkitt) bằng kính hiển vi điện tử [21] từ
năm 1964 và từ đó, virus này đƣợc mang tên là Epstein Barr virus. Tác giả Nadol và
cộng sự phân lập đƣợc các hạt (virion) của EBV trong tế bào biểu mô ung thƣ vòm
bằng kính hiển vi điện tử. Đây là lần đầu ngƣời ta quan sát đƣợc các thể virus thuộc
họ Herpesviridae trong tế bào ung thƣ ở ngƣời, do đó EBV bị nghi ngờ là nguyên
nhân gây ung thƣ ở ngƣời [1].

Hình 1.2: Hình ảnh Epstein Barr Virus dƣới kính hiển vi điện tử [44]

EBV thuộc họ virus Herpesviridae, có hệ gen thuộc loại DNA sợi đôi xoắn
kép mạch hở, kích thƣớc hệ gen khoảng 184 kb nếu tính cả phần lặp lại ở hai đầu.
Hệ gen EBV có tổ hợp 6 gen mã hóa cho các loại protein kháng nguyên nhân
(Epstein Barr virus nuclear antigen), đƣợc ký hiệu là: EBNA-1, EBNA-2, EBNA3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNA-LB và 3 gen mã hóa cho protein màng tiềm tàng
(latent membral protein), đƣợc ký hiệu là: LMP-1, LMP-2A, LMP-2B [16]. Vai trò
của 6 protein EBNA có liên quan đến quá trình nhân lên của EBV trong tế bào
lympho B ở giai đoạn đầu xâm nhiễm còn 3 loại protein LMP có liên quan đến chu
kỳ nhân lên của EBV trong tế bào lympho B.
Gen mã hóa cho protein EBNA-2 là một phân đoạn cơ bản trong gen EBNA
của hệ gen EBV. EBNA-2 có vai trò biệt hóa tế bào lympho B thành tế bào mầm

non hóa để EBV thực hiện quá trình gây ung thƣ. Hơn nữa, gen EBNA-2 là gen
5


đƣợc sao chép sớm nhất do vai trò của nó trong quá trình điều tiết sự nhân lên của tế
bào bị nhiễm. EBNA-2 điều hòa quá trình sao chép gen và tổng hợp protein của cả
virus và tế bào bị nhiễm EBV, protein EBNA-2 đƣợc coi là yếu tố quan trọng trong
cảm ứng tăng sinh dòng tế bào lympho B [35].
Toàn bộ hệ gen của EBV đƣợc chứa trong một vỏ capsid. Vỏ capsid này có
hình thái đối xứng hình khối, đó là cấu trúc protein đóng kín bảo vệ nhân DNA của
virus và mang tính kháng nguyên đặc hiệu của EBV (kháng nguyên VCA), đƣợc
xác định bởi 20 mặt bên, 12 đỉnh và 3 trục đồng dạng đối xứng. Vỏ capsid lại đƣợc
bao bọc bởi một vỏ bao ngoài khác gọi là vỏ ngoài (envelope) cấu trúc từ thành
phần chủ yếu là glycoprotein. Vỏ bao ngoài này cũng đƣợc mã hóa bởi gen virus và
cũng dấu hiệu ấn miễn dịch (Hình 1.3).

Hình 1.3: Cấu trúc EBV [54]

1.1.2.2. Cơ chế gây bệnh của EBV
EBV sau khi nhiễm vào cơ thể có các hƣớng tiến triển đƣợc minh họa ở Hình
1.4 gồm hai trƣờng hợp sau:
1. EBV xâm nhập trực tiếp vào tế bào biểu mô và nhân lên ((1))
2. Gây nhiễm trực tiếp vào tế bào lympho B, có tiềm năng cảm ứng biến đổi
tế bào nhiễm tiến triển gây ung thƣ ((2) (3) (4) (5) (6) (7) (8))

6


 Đối với trƣờng hợp thứ nhất, EBV tìm thấy sự kích ứng trong tế bào biểu
mô và sự nhân lên của EBV thuộc loại hình gây nhiễm sinh tan. Các thể EBV hoàn

chỉnh có thể nhân lên trong tế bào biểu mô hoặc chuyển từ sơ nhiễm sang lây nhiễm
thứ cấp vào tế bào lympho B.
 Trƣờng hợp thứ hai, EBV nhiễm khởi phát vào tế bào lympho B có trong
vùng họng, thực hiện xâm nhập và nhân lên trong tế bào lympho B và gây chuyển
dạng tế bào này. Những virus trong các tế bào lympho này tiếp tục tiến triển theo
hƣớng: i) EBV nhân lên hàng loạt và ly giải (sinh tan) tế bào B, các thể virus hoàn
chỉnh có thể đi theo các con đƣờng bài tiết qua nƣớc bọt, xâm nhiễm vào tế bào B
hay xâm nhiễm vào các tế bào biểu mô ((6), (7), (8)); ii) EBV tồn tại ở dạng tiềm
tan trong tế bào B và gây ra đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào. Ở trạng thái
tiềm tan có thể EBV thực hiện sự biến đổi tế bào lympho B, non hóa các tế bào này
và biệt hóa chúng tăng sinh và tiến triển chúng thành UTVMH. Tuy nhiên, quá trình
ung thƣ do EBV còn chịu nhiều tác động của các yếu tố đến từ bên ngoài và bên
trong cơ thể mà cho tới nay các nhà khoa khọc vẫn đang làm rõ.

Hình 1.4: Sơ đồ minh họa quá trình tiến triển của Epstein Barr virus trong cơ thể
ngƣời bị nhiễm [46]

7


1.1.2.3. Các phƣơng pháp phát hiện EBV
Hiện nay có hai phƣơng pháp phát hiện EBV đang đƣợc sử dụng trong các
phòng xét nghiệm ở các bệnh viện, bao gồm:
 Phƣơng pháp miễn dịch học: ELISA phát hiện kháng thể kháng EA (early
antigen- kháng nguyên sớm). Tuy nhiên, kháng thể này chỉ xuất hiện trong khoảng
vài tuần sau khi nhiễm EBV do đó khó có thể biết đƣợc sự biểu hiện của EBV trong
cơ thể ngƣời nhiễm khi đã qua giai đoạn đầu sau khi nhiễm vài tuần. Kháng thể
kháng lại VCA (kháng nguyên vỏ capsid) gồm có hai loại là IgG và IgM. Tƣơng tự
nhƣ kháng thể kháng EA, kháng thể IgM cũng chỉ xuất hiện trong khoảng vài tuần
sau khi nhiễm EBV. Kháng thể IgG tồn tại suốt đời trong cơ thể ngƣời bệnh sau khi

nhiễm nên kết quả chuẩn đoán thƣờng không có ý nghĩa do không phân biệt đƣợc
ngƣời đã từng bị nhiễm trong quá khứ đã khỏi bệnh và ngƣời đang bị nhiễm EBV.
Chính vì vậy, phƣơng pháp miễn dịch thƣờng không đem lại hiệu quả nhiều trong
chẩn đoán và hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan tới EBV [25].
 Phƣơng pháp Real-time PCR sử dụng khuôn là DNA tổng số của virus để
phát hiện trình tự gen đích của virus EBV trong mẫu bệnh phẩm bằng cách sử dụng
thiết kế đầu dò (probe) có khả năng phát huỳnh quang dƣới tác động của nguồn
sáng kích thích. Do vậy, chất lƣợng và hàm lƣợng DNA có vai trò rất quan trọng
quyết định tới kết quả của phản ứng Real-time PCR. Phƣơng pháp phát hiện EBV
bằng kỹ thuật Real-time PCR với độ chính xác và độ nhạy cao cho phép định tính,
định lƣợng số lƣợng virus EBV trong mẫu mô bệnh phẩm của ngƣời nhiễm hỗ trợ
cho chuẩn đoán, điều trị, tiên lƣợng các bệnh do tác nhân gây ra [34]. Với các ƣu
điểm mà Real-time PCR mang lại thì phƣơng pháp này hiện đang đƣợc sử dụng
rộng rãi tại các các phòng xét nghiệm và các bệnh viện.
1.1.3. Human Papilloma virus (HPV) tác nhân gây UTVMH
Nhiễm HPV là nguyên nhân dẫn đến rất nhiều bệnh lý nguy hiểm, trong đó có
UTVMH. UTVMH là một trong năm loại ung thƣ phổ biến nhất ở Việt Nam và là

8


loại hay gặp nhất trong các ung thƣ vùng tai mũi họng. Nghiên cứu của Hording và
cs 1994, Rassekh và cs 1998 hay nghiên cứu gần đây của Du- Bois và cs 2017 cho
thấy UTVMH có liên quan đến sự có mặt của virus HPV trong máu hoặc niêm mạc
họng [20 27, 36]. Hording phát hiện ra sự có mặt của HPV trong nhiều mẫu
UTVMH mà các mẫu này hoàn toàn âm tính với EBV. Trong khi đó, cũng bằng kĩ
thuật này Rassekh phát hiện tỷ lệ các mẫu có HPV là 88%; Năm 2017, Du- Bois chỉ
phát hiện đƣợc 19,4% tỷ lệ mẫu dƣơng tính với với HPV. Trên thế giới đã có rất
nhiều nghiên cứu chứng minh mối liên quan giữa HPV và UTVMH.
1.1.3.1. Giới thiệu chung về HPV

Papilloma virus là các thành viên trong họ Papillomaviridae, đƣợc tìm thấy
trong rất nhiều loài động vật có vú trong đó có con ngƣời. Các loài vật chủ khác
nhau sẽ nhiễm các loại Papilloma virus đặc thù cho loài đó. Các Papilloma virus
gây bệnh cho ngƣời gọi là Human Papilloma virus (HPV).
HPV là nhóm virus có kích thƣớc nhỏ, không vỏ. Hạt virus có đƣờng kính 5255nm, vỏ gồm 72 đơn vị capsomer. Mỗi đơn vị capsid gồm một pentamer của
protein cấu trúc L1 kết hợp với một protein L2 (protein này là thành phần kháng
nguyên đƣợc sử dụng trong phản ứng miễn dịch đặc hiệu). Cả 2 protein cấu trúc đều
do virus tự mã hóa: Protein capsid chính (L1) có kích thƣớc 55 kDa và chiếm 80%
tổng số protein của virus. Protein capsid phụ (L2) có kích thƣớc 70 kDa [3333].
HPV là virus có vật liệu di truyền là DNA, mạch đôi không hoàn chỉnh, tồn tại
dạng siêu xoắn hình vòng (circular ds-DNA). DNA của virus liên kết với histone
tạo thành cấu trúc phức hợp giống Chromatin (Chromatin-like conplex) nằm trong
lớp vỏ capsid protein.
DNA của HPV là một mạch đôi không hoàn chỉnh, tồn tại ở dạng siêu xoắn
hình vòng, chứa khoảng 7800- 8000 cặp base, có 10 khung đọc mở ORF (Open
Reading Frame). Bộ gen HPV chia làm 3 vùng:

9


- Vùng điều hòa thƣợng nguồn chiếm 10% chiều dài bộ gen, có 800- 1000
cặp base, là vùng rất biến động. Trình tự của vùng này gồm trình tự tăng cƣờng để
gắn kết các nhân tố phiên mã; promoter cho sự phiên mã để tổng hợp RNA và điểm
khởi đầu sao chép ORF.
- Vùng gen sớm: Có 6 gen, ký hiệu là E1, E2, E4, E5, E6, E7 và các khung
đọc mở ORF. Sản phẩm vùng này là các protein chức năng giúp cho quá trình nhân
lên của DNA, gây hiện tƣợng tăng sinh và biến đổi tế bào, hình thành tế bào bất tử.
- Vùng gen muộn: Gồm 2 gen tổng hợp protein L1 và L2, là protein cấu trúc
capsid của virus. Đây là vùng gen mã hóa muộn hơn, do đó vùng chứa gen L1 và
gen L2 còn đƣợc gọi là vùng sao chép muộn [12, 33].

Hình 1.5: Hạt virus và cấu trúc gen của HPV [55]

HPV là nhóm Papilloma virus gây bệnh trên ngƣời có nhiều genotype nhất.
HPV có thể đƣợc lây truyền trực tiếp qua da, niêm mạc hay các vết thƣơng hở từ
ngƣời bệnh sang ngƣời lành trong đó hơn 100 genotype đƣợc biết đến xác định
đƣợc khoảng 40 genotype có khả năng gây bệnh và lây truyền qua đƣờng tình dục
[24]. Dựa vào khả năng gây ung thƣ, HPV đƣợc chia thành 3 nhóm [12, 15, 17, 26]:
- Nhóm genotype HPV “nguy cơ thấp” (Low-risk type): những genotype
thuộc nhóm này chỉ gây mụn cóc hoặc khối u lành tính. DNA của chúng ở dạng
vòng nằm ngoài nhiễm sắc thể (NST). Các genotype HPV trong nhóm “nguy cơ
thấp” thƣờng gặp là: 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81, 89 và CP6108.

10


- Nhóm genotype HPV “nguy cơ cao” (High-risk type): gồm những genotype
có khả năng tích hợp DNA vào hệ gen ngƣời, làm rối loạn quá trình nhân lên của tế
bào chủ gây ra hiện tƣợng tăng sinh và bất tử hóa tế bào hình thành các khối u.
Những genotype thuộc nhóm “nguy cơ cao” gồm: 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51,
52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82.
- Nhóm genotype “chƣa xác định nguy cơ” (Unknow-risk type): gồm đa số
các genotype HPV chƣa xác định đƣợc khả năng gây ung thƣ nhƣ: 2, 3, 7, 10, 13,
27, 28, 29, 30, 32, 34, 55, 57, 62, 67, 69, 71, 83, 84, 85, 86, 87, 90, 91.
1.1.3.2. Cơ chế gây bệnh của HPV
Human Papilloma virus (HPV) có DNA gồm 8000 cặp base. Hai chuỗi, phân
tử DNA cuộn lại trong một vỏ protein bao gồm 2 phân tử L1 và L2. Bộ mã di truyền
của HPV ngoài phần mã để tạo L1, L2 còn có phần mã hóa của 6 loại protein sớm từ
E1 đến E7 cần thiết cho sự nhân đôi của DNA và sự thành lập hạt thể virion mới
trong tế bào bị nhiễm HPV. Các gen gây ung thƣ của HPV tác động vào gen của tế

bào chủ vốn làm nhiệm vụ ức chế quá trình phát triển của tế bào (p53 và RB); do đó
sẽ gây ra sự phát triển hỗn loạn của nhóm tế bào bị nhiễm [42, 47].
Diễn tiến tự nhiên của HPV là khả năng lui bệnh đến khỏi hẳn, tuy nhiên,
nhóm nguy cơ cao có thể gây tổn thƣơng về mô học để hình thành ung thƣ [26, 42].
HPV tác động vào tế bào biểu mô vảy không sừng hóa, với chức năng che chở, bảo
vệ, sẽ phát triển dần lên hƣớng bề mặt và sau đó đƣợc bong ra ngoài. HPV sát
nhập vào gen tế bào ký chủ, vùng gen E6, E7 điều khiển tổng hợp protein E6, E7
theo chiều hƣớng bất thƣờng làm kích hoạt các chất sinh ung thƣ, bất hoại gen ức
chế tạo khối u. Các protein này làm vô hiệu hóa chức năng của protein điều khiển sự
tăng trƣởng tế bào làm tế bào tăng sinh liên tục và bất thƣờng nên sinh ung thƣ. Khi
tế bào bất thƣờng chiếm toàn bộ các lớp của tế bào biểu mô vảy, có khả năng lan
rộng khỏi màng đáy vào lớp sâu hơn biểu mô vảy và hình thành ung thƣ giai đoạn
xâm lấn [26, 42, 47].

11


1.1.3.3. Các phƣơng pháp phát hiện HPV
Phƣơng pháp xét nghiệm mô bệnh học: sau thời gian tồn tại tiềm ẩn trong cơ
thể HPV sẽ kích hoạt tế bào cổ tử cung sinh sản nhanh dẫn đến các tổn thƣơng dị
sản tế bào ở mức độ nhẹ (CIN-1), vừa (CIN-2), nặng (CIN-3) rồi đến ung thƣ cổ tử
cung. Xét nghiệm mô bệnh học xác định sự có mặt của HPV thông qua sự thay đổi
đặc hiệu cho những tế bào nhiễm HPV. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là chỉ
phát hiện đƣợc HPV trong trƣờng hợp sự xâm nhiễm của tác nhân đã gây ra những
biến đổi tế bào, ở giai đoạn sớm hơn khi chƣa có những thay đổi tế bào thì không
thể phát hiện bằng phƣơng pháp này [2].
HPV là loại virus có cấu trúc di truyền là DNA nên chúng không thể phát triển
trong điều kiện nuôi cấy tại phòng thí nghiệm mà phải thực hiện nghiên cứu invivo,
các kháng nguyên capsid của virus xuất hiện không ổn định và kháng thể kháng
protein của HPV vẫn tồn tại nên để tìm HPV cần phát hiện bộ gen có trong mẫu

bệnh bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Hiện nay, kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện
DNA HPV chia thành hai nhóm: Nhóm có khuếch đại và không khuếch đại, trong
đó, nhóm khuếch đại đƣợc dùng trong nghiên cứu lâm sàng.
Nhóm không có khuếch đại: Thƣờng sử dụng là kỹ thuật Southern Blot.
Nhóm có khuếch đại: Đƣợc chia thành 2 nhóm là khuếch đại tín hiệu (thƣờng
dùng là Hybrid Capture II (HCII) hoặc PCR- reverse Dot Blot) và khuếch đại chính
bộ gen của HPV (thƣờng dùng PCR- Polymerase Chain Reaction).
Hiện nay, cơ bản có các phƣơng pháp sau để phát hiện HPV
- Phƣơng pháp mẫu dò trực tiếp (direct nucleic acid probe methods): Kỹ
thuật thƣờng dùng là Southern Blot hoặc lai tại chỗ. Đặc điểm của phƣơng pháp
này tƣơng tự hóa mô miễn dịch là đánh giá sự hiện diện của nucleotid đích trong
mẫu bệnh phẩm. Các mẫu dò nucleotid đƣợc sử dụng trong phƣơng pháp lai tại chỗ
là một đoạn gen ngắn đặc hiệu đƣợc đánh dấu. Tuy nhiên, kỹ thuật này có độ nhạy
thấp, mất thời gian, cần nhiều DNA của HPV tinh khiết cao [2].

12


- Khuếch đại dấu hiệu lai (hybridization signal amplification) là phƣơng
pháp đƣợc dùng khá phổ biến trong nghiên cứu và bƣớc đầu đƣa vào chẩn đoán, do
một số hãng chuyên về chẩn đoán SHPT phát triển nhằm xác định các HPV
genotype (Diagcor, Genoflow HPV DNA chip). Đại diện của phƣơng pháp này là
Hydrid capture II (HCII), là phản ứng lai đi kèm với khuếch đại tín hiệu, trình tự
đích của khoảng hơn 33 HPV genotype khác nhau sẽ đƣợc khuếch đại bằng các
primer có gắn biotin và lai trên DNA chip có blot các probe có trình tự đặc hiệu
với sản phẩm PCR của từng genotype. Sau khi phản ứng lai đƣợc tiến hành, tín hiệu
biotin sẽ đƣợc phát hiện bởi streptavidin gắn enzym và khuếch đại bằng phản ứng
hiện màu với cơ chất phù hợp. Tuy nhiên, việc định danh chính xác thƣờng không
thực hiện đƣợc. Số bản DNA virus tối thiểu để xác định nhiễm HPV khi trong mẫu
phải có từ 5000 bản sao trở lên [2, 7].

- Khuếch đại chuỗi đích (target amplification method): Polymerase Chain
Reaction (PCR) là phƣơng pháp của khuếch đại chuỗi nucleotid đích, cho phép các
vùng đặc hiệu của DNA nhân lên trong ống nghiệm nhằm khuếch đại chuỗi đích để
tạo ra nhiều bản sao từ một đoạn DNA hoặc RNA mà không cần sử dụng sinh vật
sống. Có nhiều kỹ thuật khác nhau nhƣ PCR đơn mồi, đa mồi, PCR tổ (nested PCR),
PCR tổ không dừng (non- stop nested PCR), touch- down PCR, PCR sao chép ngƣợc
(RT- PCR) hoặc Real-time PCR… Trong đó, phƣơng pháp phát hiện HPV bằng kỹ
thuật Real-time PCR với ƣu điểm thực hiện nhanh chóng (chỉ trong khoảng 1-2
tiếng), chính xác với độ nhạy và độ đặc hiệu cao cho phép định tính định lƣợng, phát
hiện đƣợc các high-risk genotype HPV phục vụ cho chuẩn đoán, điều trị cho bệnh
nhân. Hiện nay, hãng Roche Diagnostics, Sacacae... đã phát triển đƣợc kit chẩn đoán
tới 14 high-risk HPV genotype bằng kỹ thuật real time Taqman PCR [2, 7, 26].
1.2. TÁCH CHIẾT DNA TỪ MÔ FFPE
1.2.1. Vai trò quan trọng của việc tách chiết DNA từ các mẫu mô FFPE
Sử dụng parafin trong bảo quản lâu dài các mô ung thƣ là một phƣơng pháp
hiệu quả giúp cung cấp nguồn mẫu dự trữ dồi dào và có chất lƣợng ổn định cho
nghiên cứu, cũng nhƣ các xét nghiệm thƣờng quy trong bệnh viện và chẩn đoán
13


dịch tễ học phân tử trên quy mô lớn. Trong đó, việc tách chiết DNA từ các mẫu mô
ung thƣ cố định bằng parafin là bƣớc đi đầu tiên giúp phát hiện các biểu hiện phân
tử liên quan đến ung thƣ. Để làm đƣợc điều đó, các kỹ thuật sinh học phân tử nhƣ:
giải trình tự gen, real-time PCR...thƣờng đƣợc sử dụng nhằm xác định chính xác
các đột biến gen hay định lƣợng mức độ biểu hiện của gen chỉ thị ung thƣ. Qua đó,
giúp các bác sỹ lâm sàng tiên lƣợng đƣợc bệnh, chẩn đoán chính xác hơn và chỉ
định điều trị thuốc hƣớng đích hiệu quả. Chẩn đoán ung thƣ học phân tử sẽ thất bại
nếu không tách chiết đƣợc vật liệu di truyền từ các mẫu mô đã đƣợc xử lý formalin
và cố định bằng parafin [9, 26].
Trong đó, để tiến hành đƣợc các thí nghiệm nhƣ giải trình tự hay PCR phát

hiện tác nhân vi sinh vật gây bệnh thì yêu cầu đầu tiên đó là tách chiết đƣợc DNA từ
các mẫu mô FFPE. Với tầm quan trọng và thiết yếu nhƣ vậy đã có rất nhiều phƣơng
pháp tách chiết DNA từ các mẫu mô FFPE không ngừng đƣợc phát triển và cải tiến.

Hình 1.6: Hình ảnh minh họa mẫu mô đúc trong khối nến [48]

1.2.2. Tách chiết DNA từ các mẫu mô FFPE
1.2.2.1. Thách thức của việc tách chiết DNA từ mô FFPE
Tách chiết DNA từ mô FFPE hiện tại vẫn là một thách thức lớn.
Formaldehyde (HCHO) - thành phần chính trong formalin dùng trong quá trình cố
định mô tạo nên các liên kết chéo giữa protein và DNA hoặc ARN [32]. Các liên kết

14


chéo này là nguyên nhân chính ức chế phản ứng khuếch đại của DNA sau tách
chiết. Hơn nữa, các tác nhân nhiệt độ, pH thấp, parafin trong quá trình tạo mẫu ban
đầu cũng nhƣ xử lý nhiệt độ cao để loại bỏ liên kết chéo trong quá trình tách chiết
khiến DNA bị đứt gãy thành các mảnh nhỏ, hàm lƣợng DNA tách chiết đƣợc ít,
phản ứng PCR sau đó thƣờng không đạt hiệu quả cao [23, 30, 38]. Hiệu quả tách
chiết DNA từ mô FFPE phụ thuộc rất nhiều vào chất lƣợng mẫu và khâu xử lý ban
đầu, nếu xử lý không tốt, liên kết chéo xuất hiện càng nhiều, việc tách chiết càng
gặp khó khăn.

Hình 1.7: Liên kết chéo trong mẫu mô FFPE [24]

1.2.2.2. Nguyên lý chung
Parafin phủ bên ngoài các mẫu mô bản chất là các hydrocacbon dạng ankan
mạch thẳng khối lƣợng phân tử lớn, không hòa tan trong nƣớc nhƣng tan trong các
dung môi hữu cơ nhƣ ete, benzen hay một số este. Để tách chiết đƣợc DNA từ mẫu

mô FFPE bƣớc đầu tiên yêu cầu phải loại bỏ parafin. Thông thƣờng, xylen hoặc dầu
khoáng sẽ đƣợc sử dụng để hòa tan lớp parafin phủ bên ngoài mô. Sau đó dùng cồn
rửa để loại hoàn toàn xylen hoặc dầu khoáng khỏi mẫu. Bƣớc tiếp theo phải phá vỡ
mô, tế bào để giải phóng nucleic acid. Dung dịch dùng để phá vỡ mô và lớp vỏ
protein thƣờng có mặt chất tạo phức càng cua Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
(EDTA) để ức chế các nuclease thủy phân nucleic acid và Sodium Dodecyl Sulfate
(SDS) tẩy rửa và làm biến tính protein. Bƣớc tiếp theo, ngƣời ta phá vỡ các liên kết
15


chéo giữa nucleic acid với protein bằng cách ủ ở nhiệt độ cao trong thời gian dài
[11, 23, 30, 38]. Sau cùng các phƣơng pháp khác nhau nhƣ sử dụng dung môi hữu
cơ phenol - chloroform, cột lọc có màng silica hoặc hạt nano bọc silica để thu đƣợc
sản phẩm cuối cùng là DNA.
1.2.2.3. Một số phƣơng pháp tách chiết DNA từ mô FFPE
1.2.2.3.1. Phương pháp tách chiết DNA từ mô FFPE bằng màng xốp silica
Phƣơng pháp sử dụng màng xốp silica là phƣơng pháp tiên tiến hiện nay đang
đƣợc phát triển bởi nhiều công ty sinh học phân tử hàng đầu trên thế giới dựa trên
nền tảng nguyên lý của phƣơng pháp Boom [5, 40, 50, 52].

Hình 1.8: DNA liên kết với silica trong môi trƣờng có nồng độ muối cao và
chất diện hoạt sức căng bề mặt thấp [56]

Sau khi mô, tế bào bị phá vỡ giải phóng DNA nhờ tác dụng của các enzyme ly
giải, liên kết chéo trong DNA cũng bị loại bỏ bởi nhiệt cao. Lúc này nhờ tác dụng
của guanidine thiocyanate (GuSCN) với nồng độ cao đồng thời trong môi trƣờng có
sức căng bề mặt thấp, silica sẽ liên kết bền vững với các phân tử nucleic acid. Trong
cùng điều kiện đó, silica không có khả năng liên kết với protein, các đại phân tử
sinh học khác. Nhƣ vậy, khi hỗn hợp gồm nucleic acid, protein, và các đại phân tử
sinh học khác cùng các mảnh xác tế bào khi đi qua cột có gắn màng xốp silica nhờ

ly tâm thì các phân tử nucleic acid sẽ đƣợc giữ lại vì liên kết với silica, còn các

16


thành phần khác sẽ bị rửa trôi. Nucleic acid sau đó, đƣợc tách ra khỏi màng xốp
silica nhờ dung dịch đệm thích hợp.
Ưu, nhược điểm của phương pháp
Nucleic acid thu đƣợc có độ tinh sạch và nồng độ cao, không bị lẫn các dung
môi hữu cơ nhƣ phenol. Tiết kiệm thời gian khi tiến hành tinh sạch với số lƣợng
mẫu nhỏ, nhƣng sẽ gặp khó khăn khi số lƣợng mẫu quá lớn. Một hạn chế khác nữa
là phƣơng pháp này cần phải sử dụng máy ly tâm hoặc bơm hút chân không do đó
không thể tự động hóa đƣợc quy trình tinh sạch.
1.2.2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA từ mô FFPE bằng hạt nano từ bọc silica
Tách chiết DNA sử dụng hạt nano từ là một trong các cải biến lớn của công
nghệ sinh học. Mở đầu với một bằng sáng chế của Trevor Hawkins tại Mỹ đƣợc
công bố năm 1998 với tiêu đề “Tinh sạch và tách chiết DNA sử dụng hạt từ” [53],
đến nay phƣơng pháp này liên tục đƣợc cải biến, phát triển và ngày càng đƣợc áp
dụng rộng rãi trong sinh học phân tử cho thấy tính tiên tiến và khả năng ứng dụng
cao của hạt nano từ. Nguyên lý của phƣơng pháp này giống với phƣơng pháp sử
dụng màng xốp silica. Thay vì sử dụng cột lọc có màng silica ở đây sử dụng hạt
nano từ bọc silica cũng có khả năng liên kết với DNA tƣơng tự nhƣ màng xốp
silica. Hạt nano từ có kích thƣớc khoảng 20 nm bên trong chứa các hạt Fe 3O4 có từ
tính, và đƣợc phủ ngoài bởi lớp silica. Trong môi trƣờng nồng độ muối cao, pH thấp
và có mặt của các chất diện hoạt, DNA sẽ liên kết với các hạt nano từ thông qua cầu
nối cation Na+. Mặc dù liên kết ion là liên kết yếu nhƣng diện tích tiếp xúc lớn
cộng với số lƣợng liên kết nhiều vẫn đảm bảo DNA đƣợc gắn chặt với hạt trong quá
trình tách chiết [9-11, 28]. DNA sau khi gắn chặt với hạt dễ dàng đƣợc loại bỏ hết
các tạp chất nhờ hạt có từ tính nên phức hệ hạt từ - DNA đƣợc giữ lại bởi nam châm
còn protein hay xác tế bào thì bị rửa trôi. Cuối cùng DNA sẽ thu đƣợc dƣới dạng

tinh sạch khi tách ra khỏi hạt nano từ bọc silica bằng dung dịch đệm chiết đẩy phù
hợp hoặc nƣớc cất.
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về sử dụng hạt nano từ trong việc tách
chiết DNA từ mô đúc FFPE tuy nhiên chủ yếu thuộc về các công ty về công nghệ
17